REPUBLIQUE TUNISIENNE

MINISTERE DE LENSEIGNEMENT SUPERIEUR,

DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE ET DE LA TECHNOLOGIE
UNIVERSITE DE MONASTIR
Institut Suprieur des Sciences Appliques & Technologie de Mahdia

MEMOIRE DE PROJ
PROJET DE FIN DETUDES
Pour lobtention du

DIPLME DE LICENCE APPLIQUEE

Spcialit
Production alimentaire et nutrition

Sujet

Mcanismes de protection des plantes de pois par des

polysaccharides extraits dune souche de Rhizobium contre
Orobanche crenata
Ralis par

Khairi Hanene & Temani Randa

Soutenu, le 28 mai devant le jury compos de:

Dr. Ghada MENSI

Dr. KHOUAJA Fattouma
Dr. MABROUK Yassine

Assistant l'ISSAT-M
Matre Assistant l'ISSAT-M
Assistant au CNSTN

Prsident
Encadreur
Co- Encadreur

Anne Universitaire 2008/2009

2008/2009

Ddicace de RANDA
Je ddie ce mmoire
A mes chers parents
Chadli & Tajia
Tajia
Nulle ddicace ne saurait exprimer mes sentiments, ma reconnaissance et mon profond
attachement.
Pour tous lamour que vous mavez donns
Pour tous les sacrifices que vous avez consentis pour nous,
Je vous ddie ce mmoire en tmoignage de mon amour ternel et ma gratitude infinie.
Que Dieu vous prte une bonne sant et une longue vie.
A mes surs
Rfette, Rawed, Raya, Raouia
Vous mavez toujours soutenue et aide
Merci pour tous ce que vous avez fait
Que Dieu soit avec vous et vous permet de raliser tous ce que vous voudrez
A mon adorable oncle Ahmed
Et A
Ma tante Fatma
Ma tante Ommelkhir et Maymouna
Et touts mes amis
Que dieu vous bnisse et soit avec vous tout au long de votre vie

Temani.R & Khairi.H

2008/2009

Ddicace de HANENE
Je ddie ce travail toutes les personnes qui mont toujours aime, supporte,
conseille, pousse mamliorer, dont le mrite, les sacrifices et les qualits humaines,
on fait de moi ce que je suis aujourdhui et mont permis de vivre ce jour ;
Mon extraordinaire mre, Mon xcptionnelle pre,
Mes trs chrs frres : Karim,
Karim qui possde la plus grand coeure Wajdi,
Wajdi Helmi et Saif
Mes tous petits frres : Aziz et Arij leur chre maman,
Ma sage tante, mes cousins et toute la famille.
A lexceptionnelle, lunique, la voix de ma conscience, au plus beau cur qui ma
toujours support, protg et qui aucun mot ne puisse dcrire mes sentiments damour ;
Khairi.
Khairi.
A tous mes amis : lincroyable, le rare et celle qui mrite le titre dami avec excellence,
Ali.
Ali
La tendre mon adorable Halima,
Halima ma chre et mme trs chre Ines,
Ines ma binome Randa,
Randa
la minione Mouna,
Mouna qui possde la belle gosse Nahla, les deux belles jumeaux Marwa et
Mariem.
Mariem.
Tous mes camarades ; Mouhamed, Abir, Ferdaws, Wissal, Afef, Arwa, Anis, Nidhal,
Yassine et Sabrine.
MERCI POUR VOUS TOUS.

Temani.R & Khairi.H

2008/2009

Remerciements
La rdaction de ce mmoire nous donne loccasion de remercier toutes les personnes qui ont
particip et contribu au bon droulement de ce mmoire.
Nous tenons exprimer, en premier lieu, nos plus vifs remerciements Monsieur Adel
Trabelsi, Directeur Gnral du Centre National des Sciences et Technologies Nuclaires
(CNSTN), pour avoir accord notre accs au CNSTN.
Nous tenons remercier vivement Monsieur Yassine Mabrouk,
Mabrouk Assistant au CNSTN, pour
avoir accept de diriger ce projet de fin dtude, pour son encadrement, pour avoir mis notre
disposition les moyens exprimentaux ncessaires au bon droulement de ce projet mais aussi
et surtout pour ses qualits humaines et scientifiques toujours en toute modestie, sa passion
et sa confiance quil a bien voulu nous accorder tout au long de ce travail.
Nous tenons remercier vivement Madame Fattoum Khouaja,
Khouaja Maitre Assistante en
Institut Suprieur des Sciences Appliques et Technologie de Mahdia (ISSAT M), dabord
pour avoir accept dencadrer et de co-diriger ce travail, pour sa disponibilit rpondre
tous nos soucis, pour avoir mis notre disposition les moyens ncessaires, aussi pour sa
bonne humeur mais surtout pour ses implications tant humaines que scientifiques.
Nous tenons aussi exprimer notre profonde gratitude Mlle Sonia Mejri,
Mejri assistante au
CNSTN, pour son assistance jamais dmentie et son aide au niveau de la partie
exprimentale mais aussi pour avoir t si comprhensive et si gnreuse avec ses conseils.
Nous tenons exprimer lhonneur qui nous est fait par les membres de jury en acceptant de
juger notre travail. Quils trouvent ici notre reconnaissance et notre respect.
Que celles et ceux, qui par leurs actions, leurs tmoignages et leurs concessions ont contribu
la ralisation de ce travail, trouvent ici le tmoignage de notre reconnaissance.

Sommaire

Introduction gnrale .............................................................................................. 2

Synthse bibliographique........................................................................................ 1
1. Prsentation des lgumineuses ......................................................................... 2
2. Le pois ............................................................................................................... 2
2.1 Importance de la culture de pois ................................................................ 3
2.2 Les ennemies du pois.................................................................................. 5
3 Lorobanche ........................................................................................................ 5
3.1 Distribution gographique............................................................................ 6
3.2 Cycle biologique .......................................................................................... 6
3.3 Moyens de lutte ............................................................................................ 7
Matriel & Mthodes ............................................................................................. 10
1. Matriel biologique .......................................................................................... 11
2. Protocole exprimentale ................................................................................. 11
2.1 tude de leffet des polysaccharides sur le parasitisme du pois par
orobanche crenata ............................................................................................ 11
2.2 Etude biochimique des mcanismes de dfense induits chez le pois ........ 14
Rsultats et Discussion ............................................................................................ 16
1. Effet des polysaccharides sur le dveloppement de lOrobanche..................... 17
1.1 Effet sur la germination des graines de lO. Crenata ................................... 17
1.2 Effet des polysaccharides sur lattachement dO.crenata sur les racines des
plantes de pois .................................................................................................. 19
2. Etude de la variation des activits enzymatiques............................................. 20
2.1 Activit de la POX....................................................................................... 20
2.2 Activit de la PPO...................................................................................... 21
Conclusions & perspectives .................................................................................. 24
Rfrences bibliographiques ................................................................................ 26
Annexes ................................................................................................................... 30

Listes dabrviations
g : microgramme.
L : microlitre
m : micromtre.
mol : micromole
BSA : Bovine Serum Albumin
KCal : Kilocalorie.
CNSTN : Centre National des Sciences et Technologies Nuclaires.
DO : Densit Optique
EDTA: Ethylene-Diamine-Tetraacetic acid
EPS : Exopolysaccharides.
g : gramme.
h : heure.
INRAT: Institut National de la Recherche Agronomique de la Tunisie
ISSAT-M : Institut Suprieur des Sciences Appliques et Technologies de Mahdia.
L : litre.
LPS : lipopolysaccharides
M : mol.
MF : matire fraiche
mg : milligramme.
min: minute.
ml: millilitre.
mM : millimolaire
nm : nanomtre
O. Crenata: Orobanche crenata.
O. Foetida: Orobanche Foetida.
POX : Peroxydase.
PPO : Polyphnoloxydase.
rpm : Rotation Par Minute
UI : unit internationale.
YEM: Yeast Entract mannitol.

Liste des illustrations

Listes des figures

Fig. 1: Le pois (Pisum sativum).2
Fig. 2: a : Orobanche crenata, b : parcelle de fverole infeste par Orobanche foetida..4
Fig. 3: cycle biologique dO.crenata.6
Fig. 4: dispositif de strilisation des graines de pois.........9
Fig. 5: dispositif de strilisation des graines dO.crenata........10
Fig. 6: le systme de Co-culture ..12
Fig. 7: variation de la germination des graines du parasite en foction des
traitements... .15
Fig. 8: Diffrents stades de dveloppement de lO.Crenata...........................................16
Fig. 9: Variation dactivit POX en UI/mg de protines en fonction des traitements..........18
Fig. 10: Variation dactivit PPO en UI/mg de protines en fonction des traitements...19
Fig. 11 : Variation des teneures en phnols solubles en fonction des traitements..21

Liste des Tableaux

Tableau1 : Valeur nutritionnelle moyenne pour 100 g de pois..3
Tableau 2 : effet des polysaccharides sur le nombre dattachement dorobanche la racine des
plantes de pois...17

Introduction gnrale

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Prsentation de CNSTN
Cre par la loi n 93-115 en Novembre 1993, le CNSTN est un tablissement public
caractre non administratif, dot de la personnalit civile et de lautonomie financire. Il a
pour mission de raliser des tudes technologiques et nuclaires caractre pacifique dans les
diffrents domaines ainsi que la matrise des technologies nuclaires. Des tudes et des
recherches faitent dans le centre sont notamment dans les domaines de lagriculture, de
lindustrie, de lnergie, de lenvironnement et de la mdecine.

LES ACTIVITES DU CNSTN

Ralisation dtudes, de projets et de programmes de recherches thoriques et pratiques
Dans le domaine des sciences et technologies nuclaires caractre pacifique.

Collecte et traitement des informations relatives aux sciences, aux recherches et aux
technologies nuclaire.

Fourniture de services aux institutions universitaires et aux entreprises publiques et
prives y compris la formation et les stages

Garantir les mesures de sret nuclaires et de radioprotection lintrieur des
installations du centre et de lquipement et assurer la protection de lenvironnement lors
de ses activits.

Donner son avis sur les questions relatives la ralisation de la sret nuclaire et de la
radioprotection.

Ralisation de toutes les activits tendant assurer le dveloppement des sciences et
technologies nuclaires.

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INTRODUCTION GENERALE
La famille des lgumineuses est vaste. Elle est constitue de nombreuses espces dont
le pois, le fverole, les lupins, le soja, les vesces, les lentilles Du nord au sud et d'est en
ouest de la Tunisie, cette diversit apporte une adaptabilit gntique remarquable. C'est
pourquoi chaque rgion, avec ses caractristiques de sols et de climat particulires, peut
cultiver avec succs un ou plusieurs types de lgumineuses.
Les lgumineuses reprsentent une source de protine de qualit pour lalimentation
humaine (haricot, lentille, pois, pois chiche, fve) ou pour lalimentation animale sous forme
de graines (pois, fverole, soja, lupin) ou sous forme de fourrages (luzerne, trfle).
Parce quelles possdent la capacit dutiliser lazote atmosphrique, grce une symbiose
avec des bactries fixatrices dazote, les lgumineuses ne ncessitent pas lutilisation
dengrais azots. L'introduction dune lgumineuse (comme le pois) prserve la rentabilit
conomique des systmes en permettant tout particulirement des conomies d'intrants
engrais azots sur le protagineux mme, mais galement sur la culture qui suit,
gnralement un bl, dont le rendement est amlior.
Malgr ses caractristiques nutritionnelles et agronomiques, une rgression des
superficies des cultures des lgumineuses et en particulier, celles du pois sont observes.
Cette rgression est due entre autre aux attaques par les pathognes telles que les bactries,
champignons, virus et les plantes parasites. Parmi ces derniers, le genre orobanche constitue
un facteur limitant pour la culture des lgumineuses notamment la culture du pois. En Tunisie
les pertes de rendement dues lorobanche sont estimes 80% voire mme une destruction
totale de la culture dans les parcelles fortement infestes. Plusieurs mthodes de luttes contre
ce parasite ont t dveloppes mais, selon les travaux dune enqute effectue par Zermane
et al. (2001) aucune mthode de lutte pratique par les agricultures enqutes dans les
gouvernorats de Bja et de Nabeul ne sest rvle efficace. En outre, certaines mthodes
pratiques causent des effets indsirables sur lenvironnement provoquant dans certaines
exploitations labandon de la culture de lgumineuses.

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Pour ces raisons les chercheurs sont amens dvelopper de nouvelles stratgies pour
combler les limites des mthodes disponibles.
Des travaux antrieurs par Mabrouk et al. 2007 ont dcrit lutilisation des souches de
rhizobium pour la lutte biologiques contre lOrobanche crenata chez le pois. De plus ces
chercheurs ont montr que lutilisation des cellules tues des souches rhizobiennes donne les
mmes rsultats de protection des plantes de pois contre O. crenata que ceux obtenus en
utilisant les cellules vivantes. Ceci suggre que les rhizobiums induisent la rsistance chez le
pois contre lorobanche par des molcules rsistantes

la chaleur telle que les

polysaccharides (les lipopolysaccharides et les exopolysaccharides), molcules impliques

dans le processus dinteraction des souches de Rhizobium avec leurs plantes htes.

Lobjectif de cette tude est de vrifier dans un premier lieu leffet protecteur des
polysaccharides chez les plantes de pois contre O. crenata et de caractriser les mcanismes
daction mis en jeu dans un second temps. Lintrt de cet tude est dutiliser ses composs
naturels pour la protection des cultures du pois qui est une ncessit sur le plan quantitatif,
pour satisfaire les besoins alimentaires des hommes et ceux des animaux dlevage et sur le
plan qualitatif, pour assurer la production dune grande diversit de denres alimentaires de
qualit homogne, saines et des prix accessibles tous, tout en prservant les cosystmes.

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Synthse
bibliographique

Synthse bibliographique

ISSAT-M / CNSTN

Synthse bibliographique

1. Prsentation des lgumineuses

Les lgumineuses sont constitues des lgumes secs (lentilles, haricots, pois
chiches...), le soja et l'arachide. Elles sont riches en protines en lments minraux
(phosphore, fer) en vitamines et en fibres alimentaires. Elles constituent une trs bonne source
de vitamine (thiamine, de riboflavine et de niacine). Leur composition est ainsi proche de
celle des aliments du groupe "viande, poisson, oeuf". Les lgumes secs apportent environ 25
% de protines. Cependant, ils sont pauvres en mthionine qui est un acide amin
indispensable, ce qui leur confre une valeur nutritionnelle moins bonne que celle de la
viande, du poisson ou des oeufs.
Les lgumineuses sont riches en glucides complexes. Elles reprsentent donc une excellente
source dnergie. Elles renferment trs peu et souvent aucun acide gras. Elles se distinguent
aussi par leur forte teneur en fibres alimentaires. Parmi les lgumineuses, le pois (Pissum
sativum) appel aussi pois potager, est lune des principales lgumineuses alimentaires cycle
court, tout comme lharicot vert et la fve (Lvesque. D 1994).

2. Le pois
L'espce Pisum sativum fournit plusieurs types d'aliments tant pour l'homme que pour
les animaux :

les pois secs, c'est--dire les graines rcoltes maturit, constituent un lgume sec, et sont
aussi donnes aux animaux domestiques soit telles quelles (volailles, oiseaux) soit sous
forme de farines ( ovins, bovins et caprins) ; ces graines sont aussi une matire premire
pour l'industrie de transformation (amidonnerie, extraits protiques),

les pois frais, soit sous forme de graines immatures, soit de gousses entires galement
immatures, sont considrs comme un lgume frais, appel petit pois (Figure 1).

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Synthse bibliographique

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la plante entire fournit un fourrage aux ruminants, soit en sec, soit en vert, frais ou ensil ;
on utilise aussi cet effet la paille , c'est--dire les fanes restant sur le terrain aprs la
rcolte des gousses ou des graines.

Fig. 1 : Le pois (Pisum sativum)

2.1 Importance de la culture de pois

2.1.1 Intrt nutritif
Frais ou secs, les pois ont en commun d'tre des aliments riches en nergie et en
protines. Les pois secs sont comparables d'autres lgumineuses (haricots secs, lentilles,
fves sches, pois chiches), et aux crales par leur valeur nergtique (330 kcal/100 g). La
partie glucidique des pois est forme essentiellement d'amidon (50 %) et de sucres (6 %)
saccharose et oligosaccharides (Varela et al., 2004)
Ils sont aussi riches en protines (Holwach, 1982). Celles-ci, teneur leve en lysine,
sont toutefois dficientes en certains acides amins essentiels comme la mthionine et le
tryptophane. En les associant avec des aliments base de crales tel que le pain, qui sont au
contraire dficients en lysine, on obtient une bonne complmentarit. Les pois sont une bonne
source de minraux: potassium, phosphore, calcium et fer; ainsi que de vitamines B,
notamment de (folate, vitamine B9). Ils se distinguent galement par leur trs faible teneur en
matires grasses.
Les petits pois sont plus riches en eau (74 %), n'apportent que 92 kcal/100 g (crus)
mais plus nergtiques que la majorit des lgumes verts. Ils sont plus riches en sucres

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Synthse bibliographique

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solubles que les pois secs. Ils sont aussi intressants pour leurs apports en lysine et en fibres.
Les petits pois sont aussi une bonne source de vitamine C (Tableau 1).
Tableau 1 : Valeur nutritionnelle moyenne pour 100 g de pois (Tacques, 1985)

Glu/Lip/Prot

Vitamines

Sels Minraux

Acides amins

Divers

essentiels
Glucides 56g

Vitamine B1

0,7mg

Calcium

60mg

Isoleucine

Lipides

1,7g

Vitamine B2

0,2mg

Chlore

50mg

Leucine

Protides 23g

Vitamine B3

3,1mg

Fer

5,5mg

Lysine

Vitamine C

3mg

Potassium

930mg

Methionine 210mg

Vitamine K

930mg

Magnesium 130mg

Phnilalanine1000mg

Sodium

Thronine

40mg

930mg

Eau

12g

1480mg

Fibres

15g

1620mg

Cellulose 5g

860mg

Phosphor

380mg

Triptophane 210 mg

Soufre

219mg

Valine

Zinc

1000mg

3,5mg

2.1.2 Intrt agronomique

Souvent, lagriculteur est intress par la culture de pois visant ses atouts
agronomiques. En effet, le pois est capable de fournir ses besoins en azote par une simple
fixation symbiotique de lazote atmosphrique. Cette fixation symbiotique dazote se fait
grce une interaction entre les plantes de pois et les souches de rhizobium qui sont des
bactries Gram ngatif, en forme de btonnets mobiles (Broughton et Dilworth, 1971). Ces
bactries induisent chez la plante la formation des nodules sur les racines. En grande culture,
lagriculteur peut utiliser le pois en tte de rotation pour profiter de lenrichissement du sol en
azote.
Malgr ces caractristiques nutritionnelles et agronomiques, une rgression des
superficies des cultures des lgumineuses et en particulier le pois a t observe. Cette
rgression est due plusieurs contraintes biotique et abiotiques, notamment les ravageurs et
les maladies.

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2.2 Les ennemies du pois

2.2.1 Les Maladies
Le pois peut tre affect par des maladies cryptogamiques, bactriennes ou virales.
Parmi les principales maladies ayant une incidence conomique notables sur les cultures du
pois on peut citer :

Les fontes des semis dues diffrents champignons du sol notamment du genre Pythium,
les ncroses racinaires, dues entre autres Fusarium solani et aux Aphanomyces.

les maladies cryptogamiques affectant l'appareil vgtatif : le mildiou du pois

(Peronospora pisi), la pourriture grise (Botrytis cinerea), l'odium du pois (Erysiphe pisi),
la sclrotinose (Sclerotinia sclerotiorum), la rouille (Uromyces pisi) et l'anthracnose
(Colletrichum pisi),

Diverses maladies virales, dont la jaunisse apicale du pois due au virus PTYV (Pea Top
Yellow Virus) et la mosaque commune du pois, due au virus PCMV (Pea Common Mosaic
Virus).

2.2.2 Les plantes parasites

Dans les rgions mditerranennes, les rendements des cultures de pois sont affects
par des plantes parasites comme la Cuscute, le Striga, le Gui et lOrobanche qui a fait lobjet
de notre tude.

3. Lorobanche
Lorobanche est une plante parasite rpandue et redoutable qui existe en Tunisie sous
deux espces Orobanche crenata et Orobanche foetida (Figure 2). Lorobanche crenata est
capable de se dvelopper sur certaines espces cultives comme les lgumineuses (Kharrat et
al., 1992) et le parasitisme se localise au niveau des racines de la plante hte (Raghni et al.,
1997).

Fig.2: a: Orobanche crenata, b: parcelle de fverole infeste par Orobanche foetida

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Synthse bibliographique

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3.1 Distribution gographique

Les orobanches se rencontrent principalement dans les rgions tempres et
essentiellement dans les zones arides et semi-arides. Leur principal centre de dissmination
est le bassin mditerranen. Lorobanche serait originaire de lItalie, lEspagne et le Maroc
infestant environ 16 millions dhectares des terres arables dans la rgion mditerranenne
(Pujadas, 1999).

3.2 Cycle biologique

La plupart des espces dorobanche sont annuelles et se reproduisent par graine. La
germination des graines dorobanche ne peut avoir lieu quen prsence de substances
stimulatrices mises par les racines de la plante hte. Elle se manifeste alors par la sortie
dune radicule microscopique.
Aprs germination, la radicule se trouve attire par la racine de lhte, sallonge dans sa
direction pour sy fixer (Parker et Riches, 1993). Ds quelle sattache la racine de la plante
hte un haustorium (tube germinatif en stade matur) se forme, Il pntrera dans la racine de
lhte par dgradation enzymatique et mcanique (Dorr et Kollman, 1974) et tablit des
connections avec le systme vasculaire de lhte. Ces connections seront utilises par le
parasite pour absorber leau et les sels minraux ncessaire sa croissance. partir de ce
stade, des bourgeons se dveloppent sur le tubercule form par le gonflement de la racine de
lhte, produisant une tige qui sallonge verticalement en une jeune tige souterraine qui
progresse dans la terre vers la surface du sol. Lmergence de la tige souterraine marque le
dbut de la phase arienne du cycle du parasite. Cet axe, non chlorophyllien et pourvu
dcailles, se transforme rapidement en une hampe florale. Aprs la fcondation, chaque fleur
pollinise se transforme en une capsule librant environ 200 500 graines mres (Figure 3).

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Synthse bibliographique

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Fig.3 : Cycle biologique de lorobanche

3.3 Moyens de lutte

Plusieurs techniques de lutte contre l'orobanche ont fait l'objet d'tudes.

3.3.1 Lutte culturale

Date de semis : Les dates de semis tardives permettent aux cultures dchapper aux
grandes attaques de lorobanche. En Tunisie, les rsultats dexprimentation ont
montr quun semis tardif de fve (deuxime quinzaine de dcembre) permet une
rduction denviron 45 % du nombre de tige dO. Foetida merge par plante hte et
de 54 % du poids sec dorobanche par plante hte, ce qui entrane une augmentation
de rendement de 20 % (Kharrat et Halila, 1994).

Fertilisation : Des essais au champ ont montr que la fertilisation azote pourrait
rduire linfestation des cultures par lOrobanche et le Striga. Cette rduction peut
atteindre 33 50 %. Par ailleurs une application avec du sulfate dammonium a donn

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Synthse bibliographique

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de meilleurs rsultats (Pietres, 1996) Cependant, les doses impliques sont trs leves
et non conomiques.

3.3.2 Lutte physique

Arrachage manuel : Cette mthode consiste effectuer un dsherbage manuel
surtout dans les parcelles faible niveau dinfestation pour empcher la dissmination
des graines du parasite. Lefficacit de cette technique dpend de lpoque de
larrachage qui doit tre au plus tard au moment de la floraison du parasite suivant
dune incinration immdiate (Raghni et al., 1997).

Culture- Piges : Les culturespiges sont des plantes qui stimulent la germination
des graines dorobanche sans servir de cultures htes. Elles permettent ainsi de rduire
la rserve de semences dO. Crenata dans le sol (Kharrat et al., 1997).

Solarisation : Les meilleurs rsultats de lutte contre lorobanche, ont t obtenus
avec une solarisation pendant 30 50 jours en saison chaude qui consiste couvrir le
sol avec un paillage en plastique de polythylne entranant

un chauffement

important par les rayonnements solaires. Cette technique sest montre assez efficace,
mais cot lev de polythylne (Foy et al., 1989). Dautre part, la raret des
machines appropries et des jours ensoleills peuvent plus ou moins limiter son
utilisation.

3.3.3 Lutte chimique

Plusieurs essais de traitements herbicides ont t utiliss contre lorobanche. Les
meilleurs rsultats ont t obtenus avec le glyphosate et les imidazolinones. Lutilisation du
glyphosate sur fve permet de lutter contre O. crenata (At Abdallah et Hamadeche, 1996).
En effet, Kharrat et Halila (1994) ont obtenu avec ce traitement une rduction du nombre et de
poids dO. Foetida respectivement de 97 % et 98,3 %. Aboutissant une augmentation du
rendement de 53,2 % de la fve.

3.3.4 Lutte biologique

Certains insectes et champignons ont t signals comme agents parasites de
l'orobanche. Ceci a ouvert une autre voie de lutte contre ces plantes parasite par:

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Synthse bibliographique

ISSAT-M / CNSTN

Les insectes : Plusieurs insectes phytophages s'attaquant l'orobanche. Seule la

mouche Photomyza orobanchia semble avoir des perspectives d'tre utilise dans la
lutte biologique contre l'orobanche. Elle intervient au stade sensible de reproduction
de lorobanche en dtruisant les graines soit directement par action des larves, soit
indirectement par une lsion des tissus dans les tiges causant la dgnration des
capsules (Kroschel et al., 1999).

Les champignons : Certains champignons s'attaquent l'orobanche tels que:

Fusarium spp, Sclerotinia spp, Rhizoctonia. Cependant, ces champignons ncessitent
une humidit relative leve et une temprature comprise entre 10 et 20C.

Les Bactries : Des souches dEscherchia coli et Azotobacter spp. gntiquement
transformes ont t testes pour leur capacit dinduire la germination des graines
dO .crenata in vitro et dans le sol (Khalaf et al., 1997). Rcemment, Mabrouk et al.
(2007) ont montr que certaines souches de Rhizobium rduisent linfestation des
plantes de pois par O. crenata. Cette rduction de parasitisme serait explique par une
rduction de la germination des graines du parasite.

Des travaux antrieurs par Mabrouk et al. (2007) ont dcrit lutilisation des souches de
rhizobium pour la lutte biologiques contre lOrobanche crenata chez le pois. De plus ces
chercheurs ont montr que lutilisation des cellules tues des souches rhizobiennes donne les
mmes rsultats de protection des plantes de pois contre O. crenata que ceux obtenus en
utilisant les cellules vivantes. Ceci suggre que les rhizobiums induisent la rsistance chez le
pois contre lorobanche par des molcules rsistantes la chaleur telle que les
polysaccharides (les lipopolysacharides et les exopolysaccharides) qui sont des molcules
impliques dans le processus dinteraction des souches de Rhizobium avec leurs plantes htes.
Cest dans ce cadre quon sest intress dans cette tude vrifier leffet protecteur des
polysaccharides chez le pois contre O. crenata et caractriser les mcanismes daction mis
en jeu. Sur le plan quantitatif, cette tude vise utiliser ces composs naturels pour la
protection des cultures du pois pour satisfaire les besoins alimentaires de lhomme et des
animaux dlevage. Sur le plan qualitatif, ce travail permettre dassurer la production dune
grande diversit de denres alimentaires de qualit homogne, saines et des prix accessibles
tous, tout en prservant les cosystmes.

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Matriel & Mthodes

Matriel et Mthodes

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Matriel et Mthodes
1. Matriel biologique

Matriel vgtal

Une varit de pois (Pisum sativum) cycle court Douce de Provence a fait
lobjet de cette tude.

Graine dO. Crenata prleves des champs de fve de la station de recherche de

lINRAT.

Matriel bactrien

une souche de Rhizobium P.SOM de la collection du laboratoire des grandes

cultures de lINRAT a t utilise.

2. Protocole exprimentale
2.1 tude de leffet des polysaccharides sur le parasitisme du pois
par orobanche crenata

2.1.1 Prparation de lhte (le pois)

Avant germination, les graines ont t soumises un tri: seules les semences saines et
homognes sont choisies. Les graines de pois ont t strilises par traitement leau de javel
pendant 5 minutes (min). Elles ont t ensuite abondamment rinces leau distille strile
dans des conditions aseptiques (prs dun bec benzne) comme indique le dispositif suivant
(Figure 4). Les graines strilises sont mises germer lobscurit dans des botes de Petri
25C.

Fig.4 : Dispositif de strilisation des graines de pois

11
Temani.R & Khairi.H

Matriel et Mthodes

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2.1.2 Prparation de lorobanche

Les graines dO.crenata ont t dsinfectes par trempage pendant 5 min dans leau de
javel puis abondamment rinces leau distille strile. Aprs dsinfections les graines sont
places dans des boites de Ptri contenant du papier filtre imbib deau distille strile pour
assurer lhumidit (Figure 5). Ces boites ont t ensuite places lobscurit et 25C
pendant une semaine: cette tape constitue la phase de prconditionnement des graines du
parasite.

Fig.5: Dispositif de strilisation des graines dO.crenata.

2.1.3 Prparation de linoculum de la souche P.SOM

Plusieurs colonies de la souche de Rhizobium P.SOM ont t repiques partir des
botes de Petri dans des erlenmeyers contenant 100 millilitre (mL) de milieu YEM (Yeast
extract mannitol). Aprs une incubation 28 C, sous agitation orbitale de 150 rpm pendant
48 heures (h), 5 mL de cette culture ont t utiliss comme inoculum. Une petite quantit
dinoculum, prleve strilement laide dun ensemenceur pralablement flamb, est
dpose sur une lame de microscope; puis recouverte dune lamelle. Lobservation des
bactries au microscope a t ralise plusieurs grossissements pour sassurer de la survie
des bactries inoculer et pour dtecter dventuelles contaminations par dautres microorganismes.

12
Temani.R & Khairi.H

Matriel et Mthodes

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2.1.4 Extraction des lipopolysaccharides (LPS)

Lextraction des LPS a t effectue partir dinoculum bactrien ralis dans 3 L de
milieu YEM. Aprs 36 h de culture, les cellules rcupres par centrifugation 4C pendant
15 min 4600 g, ont t laves trois fois avec du NaCl (0.5 M) contenant de lEDTA (5 mM)
pour liminer les EPS.

2.1.5 Extraction des Exopolysaccharides (EPS)

Les souches de Rhizobium ont t cultives sur un milieu YEM solide. Trois jours plus
tard, les colonies dveloppes ont t grattes et resuspendues dans une solution strile NaCl
0.9 % contenant de lEDTA (25 mM). Aprs centrifugation 4600 g pendant 20 min 4C,
le surnageant contenant les EPS a t filtr (0.2 m) afin dliminer les cellules bactriennes.

2.1.6 Le systme de Co-culture

Les plantules ges dune semaine et pralablement perces pour permettre le passage
de la tige, ils ont t transfres dans des botes de Petri contenant du sable strile (Fig.6).
Ces plantes ont t infestes par des graines dO.crenata pralablement strilises et
prconditionnes. Environ Cinq millilitres dinoculum de la souche de Rhizobium P.SOM, de
LPS ou dEPS ont t appliqus sparment sur les racines des plantes. Des tmoins en
absence de souches de Rhizobium de LPS et dEPS ont t utiliss. Des observations et des
notations effectues chaque semaine pendant 6 semaines sur la culture du pois doivent
comportent les paramtres suivants:
Le pourcentage de germination des graines dorobanche par rapport au nombre initial des
graines mises dans les botes.
Le nombre de tubercules forms ou dattachements sur les racines du pois.

13
Temani.R & Khairi.H

Matriel et Mthodes

ISSAT-M / CNSTN

Fig. 6: le systme de Co-culture :

(A) Co-culture du pois avec le parasite (tmoins positifs).
(B) Co-culture du pois sur boite de Ptri (tmoin ngatif)

2.2 Etude biochimique des mcanismes de dfense induits chez le pois

2.2.1 Etude des activits enzymatiques impliques dans

la dfense
2.2.1.1 Teneur en protines
Extraction des protines : Lextraction des protines a t effectue avec 500 mg de racines
prleves puis broyes dans un mortier en prsence dazote liquide. A ce broyat, on ajoute un
tampon (Tris HCL 50 mM, pH 7) a t ajout. Lextrait a t centrifug 4500 g pendant 5
min puis 13500g pendant 20 min 4 C. Le surnageant est ensuite rcupr et conserv
20 C pour viter la dgradation des protines. Les extraits ont t par ailleurs utiliss pour le
dosage des protines et les activits enzymatiques
Dosages des protines : Le dosage des protines est ralis selon la mthode de Bradford
(1976) en utilisant une gamme talon de BSA de concentration connue. A 10 L dextrait
protique, environ 500 L de ractif de Bradford et 490 L deau MilliQ ont t ajouts. La
quantit des protines est dtermine par la mesure de la DO 595 nm par rapport celle de
la gamme talon (CF annexe).

2.2.1.2 Dosage des activits enzymatiques: (peroxydase (POX) et

polyphnoloxydase (PPO)
Lactivit POX est mesure selon la technique dcrite par Eterson et al. (1995) et Lin
et Kao (1999) en utilisant le gaacol comme donneur dhydrogne. Le milieu ractionnel
contient 50 mL du tampon phosphate pH 7, 9 mM de guaacol et 19 mM de H2O2. Lextrait
14
Temani.R & Khairi.H

Matriel et Mthodes

ISSAT-M / CNSTN

enzymatique est ajout selon sa concentration en protines. La raction est initie par
laddition de H2O2 et lvolution de la cintique de lactivit proxydase est suivie pendant
une min 470 nm. Lactivit est calcule en utilisant le coefficient dextinction (e = 26.6 mM1

cm-1 470 nm). Une unit de POX est dfinie par la quantit denzyme qui entrane la

formation dune mole de ttraguaacol par minute.

La PPO est une enzyme qui catalyse loxydation de nombreux substrats phnoliques
par le dioxygne. Le pyrocathchol incolore se transforme par oxydation en un driv rose.
Cette proprit rend possible ltude de la cintique enzymatique par spectrophotomtrie.
Lactivit polyphnyloxydasique est mesure selon le protocole modifi par Chen et al.
(2000). Le mlange ractionnel contient 700 L de tampon phosphate 0,1 M pH 7, une prise
dextrait enzymatique de 10 L et 200 L de solution du cathchol (substrat des
polyphnoloxydases) 0,2 M. La raction est initie par laddition dextrait enzymatique et
suivie pendant trois minutes et labsorbance a t lue 420 nm. Les rsultats sont exprims en
densit optique par min par g de protines.

2.2.1.3 Dosage des composs phnoliques

Le prlvement des racines pour lanalyse phnolique a t ralis sur une priode de 35
jours aprs culture. Le matriel vgtal (0.5 g de matire frache (MF)) a t broy froid
dans 5 mL de mthanol (80%). Le mlange est ensuite centrifug 10000 g pendant 10 min.
Le surnageant est rcupr et conserv 4C. Le culot est repris dans 250 l de mthanol
(80%), agit pendant 3min puis centrifug 10000 g pendant 10 min. Lopration est rpte
3 fois et les surnageants obtenus sont ensuite rassembls. La fraction obtenue constitue alors
lextrait hydroalcoolique. Le dosage des phnols totaux par le ractif de Folin Ciocalteu est
bas sur les proprits rductrices de la fonction phnolique. Il en rsulte la formation dun
complexe bleu qui accompagne loxydation des phnols et qui est stabilis par laddition de
carbonate de sodium. A 50 L de lextrait phnolique, sont ajouts 2.2 mL deau distille et
250 L de ractif de Folin. Aprs 3 min dagitation, 500 L de carbonate de sodium 20%,
ont t ajouts et les tubes sont incubs 40C avant la lecture de la densit optique 760
nm. Les teneurs en phnols sont exprimes en milligrammes quivalent catchine par g de
matire frache. Les rsultats reprsentent une moyenne dau moins trois extractions
indpendantes.

15
Temani.R & Khairi.H

Rsultats et Discussion

Rsultats et Discussion

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Rsultats et discussion
1. Effet des polysaccharides sur le dveloppement de lOrobanche.
1.1 Effet sur la germination des graines de lO. Crenata
Le but de l'observation microscopique des racines inocules et non inocules le long de 6
semaines est d'valuer l'effet de la souche de rhizobium et des polysaccharides sur la
germination de l'O.crenata. Les rsultats de l'observation sont prsents dans la figure
suivante.

Fig.7 : variation de la germination des graines du parasite

en fonction des traitements

La germination du parasite est observe vers le 14me jour aprs culture dans des boites
de Petri et les taux de germination atteinent environ 24% vers la 6me semaine aprs culture
chez les plantes non inoculs. Le traitement des plantes de pois par les EPS inhibe la
germination des graines dOrobanche mais dune faon non significative et cette inhibition
est limite dans le temps ne dpassant pas les trois premires semaines. Alors que les LPS
inhibent significativement la germination des graines dO. Crenata et la rduction peut
atteindre 30, 40 et 48% respectivement aprs 4, 5 et 6 semaines de culture (Figure7).
En plus de linhibition de la germination, des symptomes de brunissement affectant les
tubes germinatifs chez les plantes traites par des LPS ont t observs. On outre, ces tubes

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Rsultats et Discussion

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germinatifs prsente une couleur bruntre qui montre lapparition des ncroses compars
ceux des graines tmoins qui sont plutt jauntres et transparentes (Figure 8 A et B).

Fig. 8 : Diffrents stades de dveloppement de lOrobanche crenata.

A : tube germinatif normal, B : Tube germinatif ncros, C : Attachement la racine du pois,
D : attachement ncros, E : bourgeon normal, F : bourgeon ncros, G : Tubercule, et H : Tubercules ncross

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Rsultats et Discussion

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1.2 Effet des polysaccharides sur lattachement dO.crenata sur les

racines des plantes de pois
Aprs germination des graines dOrobanche, les tubes germinatifs sallongent et se
mettent en contact de la surface des racines pour tablir des connections avec la
vascularisation. Les tubercules forms sur les racines des plantes saines varient de 6 14
tubercules/ plante allant de la 3me vers la 6me semaine (Tableau 2). Le traitement des plantes
de pois par les LPS provoque la manifestation de symtmes de brunissement affectant les
tubes germinatifs du parasite avant ou aprs leurs contactes avec les racines de la plante hte
(Figure 8 D). Ces symptmes de ncrose causant le dprissement des tubes germinatifs et
limpossibilit de leurs connection la vascularisation des racines de lhte, peuvent
expliquer le nombre rduit de tubercules forms sur les racines des plantes traites par les
LPS en comparaison avec les plantes tmoins.

Tableau 2 : effet des polysaccharides sur le nombre dattachement dorobanche

la racine des plantes de pois

Sem.1

Sem. 2

Sem. 3

Sem. 4

Sem.5

Sem. 6

Pois + orobanche

12

14

Pois + orobanche + Rhiz.

Pois + orobanche + LPS

Pois + orobanche + EPS

10

13

Par consquent linoculation du pois par les LPS rduit significativement la formation
des tubercules pouvant atteindre 60%. Ceci peut tre accompagn par lapparition de
symptmes de ncrose tuberculaires (Figure 8 F et H). Ces symptmes sont absents chez les
tubercules forms sur les racines des plantes saines (Figure 8 E).
Concernant leffet de la souche de Rhizobium P.SOM sur la germination et le
dveloppement du parasite, les rsultats obtenus rappellent ceux obtenus par Mabrouk et al.
(2007) qui ont montr que cette souche rduit linfestation des plantes de pois par O. crenata.
Ses travaux ont montr que cette rduction dinfestation rsulte dune inhibition de la
germination des graines du parasite. Par ailleurs, Ces auteurs ont suggr que la souche
P.SOM protge le pois contre lOrobanche par des cellules qui rsistent la chaleur. Nos
rsultats supportent cette hypothse et montrent que llicitation de la dfense naturelle chez
le pois est faite par les LPS des rhizobiums.
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Rsultats et Discussion

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La premire partie de ce travail a montr que le traitement des plantes de pois par des
LPS rduit leurs infestations par la plante parasite. Ceci serait du une inhibition de la
germination des graines dorobanche rsultant une rduction de la formation des tubercules et
et lapparition de certains symptmes de ncroses affectant le parasite. Ces rsultats suggrent
ainsi que les LPS stimulent la rsistance chez le pois contre lorobanche via lactivation du
mtabolisme des composs phnoliques et/ou la formation de barrires physique empchant la
connexion du parasite la vascularisation des racines de la plante hte. Pour cela, la partie
suivante de ce travail portera sur le suivi de lvolution des phnols et des activits
enzymatiques impliques dans la synthse de ces composs.

2. Etude de la variation des activits enzymatiques

2.1 Activit de la POX
Lvolution de lactivit enzymatique peroxydase des diffrents chantillons en
fonction du type de traitement et de la date du prlvement est prsente dans la figure qui
suit.

Taux de l'activit POX

(UI/ mg)

8
7
6
5
4
3
2
1
0
sem1

sem2

sem3

sem4

sem5

Temps(semaine)

pois
pois+oc
pois+oc+rh
pois+oc+LPS
pois+oc+EPS

Fig.9 : Variation de lactivit enzymatique (POX) en UI/mg de

protines en fonction des traitements

Lvolution de lactivit enzymatique POX des diffrents chantillons en fonction des

traitements et de la date du prlvement est prsente dans la figure 9. Lanalyse de cette
figure montre que le traitement des plantes de pois active la POX dans leurs racines ds la
premire semaine de la culture. Cette augmentation de lactivit de la POX dans les racines
de pois traites par les LPS et par la souche de Rhizobium persiste dans le temps et reste
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Rsultats et Discussion

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considrablement plus importante en comparaison aux tmoins non traits. Par contre, le
traitement des racines de pois par les EPS na pas deffet significatif sur lvolution de
lactivit de la POX tout au long de la culture.

2.2 Activit de la PPO

L'activit de la PPO augmente progressivement partir de la 1re semaine de culture
avec un pic observ vers la 4me semaine de culture chez les plantes traites par les LPS ou
inocules par la souche de Rhizobium P.SOM en comparaison avec les plantes tmoins. Il est
noter que l'activit de la PPO est plus leve dans les racines de pois inocules avec la
souche de Rhizobium que dans les racines de pois traites par les LPS, cependant cette
diffrence n'est pas significative. Les EPS activent la PPO mais laugmentation de cette
activit nest pas assez importante en comparaison avec les plantes saines ou inocules avec le

Taux de l'activit PPO (UI/ mg)

parasite seul (Figure 10).

90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
sem1

sem2

sem3

sem4

sem5

Temps(semaine)

pois
pois+oc
pois+oc+rh
pois+oc+LPS
pois+oc+EPS

Fig. 10 : Variation de lactivit enzymatique PPO en UI/mg de

protines en fonction des traitements

Lactivation de la POX et de la PPO chez le pois trait par les LPS est corrle la
rduction de son infestation par lOrobanche avec apparition des symptmes de ncrose
affectant le parasite. Ceci pouvant tre du au fait que la PPO est une enzyme qui oxyde les
composs phnoliques en quinines trs toxiques et impliques dans la formation barrires de
la dfense pour renforcer la structure cellulaire (Avdiushko et al., 1993). En outre, la
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Rsultats et Discussion

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peroxydase polymrise les polysaccharides et les polyphnoles pour produire des gels qui
empchent la propagation des pathognes (Crews et al., 2003). Nos rsultats montrent que le
pois accumule ces deux enzymes suite une inoculation par les LPS. Cela suggre que ces
derniers induisent la formation de barrires physiques contre linfection du pois par
lorobanche. Ces rsultats expliqueraient le nombre trs faible de tubercules forms sur les
racines du pois inocules par rhizobium. Les graines du parasite germes, pouvant arrivant
difficilement infester les racines de la plante hte, finissent par dprir. De plus une
accumulation des composs toxiques dans les racines de pois suite au traitement par les LPS
pourrait expliquer les symptmes de ncroses observs. Il serait intressant de vrifier
laccumulation des composs phnoliques dans les racines de pois et la corrler avec
lapparition des symptmes de ncrose.

3. Etude de la variation des phnols solubles dans les racines du

pois
Lanalyse des extraits phnoliques chez les plantes saines ges de 6 semaines a
montr que les teneurs en phnols totaux solubles varient de 50 150 g/g MF. Ces quantits
sont trs peu modifies par linfestation par lO. Crenata et le traitement par les EPS. Suite
au traitement avec des LPS ou linoculation par la souche de Rhizobium P.SOM, on assiste
une augmentation des teneurs des phnols solubles, faible les deux premire semaines mais
nettement plus accentue aprs 5 6 semaine de culture que ceux observs chez les plantes
saines ou infestes par lorobanche (Figure 11).

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Rsultats et Discussion

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Quantite de phnole
(g/ g de MF)

350
300
250
200
150
100
50
pois
0

pois+oc
sem1

sem2

sem3

sem4

sem5
pois+oc+rh

Temps (semaine)

pois+oc+LPS
pois+oc+EPS

Fig. 11 : Variation des teneures en phnols solubles en

fonction des traitements

Les rsultats de la prsente tude montrent une corrlation entre laccumulation des
composs phnoliques avec lapparition des symptmes de ncrose. Ces constatations
suggrent que les phnols sont impliqus dans la rsistance induite par les LPS chez le pois
contre lO.crenata. Ces composs prsentent une toxicit pour le parasite avant ou aprs son
attachement aux racines des plantes de pois. Il est signaler que des analyses par HPLC, pour
identifier le(s) compos(s) impliqus dans ce processus seront effectus. De plus, dautres
tudes ont suggr que la formation des barrires (chimique ou physique) peut expliquer la
rduction de formation des tubercules sur les racines des lgumineuses (Mabrouk et al.,
2007).

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C on cl u s i on s &
p er s p ect i v e s

Conclusions & perspectives

Conclusion gnrale
Les rsultats de nos tudes nous conduisent mettre les conclusions suivantes :

Le traitement des plantes de pois avec des lipopolysaccharides a montr une efficacit
dans la lutte contre lO. crenata en induisant la rsistance des plantes de pois contre ce
parasite. Avec lapparition des symptmes de ncrose affectant les tubes germinatifs et les
tubercules forms sur les racines du pois. Linduction de la rsistance par les
lipopolysaccharides contre lOrobanche est due lactivation de certaines enzymes de
dfense (POX et PPO) et une accumulation des composs phnoliques dans les racines du
pois.

Les LPS extraits dune souche de Rhizobium semblent des molcules intressantes pour
tre utilis dans un programme de lutte contre lorobanche mais il serait intressant de
vrifier leffet de ces composs dans les conditions dinfections naturelles.

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Rfrences
b i b l i og r a p h i q u es

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2008/2009
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Annexe

Annexes

ISSAT-M / CNSTN

Gamme talon BSA

DO

0,243

0,486

0,729

0,972

BSA (g)

30

60

90

120

Temani.R & Khairi.H

2008/2009

Anne : 2009
Noms des auteurs : Khairi
Khairi Hanene et Temani Randa
Rsum :
LOrobanche crenata occasionne des dgts notables sur les cultures de lgumineuses
et est devenue un facteur limitant majeur de la production du pois dans la rgion
mditerranenne. Leffet des polysaccharides extraits de la souche de rhizobium P.SOM sur
le dveloppement dO. crenata sur le pois a t tudi. les rsultats ont montr que les
lipopolysaccharides rduisent significativement linfestation du pois par O. Crenata. Cette
limitation dinfestation rsulte de la rduction du taux de germination des graines du parasite
et dufait une rduction du nombre de tubercules forms sur les racines de la plante hte. De
plus, le dprissement des tubes germinatifs du parasite avant ou aprs attachement aux
racines du pois peut expliquer cette rduction de parasitisme
En rponse au traitement par les LPS, une corrlation est observe entre la rduction
dinfection du pois par lorobanche et lactivation des voies de signalisation. Cette activation
est caractrise dune part, par laugmentation des activits enzymatiques de la proxydase et
la polyphnoloxydase et dautre part, par laccumulation des composs phnoliques.
Les rsultats de notre tude ont montr que les LPS semblent impliqus dans linduction de la
rsistance contre lorobanche chez le pois.
Mots cls : Orobanche crenata, lgumineuses, pois (Douce de Provence), souche de
Rhizobium, polysaccharides, enzymes de dfense, polyphnols

Abstract :

The Broomrape causes notable damage on the leguminous crops and became major
factor limiting production of pea in the Mediterranean region. The effect of the
polysaccharides extracted from P.SOM Rhizobium strain on the development of
Orobanche crenata on pea was studied. The results showed that the lipopolysaccharides
significantly reduce the infestation of pea by O. crenata. This limitation of infestation
results from the reduction of seeds germination rates of the parasite resulting in reduction
of the tubercles number on pea roots. Moreover, necrosis of orobanche before or after
attachment on pea roots treated by LPS can explain this reduction of parasitism. A
correlation was observed between the reduction of pea infection by the broomrape and
the activation phenolic compounds pathway. This activation resulted to increase of two
enzymes (peroxidase and polyphenoloxidase) activities these enzymes are implicated in
plant defense. The results of our study showed that the LPS seem implied in the
induction of pea resistance against the broomrape.
Keys words: Orobanche crenata, leguminous, pea (Pisum sativum L.), Rhizobium strain,
polysaccharides, resistance, phenolic compounds.