UN IVERSI DAD AUTONOMA DE TLAXCALA

UNIVERSIDAD AUTNOMA DE TLAXCALA

POR LA CULTURA

LA

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TI CIA S O

POSGRADO EN CIENCIAS BIOLGICAS

CENTRO TLAXCALA DE BIOLOGA DE LA CONDUCTA

Degradacin de hexadecano a partir del crecimiento de Fusarium oxysporum y

Neurospora sitophila en fermentacin lquida.

PROTOCOLO DE INVESTIGACIN

PRESENTA
FERNANDO EFRN PALACIOS GARCA

DIRECTOR
DRA. MA. CARMEN SANCHEZ HERNANDEZ

ASESORES
DRA. TANIA VOLKE SEPLVEDA
DR. RUBN DAZ GODNEZ

Enero 2014

INTRODUCCIN
Ms de 2,000, 000,000 de toneladas mtricas de petrleo son producidas por ao en todo
el mundo. En Mxico se producen 2,983 millones barriles/da (CIA World Factbook,
2010). El petrleo y sus derivados son la principal fuente de energa para las industrias y
la vida diaria del ser humano. Sin embargo, las fugas y derrames son frecuentes durante
el proceso de exploracin, produccin, refinacin, transporte y almacenamiento del
petrleo (Das y Chandran, 2011). La liberacin de los hidrocarburos (HC) en el medio
ambiente es la principal causa de contaminacin de suelos y aguas (Holliger y col. 1994);
particularmente, la contaminacin del suelo con hidrocarburos causa daos masivos a la
flora y fauna existente. El petrleo y sus derivados constituyen una importante fuente de
contaminacin. Se estima que de 0,08 % a 0,46 % (ms de tres millones de toneladas)
de la produccin total del petrleo termina formando parte, bajo diversas formas, de la
contaminacin ambiental (Jacobucci y col. 2000). El petrleo contamina el ambiente en
las diferentes etapas de su explotacin, extraccin, transporte y refinado (Vasudevan;
Rajaram, 2001). Los daos causados por la contaminacin por HC son varios como: la
reduccin o destruccin de la vida marina, destruccin del hbitat de toda forma de vida
silvestre, reduccin total o parcial de las playas costeras y sus animales, modificacin de
la vida microbiolgica presente en el suelo y agua.
El petrleo es un combustible natural compuesto de varios tipos de hidrocarburos, es
decir, de molculas que contienen bsicamente, carbono e hidrgeno. Estas molculas
pueden estar formadas de cadenas de tomos de carbono largas o cortas y que pueden
adoptar diferentes estructuras. Los HC del petrleo pueden dividirse en cuatro categoras
de compuestos:
I. Los saturados: los alcanos como el hexano, el octano, el decano, el hexadecano, los
isoalcanos y los cicloalcanos como el ciclohexano.
II. Los aromticos: benceno, tolueno, xileno y naftaleno agrupados tambin bajo la
apelacin BTEX y los poliaromticos o PAHs (Rittman, 1994).
III. Las resinas: slidos polares amorfos disueltos que contienen nitrgeno, azufre y
oxgeno.
IV. Los asfltenos: grandes molculas polares coloidales sin disolver que son ms
resistentes a la biodegradacin (Balba; Al-Awadhi; Al-Daher, 1998).
En trminos generales, de un 70 a un 97% de los hidrocarburos del petrleo es
degradable (la fraccin de hidrocarburos saturados y aromticos) y el resto representa
los asfaltenos y las resinas esencialmente inertes (Prince y col. 1999). Cada una de las
categoras agrupa compuestos con caractersticas de solubilidad, volatilidad y toxicidad
propias. Desde un punto de vista de biodegradabilidad, los hidrocarburos pueden
ordenarse de mayor a menor biodegradabilidad en: alcanos lineales > alcanos
ramificados > aromticos ligeros > alcanos cclicos > aromticos pesados > compuestos
polares (Olson, y col. 1999; Harris, 1997).

Los alcanos son molculas qumicamente muy estables en las que el esqueleto
carbonado se encuentra saturado de hidrgeno. Presentan estructuras lineales,
ramificadas o cclicas. Los ramificados conforman la mayor parte del petrleo; en caso
de una contaminacin con petrleo, son degradados ms lentamente y despus de
haberse degradado los lineales (Rittman, 1994). Los de cadena corta son ms txicos
que los de cadena larga, siendo estos ltimos ms hidrofbicos (Balba; Al- Awadhi; AlDaher, 1998). El HXD es un HC de la familia de los alcanos (sin anillos ni enlaces
mltiples) cuya frmula qumica es C16H34. Su estructura consiste en una cadena lineal
de 16 tomos de carbono, con tres hidrgenos unidos a cada uno de los dos carbonos
extremos y dos hidrgenos unidos a los restantes 14 tomos de carbono (Morrison boyd,
1987). El hexadecano, es un sustrato selectivo ideal para aislar microorganismos
capaces de degradar los alcanos (Wrenn; Venosa, 1996).
Los tratamientos biolgicos representan usualmente la mejor alternativa. Adems de no
implicar los costos de equipos, materiales, productos y maquinaria necesarios para los
tratamientos fsicos y qumicos, pueden aplicarse sobre el sitio mismo de la
contaminacin, sin exigir el desplazamiento de los suelos contaminados. El tratamiento
biolgico de descontaminacin recibe tambin el nombre de biorremediacin.
La biorremediacin es definida como el proceso mediante el cual los microorganismos
transforman o alteran (a travs de reacciones de xido-reduccin) la estructura qumica
de los contaminantes en el ambiente (EPA, 2009). La biodegradacin de los
hidrocarburos del petrleo es un proceso complejo que depende de la estructura
molecular y de la concentracin de los hidrocarburos en los sitios contaminados. Los
hidrocarburos provenientes de los productos petroleros pueden funcionar como fuente de
carbono y de energa para el crecimiento de diferentes microorganismos que pueden de
este modo, colonizar los sitios contaminados y degradar el agente contaminante
(Thomassin-Lacroix y col. 2002).
Se conocen varios factores que inciden en la degradacin de los hidrocarburos pero uno
de los ms importantes es su baja biodisponibilidad para los microorganismos. La
biodisponibilidad es definida como el grado de interaccin de los compuestos o
contaminantes con los microorganismos (Harms y col. 2010). Por lo tanto, los
hidrocarburos del petrleo difieren entre s por su susceptibilidad al ataque microbiano,
la susceptibilidad de los hidrocarburos a la degradacin generalmente es considerada en
el siguiente orden: alcanos lineales> alcanos ramificados> aromticos pequeos> ciclo
alcanos> hidrocarburos aromticos policclicos. Particularmente, los alcanos son
hidrocarburos saturados y son los principales constituyentes del petrleo en un 20 a 25%
(Ulrici, 2000), de aqu la importancia de estudiar y entender la biodegradacin, sus
alcances y consecuencias. El hexadecano (HXD) es considerado como un compuesto
modelo representativo de los alcanos.
Se ha aislado y reportado un gran nmero de microorganismos con la capacidad para
degradar hidrocarburos. En la siguiente tabla se muestran los principales gneros
microbianos que son capaces de utilizar alcanos como nica fuente de carbono y energa.

Como se aprecia, los alcanos son degradados principalmente por bacterias, hongos y
levaduras, destacando los gneros Acinetobacter y Pseudomonas como los ms
estudiados (van Beilen y col. 2003; Throne-Holst y col. 2007).
Bacterias
Levaduras
Achromobacter
Candida
Acinetobacter
Cryptococcus
Alcanivorax
Debaryomyces
Alcaligenes
Hansenula
Bacillus
Pichia
Brevibacterium
Rhodotorula
Burkholderia
Saccharomyces
Corynebacterium
Sporobolomyces
Flavobacterium
Torulopsis
Mycobacterium
Trichosporon
Nocardia
Yarrowia
Pseudomonas
Rhodococcus
Sphingomonas
Streptomyces
Adaptada de Van Beilen y col. 2003.

Hongos
Aspergillus
Cladosporium
Corollasporium
Cunninghamella
Dendryphiella
Fusarium
Gliocladium
Lulworthia
Penicilium
Varicospora
Verticilium

Algas
Prototheca

Los hongos representan un reino que comprende una gran variedad de organismos
eucariontes, morfolgicamente clasificados como levaduras, hongos filamentosos u
hongos dimrficos. Muchos de ellos viven como saprfitos descomponiendo materia
muerta, mientras que otros han evolucionado para ser patgenos obligados u
oportunistas, obteniendo nutrientes de sus huspedes, animales o plantas. Los hongos
filamentosos han desarrollado una habilidad extraordinaria para adaptarse a los cambios
ambientales, principalmente debido a sus sistemas enzimticos de defensa que los
protegen de compuestos exgenos txicos, xenobiticos. Fusarium oxysporum es un
hongo del gnero ascomycota, cosmopolita que existe en muchas formas patognicas,
parasitando ms de 100 especies de plantas gimnospermas y angiospermas, gracias a
los diversos mecanismos que tiene el hongo para vencer las defensas de muchas plantas
(Gottwald y col. 2001). Se caracteriza por producir colonias de rpido crecimiento, con
una tasa diaria cercana a un centmetro en medio papa- dextrosa agar (PDA) a 25C.
Este hongo puede presentar dos tipos de morfologa: una de tipo micelial caracterizada
por la produccin de abundante micelio areo, algodonoso, con una coloracin variable,
de blanco a rosado durazno, pero usualmente con un tinte prpura o violeta ms intenso
en la superficie del agar y pocas microconidias (Booth, 1970) y una de tipo pionotal con
la formacin de poco o ningn micelio areo y abundantes microconidias. Neurospora es
un gnero de hongos ascomicetos. Es un microorganismo aerobio obligado. El nombre
del gnero, que significa "esporas nervio" se refiere a las estras caractersticas en las
esporas que se asemejan a los axones. Se caracteriza por crecer en gran variedad de
mono y disacridos como fuentes de carbono y digerir carbohidratos complejos como
celulosa y almidn (Tatum 1961).

Consecuentemente, los hongos filamentosos juegan un papel crucial en la degradacin

y mineralizacin de una amplia gama de contaminantes ambientales, as como en la
catlisis de reacciones importantes para la produccin biotecnolgica de hormonas de
plantas y humanas. El consumo de hidrocarburos se lleva a cabo mediante una serie de
reacciones enzimticas que comienzan gracias a un grupo de enzimas conocidas como
oxigenasas o hidroxilasas. Se han reportado varias rutas de oxidacin de hidrocarburos
de cadena larga. En la ruta de degradacin de alcanos Fig.1, la alcano monooxigenasa
es la enzima clave que cataliza la oxidacin inicial del metilo terminal del sustrato
produciendo un alcohol primario: el 1-alcanol. Posteriormente, el alcohol primario es
oxidado hasta la obtencin del cido graso correspondiente y metabolizado siguiendo la
-oxidacin (Whyte y col. 2002).
Puede ocurrir tambin que los microorganismos degraden los hidrocarburos mediante
una oxidacin del grupo metilo subterminal para producir un alcohol secundario en vez
del alcohol primario producido por la oxidacin del grupo metilo terminal. Esta oxidacin
es realizada por lo general por aquellas cepas que co-oxidan los alcanos durante su
crecimiento sobre otros sustratos por co-metabolismo.

Fig. 1. Ruta de degradacin de los alcanos

La biodisponibilidad de los hidrocarburos es esencial para su descomposicin. La adicin

de agentes de superficie (surfactantes o emulsificantes) permite mejorar esta
disponibilidad (Harris, 1997). Los surfactantes actan logrando incrementar la
biodisponibilidad mediante la accin paralela de la desorcin y solubilizacin del
contaminante (Jimnez y col. 2010; Singh y col. 2007; Helmy y col. 2009). Sin embargo
la toxicidad e inhibicin puede reducir el potencial de las aplicaciones en la
biorremediacin (Makkar y Rockne 2003). Durante la biodegradacin ocurren dos
eventos principales: el consumo del sustrato y el crecimiento microbiano, los cuales estn
estrechamente relacionados (Helmy y col. 2009). La respuesta de los microorganismos
degradadores de hidrocarburos a un agente surfactante depender de una serie de
factores tales como la ultraestructura celular, la capacidad de biodegradacin o flujo de
salida, concentracin del surfactante y la biodisponibilidad (Perez y col. 2008).
El HXD es un sustrato de baja solubilidad en agua (0.0009 mg/L a 25C) que puede
presentarse en formas libres (gotas macroscpicas y soluble) y/o en formas emulsificadas
(microgotas) (Mehrnia y col. 2005), siempre y cuando se encuentre en presencia de
agentes surfactantes, con lo que aumenta su concentracin en la fase acuosa (62 mg/L)
(Quijano col. 2010) y con esto su biodisponibilidad. Una vez biodisponible, el HXD es una
fuente de carbono y energa para muchos microorganismos tanto en cultivos puros (Pepi
col. 2005) como en cultivos mixtos como los consorcios microbianos (Medina-Moreno col.
2005).
Antecedentes
La mayor cantidad de reportes de hongos aislados de crudos han sido realizados en
suelos contaminados. Radwan y col. (1995) aislaron los gneros Aspergillus y Penicillium
de muestras de suelos desrticos contaminados en Kuwait. Los gneros de mayor
frecuencia de aislamiento en hidrocarburos fueron Penicillium (18%), Aspergillus (17%) y
Fusarium (6%).
Chaineau y col. (1999), aislaron cepas de suelos agrcolas contaminados en Francia y
evaluaron su capacidad de degradar crudo (179 mg de crudo en 150 ml de medio de
cultivo) en 30 das mediante cromatografa de gases (CG), encontrando que las especies
de los gneros Aspergillus, Penicillium, Trichoderma, Acremonium, Beauveria, Fusarium,
Cladosporium y Gongronella posean dicha habilidad.
Estudios realizados con el hongo Cladosporium resinae, el cual fue aislado de un sistema
de gasolina de avin (Jet fuel), demostraron que este hongo es capaz de utilizar como
nica fuente de carbono y energa alcanos lineales de C 6 a C19, alcanos ramificados (C2
metil undecano) y alcanos cclicos (ciclohexano y ciclohexeno) (Parbery, 1971; Cofone y
col. 1973). De igual forma, los hongos Scedosporium y Graphium fueron capaces de
crecer en n-alcanos en el rango de gasolina (C5-C9) y gas natural (C1-C4) y los hongos
Fusarium oxysporum, Graphium rubrum, Graphium fruticolum, Penicillium lilacinus y
Petriella sp. de crecer en alcanos ms grandes de C 10-C16 (Lowery y col. 1968; Llanos y
Kjoller, 1976).

La degradacin de alcanos se ha demostrado para Aspergillus niger, Aspergillus

ochraceus y Penicillium chrysogenum capaces de degradar n-alcanos (C13-C18) (Elshafie
y col. 2007), Trichoderma sp. eicosanos (C19) (Hadibaratata y Tachibana, 2009).
Mancera-Lpez y col. (2008) reportaron que hongos filamentosos como Aspergillus niger
era capaz de degradar HXD en un medio slido y lquido. En un medio slido,
inmovilizado en un soporte inerte, su capacidad consumidora de HXD es mucho mayor
que en un medio lquido (Volke-Seplveda y col. 2003); adems, se ha observado que,
en un cultivo slido, es capaz de degradar hasta 717 mg HXD/l en 15 das (VolkeSeplveda y col. 2006).
Volke-Seplveda y cols. (2003) observaron que la utilizacin de HXD como HC aliftico
modelo, permiti demostrar que, en cultivo slido, es posible biodegradarlo, a
concentraciones tan elevadas como 717 mg/g de espuma de poliuretano (PUF) y que la
velocidad de biodegradacin es proporcional a la concentracin inicial de HXD. Los
valores de biodegradacin obtenidos son al menos 3 veces mayores que los obtenidos
con limitacin de N, P y K, y hasta 12 veces mayores que los encontrados en cultivo
sumergido bajo las mismas condiciones de cultivo, pero con concentraciones de HXD 3
veces menores. La velocidad de produccin de biomasa (BM) se increment (hasta 3
veces) al aumentar la concentracin inicial de HXD. El rendimiento en el crecimiento de
A. niger (YX/S) fue ligeramente mayor con 180 mg HXD/g PUF y se mantuvo
prcticamente constante con 360, 540 y 717 mg HXD/g PUF. Este resultado demuestra
que con relaciones C/N bajas se favorece la completa degradacin de HXD y que la
velocidad de degradacin aumenta en funcin de la concentracin del sustrato
hidrofbico.
Harris 1997 menciona que debido a la baja solubilidad de los hidrocarburos se necesita
la accin de surfactantes para incrementar su biodisponibilidad y su metabolizacin por
los microorganismos. Breuil y Kushner sealan que los cidos grasos C16 y C18 y los
surfactantes Triton X-100, FI-70, 75 y Brii, estimulan el crecimiento de Pseudomonas
eruginosa en HXD ya que puede mejorar su dispersin y pseudosolubilizacin en el
medio.
Li y col. (2008) estudiaron la degradacin de hidrocarburos por Mycobacterium hyalinum,
el hongo Cladosporium y por un consorcio utilizando los dos microorganismos anteriores,
determinaron que hubo una degradacin de 21% empleando de M. hyalinum y de 34%
para Cladosporium. Sin embargo, observaron una degradacin de un 99% al utilizar el
consorcio microbiano (Mycobacterium-Cladosporium). Sugieren que el hongo
Cladosporium es capaz de degradar tanto los hidrocarburos alifticos como los
aromticos en el disel.

Se ha reportado que la adicin de fuentes de carbono ms fcilmente asimilables altera

substancialmente la cintica de degradacin de contaminantes orgnicos (Scow y cols.
1989). Merkel y Perry (1977) reportan un aumento en la degradacin del malatin en
presencia de n- hexadecano. Scow y col. (1989) encontraron que la adicin de glucosa
favoreci la degradacin de 2,4-diclorofenoxiacetato y del metil-paratin mientras que la
anilina favoreci la mineralizacin de dicloroanilina.
Uzoamaka y col. 2009 identificaron y aislaron un total de 12 hongos provenientes de tres
sitios de suelos contaminados por crudo en Nigeria, de los cuales 8 mostraron potencial
para la biodegradacin de hidrocarburos. Fueron identificados Aspergillus versicolor,
Aspergillus niger, Aspergillus flavus, Syncephalastrum spp., Trichoderma spp.,
Neurospora sitophila, Rhizopus arrhizus and Mucor spp. Algunos de estos
microorganismos ya han sido reportados como biodegradadores de hidrocarburos (April
y col. 2000; Oudot y col. 1993)

Hiptesis:
Las cepas de F. oxysporum y N. sitophila crecern en una fermentacin lquida que
contenga diferentes concentraciones de HXD (500,1000 y 1500 mg de HXD/L)
utilizndolo como nica fuente de carbono.

Objetivo general
Evaluar el crecimiento de F. oxysporum y N. sitophila en una fermentacin liquida
con un medio que contenga hexadecano a concentraciones de 500, 1000 y 1500
mg de HXD/L y cuantificar la degradacin de este compuesto a travs del tiempo
de fermentacin.
Especficos:

Determinar la tasa especifica de crecimiento de F. oxysporum y N. sitophila

crecidos sobre 500, 1000 y 1500 mg de HXD/l.

Cuantificar la degradacin y los productos generados despus del

crecimiento de F. oxysporum y N. sitophila crecidos sobre 500, 1000 y 1500
mg de HXD/l en fermentacin lquida.

Determinar la concentracin de azcares reductores de los sobrenadantes

del crecimiento de F. oxysporum y N. Sitophila crecidos en medio lquido.

Monitorear el consumo de oxgeno y produccin de CO 2 a partir de la

fermentacin lquida en concentraciones de 500, 1000 y 1500 mg de HXD/L.

Metodologa
Microorganismos
Las cepas a utilizar sern F. oxysporum y N. sitophila, depositadas en el cepario del
Centro de Investigaciones en Ciencias Biolgicas (CICB) de la Universidad Autnoma de
Tlaxcala. Se reactivar el inoculo de una colonia crecida sobre agar extracto de papa
(PDA) a 20C durante 7 das.
Medios de cultivo
Se prepararan cuatro medios de cultivo enriquecidos con glucosa y extracto de levadura
(MGEL). 1) Medio de cultivo MGEL conteniendo en (g/l): glucosa, 10; extracto de
levadura, 5; KH2PO4, 0.6; MgSO4.7H2O, 0.5; K2HPO4, 0.4; CuSO4, 0.25; FeSO4.7H2O,
0.05; MnSO4.H2O, 0.05 ZnSO4.7H2O, 0.002. (Snchez y Cols. 2009), 2) MGEL + 500 mg
de HXD/l, 3) MGEL + 1000 mg de HXD/l y 4) MGEL + 1500 mg de HXD/l. El pH inicial
de crecimiento se ajustara a 7.5 con HCl 1M. Las condiciones de cultivo sern matraces
Erlenmeyer de 150 ml, conteniendo 50 ml de cada medio de cultivo a utilizar y 3 inculos
de 4 mm de dimetro tomados de la periferia de la colonia de la cepa previamente
reactivada (F. oxysporum y N. sitophila respectivamente), crecido a 25C durante 15 das
en una incubadora orbital a 120 rpm.
Evaluacin de la tasa especifica de crecimiento, biomasa y obtencin del extracto
crudo enzimtico
Los hongos van a desarrollarse en el medio antes mencionado. Posteriormente se
obtendr el extracto crudo enzimtico (ECE) que corresponde al sobrenadante de los
cultivos cada 12h para la cepa de N. sitophila y cada 24 h para la cepa de F. oxysporum
por filtracin, seguido de la retencin de la biomasa a travs de papel filtro Whatman No.
4. Con tres replicas, una vez que se encuentre retenida la biomasa sobre el papel
Whatman se secar hasta obtener un peso constante y as poder realizar la cuantificacin
por diferencia de peso seco (AOAC 1990).
El progreso de la biomasa en funcin del tiempo X = X (t) se ajustar mediante la ecuacin
logstica de Velhurst-Pearl:
dX / dt = (1-X / Xmax) X
La solucin a la ecuacin ser la siguiente:
X = Xmax / (1 + C*e-*t)
Donde:
= Mxima velocidad especfica de crecimiento (h-1)
Xmax = Valor de la biomasa mxima o de equilibrio (g/L) cuando dX / dt = 0 para X > 0.
t = Tiempo transcurrido en la fermentacin (h)

X0 = Valor de la biomasa inicial (g/L)

C = Valor que representa la relacin entre la diferencia de X max y X0 (g/L):
C = (Xmax X0) / X0
Los parmetros cinticos de evaluaran utilizando el programa Solver de Microsoft Excel
(Viniegra-Gonzlez y cols. 2003).
Determinacin de azcares reductores
Se determinara la concentracin de azcares reductores en el EE mediante el mtodo de
DNS (acido 3,5 dinitrosaliclico) (Miller, 1959). A 50 NL de EE se le adicionaran 2 ml de
DNS y 950 nL de agua destilada. La mezcla de reaccin se llevara a ebullicin en bao
mara durante 5 min. Posteriormente, se detendr la reaccin cambiando el agua caliente
por agua fra. Se leer la absorbencia a 575 nm. Para finalizar se realizar una curva de
calibracin con concentraciones conocidas de glucosa.

Determinacin de la degradacin de hexadecano e identificacin de los productos

generados despus del crecimiento de los hongos.
Para la determinacin de la concentracin residual de HXD en el medio de cultivo y para
cada tiempo se llevara a cabo una extraccin lquido-lquido (1:1 v/v) con una mezcla
hexano acetona (1:1 v/v), (Velasco-lvarez 2011). La fase orgnica se analizara por
cromatografa de gases previa correlacin con una curva estndar, utilizando un
cromatgrafo Modelo 3900, Varian, USA empleando un detector FID a 300 C, columna
DB-Petronarrow bore, J & W Scientific de 30 m x 0.25 mm y helio como gas acarreador.
Consumo de O2 y produccin de CO2
La produccin de CO2 y consumo de O2 se cuantificara por respirometra.

Anlisis estadstico
El anlisis se llevara a cabo aplicando un Anlisis de varianza (ANOVA) utilizando el
programa Graph pad Prism version 6.0

Resultados preliminares
Para este trabajo se comenz por realizar una prueba piloto, en la cual se pretenda
comprobar que la cepa de F. oxysporum utilizara HXD como fuente nica de carbono y
energa, esto durante 15 das de fermentacin y bajo dos diferentes concentraciones de
HXD.
Para esto se prepar un medio lquido que contiene (g/L) sales minerales; KH2PO4, 0.6;
MgSO4.7H2O, 0.5; K2HPO4, 0.4; CuSO4, 0.25; FeSO4.7H2O, 0.05; MnSO4.H2O, 0.05
ZnSO4.7H2O, 0.002; y una relacin C/N del 5 donde la fuente de carbono es HXD y la
fuente de N es (NH4)2 SO4. No se utiliz otra fuente de carbono como la glucosa.
Las condiciones de cultivo fueron en matraces Erlenmeyer de 150 ml adicionando 50 ml
de medio lquido y tres inculos de 4 mm obtenidos de la periferia de la colonia de F.
oxysporum previamente crecidas en cajas Petri con agar PDA. Para la concentracin de
1500 mg/L de HXD se agreg 75 L de HXD utilizando 1.2 g/L de (NH4)2 SO4 como fuente
de N y para la concentracin de 500 mg/L de HXD se agreg 25 L de HXD y 0.4 g/L de
(NH4)2 SO4, ajustando el pH a 7.5 con HCL 1M. Como surfactante se utiliz Tween 80 al
0.04% (400 L/L). Por ltimo la fermentacin se realiz a travs de 15 das por duplicado
en una incubadora orbital a 120 rpm a 26C.
Los parmetros a evaluar en esta prueba fueron:

La tasa especfica de crecimiento, que es el incremento de la poblacin a lo largo

del tiempo obtenido a travs de la produccin de biomasa por el mtodo del peso
seco constante. El progreso de la biomasa en funcin del tiempo se ajustar
mediante la ecuacin logstica de Velhurst-Pearl.
Se cuantificara el perfil de pH a travs del tiempo de fermentacin cada 24 h
utilizando un potencimetro.

Resultados
Para la concentracin de 1500 mg de HXD/L se obtuvieron los siguientes datos de
biomasa producida respecto al tiempo. Estos datos al ser muy bajos no pueden ajustarse
a la ecuacin de la lnea recta ya que arroja valores negativos el Ln de la fase
exponencial, y por lo tanto no podr ajustarse a la ecuacin logstica.
Tiempo
0
24
48
72
96
120
144

X experimental g/L
0
0.0328
0.0586
0.0618
0.0568
0.0642
0.0749

168
192
216
240
264
288
312
336

0.0962
0.1281
0.1012
0.1123
0.0938
0.0765
0.0922
0.0775

Esto puede deberse a que el microorganismo necesita de otra fuente de carbono ms

asimilable para poderse adaptarse al medio y posteriormente utilizar al HXD como fuente
de carbono, ya que se ha reportado que la adicin de fuentes de carbono ms fcilmente
asimilables altera substancialmente la cintica de degradacin de contaminantes
orgnicos (Scow y cols. 1989).
Otro indicador de crecimiento fue el pH que se modific al paso de la fermentacin
acidificando el medio de cultivo.

0
24
48
72
96

pH
promedio
7.5
6.885
6.79
6.725
6.675

120
144
168
192
216
240
264
288
312
336

6.575
6.495
6.415
6.45
6.44
6.45
6.345
6.425
6.265
6.42

7.6
7.4
7.2
7

pH

Tiempo

6.8
6.6
6.4
6.2
0

50

100

150

200

250

300

350

Tiempo (h)

Perfil de pH a travs del tiempo de fermentacin.

La oxidacin de los hidrocarburos produce cidos grasos que son utilizados por los
microorganismos o liberadas en el medio. Si este es el caso, el pH del medio disminuye.

400

Lo mismo sucedi para el medio con 500 mg de HXD/L

tiempo

X experimental g/l

0
24
48
72
96
120
144
168
192
216
240
264
288
312
336

0
0.0269
0.0341
0.0413
0.0474
0.045
0.04369
0.0479
0.0436
0.0403
0.0485
0.051
0.0564
0.052
0.0421

No produjo biomasa significativa a travs del tiempo de fermentacin.

De igual forma se presentaron cambios en el pH inicial a travs del tiempo de
fermentacin.

7.6
7.4
7.2
7

pH

Perfil de pH
Tiempo pH promedio
0
7.5
24
6.865
48
6.77
72
6.78
96
6.99
120
6.52
144
6.55
168
6.66
192
6.725
216
6.62
240
6.63
264
6.635
288
6.535
312
6.47
336
6.4

6.8
6.6
6.4
6.2

-50

50

100

150

200

Tiempo (h)

250

300

350

400

Conclusin preliminar
A partir de esta prueba podemos decir que la cepa de F. oxysporum necesita de una
fuente de carbono primaria ms asimilable para adaptarse al medio y despus poder
metabolizar el HXD. El perfil de pH nos demuestra que existe un crecimiento debido a la
acidificacin del medio de cultivo en el cual al ajustar el pH inicial a 7.5 al final de la
fermentacin se determin un pH de 6.4.

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