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Rapport de stage de pratiques agricoles 4

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Introduction

Dans de trs nombreux domaines, le contrle microbiologique des produits constitue soit un
impratif de scurit comme dans les domaines pharmaceutiques, mdicaux ou hospitaliers, soit
plus simplement, un critre de qualit. Les tablissements hospitaliers sont tenus de contrler
rgulirement la contamination microbiologique de leur eau ou de lair. Ils peuvent aussi tre
amens effectuer des analyses microbiologiques de liquides biologiques.
De mme, dans lindustrie pharmaceutique, la scurit de la production impose de multiples
contrles bactriologiques dans les diffrents sites de production, de stockage ainsi que sur les
matires premires et les produits finis. Les industries alimentaires doivent aussi faire face aux
exigences toujours croissantes du consommateur en matire de qualit et de conservation des
denres alimentaires et des boissons.
Les examens microbiologiques et hyginiques jouent alors un rle prpondrant. Les exigences
auxquelles sont soumises les mthodes dexamens microbiologiques ont pour rsultat une
excellente reproductibilit des analyses concernant la prsence et le dnombrement des germes
recherchs.
Tout au long de ce rapport nous allons numrer les diffrentes analyses que nous avons
effectues lors de notre stage pour le dnombrement de certains microorganismes nocifs.

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I. Prsentation de linstitut
Lors de sa cration lInstitut National de Nutrition et de Technologie Alimentaire (INNTA) fut
plac sous la tutelle du Ministre de l'Education Nationale avec pour principale mission la
formation des techniciens dans le domaine de la Nutrition et des Sciences de l'Aliment.
En 1971, il fut dot de la double tutelle avec le Ministre de la Sant Publique, et actuellement
il relve exclusivement de ce dernier.

L'INNTA est charg notamment d'effectuer tous travaux, tudes, vulgarisation et information
relevant du domaine de la nutrition et de l'alimentation humaine. Dans ce cadre, il participe
l'ducation nutritionnelle par des moyens audio visuels (radio, tlvision, journaux,
sminaires)

et

veille

au

contrle

alimentaire

des

collectivits.

Il a galement pour mission de cerner l'tat nutritionnel de la population, d'identifier les


pathologies

nutritionnelles,

d'assurer

leur

prvention

et

leur

traitement.

Le contrle de l'tat sanitaire et de la qualit des produits alimentaires fait partie de ses
missions.

L'INNTA participe aux commissions nationales de normalisation, de planification,


d'enseignement et de recherche d'environnement ainsi qu'aux diffrentes commissions
techniques nationales affrentes la nutrition, l'alimentation et aux disciplines et sciences
apparentes.
L'INNTA participe la ralisation des programmes de recherche alimentaire intressant les
diffrents secteurs de la vie conomique et sociale du pays ainsi qu' l'amlioration de
l'environnement.

Le conseil scientifique de l'institut donne son avis sur toute orientation ou action de recherche
et de planification en matire de nutrition et de technologie alimentaire.

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I.1.Les laboratoires de lINNTA


L'Institut National de Nutrition et de Technologie Alimentaire dispose d'un Laboratoire de
Biologie Clinique et de deux Laboratoires de Technologie alimentaire qui offrent les
prestations suivantes :
* Le Laboratoire de biologie clinique
Il ralise des analyses de biochimie mdicale aussi bien pour les maladies suivis l'INNTA,
que pour des demandes prives externes.
* Les Laboratoires de Technologie Alimentaire
Ces laboratoires ralisent les analyses suivantes :

Analyses bactriologiques

Analyses physico-chimiques

Ces analyses se font la demande de personnes morales (institutions, socits, industries,


organismes...) et personnes physiques. Les clients doivent rgler une avance sur les prestations
au moment du dpt de l'chantillon analyser au bureau de rception technique des
chantillons.

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I.2.Organigramme de lINNTA

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II. Le but des analyses microbiologiques sur les aliments


Pour des raisons conomiques : pendant leur fabrication ou stockage, les aliments sont altrs par
l'oxydation, l'action des enzymes prsentes dans ceux-ci, ainsi que par des micro-organismes
(bactries, champignons, invertbrs..) qui vont se multiplier et les rendre impropres la
consommation.
L'altration microbienne est la plus frquente car tous les aliments sont des substrats ventuels
pour les microbes. Il est donc ncessaire de suivre la qualit microbiologique des aliments pour
viter des pertes de production pour les industriels, ou pour viter une mauvaise publicit due
une affaire d'intoxication alimentaire.
Pour des raisons de sant publique : les aliments peuvent devenir toxiques sous l'action de
certains microbes, ce qui aura donc des consquences sur la sant des consommateurs. La qualit
microbiologique des aliments est donc surveille par lInstitut pour viter des intoxications
alimentaires.
Pour respecter la lgislation, divers rglements, lois, dcrets, arrts imposent certains suivis
qualitatifs d'aliments.
Nous allons donc effectuer de nombreuses analyses sur diffrents aliments afin de dtecter une
ventuelle prsence de microorganismes nocifs pour la sant des consommateurs.

II.1. Les diffrents produits analyss


Les produits analyss dans ce laboratoire sont des chantillons provenant de lextrieur. Ils
peuvent tre dorigine animale (produit laitiers, charcuterie..) ou dorigine vgtale (salade crue,
lgumes congels, pates..). Pour ceci le laboratoire est divis en deux parties : une section animale
et une section vgtale. Aussi chaque section est divise en deux parties : une partie pour lanalyse
microbienne est une partie pour lanalyse physico-chimique.

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II.2. Les analyses microbiologiques


Pour chaque chantillon on cherche et on compte le nombre des germes suivants :

les germes totaux.

les coliformes totaux.

les coliformes fcaux.

les levures et les moisissures.

les ASR (germes anarobies sulfito-rductases).

les E. coli.

les salmonelles.

Staphylocaccus aureus.

Mais avant tout, il faut procder la strilisation du matriel et la prparation des milieux de
culture ainsi que la prise dessai.
II.2.1.Autoclavage
Lautoclavage est une mthode de strilisation des milieux et des diluants, elle se fait comme
suit :
-Tout dabord, on vrifie le niveau deau qui doit recouvrir la rsistance.
-On place les bocaux autoclaver.
-On vrifie que le couvercle est bien ferm pour viter tout risque de fuite.
-On sassure que la temprature est maximale e que le purgeur est bien ouvert.
-Au moment o la pression atteint 1 bar, on fait baisser la temprature moiti et on compte 15
minutes pour ouvrir le purgeur.
- Ds que les 15 minutes sont atteintes, on laisse refroidir avant de rouvrir le couvercle et faire
sortir les bocaux contentant les milieux autoclavs.

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Figure n1 : Autoclave

II.2.2.Prparation et prlvement des chantillons


Les chantillons doivent tre achemins au laboratoire dans les plus brefs dlais possibles et
conservs dans un rfrigrateur pour que le nombre de microorganismes prsents dans
lchantillon ne soit pas modifi.
Le prlvement de lchantillon doit tre fait proprement, cot du bec benzne, sur une
payasse nettoye avec de lalcool 70%. Il faut aussi prlever de diffrents points de la surface
de notre chantillon analyser afin de sassurer que nous avons pris tous les microorganismes
prsents ventuellement.

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II.2.3.Les milieux de culture utiliss


Tableau1 : les diffrents milieux de culture de certains micro-organismes.
Micro-organismes

Milieux de culture

Coliformes totaux

DA

Coliformes fcaux

DA

ASR

TSN

E. coli

TBX

Staphylococcus aeurus

BD

Salmonelle

XLD et HEK

III. Recherche des salmonelles


III.1. Dfinition
Ce sont des entrobactries bacilles Gram ngatifs, mobiles ( pri triche), aro-anarobies
facultatifs, oxydase -, fermentative du glucose, nitrate rductase + ,lysine dcarboxylase +,
lactose-,indole-,

responsables

de gastro-entrites, toxi-infections alimentaires

et

des

fivres typhode et paratyphode. (S. typhi et S. paratyphi)


III.2. Description des milieux utiliss
III.2.1.Le diluant Eau Peptone Tamponne
Leau peptone est un milieu liquide qui permet la croissance des bactries sans exigences
particulires. Les peptones trypsiques sont une source dazote.
III.2.2.Bouillon de Rappaport
Le milieu, dcrit initialement par Rappaport, permet lenrichissement des Salmonelles.
Il reprsente un compromis entre le dveloppement optimal des Salmonelles et linhibition de
la flore contaminante.
Le bouillon Rappaport est plus slectif que les bouillons denrichissement habituellement utiliss
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grce la prsence de :
Chlorure de magnsium une concentration de 30 g/L, qui ralentit la croissance des
germes autres que les Salmonelles.
Vert malachite, qui inhibe la culture de Salmonella typhi et qui ralentit aussi la croissance des
germes autres que les Salmonelles.
tampon phosphate (abaissement du pH 5,5).
Lutilisation en parallle de bouillon slnite et de bouillon Rappaport est recommande
pour les prlvements contamins par Salmonella typhi, Salmonella cholerasuis et par
dautres srotypes de Salmonelles.
III.2.3.Bouillon au slnite
Le bouillon slnite est utilis pour lenrichissement slectif des salmonelles dans les
produits alimentaires. Ce bouillon contient :
Des tryptones : source azot.
Du lactose : source de carbone (Salmonella est lactose -).

Du slnite : pour inhiber la croissance des bactries coliformes et des entrocoques tout en
slectionnant Salmonella.
Du phosphate : pour contribuer maintenir le pH de 7 et rduire la toxicit du slnite

pour augmenter la capacit de rcupration du milieu.


III.2.4. Glose Hektoen (HEK)
La glose Hektoen est un milieu de choix pour lisolement des entrobactries pathognes :
La prsence dextrait de levures et de sucres, et la qualit des peptones favorisent la
croissance des Salmonella.

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Des sels biliaires assurent le pouvoir slectif en limitant le dveloppement des


coliformes.
Lorientation de lidentification des bactries isoles est fonde sur lattaque de trois
sucres, le lactose, la salicine et le saccharose, permettant un reprage plus prcis des
Salmonelles qui nattaquent aucun de ces sucres.
Deux indicateurs permettent de visualiser la raction :
o Le bleu de bromotymol qui vire au jaune lacidit.
o La fuchsine qui se colore en prsence daldhyde (do une teinte saumone si
la souche utilise lun ou plusieurs des sucres prsents).
Une diffrenciation supplmentaire reposant sur la production dH2S est galement
possible grce la prsence de thiosulfate et de citrate de fer : elle se traduit par des
colonies centre noir, coloration due la formation de sulfure de fer.
Observation
Croissance de colonies noires plates tmoignant de la production d H2S
dans un milieu bleu tmoignant une basificatio, consquence de lutilisation des peptones.
Prparation
Mettre en suspension 75.1 gramme de milieu dshydrat dans 1 litre deau distill ou
dminralise. Porter bullition lentement en agitant jusqu dissolution complt. Ne pas
autoclaver.
III.2.5. Glose XLD
La

glose

XLD

(Xylose-Lysine-Dsoxycholate)

est

utilise

pour

lisolement

des

entrobactries pathognes et notamment des Salmonelles dans les produits pharmaceutiques


et les produits alimentaires.
Le dsoxycholate de sodium assure linhibition de la flore contaminante Gram positif.

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Le xylose est ferment par presque tous les germes entropathognes, lexception des
shigella qui sont ainsi diffrencies des autres bactries. Aprs avoir utilis le xylose, les
salmonelles dcarboxylent la lysine (par lintermdiaire de leur lysine-dcarboxylase) en
cadavrine, ce qui provoque une augmentation de pH. En milieu devenu alcalin, les
colonies de salmonelles se prsentent sous le mme aspect que les shigella.
Les colonies qui se dveloppent sont de couleur rouge en prsence de lindicateur, le rouge
de phnol.
Laddition de lactose et de saccharose au milieu permet aux coliformes, qui dcarboxylent
la lysine, de produire un excs dacidit faisant virer lindicateur au jaune, ce qui favorise
leur diffrenciation.
En milieu alcalin et par rduction du citrate ferrique ammoniacal, les germes pathognes
producteurs de sulfure d'hydrogne se manifestent par un noircissement qui est d
lapparition de sulfure de fer au centre des colonies. Les germes non pathognes qui ne
dcarboxylent pas la lysine produisent une acidification.

III.3.Les tapes de la recherche des salmonelles


La recherche de salmonelle se ralise en quatre tapes :

Pr enrichissement.

Enrichissement en milieu slectif.

Isolement et identification.

Confirmation.

III.3.1. Pr enrichissement
On prend 25g de lchantillon analyser quon fait introduire dans un bocal contenant 225 ml
deau peptone tamponne. Ceci doit se faire aseptiquement cot du bec benzne.
Lchantillon est incub pendant 24h 37C.
Cette tape favorise la rcupration et la croissance des salmonelles.

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III.3.2. Enrichissement en milieu slectif


Avec une pipette strile, transfrer 1,0 ml de la culture de pr-enrichissement dans 9 ml de
bouillon de slnite cystine (SC). Incuber le bouillon SC pendant 24 h 37C. On refait la
mme chose mais cette fois ci on change le bouillon et on utilise le bouillon MKTTN.
Cette tape

favorise le dveloppement des salmonelles tout en retardant ou inhibant la

croissance des micro-organismes comptiteurs.


III.3.3. Isolement et identification
Ensemencer en stries une anse de 10l de chaque culture d'enrichissement slectif sur une
glose XLD et sur une glose Hektoen de faon obtenir des colonies bien isoles. Les
cultures d'enrichissement peuvent galement tre ensemences en stries sur d'autres gloses
pour l'isolement de Salmonella.
Incuber les boites de ptri pendant 24h 37C.
Aprs incubation, inspecter les botes pour dceler la prsence de colonies de Salmonella.
Sur milieu XLD, les colonies de salmonelles sont de couleur rouge centre noir. Sur le milieu
hektoen, elles sont de couleur verte centre noir.

Figure n2 : Colonies de salmonelle sur XLD

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Figure n3 : Colonies de salmonelle sur hektoen


Remarque :
Durant notre priode de stage nous navons dtect aucune prsence de colonies de salmonelle.
Alors lanalyse sest arrt dans cette tape. Mais le technicien de laboratoire nous a dcrit les
tapes suivantes de lanalyse.

III.3.4.La confirmation
III.3.4.1.La confirmation biochimique
Les colonies isoles sont analyses en fonction de ractions biochimiques dterminantes. Cela
consiste la recherche de certaines enzymes caractristiques telles que lurase, la galactosidase, la saccharase, la lactase
III.3.4.2.La confirmation srologique
Cette tape consiste rechercher les antignes O, Vi ou H.
Il existe des srums pour confirmer l'identification provisoire des isolats comme membres de la
famille de Salmonella. Cette confirmation se traduit par une agglutination des antignes avec
les srums appropris.

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III.4.Rsultats
Tableau 2: Rsultats des Salmonella
Echantillons analyss

Rsultats

Charcuterie

Absence

Escalope de dinde

Absence

Salami sandwich

Absence

Saucissons de dinde

Absence

IV. Recherche des Staphylococcus aureus


IV.1.Dfinition
Cest un coque en amas gram positif de 0,5 1 m de diamtre, non sporul, immobile, aro
anaerobie facultatif, catalase positif. Il est responsable d'intoxications alimentaires, d'infections
localises et, dans certains cas extrmes, de septicmies physiques.
IV.2.Description des milieux utiliss
IV.2.1.Glose BAIRD-PARKER
Cest un milieu slectif pour les Staphylocoques aureus.
On prend 58g du milieu dshydrat quon met dans 950 ml deau distille. On porte le mlange
jusqu bullition avec agitation. On rparti ensuite la solution dans des bocaux qui vont tre
autoclavs par la suite pendant 15min.

VI.2.2.Les tapes de la recherche des Staphylocoques


Lanalyse des staphylocoques aureus est ralise en deux tapes : Lisolement et la
confirmation.

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VI.2.2.1.Isolement
Cela consiste ensemencer en surface 0,1 ml dune dilution 101 de lchantillon analyser
sur le milieu de culture Braid Parker. Incuber 37C pendant 24h. Aprs incubation, les
colonies des staphylocoques aureus sont noires ou grises, brillantes, convexes et entoures
dune aurole dclaircissement.

VI.2.2.2. La confirmation
La confirmation est ralise par le test coagulase. Les staphylocoques aureus produisent une
enzyme capable de coaguler le plasma : la coagulase. Ce test consiste repiquer les colonies
caractristiques sur un bouillon cur cerveau (BCC) aprs incubation pendant 24h 37C, on
introduit dans un tube hmolyse 0.1ml de la culture et 0.3ml du plasma de lapin, on incube
nouveau 37C pendant 4 6 h.
Une raction est considr positive si le coagulum occupe plus de trois quarts du volume
initialement occup par le liquide.

VI.2.3.Rsultats
Tableau 3: Rsultats des Staphylococcus aureus
Echantillons analyss

Rsultats

Charcuterie

Absence

Escalope de dinde

8.105

Salami sandwich

Absence

Saucissons de dinde

Absence

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Figure n4 :Colonies de staphyloquoques


V. Recherche des coliformes fcaux et totaux
V.1.Dfinition
Les coliformes fcaux, ou coliformes thermotolrants, sont un sous-groupe des coliformes
totaux capables de fermenter le lactose une temprature de 44,5C.
Les coliformes totaux sont dfinis comme tant des bactries en forme de btonnet, arobies ou
anarobies facultatives, possdant lenzyme -galactosidase permettant lhydrolyse du lactose
35C afin de produire des colonies rouges.
La prsence de coliformes

dans lchantillon analyser

indique la prsence d'une

contamination fcale.

V.2.Description des milieux utiliss


V.2.1. La glose lacte au Dsoxycholate AGAR 0,1%(DA)

Prparation
Mettre en suspension 45 g de milieu dshydrat dans 1 L deau distille ou dminralise.
Porter bullition lentement, en agitant jusqu dissolution complte. Ne pas autoclaver.
Le milieu doit tre utilis le jour de sa prparation.

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V.3.Les tapes de la recherche des coliformes fcaux


V.3.1. Prlvement
On prlve 10 g de lchantillon (dans notre cas 10g descalope), cot du bec benzne, quon
met dans un bocal strile, contenant 90ml de diluant qui est le NaCl. Ensuite il faut
homogniser notre solution par le Stomacher pour librer les microorganismes contenus dans
lchantillon.
V.3.2. Dilutions dcimales
Introduire aseptiquement laide dune pipette en verre gradue et strile, 1 ml de la solution
mre, dans un tube essai strile contenant au pralable 9 ml du mme diluant (NaCL) : cette
dilution est alors au 1/10 ou 101.
Introduire par la suite 1ml de la dilution 101 dans un tube essai strile contenant au pralable 9
ml du mme diluant : cette dilution est alors au 1/100 ou 10-2.
Enfin, introduire 1 ml de la dilution 10-2 dans un tube essai strile contenant 9 ml du diluant
NaCl. Cette dilution est alors au 1/1000 ou 10-3.

Figure n5: schmatisation de la dilution dcimale


V.3.3. Ensemencement
Lensemencement se fait en profondeur, cest dire on prend 1ml de chaque dilution (allant de
101 103) quon verse dans la boite de ptri et quon recouvre avec le milieu de culture DA
et enfin on laisse refroidir. Ce travail ce fait cot du bec benzne.
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V.3.4.Incubation
On place les boites de ptri de recherche de coliformes fcaux dans une tuve 44c pendant
24 heures et celles des coliformes totaux dans une tuve 37c pendant 24h.
V.4.Rsultats
Tableau 4 : Rsultats des coliformes fcaux
Echantillons analyss

Rsultats

Saucisson de dinde

Absence

Escalope de dinde

5.10

Salami sandwich

Absence

Jambon enrichi lomga 3

Absence

Tableau 5: Rsultats des coliformes totaux


Echantillons analyss

Rsultats

Charcuterie

Absence

Escalope de dinde

6.10

Salami sandwich

Absence

Saucissons de dinde

Absence

Figure n6 : Colonies de coliformes totaux

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VI. Recherche des Escherichia coli

VI.1. Dfinition
Escherichia coli est un bacille gram ngatif radio rsistant de la famille des Entrobactries.
Cest un hte commun de la microflore commensale intestinale de lHomme et des animaux
homothermes.
VI.2.Description du milieu utilis (TBX AGAR)
Prparation
Mettre en suspension 36,5 g de milieu dshydrat dans 1 L deau distille ou dminralise.
Porter bullition lentement, en agitant jusqu dissolution complte. Rpartir en tubes ou en
flocons. Striliser lautoclave 121C pendant 15 minutes.
VI.3.Les tapes de la recherche de E coli
Prparer 25g de lchantillon analyser dans 100 ml deau peptonne et en prlever 1 ml quon
ensemence en surface sur le milieu TBX puis on incube 37C pendant 24 48 heures.

VI.4.Rsultats
Tableau 6 : Rsultats des E. coli
Echantillons analyss

Rsultats

Charcuterie

Absence

Escalope de dinde

100

Salami sandwich

Absence

Saucissons de dinde

Absence

Jambon enrichi lomga 3

Absence

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Figure n7 : Colonies de E.coli

VII. Recherche des anarobies sulfito-rducteurs (ASR)


VII.1.Dfinition
Le groupe des Anarobies sulfito-rducteurs regroupe diffrentes bactries se multipliant en
absence dair.
Les troubles se manifestent principalement par des gangrnes, des septicmies, des infections
pulmonaires, des infections abdominales, des sinusites ou des otites chroniques, des syndromes
diarrhiques...
Les principaux germes anarobies sulfito-rducteurs pathognes sont les suivants :

Clostridium Perfringens

Clostridium Botulinum

Clostridium Difficile

Clostridium Tetani

Les Anarobies sulfito-rducteurs rsistent remarquablement bien la cuisson.

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VII.2.Description du milieu utilis


VII.2.1.Une glose TSN

La glose TSN est principalement destine au dnombrement, 46C, des microorganismes


sulfitorducteurs dans certaines denres animales ou dorigine animale :
La prsence simultane de Nomycine rend le milieu inhibiteur vis--vis des
entrobactries.
La Nomycine inhibe la croissance de la plupart des souches de Clostridium bifermentans.
Les microorganismes sulfito-rducteurs rduisent le sulfite en sulfure provoquant, avec le
citrate ferrique, un prcipit noir de sulfure de fer autour des colonies.

Prparation
- Mettre en suspension 40,0 g de milieu dshydrat dans 1 litre deau distille ou dminralise.
- Porter lentement le milieu bullition sous agitation constante et ly maintenir durant le temps
ncessaire sa dissolution.
- Rpartir en tubes, ou en flacons.
- Striliser lautoclave 121C pendant 15 minutes.

VII.3. Les tapes de la recherche des ASR

VII.3.1.Principe
Les Clostridum sulfito-rducteurs et les Clostridum perfringens ont la possibilit de rduire les
sulfites en sulfures, qui prcipitent avec les ions du fer en donnant ainsi une coloration noirtre.

VII.3.2.Ensemencement
Prparer la glose TSN dans des tubes raison de 20 ml par tube, ensuite, ensemencer chaque
tube de TSN par un ml de chaque dilution, enfin incuber pendant 24h 37C.

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VII.4.Rsultats

Tableau 7 : Rsultats de la recherche des ASR


Echantillons analyss

Rsultats

Charcuterie

Absence

Escalope de dinde

Absence

Salami sandwich

Absence

Saucissons de dinde

Absence

Jambon enrichi lomga 3

Absence

Figure n8 : Absence de colonies des ASR

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Conclusion

Les analyses microbiologiques des aliments sont indispensables pour palier aux infections
alimentaires de la population. En effet, les aliments sont tous des substrats ventuels pour les
microbes.
Le stage auprs du laboratoire de bactriologie linstitut de nutrition est une forme
dapprentissage efficace permettant la transmission des connaissances et du savoir faire dun
travailleur expriment et de haute performance un stagiaire au dbut du chemin.
Nous avons profit de ce stage qui nous a permis de se familiariser avec les diffrentes analyses
effectues sur diffrents chantillons alimentaires.
De plus, ce stage nous a donn loccasion de passer de la thorie la pratique et surtout auprs
de responsables expriments pour mieux dtailler la technologie de chaque analyse.
Pour conclure, au cours de ce stage nous avons appris tant de choses qui reprsentent un plus
non ngligeable pour nos connaissances en microbiologie et une motivation supplmentaire
pour notre poursuite d'tude en industries agro alimentaires.

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