Espectrofotometra:

Los mtodos espectrofotomtricos se basan en la interaccin materia-energa. La radiacin

EM interacciona con la materia produciendo algn efecto, se dice que materia absorbe
energa. Se lleva la materia desde un estado fundamental a un estado excitado.
Dependiendo de la cantidad de energa aplicada, la interaccin ocurrir a distintos niveles.
Con ello se distinguen varios tipos de espectroscopia segn sea el tipo de interaccin con la
REM:

Para el caso de la espectrofotometra UV-visible la interracin ocurre a nivel de los e- de la

capa de valencia existe un cambio en la distribucin electrnica.
Absorcin UV-visble : Para que ocurra la absorcin de una radiacin UV-visible en
molculas orgnicas, se requiere que la energa absorbida corresponda al salto de un orbital
poblado a uno desocupado. En el caso molecular, los niveles no son tan discretos por lo que
existe una gamma de frecuencias posibles.
Absorcin y Emisin: Cuando se absorbe energa se pasa de un estado fundamental a un
estado excitado. Este estado excitado vuelve a su estado basal luego de un cierto periodo de
desfase, ocurriendo emisin de radiacin (no siempre puede ocurrir, la energa se puede
disiparse de otras formas). Este fenmeno da origen a otro tipo de espectroscopa como la
espectroscopia de luminiscencia, fluorescencia.

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Cada analito molecular tiene un mximo de absorcin en la zona del UV-visible.

Atendiendo a esta para cada sustancia y a la intensidad en que se absorbe la radiacin se
disea un mtodo para cuantificar la cantidad de sustancia .
La cubeta: Recipente de la muestra

Procedimiento experimental:

Una vez que se tiene la muestra, se obtiene una solucin perfectamente disuelta y
transparente que se coloca en la cubeta.
En general se ocupan cubetas cuadradas de un cm de paso. Si la disolucin es muy
diluida, se ocupa una cubeta ms ancha (mayor posibilidad de paso de luz y absorcin).
Se ocupan cubetas de cuarzo (no absorbe radiacin visible ni UV)
Los fenmenos pticos (reflexin, dispersin) causan atenuacin del haz que atraviesa
la solucin que se deben considerar en la medicin. Para compensar estos efectos, se
coloca una solucin blanco que da cuenta de las perdidas anteriores. Esta se conoce
como solucin o cubeta de referencia.

Absorcin de la Luz

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La figura ilustra la atenuacin (disminucin de energa por unid. de area) de un haz de

radiacin monocromatica, antes y despus de haber atravesado una capa de solucin con un
grosor de b cm y una concentracin c. A causa de la interaccin entre los fotones y las
partculas absorbentes, la potencia del haz disminuye de Po a P.
Se define la transmitancia T de una solucin como la fraccin de radiacin incidente
transmitida por la solucin:

Y el porcentaje de transmitancia como %T= (P/Po)*100

Los valores de transmitancia pueden ir de 0 a 1, cero si no pasa nada de luz y uno si pasa
toda la luz.
Se define la absorbancia A de una solucin:

La absorbancia toma valores entre 0 e infinito. Obsrvese que la absorbancia aumenta

conforme disminuye la transmitancia.

Los instrumentos miden transmitancia, es decir, comparan la potencia incidente y

emergente. Tienen un procesador integrado que convierte los valores en absorbancia. En
general , los instrumentos comunes tienen una escala de absorbancia de 0 a 2.
Ley de Beer:
De acuerdo a la ley de Beer, la absorbancia esta relacionada linealmente con la
concentracin de la especie absorbente (c ) y con la longitud de la trayectoria (b) de la
radiacin con el medio absorbente.

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a es una constante de proporcionalidad denominada absortividad. Si c esta en gr/L, a esta

en Lgr-1m-1 y se c esta en mol/L a se denomina absortividad molar y se designa por
(unidades de Lmol-1cm-1)

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Anlisis Cuantitativo:
Para efectuar el anlisis la radiacin de la fuente luminosa debe ser monocrmatica . Se
debe elegir mximo para obtener la mxima sensibilidad y minimizar los errores. El
espectrofotmetro contiene un monocromador, que transforma la luz policromtica en
monocromtica. Depende de la calidad de este, que tan buena es esta transformacin.

Se debe establecer el rango de concentracin donde la relacin con la absorbancia es lineal.

Depende de la absorbilidad de la sustancia. Solo debera usarse el rango lineal.

Existe un rango de absorbancia ptima para la medicin (alrededor de 0.15-0.7). Esto

debido a que en la zona de alta absorbancia se producen desviaciones como consecuencia
de que la luz que logra pasar es casi nula y se confunde con el ruido de fondo. Este rango
depende de la calidad del aparato, incluso hay algunos que llegan a valores de 3 en
absorbancia, pero llevan implcito cierto error. Esto se conoce como desviaciones
instrumentales.
Tambin pueden ocurrir desviaciones qumicas de la ley de Beer producto de que las
especies que forman la muestra interactan y se desva de la linealidad. Esto ocurre a altas
concentraciones.
Para construir la curva de calibracin se toman valores limite de concentracin en los
valores 0.15-0.7 de A y luego se toma un par de puntos ms. Lo ideal es que la curva de
calibracin se construya en las mismas condiciones que la muestra (misma matriz). Cuando
no procede esto, se puede eliminar el efecto de la matriz si se aplica el Mtodo de Adicin
Estndar.

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Componentes de un Espectrofotmetro
1.
2.
3.
4.

Monocromador: Dispersa la luz y selecciona una longitud de onda

Colimador: Selecciona de la franja de luz una determinada longitud de onda
Detector: Transforma los fotones recibidos en una seal elctrica.
Fuentes radiante: Origen de luz (lamparas)

General mente se toman dos extremos:

Blanco 100% de transmitancia
Objeto opaco 0% de transmitancia
Luego se toma el valor para la muestra.

Fuentes radiantes:

Lampara de Tungsteno no tiene una longitud de onda constante en su radiacin, lo

que obliga a calibrar el instrumento cada vez que se cambia la longitud de onda.
Permite medir solo en el rango del espectro visible.

Lmpara de Deuterio Tambin tiene intensidad variable en la longitud de onda lo

que obliga a recalibrar el instrumento cada vez que se varia la longitud de onda. Sirve
para medir en el rango UV.

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Selector de Longitud de Onda Dispositivo que selecciona la longitud de onda que ser
utilizada a una banda estrecha que es absorbida por el analito. Con esto se garantiza de que
al analito siga la ley de Beer, se asegura una mayor selectividad ya que no es probable que
interfieran sustancias con un mximo de absorcin en regiones de otras longitudes de onda
y adems se aumenta la sensibilidad ya que una banda estrecha origina una mxima
variacin en la absorbancia al variar la concentracin.
Monocromador: Dispositivo que dispersa un haz de radiacin policromtico en las
longitudes de onda que lo componen, para luego selecciona una longitud de onda
determinada del espectro.
Filtros de Absorcin y rejilla de reflexin: En este tipo de monocromadores la dispersin
angular se origina por la difraccin que se produce en la superficie reflectante. Se genera
una dispersin pareja de la luz, es decir, la dispersin de la longitud de onda es
independiente de la longitud de onda.

Prisma: La difraccin en las dos caras del prisma da lugar a una dispersin angular de la
radiacin. Algunas longitudes de onda son ms dispersadas que otras. La dispersin
producida por un monocromador de prisma es mayor a longitudes de onda cortas que a
longitudes de onda largas.

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Portamuestras, cubetas:

Material Rango UV: cuarzo

Rango visible : cuarzo, vidrio, plstico

La cubeta debe estar perfectamente limpia (no tocar con las manos)
No debe tener burbujas
En general, el largo es de 1 cm. Cuando las soluciones son muy diluidas se debe utilizar
una cubeta ms ancha para aumentar la sensibilidad (5-10 cm)

Detectores:

Espectrofotmetro de haz simple:

Del tipo que se ha visto anteriormente, el problema es la sensibilidad del detector, ya que el
detector puede ser ms sensible para una longitud de onda y menos para otras. Este tipo de
espectrofotmetro esta bien adecuado para mediciones de absorcin de una sola longitud de
onda.

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Espectrofotmetro de doble haz:

Para compensar lo anterior, se invent un sistema de doble haz. Un haz pasa por un divisor
de haz (espejo en forma de V) formando dos haces en el espacio. Un haz pasa por una celda
de referencia y otra por una celda de muestra simultneamente (se requieren dos cubetas),
luego los haces pasan por dos fotodetectores idnticos. Lo que se mide al final es la
diferencia entre las dos mediciones (se utiliza un amplificador de diferencia). Es decir, cada
medicin implica una recalibracin automtica.
Con este tipo de instrumentos se puede obtener espectros de absorcin de una sustancia ya
que se hace un barrido de las longitudes de onda.

Espectrofotmetro de Fotodiodos (arreglo de diodos):

La luz separada (mltiples longitudes de onda) se hace incidir en un arreglo de diodos que
absorbe a las distintas longitudes de onda. El corazn del instrumento es la disposicin de
varios centenares de diodos detectores de silicio que se fabrican de lado a lado sobre un
solo chip de silicio. Estos perciben para cada una de las distintas longitudes de onda de
manera electrnica mediante un arreglo de circuito.
Experimentalmente se coloca primero un blanco y luego la muestra. Se percibe una menor
seal de la muestra , es decir, con menos seales en el espectro.
Con este instrumento se puede detectar el espectro completo en fraccin de segundos, es
mucho mas til. Incluso, la cubeta puede estar en un lugar accesible a la luz ambiente, no
se afectan las mediciones.

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