Una actualizacin de reparacin gnica dirigida en clulas de

mamferos: mtodos y mecanismos

Resumen
La transferencia de genes de longitud completa, incluyendo elementos de regulacin ha sido la
estrategia de terapia gnica preferida para aplicaciones clnicas. Sin embargo, con inconvenientes
significativos emergente, dirigida alteracin del gen (TGA) se ha convertido recientemente en una
alternativa prometedora a este mtodo. Por medio de TGA, vas de reparacin del ADN endgeno de la
clula se activan conduciendo a la correccin gentica especfica de mutaciones de una sola base en el
genoma. Esta estrategia se puede implementar utilizando oligodesoxirribonucletidos de una sola
hebra (ssODNs), los fragmentos de ADN pequeos (sdfs), los oligonucletidos formadores de triplex
(TFOs), vectores de virus adeno-asociados (AAV) y nucleasas de dedos de zinc (ZFNs). A pesar de las
dificultades en el uso de la TGA, incluyendo la falta de conocimientos sobre los mecanismos de
reparacin estimuladas por los mtodos individuales, el campo representa una gran promesa para el
futuro. El objetivo de esta revisin es resumir y evaluar los diferentes mtodos que existen dentro de
esta rea particular de investigacin en terapia gnica humana.

Introduccin
En medio de los aos noventa, el campo de la alteracin dirigida de genes (TGA) surgi como un
posible mtodo para corregir enfermedades causadas por mutaciones de una sola
base [ 1 , 2 ].Inicialmente, el enfoque se centr en la estimulacin de los mecanismos de reparacin de
genes endgenos usando diversos oligonucletidos de una o de doble cadena. Estos son
complementarios a parte del gen diana excepto por una coincidentes base especficamente localizada
en el sitio de la mutacin endgena. Sobre la introduccin celular estas molculas interactan con la
secuencia de gen diana por diferentes mecanismos. El desajuste es entonces reconocida por
componentes de las vas de reparacin del gen, que posteriormente pueden ser estimulados para
corregir el desajuste por el uso de la molcula de direccionamiento introducido [ 3 - 6 ].
Uso de TGA, los genes mutados pueden ser dirigidos y corregidos sin interferir con el promotor
endgeno, as como elementos potenciador / silenciador y marcos de lectura [ 7 ]. Tal impacto de lo
contrario se ha visto con ciertos aspectos de la terapia gnica introducir una secuencia de gen
completo incluyendo todos sus elementos asociados[ 8 , 9 ]. Varios mtodos han sido desarrollados con
el fin de optimizar y aplicar eficazmente la estrategia TGA in vitro as como in vivo . Todos estos
mtodos constituyen diferentes estructuras de molculas de direccionamiento, las vas de integracin
y las vas de reparacin de genes estimulados, lo que resulta en tasas de xito variables[ 4 , 10 - 12].

Mamferos vas de reparacin del gen

Las clulas de mamferos utilizan una variedad de vas de reparacin genticos para asegurar la
estabilidad genmica del genoma. La comprensin de estas vas es esencial para la optimizacin
adicional de TGA[ 13 - 16 ]. Una breve introduccin a la vas incluyendo la mayora de sus factores
moleculares centrales se proporciona aqu (Figura1 ). Para revisiones detalladas, consulte[ 17 - 23 ].

Figura 1. Componentes implicados en las vas de reparacin de mamferos . A:

En reparacin de apareamientos errneos (MMR), hMutS reconoce el dao del ADN mediante el cual
hMutL es reclutado resultando en muescas en ambos lados de la falta de coincidencia. Exonucleasa I
humana (hExoI, 5 ' 3' actividad) escinde la falta de correspondencia y sus secuencias flanqueantes

despus de lo cual la ADN polimerasa (3 actividad ' 5'), junto con PCNA y RFC, re-sintetiza una nueva
hebra de ADN. B: En la reparacin por escisin de nucletidos (NER), el complejo XPC reconoce el dao
en el ADN causando el reclutamiento del complejo TFIIH, que se desenrolla el ADN a un complejo
abierto. XPA se une la cadena de ADN daado despus de lo cual endonucleasas, XPG y XPF-ERCC1,
extirpar el desajuste y la ADN polimerasa, con PCNA y RFC re-sintetiza la cadena de ADN. C: En la
reparacin homologa dirigida (IDH), el OSD est obligado por el complejo MRN CtIP reclutamiento y
hexo, el ltimo de los cuales los nucletidos especiales que rodean el descanso. Rad51 inicia bsqueda
de homologa y cuando se encuentra un donante de ADN homloga, el OSD se repara con Holliday
Junction formacin y resolucin. D: En extremos no homlogos a participar (NHEJ), el complejo Ku
reconoce el OSD que lleva a una contratacin simultnea de DNA-PK CS , XRCC4: LigIV y XLF. El
intercambio de estos factores conduce la ligacin de los extremos no homlogos. Artemis nucleasa, las
ADN polimerasas y factores proteicos y otros que pueden estar involucrados si los extremos de
ADN no son directamente compatibles. Vase el texto para ms detalles.

Desajuste de reparacin (MMR)

El sistema de reparacin de genes (MMR) corrige principalmente errores de replicacin, como AG y TC
desajustes [ 18 ]. Se ha estudiado extensamente tanto en procariotas como en clulas de mamfero,
pero para simplificar la siguiente descripcin se centrar principalmente en los homlogos de
mamferos.
El reconocimiento de los desajustes en el sistema MMR mamferos (Figura 1A ) se lleva a cabo por
heterodmeros de MSH (MutS homlogo) protenas[ 24 ]. El Msh2: heterodmero MSH6 (hMutS)
reconoce la base: base desajustes y pequeos bucles de insercin / delecin, mientras que el MSH2:
heterodmero Msh3 (hMutS) reconoce 2-10 de insercin de nucletidos / bucles de
delecin[ 25 ].reconocimiento desajuste mediada hMutS se ha estudiado minuciosamente con menos
nfasis puesto en el mecanismo conducido por hMutS. Sin embargo, existen varias similitudes entre
las vas[ 24 ]. hMutS reconoce la base no coinciden y se une a la cadena de ADN daado, por la
presente reclutar hMutL (hMLH1: hPMS2 heterodmero)[ 19 , 24 ]. Con el intercambio de ADP por ATP,
los portaobjetos complejos hMutS a lo largo de la cadena de ADN causando mellas inducidas por
hPMS2 a cada lado de la falta de correspondencia[ 17 , 19 ]. Esto permite la entrada de la exonucleasa,
hExoI, en el extremo 3 'de la hebra daada, donde se elimina ~ 150 bases, incluyendo la falta de
correspondencia, despus de lo cual la protena de replicacin A (RPA) es reclutado para proteger el
ssDNA recin expuesta[ 17 ]. ADN polimerasa une en asociacin con su antgeno nuclear de clulas
proliferantes factor de procesividad (PCNA) que se carga en el ADN procesada por el factor de
replicacin C (RFC)[ 24 , 25 ]. Una nueva cadena de ADN es posteriormente re-sintetizado despus de
lo cual la ADN ligasa que une los extremos[ 17 , 19 ].

Reparacin por escisin de nucletidos (NER)

La va de reparacin por escisin de nucletidos (NER) (Figura 1B ) corrige principalmente aductos
voluminosos y dmeros de pirimidina causadas por ejemplo, la luz UV[ 26 ]. Dao reconocimiento se
lleva a cabo por el complejo que consta de XPC XPC, HR23B y Centrin-2, que se une a la hebra nodaado[ 20 ]. El TFIIH-complejo, que es un heterodmero de 2 helicasas diferentes XPD (5 ' 3'
actividad) y XPB (3 actividad ' 5') unido a una ciclina-quinasa activada (CAK) compleja, es reclutado y
desenrolla la doble -cables ADN que rodea la mutacin[ 20 , 27 , 28 ]. Un XPA-complejo se une a la
cadena de ADN daado seguido por la llegada de un complejo de incisin, que consiste en la XPG
endonucleasas y XPF-ERCC1[ 20 ]. Esto hace que la escisin de 25-30 nucletidos, incluyendo el ADN

daado, despus de lo cual la ADN polimerasa (incluyendo PCNA) o re-sintetizar la cadena de ADN
polimerasa de ADN . Con el tiempo, la ADN ligasa III re-une los extremos[ 20 ].
La va de reconocimiento que implica el XPC-complejo se denomina reparacin global del genoma
(GGR) y corrige los desajustes en todo el genoma [ 27 ]. Una reparacin de trascripcin acoplada (TCR),
que especialmente reparaciones transcriben activamente genes, tambin existe. El reconocimiento de
los daos de esta va implica el estancamiento de la ARN polimerasa seguida de reclutamiento de
molculas de sealizacin como grupo sndrome de Cockayne A (CSA) y el sndrome de Cockayne
grupo B (CSB), protenas[ 28 ]. Adems de las funciones de TCR etapa de reconocimiento como la va
GGR[ 20 ].

Reparacin por escisin de base (BER)

Reparacin por escisin de base (BER) corrige los desajustes en el ADN causado por alquilacin,
desaminacin o dao oxidativo [ 29 ]. Recientemente, se demostr que esta va puede estar implicada
en una de las tcnicas de reparacin de genes (vase oligodesoxirribonucletidos de hebra sencilla) se
describe en esta revisin [ 30 ]. La falta de coincidencia de ADN es reconocida por ADN glycosylases
que voltean la base daada de la hlice del ADN y partir por ella, creando un / sitio apyrimidinic
apurinic (sitio AP)[ 29 ]. La hebra de ADN es posteriormente escindido por una endonucleasa AP y un
AP liasa la creacin de un vaco que se llena por ADN polimerasa y se lig mediante ADN ligasa
III[ 29 ]. Un camino largo parche de REC tambin existe donde PCNA, ADN polimerasa y ADN ligasa
que se encuentran entre las protenas implicadas[ 29 ].

La homologa-Dirigida Reparacin (HDR) y End-Participar no homlogos

(NHEJ)
Homologa de reparacin dirigida (HDR) y no homloga extremo de unin (NHEJ) se utilizan de forma
redundante para corregir roturas de la doble hebra (DSB) en el genoma. Dado que estos descansos son
algunos de los daos al ADN ms peligrosas que ocurren, estos mecanismos de reparacin juegan un
papel importante en el mantenimiento de la integridad del genoma.
Reparaciones de HDR DSBs por la accin de la recombinacin homloga (HR) entre secuencias
homlogas utilizando por ejemplo una cromtida hermana como molde (Figura 1C )[ 23 ]. Despus de
la unin del complejo Mre11-Rad50-Nbs1 (MRN), la unin de CtIP es seguido por la exonucleasa I
humana, hExoI, que recorta las hebras de una manera 5'-3'-dirigida. Protena de replicacin A (RPA) es
reclutado despus de proteger el ssDNA expuesto, antes de Rad51 inicia una bsqueda de
homologa. Cuando una secuencia homloga se ha detectado, HR se produce a travs de la formacin
y resolucin de una unin Holliday[ 23 ].
NHEJ es el predominante de mamferos va de reparacin de DSB-de los dos, que ocurren en una
proporcin de aproximadamente 1,000: 1 [ 31 ]. Sin embargo, NHEJ re-ligantes de ADN termina sin el
empleo de homologa, causando de este modo que sea muy propenso a errores[ 32 ]. El factor de
reconocimiento de dao de la va NHEJ es el complejo de protena heterodimrica Ku que consta de las
dos subunidades, Ku70 y Ku86 (Figura1D )[ 33 ]. Ku se une al ADN inducido ruptura termina
conduciendo a la independencia, pero simultnea, la contratacin de DNA-PKcs, XRCC4: LigIV y
XLF[21 ]. Estos ltimos factores son constantemente intercambiados con protenas no unidas, por la
presente conducir la reaccin NHEJ donde los extremos de ADN recin expuestas se ligan de nuevo
juntos[ 21 ]. Si los dos extremos de ADN no son directamente compatibles para la ligacin varios otros
factores proteicos, como por ejemplo Artemis nucleasa, facilita la reaccin de unin de extremos[ 22 ].
An no se sabe cmo se toma la decisin sobre el uso de celular NHEJ o HDR. HDR parece ocurrir slo
en las clulas que se encuentran en la S / G 2 fase del ciclo celular, mientras que NHEJ no parece estar
restringida fase-, aunque la reparacin de todos los daos que ocurren en el G 1 fase[ 21 , 34 ].En
cualquier caso, el 5 ' 3' reseccin del ADN expuesta extremos parecen jugar un papel fundamental en
la decisin entre las dos vas[ 34 ]. Blunt extremos del ADN se corrigen preferiblemente por NHEJ,
mientras que los extremos de ADN corregida por lo general HDR se recortan por hExoI[ 23 , 34 ]. Por

otra parte, la fosforilacin del factor HDR-involucrados CtIP parece comprometer la reparacin de la va
de HDR, pero si existen factores decisivos adicionales todava se discute[ 23 ].

Alteracin de genes dirigidos

Como se mencion anteriormente, varias tcnicas diferentes se pueden utilizar para alterar los genes
de mamferos a travs de la activacin de vas de reparacin del gen. En general, se pueden dividir en
cinco categoras, las cuales se discutirn a continuacin. Una visin general de las correlaciones entre
las vas de reparacin del gen y las tcnicas TGA se ilustra en la Figura2 y un resumen de las
caractersticas importantes de los mtodos TGA se suministra en la tabla1 .

Figura 2. Actualmente conexiones conocidas entre TGA-tcnicas y vas de

reparacin de mamferos . Nucleasas Zinc dedo (ZFNs, lneas azules) a travs de la funcin de
reparacin de homologa-dirigido con la posible participacin de reparacin de genes y vas de
reparacin por escisin de nucletidos.Oligodesoxiribonucletidos de cadena simple (ssODNs, lneas
rojas) se cree que funcionan a travs de la va de reparacin por escisin de nucletidos con la
reparacin por escisin de base potencialmente tambin juega un papel. Funcin de oligonucletidos
(OFT, lneas verdes) Triplex de formacin a travs de la va de reparacin por escisin de nucletidos
con la posible participacin de reparacin de genes, as como unin de extremos no homlogos. Los
virus adeno-asociados (AAV, lneas marrn) implican la reparacin de homologa dirigida y la
reparacin y la reparacin por escisin de nucletidos, potencialmente, tambin falta de
coincidencia. Fragmentos de ADN pequeos (sdfs, lnea morada) son conocidos por funcionar a travs
de pequeo fragmento de recombinacin homloga. Ver texto para ms detalles y
referencias. Totalmente lneas dibujadas se refieren a conexiones soportadas por la evidencia
experimental de varios grupos, mientras que las lneas de puntos se refieren a enlaces menos
justificadas.
Tabla 1. Caractersticas de los mtodos de TGA-que median
La reaccin en cadena de la polimerasa se levanta con frecuencia la base de ensayos involucrados en
los efectos de los mtodos de TGA-mediadores y la reaccin que revela, adems, se utiliza para la
produccin de fragmentos de ADN pequeos (SDF) [ 35 ]. Sin embargo, es una reaccin de PCR
propensa a errores e incluso el uso de enzimas de alta precisin la frecuencia de incorporacin errnea
de ADN durante una reaccin de PCR es alta (~ ,0035-0,02 / bp)[ 36 ]. Esto puede conducir a la
incertidumbre sobre si las mutaciones deseadas se introducen en el gen diana cuando se est
corrigiendo el desfase deseado. Adems, el riesgo de artefactos de la PCR causada por cebado de la
oligodesoxirribonucletido correctiva (ODN) o SDF al ADN puede conducir a falsos positivos y producir
una estimacin incorrecta de la eficiencia de correccin[ 8 , 37 ]. A principios de esta ventaja a las
crticas, especialmente de SDF y gnica mediada por ODN focalizacin [ 37 ]. Con el fin de evitar esto,
se han desarrollado recientemente protocolos novedosos. Estos incluyen el uso de cebadores de PCR
analticos situados fuera de la regin de SDF / ODN-homologa, as como la purificacin en gel de ADN
diana genmico desnaturalizado por calor[ 38 - 40 ]. Ambos mtodos contribuyen a un aumento de la
fiabilidad de los ensayos basados en PCR. Sin embargo, la falta de ensayos estandarizados, no basados
en PCR de genes de reparacin puede hacer que sea difcil comparar directamente los diferentes
mtodos[ 8 , 39 ]. Mtodos de secuenciacin de prxima generacin probablemente sern cada vez
ms utilizados para documentar las frecuencias de reparacin y la integridad del genoma.

Los oligonucletidos

Oligo-desoxirribonucletidos de una sola cadena (ssODNs) se han utilizado para la TGA. La estructura
de ssODNs es simple y comprende una secuencia de ADN de una sola hebra complementaria al sitio de
destino a excepcin de un solo nucletido no coincidente situado en el centro de la
molcula[ 3 ].Fosforotioato conjugados, as como bases de uracilo 2'-O-metilado se pueden utilizar para
crear ssODNs modificados que muestran altos niveles de estabilidad a travs de la resistencia a, por
ejemplo la actividad RNasa H endgena[ 41 , 42 ]. El mecanismo de invasin de estos oligonucletidos
todava no est claro. Sin embargo, varios resultados experimentales apuntan a la implicacin de la
replicacin del ADN en el proceso de incorporacin con las horquillas de replicacin desestabilizar la
estructura del nucleosoma genmico. Por la presente, la unin y la posterior incorporacin de la ssODN
en o cerca del tenedor de replicacin - posiblemente como "pseudo-Okazaki fragmento" en el filamento
de revestimiento - est habilitado[ 43 , 44 ]. Esta hiptesis est apoyada por la evidencia que
demuestra que la detencin del ciclo celular en la fase S se produce en las clulas tratadas con
ssODN. En estos detenidos cooperacin clulas entre las horquillas de replicacin y la ssODN,
incluyendo la bsqueda de homologa, tener tiempo suficiente para producir[12 ]. Sin embargo, la
detencin del ciclo celular se ha disputado y, si se producen, parece ser temporal[ 30 , 45 ]. En
cualquier caso, una necesidad prolongada celular para la fase S puede plantear problemas en las
aplicaciones clnicas con muchos objetivos en vivo slo se someten a niveles limitados de replicacin y
divisin[ 46 ].
Tras la invasin, se forma un heterodplex de cadena 3-entre el ssODN y el sitio diana de doble
cadena [ 3 , 41 ]. Si existe o no se ha discutido un captulo sesgo correccional y en varios casos los
ssODNs antisentido (es decir ssODNs reconocen la cadena no transcrita) ha estado dando las mayores
eficiencias de correccin[ 4 , 9 , 47 - 49 ]. Este captulo sesgo originalmente llev a la conclusin de
que la maquinaria de transcripcin y sus factores accesorios invocan un impedimento estrico en la
hebra transcrita que complica la unin de ssODNs[ 50 ]. Sin embargo, la evidencia muestra que la
hebra no transcrita puede estar sesgada, incluso cuando la orientacin de genes transcripcionalmente
silenciosos[ 9 ]. Esto significa que la maquinaria de transcripcin no es el nico responsable, en todo
caso, para el captulo sesgo visto con ssODNs y factores de transcripcin independiente deben
participar en el proceso[ 9 , 49 ]. Adems, los estudios muestran que dos mutaciones idnticas en
diferentes ubicaciones de un gen diana se repara con sesgo contraria, que indica una alta dependencia
y la secuencia diana en este caso un bajo contenido de GC en la regin de flanqueo que favorece la
correccin de la hebra no transcrita[ 51 ]. El mecanismo de reparacin especfica que subyace mediada
ssODN TGA todava se disputa. Sin embargo, un consenso general sobre la funcin de supresin de la
va MMR se ha establecido con varios grupos que informaron un aumento de la eficiencia de correccin
en las clulas deficientes MSH2, [ 12 , 14 , 47 , 52 , 53 ]. La razn de esto todava no se ha
dilucidado. Sin embargo, MSH2 se conoce para suprimir la recombinacin homeologous, es decir, HR
entre secuencias homlogas casi, potencialmente al funcionar como un anti-recombinasa - un
fenmeno conocido como rechazo de heterodplex[ 54 , 55]. Sobre la base de esto, la protena MSH2
se ha sugerido para bloquear la formacin ssODN-ADN heterodplex en las horquillas de replicacin
debido a la divergencia de secuencia aqu presentes [ 14, 54 ]. Del mismo modo, las clulas que
carecen de la endonucleasa de reparacin de apareamientos errneos PMS2 tambin mostraron un
mayor nivel de ssODN mediada por TGA[ 46 ]. Resultados recientes muestran que la introduccin
celular de ssODNs conduce a un aumento en la cantidad de DSBs genmicas[ 12 , 48 ]. Esto indica un
efecto genotxico de ssODNs pero ms notablemente que HDR podran estar involucrados en el
mecanismo de TGA, a pesar de que ssODNs son complementarias y no homlogas a sus cadenas
diana. Asimismo, la presencia de estos DSBs podra explicar la detencin del ciclo celular mencionada
observada en las clulas con la reparacin mediada por HDR que causan la detencin de la
fosforilacin de protenas de control del ciclo celular ssODN tratados[ 12 , 41 ]. Adems de la
participacin de la triple vrica y el HDR, las protenas NER, XPG y ERCC4 parecen ser necesarias para
facilitar mediada ssODN TGA, mientras que se encontraron los componentes de la va NHEJ para inhibir
el proceso de correccin[ 54 , 56 ]. El ltimo hallazgo ha sido cuestionada sin embargo, con los datos
recientes que muestran que ssODNs compiten por extremos producidos-OSD de que, de otro modo

participar en NHEJ[ 57 ]. Adems, se demostr que la nica lnea de recocido (SSA) que es una va de
reparacin correccin de DSBs que ocurren entre las secuencias repetitivas de ADN no est involucrado
en mediada por ssODN TGA, como se describe de otro modo en la levadura[ 57 , 58 ]. Recientemente,
la implicacin de otra va de reparacin del ADN, conocida como reparacin por escisin de base (BER),
tambin ha sido implicado en mediada por ssODN TGA por el uso de ssODNs modificados-metilCpG[ 30 ]. Estos oligonucletidos son capaces de unirse MBD4, un miembro de la va BER, y un gen
aumento de la eficiencia de correccin de ms de 10 veces en comparacin con ssODNs no
modificados fue visto[ 30 ]. SsODNs modificados-metil-CpG estn limitados por la necesidad de una
guanina inmediatamente 3 'de la base especfica para la reparacin[ 30 ].
Sin embargo, la capacidad de corregir las mutaciones de una sola base sin la incorporacin de grandes
piezas de ADN exgeno ha hecho ssODN mediada por TGA estudi y se emplea en clulas de
mamferos a fondo.
Oligonucletidos de ARN / ADN quimrico (RDOS) son otro tipo de oligonucletidos que han sido
investigados por TGA. En comparacin con ssODNs, la estructura RDO es ms compleja con una
estructura de horquilla que comprende una cadena de ADN, homloga a la cadena objetivo, el
emparejamiento con ARN-nucletidos que flanquea la base coincidentes[ 3 ]. La hebra de todos los
ADN de la RDO ha demostrado ser el nico jugador activo en el proceso de TGA[ 59 ]. Para evitar la
degradacin de los ARN-restos por nucleasas celulares estos nucletidos son generalmente
modificados por 2'-O-metilacin de las unidades de azcar[ 60 ]. Se cree que despus de la invasin de
destino se forma un heterodplex causando reconocimiento celular de la falta de coincidencia recin
formado y que conduce a la correccin de nucletidos usando el todo-ADN RDO-hebra como
molde[ 3 ]. RDOs rara vez se utilizan en estudios de correccin gnica hoy, debido principalmente a la
falta de reproducibilidad de las eficiencias de correccin[ 2 , 3 , 41 , 51 , 54 , 60 - 62 ].

Fragmentos de ADN pequeos

Fragmentos de ADN pequeos (sdfs), tambin conocidos como pequeos fragmentos de ADN
homlogas, se pueden utilizar para TGA. Los fragmentos comprenden usualmente 400-1000 pb y son
homlogos a su secuencia diana de ADN es capaz de modificar simultneamente hasta 4 pares de
bases secuenciales in vitro as como in vivo[ 40 , 63 ]. SDFs inducir la modificacin gentica por medio
de un mecanismo basado en la homologa conocida como fragmento pequeo de sustitucin homloga
(SFHR)[ 63 , 64 ]. Los detalles del mecanismo SFHR an se desconocen[ 64 ]. Sin embargo, se cree
homloga de emparejamiento para hacer que la secuencia diana de ADN endgeno que ser
reemplazado por el SDF exgeno despus de la introduccin de este fragmento en el ncleo de la
clula[ 63 ]. Esta sustitucin hace que una modificacin gentica de la falta de correspondencia
dirigida. Sorprendentemente, la va de reparacin HDR no parece estar directamente implicados en el
SFHR-mecanismo. Esto se basa en el hallazgo de las clulas SDF-corregido expresando p53 de tipo
salvaje, que normalmente inhibe la recombinacin homloga a travs de la unin de Rad51 y el
complejo MRN [ 64 , 65 ].
SDFs pueden ser creados ya sea como ds o molculas de ADN ss - este ltimo por el calor
desnaturalizacin de la molcula de doble hebra [ 64 ]. Estudios llevados a cabo utilizando clulas de
mamferos indican que no hay diferencia en la eficiencia de correccin entre ss- y ds-SDFs[ 63 , 64 ].Sin
embargo, un estudio llevado a cabo utilizando E. Coli indica una mayor eficiencia utilizando ss-SDFs en
comparacin con ds-SDFs[ 35 ]. Esto puede ser debido a la elusin de un proceso unpairing SDF, que
en este estudio se sugiere que el paso limitante de la velocidad del proceso de SFHR
bacteriana[ 35 ]. Al igual que varias otras tcnicas TGA, incluyendo por ejemplo, ODN y los OFT (ver
ms abajo), SDFs han demostrado eficiencias relativamente altos de correccin dentro de los genes
diana episomal in vitro, as como in vivo[ 4 , 8 ]. Reparacin de genes mediada por episomal SDF ha
sido reportado en clulas madre embrionarias de ratn y en clulas progenitoras hematopoyticas
humanas de vstago /[ 8 , 38 , 40 ]. Sin embargo, la eficiencia de correccin cromosmico obtenido
utilizando el mtodo SFHR est disminuido en comparacin con ssODNs, en contraposicin a la
eficiencia de reparacin episomal[ 8 ]. La explicacin de esta disparidad podra ser el aumento de la
movilidad experimentada por molculas ms pequeas como ssODNs en comparacin con las

molculas ms grandes, posiblemente facilitando un mayor acceso al ncleo[ 8 ]. En apoyo de esta

idea, se encontr que SDFs eran superiores a ssODNs en la correccin de un 1567G> Una mutacin en
genes episomales -galactosidasa (Figura3 ). Adems, se utiliz SDFs para corregir mutaciones en
genes -galactosidasa in vivo en hgado de ratn despus de la inyeccin hidrodinmica vena de la
cola (resultados no publicados). SDFs tambin se han empleado con xito para la reparacin
permanente ex vivo de los genes de ADN-PKcs en una lnea celular de ratn SCID[ 63 ].

Figura 3. Comparacin entre SDFs y ssODNs para la correccin de 1567G> A

mutaciones en los genes de -galactosidasa . Clulas CHO-K1 fueron co-transfectadas con el
pCH110 1567G> A plsmido y ssODNs correctores (0,25 M) o SDF (7,5 nM), utilizando 15 g de
Lipofectamine (Invitrogen)[ 51 ]. Dos das despus de la transfeccin actividad de la enzima galactosidasa se midi utilizando un sistema de -galactosidasa de la enzima de ensayo (Promega) de
acuerdo con el protocolo del fabricante. ssODNs fueron diseados para apuntar a la cadena antisentido
(AS) de la secuencia de -galactosidasa en la regin de la 1567G> Una mutacin. Se emplearon dos
longitudes diferentes: 25nt (AS-ssODN, 25nt) y 35nt (AS-ssODN, 35nt), ambos contienen una citosina
cntrico con el fin de inducir a una falta de coincidencia con el ADN diana. Un ssODN conjugado con
Cy3 (AS-ssODN, 35nt, Cy3-conjugado) se incluy para probar el efecto de la proteccin del extremo 5
'adicional. SDFs se sintetizaron usando el pCH110 659G> A plsmido como plantilla como se describi
previamente. El 480 pb SDF-molcula contena el coincidentes base de 270 pb desde el extremo 5
'. Como controles negativos pCH110 1567G> Un plsmido solo, una se utiliza no corregir SDF
(construido con la pCH110 1567G> Un plsmido como plantilla) y SDF sin plsmido transfeccin.
Con el fin de aumentar la eficiencia de correccin de SDFs, radiacin ionizante o tratamiento con Dox
(doxorrubicina), que inhibe la topoisomerasa II, se ha empleado [ 4 , 63 ]. Las DSBs inducidas por estos
tratamientos son conocidos para activar las vas de reparacin endgenos basarse en el
reconocimiento homloga[ 4 ]. Adems Dox-tratamiento, tratamiento celular con fleomicina que es un
ADN de escisin de antibitico capaz de causar S / G 2 cambios del ciclo celular, resulta en un aumento
de 5 veces en la eficiencia de correccin objetivos cromosmicas[ 4 ]. Esto indica SDF-dependencia
mediada fase del ciclo celular, as como una participacin de la replicacin del ADN en el mecanismo
de SFHR, como se inform para mediada por ssODN TGA.
Una ventaja de la modificacin gentica mediada por SDF es la reproducibilidad de los resultados y sin
artefactos de PCR que se producen con las concentraciones de SDFs utilizados para producir altas
eficiencias de correccin (0,2-10%) [ 38 , 40 ]. Sin embargo, la falta de conocimiento sobre el
mecanismo subyacente SFHR y el mtodo de produccin basado en la PCR propensa a errores limita el
uso de esta tcnica.

Oligonucletidos formadores de triplex (incl. cidos nucleicos peptdicos)

Oligonucletidos (OFT) y cidos nucleicos peptdicos (PNA) son molculas formadores de triplex de
cadena sencilla que exhiben secuencia diana complementariedad formador de triplex [ 66 , 67 ]. TFOs
son oligonucletidos cortos (10-50 pb) que constan de ARN, ADN o derivados sintticos (descrito ms
adelante), que se unen al surco mayor del ADN dplex[ 67 ]. Por la presente, las funciones de TFO
como 3 hebra en un ADN-TFO-ADN triplex[ 67 , 68 ]. La unin especfica se limita a homopurina
extensiones de la secuencia diana debido a que el triplex se basa en enlaces Hoogsteen que son
dependientes de la H-bond disponible existente en purinas[ 68 , 69 ].
Una vez unido al ADN objetivo, repulsiones electrostticas entre la TFO originarios y dplex de ADN se
cree que desencadenar una, hasta ahora, desconocida serie de vas de reparacin del

ADN [ 68 ,70 ]. La va NER se ha demostrado importante para este proceso de reparacin, con mediada
TFO TGA no se producen en XPA- o-agotadas las clulas CSB[ 70 , 71 ]. Adems XPC / Rad23B se ha
demostrado que reconocer la estructura triplex inducida por TFO mientras que XPD y XPF se cree para
escindir el ADN de hebra distorsionada seguido por re-sntesis por Pol ( de la polimerasa), que est
implicado en la sntesis de derivacin translesion[ 68 , 72 , 73 ]. NER as como MMR, adems, ha sido
implicado en TFO mediada por TGA por el uso de TFOs conjugados con el psoraleno mutgeno
fototxico. Estos TFOs modificadas inducen TFO dirigidas entrecruzamientos entre cadenas de
psoraleno (TDP-ICL), que parece ser reconocido por un complejo multimrico que consiste en
cualquiera XPA-RPA (NER) y MutS (MMR) o XPC / Rad23B (NER) solo[ 16 ]. Estos resultados han
llevado a la propuesta de la reparacin mediada por TFO travs de una va libre de errores MMRdependiente, as como una va propenso a errores NER-mediada[ 16 , 74 ]. Por otra parte, adems de
los OFT junto con un ADN de donantes-objetivo homloga causa un aumento de la eficiencia de
correccin de genes que conduzcan a sugerencias sobre la participacin de las vas de reparacin
recombinatorios as[ 75 ]. NHEJ se sugiere tomar durante la reparacin de TDP-ICL cuando factores NER
estn ausentes, mientras que la necesidad de Rad51 para la recombinacin inducida por TFO implica
HDR en mediada TFO TGA[ 68 , 71 ]. Adems, existe un cambio de mecanismo de reparacin entre el
ms largo (~ 30nt) y ms corto (~ 10nt) TFOs con las ms largas de ser reparados por NHEJ y los ms
cortos de NER[ 68 , 76 ].
Derivados sintticos de cidos nucleicos utilizados para crear TFOs modificados incluyen un puente de
metileno o etileno 2'-O, 4 '-C de la columna vertebral de TFO. Estos son conocidos como cidos
nucleicos puenteados / bloqueado (BNA / LNA) y cidos nucleicos de etileno (ENA), respectivamente, y
son capaces de aumentar la estabilidad as como la eficiencia de correccin bajo diferentes condiciones
fsicas [ 77 - 79 ]. Sin embargo, TFOs modificado LNA-an no ha sido mostrar un vivo aumento
significativo en la eficiencia de correccin en comparacin con los OFT no modificados[ 4 ].Esto,
adems de una restriccin a secuencias diana de homopurina, as como dplex de ADN de unin dbil
a un pH por encima de 6, ha hecho TFO mediada por TGA un sujeto para la
optimizacin [ 4 , 69, 77 , 78 ].
PNAs proporcionar una alternativa funcional para TFOs y son 12-18 nucletidos con un esqueleto de
ADN completamente sustituido por N no cargado (2-aminoetil) glicina poliamidas [ 80 ]. Esta
modificacin altamente aumenta la estabilidad de la molcula a travs de nucleasa y proteasa
resistencia[ 80 ]. Adems, permite la formacin de un complejo estable con el ADN diana debido a no
repulsiones electrostticas entre las molculas[ 68 ]. Esta estabilidad puede mejorarse an ms por
PNA-conjugacin de la molcula de ADN intercalador, 9-aminoacridina[ 81 ].
ANP existe como tres diferentes variantes: oligmeros de PNA, bis-PNA y PNA pseudo complementaria
(pcPNAs) [ 66 , 82 ]. Oligmeros de PNA pueden participar en cualquiera de triplexes de ADN-PNA-ADN
como TFOs o en un complejo invasin triplex PNA-ADN-PNA con la segunda hebra de ADN desplazados
como P-loop[ 83 ]. Ambos de estos complejos dependen, al menos en parte, de los bonos Hoogsteen
causando una restriccin similar a homopurina tractos como se ha visto con los OFT. Asimismo, bisPNAS (2 oligmeros de PNA conectados por un enlazador) inducen complejos de invasin triplex PNAADN-PNA[ 80 ]. Estas molculas han demostrado con xito para corregir una mutacin del sitio de
empalme -globina en clulas progenitoras hematopoyticas primarias[ 66 ].Sin embargo, la restriccin
de destino para homopurina tractos se considera que es un inconveniente principal del mtodo
triplexing. Por lo tanto, doble dplex pcPNAs forman son las principales molculas utilizadas en
mediada PNA TGA hoy.
En pcPNAs, A y T nucleobases de la columna vertebral han sido reemplazados con pseudocomplementaria 2,6-diaminopurina (D) y 2-tiouracilo (U s bases), respectivamente[ 84 ]. Esta
incorporacin inhibe estricamente la formacin de otro modo estable PNA-PNA dplex y resulta en un
complejo invasin dplex doble con el ADN dirigido[ 69 ]. Este tipo de invasin depende nicamente de
Watson-Crick pcPNAs eximen de la restriccin de destino homopurina[ 67 ]. Uso de N (aminoetil)entidades -D lisina pcPNA la columna vertebral puede ser cargado positivamente que resulta en la
invasin complejos ADN dplex estables debido a la atraccin electrosttica entre pcPNA y el
objetivo[ 84 ]. La polaridad inducida permite, adems, la invasin de ricos secuencias diana GC, que de
otro modo se ha complicado por la falta de nucleobases GC pseudo complementaria [ 84 ]. La

modificacin ha dado lugar a frecuencias de correccin episomales de 0,65%[ 69 ]. Sin embargo, an

se requiere la secuencia diana para contener 50% de AT con el fin de evitar la formacin de dplex
PNA-PNA[ 67 ]. La histona deacetilasa (HDAC) de tratamiento inhibidor de sincronizacin siguiente fase
S ha llevado adems a cromosmicas eficiencias de correccin de 0,78%, indicando un papel para la
replicacin del ADN en el mecanismo de pcPNA mediada por TGA[ 69 ]. Las incertidumbres sobre el
mecanismo de reparacin mediada por TFO se aplican para la tecnologa basada en PNA, as, con el
mecanismo empleado por estas tcnicas se cree que son similares, si no idnticos[ 69 ]. Dado que este
mecanismo an no se ha dilucidado el uso de pcPNAs para TGA todava no est plenamente explotado.

Vectores de virus adeno-asociado

Alteracin de genes dirigidos usando vectores basados en virus adeno-asociado (AAV) se ha estudiado
durante ms de una dcada. AAV son virus icosadricos que consisten en un 4,7 kb genoma sentante
de una sola hebra de codificacin y cap-genes importantes para la replicacin viral y la formacin de la
cpsida, respectivamente[ 85 ]. Estos genes estn flanqueados por dos repeticiones terminales
invertidas (ITR, 145nt cada uno), que son cis-actuando elementos necesarios para la transduccin viral
y la funcionalidad en la TGA. Las ITR son los nicos elementos virales originales presentes en vectores
AAV recombinantes (rAAV), donde tantes y cap-genes han sido sustituidos por el ADN especfico de la
diana homloga antes de la introduccin celular[ 4 ]. Para la produccin de los vectores virales los
presentantes y cap-genes se proporcionan en trans.
Despus de la entrada del vector en la clula, se cree que el ADN homloga especfica de la diana para
activar y reclutar factores de reparacin de recursos humanos dependientes, tales como miembros del
complejo MRN as como Rad51 y Rad54 [ 86 ]. Sin embargo, como se describi anteriormente, de
mamfero NHEJ es predominante en comparacin con HDR razn por la cual la recombinacin
homloga es bastante socavada[ 31 ]. Esto es un obstculo que hay que superar desde la direccin de
genes slo se ve cuando el donante de ADN est inscrito en la va HDR. Por esta razn, varios grupos
han estudiado transitoria knock-down de uno o ms factores de protenas conocidos por estar
involucrados en la va NHEJ y esto con xito. Mediante la creacin de heterodimricas Ku70 +/- clulas y
el uso de Ku70siRNA, ha sido posible aumentar la frecuencia de genes objetivo en un locus
cromosmico casi 9 veces[ 31 ]. Del mismo modo, el agotamiento transitoria de Ku70 y XRCC4, siendo
esta ltima parte del complejo responsable XRCC4-LigIV para la ligacin mediada por NHEJ, crea un
aumento de 11 veces en la reparacin mediada por HDR[ 32 ].Sin embargo, una importante restriccin
para el uso de vectores de AAV para TGA es la alta proporcin de integraciones aleatorias (RI) a
eventos de HDR dirigidos visto en clulas de mamfero[5 , 87 , 88 ]. El transitorio knock-down de Ku70
no parece afectar a la frecuencia de RI y con NHEJ cree que es la causa de la RI, estos resultados
indican la existencia de una va NHEJ-Ku70-independiente[ 31 ]. Una va alternativa NHEJ-(A-NHEJ) de
hecho se ha informado, el funcionamiento en los cnceres linfoides y ser independiente de Ku70 y
XRCC4, as como otros factores relacionados con el NHEJ importantes[ 89 ]. Sin embargo, el
agotamiento simultneo de Ku70 y XRCC4 caus una disminucin de RI, lo que sugiere que XRCC4
puede simplemente ser ms fundamental que Ku70 en NHEJ dirigido-IR[ 32 ].
Como se ve con SDFs [ 63 ], la introduccin de las DSB, as como SSBs siguientes el proceso de
transduccin ha demostrado un aumento significativo en los niveles de eficiencia que alcanzan
correccin mediada por AAV tan alta como 65%[ 88 ]. Este aumento apoya la participacin de HDR y
NHEJ en la correccin gentica inducida AAV-. Adems, la dependencia de la fase S parece importante
con el S / G 2 drogas -arresting fleomicina que conduce a un aumento de 10 veces en la eficiencia de
correccin cromosmico de AAV[ 4 ]. Una correlacin directa entre el nmero de copias de genes AAV
intracelulares y frecuencia de focalizacin se ha confirmado[ 11 ]. Una ventaja de TGA basado AAV-es
el xito con el que mesenquimales, hematopoyticas y las clulas madre embrionarias, as como
clulas madre pluripotentes inducidas han sido objeto genticamente - con eficiencias de correccin
que van desde 0,07 hasta 1%[ 90 - 93 ]. Sin embargo, a pesar de la mayora de los grupos slo
alcanzan eficiencias de clulas madre alrededor de 0,01-0,1%, el uso potencial de esta tcnica para
modificar las clulas madre es revolucionario[ 5 , 11 , 91 ]. Sobre la base de alta fidelidad direccin de

genes, la falta de patogenicidad y eficiente en la entrega vivo, mediada por AAV TGA muestra una gran
promesa para el futuro.

Nucleasas de dedos de zinc

Nucleasas de dedos de zinc (ZFNs) se pueden utilizar para altamente eficiente TGA en episomal de
mamfero, as como loci cromosmicos [ 13 , 94 , 95 ]. ZFNs son creados por la fusin de 3-4 dominios
de dedos de zinc (ZFS), dispuestos en un veces coordinados por Zn 2 + , con el dominio no
especfica-ADN escisin del tipo IIS enzima de restriccin, FokI [ 6 , 96 , 97 ]. Especificidad de diana se
determina por el extremo amino-terminal de las ZF involucrados, y con la reingeniera de estos
dominios, composicin de aminocidos puede ser modificado para inducir la unin altamente
especfica ZFN-objetivo[ 98 ]. La caracterstica central de esta tcnica es inducir DSBs en la diana de
ADN que se realiza por la dimerizacin de los dominios nucleasa FokI[ 99 , 100 ]. Por lo tanto, ZFNs se
producen en pares con la dimerizacin de dominios que FokI en secuencias diana
palindrmicas[10 , 99 ]. Los ZFNs estn diseados para obligar a la secuencia diana en direcciones
opuestas reconocer un total de 18-24 pb[ 101 ]. Esta especificidad asegura que slo la secuencia de
ADN especfica estar obligado teniendo en cuenta el tamao del genoma de
mamferos[ 102 ]. Mediante el suministro de la pareja ZFN a las clulas, la alteracin gentica se
obtiene por un FokI-facilitado OSD, que lo ms probable es reparado por la va NHEJ resultando en un
dao permanente en el gen infligido[ 103 ]. Por el contrario, si un donante de ADN se suministra
simultneamente a las clulas ZFN orientada correccin gentica de la secuencia diana, a travs de la
activacin de HDR, se consigue con HR del ADN diana y el donante[ 13 ].
El uso de ZFNs para la correccin gentica ha demostrado ser muy hbil con somticas eficiencias de
correccin gnica de ~ 18-30% se reproduce repetidamente y con embriones humanos, as como
clulas madre hematopoyticas est dirigido con xito [ 6 , 13 , 95 , 104 ]. Sorprendentemente, la
correccin gentica de CD34 humanos + clulas progenitoras hematopoyticas han sido expuestos en
las eficiencias relativamente bajas (0,11%) en comparacin con las clulas madre[ 13 ]. Esta
divergencia puede ser causada por un crecimiento pobre como clulas individuales, una capacidad
necesarios para la seleccin especializada[ 95 ]. Adems, la falta de una nica construccin que
alberga el par ZFN as como el ADN donante puede contribuir a las eficiencias de correccin bajas
debido a las complicaciones relativas a mltiples transduccin de clulas
progenitoras[ 13 , 105 ].Resultados recientes muestran, sin embargo, que una relacin ptima entre el
ADN del donante y ZFNs es crucial para la eficiencia de correccin de genes en fibroblastos primarios y
de adultos, as como las clulas ES murinas y astrocitos primarios[ 106 ]. Un ADN del donante: ZFN
relacin de por lo menos 10: 1 se muestra necesaria para la correccin ptima, lo que indica la
importancia de constructos separados que albergan el par ZFN y el ADN donante[ 106 ]. Con la
induccin de una DSB cerca del sitio de la mutacin, las mayores eficiencias correccionales ZFN
mediada se alcanzan - como se ha visto con SDFs y AAV[ 63 , 88 , 107 ]. En los casos en que el diseo
de un ZFN de unin en la proximidad de la mutacin genmica es imposible, la correccin gentica
puede ser estimulada lejanamente[ 102 ]. ZFNs inductores de HR a una distancia de 400 pb ha sido
empleado con xito - sin embargo, a una disminucin de la frecuencia de recombinacin[ 102 ].
Resultados prometedores se han obtenido utilizando un vector lentiviral-integrasa defectuosa (IDLV)
mtodo de entrega para ZFNs con eficiencias de correccin somticas que llegan a 29% [ 13 ]. Sin
embargo, estos resultados fueron cuestionados debido a la falta de anlisis de transferencia de
Southern eliminar el potencial de IR del ADN donante, as como documentar el proceso HR
real [ 95 ,108 , 109 ]. Integracin aleatoria de IDLVs en el genoma humano del mismo modo que se ha
detectado, lo que plantea un grave riesgo de modificacin gentica no
intencionada[ 13 , 110 ].Asimismo, el grado de genotoxicidad mediada por ZFN sigue sin resolverse. A
la fosforilacin de la protena de mamfero daos sensor H2AX en clulas corregidas-ZFN en
comparacin con las clulas tratadas con ssODN indica un nivel tolerable o la falta completa de
disminucin de ZFN inducida por dao genmico[ 12 ]. Estos resultados son an ms emocionante
debido a la evidencia de no misintegration del plsmido de ADN de donantes, as como no hay
reordenamientos cromosmicos brutos tras la correccin gentica mediada ZFN[ 6 ]. Sin embargo, esta

conclusin podra ser impugnada por los informes de altas frecuencias de las divisiones fuera de
objetivo por el par ZFN, muy probablemente causado por homodimerizacin de los dominios
individuales ZFN-FokI[ 99 , 102]. El problema puede ser resuelto mediante la adicin de cargas
positivas o negativas para el individuo ZFN durante la construccin de estos, causando repulsin
electrosttica entre ZFNs idnticos[ 10 , 96 , 99 ]. Los experimentos realizados con este tipo de ZFNs
cargadas muestra una reduccin de 40 veces en las divisiones fuera de objetivo, mientras que la
detencin de las clulas diana en el G 2 fase / M aument la HR: cociente RI casi 6 veces[ 99 , 111 ]. El
acortamiento de las vidas medias de las molculas ZFN mediante la adicin de una arginina N-terminal
como resultado una reduccin genotoxicidad sin disminuir la eficiencia de la focalizacin[ 112 ]. Otros
factores que afectan genotoxicidad ZFN mediada son el nmero de ZF utilizados con 4 ser menos
txico que 3, y la longitud del enlazador pptido ZF-FokI con 4 aminocidos ser superior a
6[ 102 , 113 ].
La construccin de las molculas complejas ZFN ha planteado anteriormente un gran inconveniente
para el uso de stos para la modificacin gentica [ 114 ]. Originalmente, los ZFNs se construyeron
mediante el uso de un mtodo de montaje modular que abarca la fusin de ZF individuales con las
especificidades de unin a ADN establecidos [ 115 ]. A pesar de la relativa facilidad con que esto se
realiza, la eficiencia de la creacin de un par ZFN funcional es extremadamente baja (<6%)
[ 114 ,115 ]. Sin embargo, con la construccin de la plataforma OPEN pblicamente disponibles
(oligomerizadas piscina Ingeniera) el diseo de ZFNs se ha convertido en ms fcil y ms
seguro[114 , 115 ]. Actualmente, el desarrollo de la tcnica basada en ZFN est influenciada por las
patentes extensa que complica la progresin de la tcnica[ 94 ]. Pero con iniciativas como el Consorcio
de dedo de zinc proporcionar acceso pblico a la informacin relativa a la construccin ZFN as como
vencimiento de patentes predominantes, esta rea est en constante desarrollo[ 114 ].

Conclusin
La capacidad de corregir las mutaciones genmicas y reparacin de defectos celulares ha sido el centro
de una amplia investigacin durante varias dcadas. Estudios exitosos se han hecho con la
transferencia de genes de longitud completa, sino un problema constante emergente se refiere a los
elementos reguladores del gen de inters. Sin embargo, este problema se ha eludido con el
surgimiento de alteracin gnica dirigida, que se basa en la estimulacin de los mecanismos
endgenos de reparacin celular, es decir, sin interferir con los elementos de regulacin de ningn
tipo. Targeted funciones de alteracin de genes a travs de la adicin de una variedad de
oligonucletidos, incluyendo oligonucletidos de cadena sencilla, fragmentos pequeos de ADN, cidos
nucleicos peptdicos pseudo-complementaria, vectores de virus adeno-asociados y nucleasas de dedos
de zinc. Las antiguas tcnicas se basan en oligonucletidos complementarias de diana construidas por
el uso de cidos nucleicos estandarizados o sintticos. Ellos han recibido atencin principalmente
debido a la facilidad y el bajo costo con los que se sintetizan, as como la estabilidad de las
molculas. Sin embargo, la eficiencia de correccin de genes han sido generalmente bajo en las clulas
somticas (0,1-20%) y extremadamente bajo en diversas clulas madre (~ 0,1%). Por otra parte, la
falta de conocimientos sobre los diferentes mecanismos de reparacin gentica estimuladas por uno de
estos mtodos complica la optimizacin de las tcnicas. Por el contrario, estas ltimas tcnicas se
basan en el objetivo homologa y estimulan la eficiencia de reparacin gentica por la activacin del
mecanismo de reparacin basado en homologa, HDR. Sin embargo, la tendencia al error NHEJ es un
efecto secundario no deseado de esta estimulacin razn por la cual enfoque ha sido puesto en el
celular cierre de esta va con el fin de dominar para HDR. Esto ha demostrado ser exitoso y AAV y ZFNs
obtener eficiencias de correccin de genes de hasta 65% en las clulas somticas y el 5% en las
clulas madre y progenitoras. A pesar de su dificultad de sntesis y problemas potenciales de seguridad
con respecto a la patogenicidad viral estas tcnicas parecen muy prometedores para futuros estudios
sobre la alteracin del gen diana.
En este artculo, hemos revisado los mtodos que actualmente se utilizan en la reparacin del gen
diana y los mecanismos subyacentes. Aunque la terapia gentica clnica ha experimentado grandes
progresos en las ltimas dos dcadas, la reparacin de genes para aplicaciones clnicas se encuentra

todava en su infancia. El nivel de eficiencia de correccin de genes cromosmicos, hasta hace poco, ha
sido demasiado bajo para la traduccin clnica. La clave para mejorar la eficiencia de correccin de
genes actualmente se encuentra con un conocimiento profundo de los mecanismos de reparacin de
genes de mamferos que participan en las diferentes tcnicas de TGA. Adems, el desarrollo de
ensayos robustos para comparar las eficiencias es necesario.
Se requiere una correccin gnica eficaz en las clulas progenitoras para corregir de forma permanente
las enfermedades genticas hereditarias. La rpida evolucin de los mtodos eficaces para la
generacin de clulas madre pluripotentes y mtodos mejorados de cultivo ex vivo sin duda mejorar
nuestras posibilidades. Adems, el desarrollo de nucleasas de dedos de zinc y el uso de vectores de
virus adeno-asociados para la reparacin de genes han hecho posible para inducir la correccin gnica
eficaz tanto in vitro como in vivo. Esto sin duda ha acortado la distancia a los ensayos clnicos. Sin
embargo, siguen siendo cuestiones de seguridad relativas a la genotoxicidad ZFN mediada, fuera de
objetivo divisiones, preocupaciones virales basados en AAV e integraciones aleatorias que hay que
resolver, pero los mtodos de secuenciacin de alto rendimiento para comprobar el resultado de los
esfuerzos de reparacin ya estn disponibles. Por lo tanto, no estn en duda de que la aplicacin clnica
de tcnicas de reparacin de genes tienen un gran futuro - inicialmente para enfermedades
monognicas.

Abreviaturas
AAV: virus adeno-asociado; BNA: puente de cido nucleico; CAK: ciclina-quinasa activada; CSA:
Cockayne Sndrome grupo A; CSB: Cockayne Sndrome grupo B; ds: doble cadena; OSD: rotura de doble
cadena; ENA: cido nucleico de etileno; HDAC: histona desacetilasa; HR: recombinacin homloga; ITR:
repeticin terminal invertida; LNA: bloqueado cido nucleico; MDB4: metil-CpG protena de unin de
dominio 4; MRN: complejo Mre11-Rad50-Nbs1; PCNA: antgeno nuclear de clulas proliferantes; Pc-PNA:
cido nucleico complementaria pseudo-pptido; PNA: cido nucleico peptdico; RDO: quimrico
oligonucletido de ARN / ADN; Factor de replicacin C;: RFC RI: integraciones aleatorias; RPA: protena
de replicacin A; SDF: fragmento de ADN pequeo; ss: monocatenario; SSB: ruptura de hebra
sencilla; ssODN: oligo-desoxirribonucletido de cadena sencilla; TDP-ICL: TFO-dirigida
entrecruzamientos entre cadenas psoraleno; TFO: triple de la formacin de oligonucletidos; TFIIH:
factor de transcripcin II H; TGA: alteracin gnica dirigida;XPA / XPB / XPC / XPD / XPF / XPG:
xeroderma pigmentoso A, B, C, D, F y G, respectivamente; ZFN: nucleasa dedo de zinc.

Figura 1.

Componentes implicados en las vas de reparacin de mamferos . A: En reparacin de

apareamientos errneos (MMR), hMutS reconoce el dao del ADN mediante el cual hMutL es reclutado
resultando en muescas en ambos lados de la falta de coincidencia. Exonucleasa I humana (hExoI, 5 ' 3'
actividad) escinde la falta de correspondencia y sus secuencias flanqueantes despus de lo cual la ADN
polimerasa (3 actividad ' 5'), junto con PCNA y RFC, re-sintetiza una nueva hebra de ADN. B: En la
reparacin por escisin de nucletidos (NER), el complejo XPC reconoce el dao en el ADN causando el
reclutamiento del complejo TFIIH, que se desenrolla el ADN a un complejo abierto. XPA se une la cadena de
ADN daado despus de lo cual endonucleasas, XPG y XPF-ERCC1, extirpar el desajuste y la ADN polimerasa,
con PCNA y RFC re-sintetiza la cadena de ADN. C: En la reparacin homologa dirigida (IDH), el OSD est
obligado por el complejo MRN CtIP reclutamiento y hexo, el ltimo de los cuales los nucletidos especiales
que rodean el descanso. Rad51 inicia bsqueda de homologa y cuando se encuentra un donante de ADN
homloga, el OSD se repara con Holliday Junction formacin y resolucin. D: En extremos no homlogos a
participar (NHEJ), el complejo Ku reconoce el OSD que lleva a una contratacin simultnea de DNA-PK CS ,
XRCC4: LigIV y XLF. El intercambio de estos factores conduce la ligacin de los extremos no
homlogos. Artemis nucleasa, las ADN polimerasas y factores proteicos y otros que pueden estar
involucrados si los extremos de ADN no son directamente compatibles. Vase el texto para ms detalles.

Figura 2.

Actualmente conocido conexiones entre TGA-tcnicas y vas de reparacin de

mamferos . Nucleasas Zinc dedo (ZFNs, lneas azules) a travs de la funcin de reparacin
de homologa-dirigido con la posible participacin de reparacin de genes y vas de
reparacin por escisin de nucletidos. Oligodesoxiribonucletidos de cadena simple
(ssODNs, lneas rojas) se cree que funcionan a travs de la va de reparacin por escisin de
nucletidos con la reparacin por escisin de base potencialmente tambin juega un
papel. Funcin de oligonucletidos (OFT, lneas verdes) Triplex de formacin a travs de la va
de reparacin por escisin de nucletidos con la posible participacin de reparacin de
genes, as como unin de extremos no homlogos. Los virus adeno-asociados (AAV, lneas
marrn) implican la reparacin de homologa dirigida y la reparacin y la reparacin por
escisin de nucletidos, potencialmente, tambin falta de coincidencia. Fragmentos de ADN
pequeos (sdfs, lnea morada) son conocidos por funcionar a travs de pequeo fragmento
de recombinacin homloga. Ver texto para ms detalles y referencias. Totalmente lneas
dibujadas se refieren a conexiones soportadas por la evidencia experimental de varios
grupos, mientras que las lneas de puntos se refieren a enlaces menos justificadas.

Figura 3.

Comparacin entre SDFs y ssODNs para la correccin de 1567G> A las mutaciones

en los genes de -galactosidasa . Clulas CHO-K1 fueron co-transfectadas con el pCH110
1567G> A plsmido y ssODNs correctores (0,25 M) o SDF (7,5 nM), utilizando 15 g de
Lipofectamine (Invitrogen)[ 51 ]. Dos das despus de la transfeccin actividad de la enzima
-galactosidasa se midi utilizando un sistema de -galactosidasa de la enzima de ensayo
(Promega) de acuerdo con el protocolo del fabricante. ssODNs fueron diseados para apuntar
a la cadena antisentido (AS) de la secuencia de -galactosidasa en la regin de la 1567G>
Una mutacin. Se emplearon dos longitudes diferentes: 25nt (AS-ssODN, 25nt) y 35nt (ASssODN, 35nt), ambos contienen una citosina cntrico con el fin de inducir a una falta de
coincidencia con el ADN diana. Un ssODN conjugado con Cy3 (AS-ssODN, 35nt, Cy3conjugado) se incluy para probar el efecto de la proteccin del extremo 5 'adicional. SDFs se
sintetizaron usando el pCH110 659G> A plsmido como plantilla como se describi
previamente. El 480 pb SDF-molcula contena el coincidentes base de 270 pb desde el
extremo 5 '. Como controles negativos pCH110 1567G> Un plsmido solo, una se utiliza no
corregir SDF (construido con la pCH110 1567G> Un plsmido como plantilla) y SDF sin
plsmido transfeccin.