UFPE - Departamento de Engenharia Qumica

Disciplina Estatstica Aplicada aos Processos Qumicos

ESTUDO DE CASO - VALIDAO DE MTODO ANALTICO
Objetivo: Avaliar os resultados obtidos experimentalmente para a validao de um mtodo analtico para determinao do
hipertensivo atenolol por espectrofotometria no ultravioleta, comparando com a metodologia oficial. Em seguida, analisar
uma amostra (comprimidos de 100 mg do princpio ativo) a partir de uma soluo padro de 0,1 mg.mL-1.
1) Procedimentos para os ensaios de validao
a) Detalhamento dos procedimentos
1. Linearidade
A linearidade foi determinada por meio de medidas de absorvncia (Abs) feitas em triplicata para seis diferentes concentraes de
solues de atenolol SQR1 (n =18): 80% 2 (0,08 mg.mL-1), 90% (0,09 mg.mL-1), 100% (0,1 mg.mL-1, concentrao de referncia), 110%
(0,11 mg.mL-1), 120% (0,12 mg.mL-1) e 130% (0,13 mg.mL-1). A linearidade entre as concentraes e as medidas de absorvncia,
avaliada pelo coeficiente de correlao (r), pode ser considerada satisfatria se r 0,99 (ANVISA, 2003). Se esta exigncia for atendida,
o procedimento analtico apresenta-se vlido no intervalo de 80% a 130% de atenolol.
2.

Limite de deteco e limite de quantificao

Os limites de deteco (LD) e de quantificao (LQ) foram determinados a partir do estudo da linearidade, sendo que LD = 3 (sb/
= 10 (sb /

), onde sb o desvio padro do intercepto com o eixo Y e

) e LQ

a inclinao mdia da curva analtica (ANVISA,

2003; FREGONEZI-NERY et al., 2008; PEREIRA et al., 2007). O LQ deve ser igual ou inferior a 0,02 mg.mL -1. A equao da curva
expressa sob a forma Y = aX + b, onde Y a leitura e X a concentrao.
3. Preciso: repetibilidade e preciso intermediria
A repetibilidade do procedimento analtico foi determinada por meio da anlise de seis solues de mesma concentrao (100% = 0,1 mg.mL-1) pelo
mesmo mtodo, sob as mesmas condies de medio, mesmo procedimento, mesmo analista, mesmo instrumento e mesmo dia. J a preciso
intermediria foi avaliada no mesmo laboratrio, utilizando o mesmo equipamento, porm em dias diferentes. O coeficiente de variao (CV %)
mximo permitido de 5 % (ANVISA, 2003).
4. Exatido (Recuperao)
A exatido do mtodo foi avaliada pela anlise em triplicata de solues de atenolol SQR nas concentraes: baixa (0,05 mg.mL-1), mdia
(0,1 mg.mL-1) e alta (0,15 mg.mL-1). A Anvisa no define limites especficos para a recuperao, mas uma recuperao entre 95% a 105%
considerada satisfatria (PEDROSO, 2009; SILVA et al., 2007; DUARTE et al, 2007). A equao que determina a recuperao :

Recuperao=100

Resultado
X
=
Valor verdadeiro

5. Robustez
A robustez foi verificada utilizando-se a Anlise de Varincia (ANOVA). Assim, foram verificados os efeitos da variao do pH da
soluo, da temperatura e da marca do solvente. Os testes foram realizados em triplicata e em concentrao de 100% (0,1 mg.mL -1). Os
experimentos foram comparados entre si e com a situao padro 3 (Nominal).

2) Procedimentos para a anlise

a) Preparao da soluo padro

Dissolver 1000 mg de atenolol em 10 mL de solvente.

Transferir a soluo para um balo volumtrico de 100 mL e aferir com o solvente.

Transferir uma alquota de 1 mL (pipeta volumtrica) para outro balo volumtrico de 100 mL e aferir com o solvente.
b) Preparao da amostra

Dissolver o contedo de 10 comprimidos de 100 mg em 10 mL de solvente.

Transferir a soluo para um balo volumtrico de 100 mL e aferir com o solvente.

Transferir uma alquota de 1 mL (pipeta volumtrica) para outro balo volumtrico de 100 mL e aferir com o solvente.

Pede-se:

1 Substncia Qumica de Referncia.

2 Em relao concentrao de referncia.
3 Situao padro: anlise realizada nas condies padro, empregando o mtodo oficial.

i) Determinar linearidade, Limite de deteco e Limite de Quantificao, Preciso, Exatido e Robustez.

ii) Determinar o Nmero ideal de repeties.
iii) Determinar a concentrao da amostra, expressando o resultado em mg por comprimido e de acordo com o coeficiente de
variao (CV) correspondente s n repeties.
iv) Admitindo que a Anvisa considera fora de especificao se o teor mdio de atenolol for inferior a 90% do valor nominal
(100 mg por comprimido), dizer se a amostra analisada atende a essa especificao ou no.

2) Resultados dos experimentos

1.

Dados para clculo da Linearidade

Quadro 1. Resultados para avaliao da linearidade do mtodo.

Concentrao (mg.L-1)
1a Leitura
0,08
0,365
0,09
0,424
0,10
0,467
0,11
0,510
0,12
0,555
0,13
0,610
2.

2a Leitura
0,370
0,429
0,471
0,515
0,557
0,608

3a Leitura
0,368
0,420
0,469
0,517
0,560
0,606

Dados para clculo do Limite de deteco e limite de quantificao

O LD e o LQ so calculados a partir dos dados do Quadro 1.

3.

Dados para clculo da Preciso (repetibilidade e preciso intermediria)

Quadro 2. Resultados para avaliao da repetibilidade do mtodo.

Concentrao Referncia
(mg.mL-1)
0,1
0,1
0,1
0,1
0,1
0,1
Mdia
Desvio padro
4.

Concentrao medida (mg.mL-1)

Repetibilidade
Preciso intermediria
Repetio 1
Repetio 2
Repetio 1
Repetio 2
0,104
0,096
0,101
0,102
0,101
0,103
0,102
0,104
0,102
0,102
0,102
0,103
0,101
0,099
0,101
0,100
0,099
0,097
0,099
0,101
0,098
0,104
0,098
0,105
0,101
0,100
0,101
0,103
0,002
0,003
0,002
0,002

Dados para clculo da Exatido (Recuperao)

Quadro 3. Resultados para avaliao da exatido (Recuperao) do mtodo.

Concentrao Medida (mg.mL-1)
Concentrao Referncia (mg.mL-1)
Exp. 1
Exp. 2
Exp. 3
Mdia
0,0500
0,0507
0,0504
0,0489
0,050
0,1000
0,1021
0,1030
0,0982
0,101
0,1500
0,1495
0,1507
0,1480
0,149
5.

Recuperao (%)
100,0
101,1
99,6

Dados para clculo da Robustez

Quadro 4. Parmetros utilizados no ensaio de Robustez (ANOVA)

Parmetro
Nominal
Temperatura
22 C
pH
1,93
Marca do reagente
Vetec

Variao
25 C
1,81
Quimex

Quadro 5. Resultados para avaliao da robustez do mtodo (empregando a soluo a 0,1 mg.mL -1 com a concentrao j transformada
para mg/comprimido).
Amostras
Parmetro
Mdia (%)
1
2
3
Nominal
99,46
98,41
99,86
99,243
Temperatura
99,36
98,61
99,86
99,277
pH
99,70
99,26
99,58
99,513
Reagente
99,95
99,51
99,27
99,577

6.

Dados para avaliao da Soluo padro

(Concentrao da soluo de trabalho: 0,1 mg.mL-1)

Leitura
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Mdia
Desvio padro
7.
n
2
3
4
5
6
7
8
9
10
8.

Resultado
0,486
0,472
0,476
0,472
0,462
0,458
0,481
0,476
0,462
0,453
0,4698
0,01063

Dados para determinao do nmero ideal de repeties

n
1,414
1,732
2,000
2,236
2,450
2,646
2,828
3,000
3,162

Incerteza

CV

Dif.

12,706
4,303
3,182
2,776
2,571
2,447
2,365
2,306
2,262

0,0955
0,0264
0,0169
0,0132
0,0112
0,0098
0,0089
0,0082
0,0076

20,3
5,6
3,6
2,8
2,4
2,1
1,9
1,7
1,6

14,7
2,0
0,8
0,4
0,3
0,2
0,2
0,1

Dados para avaliao da Amostra

Leitura
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Mdia
Desvio padro

Resultado
0,423
0,413
0,418
0,413
0,404
0,399
0,423
0,418
0,404
0,395
0,417
0,005

3) Resultados:
1.

Coeficiente de correlao: 0,99918 > 0,99. Logo, o mtodo linear em toda a faixa.

2.

Limites de Deteco e de Determinao:

Exp 1
4,75
-0,010

a
b

Exp 2
4,62
0,006

Exp 3
4,74
-0,007

= 4,70

sb = 0,0087
LD = 0,0055 mg.mL-1
LQ = 3,33 LD = 0,0184 mg.mL-1 < 0,02 mg.mL-1. Logo, o LQ atende legislao.
3.

Preciso:

Repetibilidade:

Comparando os dois experimentos realizados no mesmo dia encontra-se t calc = 0,378 < 2,571 (ttabelado).

Preciso Intermediria:

Comparando os dois experimentos realizados em dias diferentes encontra-se t calc = 1,796 < 2,571 (ttabelado).
4.

Exatido/Recuperao:

A recuperao realizada com trs diferentes concentraes do analito mostrou-se muito boa:
Mdia:100,2%
Desvio padro: 0,8
Mximo:
101,1%
Mnimo:
99,6%
A legislao admite recuperao entre 95% e 105%.
5.

Robustez:

Aplicao de ANOVA no detectou nenhuma diferena significativa entre as diferentes mdias. Como consequncia, as alteraes
propositais no alteram significativamente o resultado da anlise, mesmo quando se compara com o mtodo oficial.
6.

Nmero ideal de repeties:

Como o CV mximo 5%, o nmero ideal de repeties deve ser 4 (CV = 3,6%).
7.

Concentrao da amostra:

Como o nmero ideal de repeties 4 (CV = 3,6%), foram utilizados, no clculo da concentrao da amostra, os quatro primeiros
resultados.
Mdia das quatro primeiras leituras do padro:
Concentrao do padro: Cp = 0,1 mg.mL

P=

0,4765

-1

Mdia das quatro primeiras leituras da amostra:

A=

0,41675

Concentrao da amostra: Ca = 0,41675 0,1 0,4765 = 0,0875 mg.mL-1. (

C a= A

Cp

).

Aplicando o CV ao resultado, fica: Ca = 0,0875 0,036 0,0875 = 0,0875 0,00315 = (0,088 0,003) mg.mL-1.
De acordo com o procedimento de preparao da amostra, 1 comprimido com exatos 100 mg resulta em uma soluo com 0,1 mg.mL -1.
Logo, a concentrao encontrada corresponde a um comprimido com 88 3 mg de atenolol.
Consequentemente, o produto no atende especificao legal (mn. 90 mg/comprimido).