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Apuntes - Ingeniera gentica molecular

TEMA 1: Introduccin.
Al principio de los 70 se podan detectar molculas (protenas, genes) pero no se podan capturar ni
caracterizar Nacimiento del ADN recombinante para poder detecta y aislar las molculas.
En la actualidad es imposible trabajar con el genoma entero; se han de amplificar secuencias.
Electroforesis: Tcnica para separar molculas de diferentes tamaos y cargas, tpicamente DNA
protenas. La muestra se pone en una matriz que generalmente es un gel (Ej. acrilamida para protenas;
agarosa para RNA y DNA), se somete a la accin de un campo elctrico y las molculas se separan de
acuerdo a carga y tamaos. Para molculas de DNA y RNA donde todas tienen igual carga, migran ms
rpido aquellas de menor tamao. Electroforesis nativa es aquella donde no se incorpora un agente
denaturante en el gel. Por ej. para determinar actividad enzimtica. Electroforesis denaturante es aquella
donde se incorpora un agente denaturante al gel. Ej. SDS (sodiododecil sulfato) en geles para protenas,
denaturndose las protenas y separandose las cadenas polipeptdicas de acuerdo a sus pesos
moleculares.
Nothern Blot: Tcnica que permite la identificacin de molculas especficas de RNA. Bsicamente
consiste en la separacin electrofortica de RNA, traspaso a un filtro e hibridizacin con sonda marcada.
Southern Blot: Tcnica utilizada para analizar fragmentos de DNA, los cuales son separados mediante
electroforesis, transferidos a un filtro e incubados con sonda especfica.
Dot Blot: Anlisis basado en ADN que utiliza sondas especficas del patgeno. Las sondas contienen ADN
complementario especfico para las regiones conservadas del genoma del patgeno.
Slot Blot: similares al Northern con la diferencia de que el ARN no es sometido a electroforesis sino que se
sita directamente sobre la membrana. Este tipo de anlisis requiere de un molde asociado a succin con
vaco para colocar el ARN que puede producir crculos o puntos (dot blot) o hendiduras (slot blot). Este tipo
de prueba es muy til cuando se quieren estudiar gran nmero de muestras, pero tienen la limitante de no
ofrecer informacin sobre el tamao de las bandas del ARN hibridado.
1. Operaciones bsicas en ingeniera gentica.
1. Obtencin del material de partida (futuro inserto)
Bancos de ADN genmico
Bancos de cADN
Fragmentos amplificados por PCR.
Genes sintticos.
2. Ligar el inserto (material) a un vector que es una molcula de ADN capaz de autorreplicarse y que tiene
la posibilidad de admitir, dentro de su estructura, ADN forneo.
3. Introducir el vector con el inserto dentro de clulas huspedes el vector comienza a replicarse y a
hacer copias de l mismo.
4. Identificar los clones portadores, es decir, las clulas husped que llevan el vector y el inserto (los clones
portadores se pueden capturar).
5. Expresar o modificar un gen:
Determinar la funcin bioqumica del gen.
Determinar las partes de la protena responsables de la funcin.
Mejorar la funcin bioqumica.
6. Modificar el genoma.
La ingeniera gentica naci en 1970 gracias a Cohen/Boyer que aportaron conocimientos de ciencia bsica
y clonaron genes del ARN de E. Coli.
2. Electroforesis.
Antes, para determinar fragmentos de ADN se hacan servir gradientes de sacarosa marcados
radiactivamente.

La electroforesis en gel de agarosa y archilamida permiten determinar fragmentos ms rpidamente que


en gradientes de sacarosa y el ADN no tiene que estar marcado.

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Al aplicar una corriente elctrica los diferentes fragmentos de ADN lineal migran por el gel y se paran
segn su peso molecular (ms o menos nmero de nt) en geles de agarosa (en la archilamida porque
hay una malla).
El ADN migra debido a la carga (-) derivada de sus grupos fosfatos migrando hacia el nodo (+).
Si las molculas de ADN son circulares migran segn su topologa y no segn su masa.
En el ADN circular tenemos 2 formas topolgicas diferentes:
o Crculos de ADN abiertos o nickados (OC).
o Crculos de ADN cerrados (CCC /SC) que tienen grados de superenrrollamientos formando
molculas cerradas.
ADNs de 10 - 200 pb: En los geles de agarosa no quedan suficientemente retenidos electroforesis
en gel de archilamida ya que es extraordinariamente resolutivo).
Los geles de archilamida desnaturalizantes (urea) permiten separar molculas de ADN que difieren en
un nucletido (es el fundamento de los geles de secuenciacin).
ADNs de 50pb - 25kb: Geles de agarosa estndar.
ADNs de 25kb - 315Mb: Geles de agarosa normales no separan Electroforesis de campo pulsado
(geles de agarosa en el varan el campo elctrico).

3. Electroforesis de campo pulsado.


Las molculas de ADN avanzan reorientndose segn el campo elctrico.
En lugar de mover el campo elctrico tambin pueden mover el gel (no es tan caro).
Se ha de vigilar al pipetear para que no se rompa el ADN.
Sirve para aislar y detectar molculas de ADN muy grandes.
Dependiendo del % de agarosa se obtienen diferentes tipos de resolucin:
o Cuanto ms pequea es la molcula ms rpidamente migra en un gel para la misma
concentracin de agarosa.
o A medida que aumenta la concentracin de agarosa resolvemos molculas ms pequeas.

El bromuro de etidio:
o Sirve para detectar ADN dentro de la agarosa.
o Se origin como una molcula para tratar la enfermedad del sueo a los animales.
o Es una molcula capaz de colocarse como un agente intercalante entre cada una de las bases
adyacentes de ADN experimentando as una fluorescencia que se intercala emitiendo luz roja o
anaranjada (590 nm) permitiendo la visualizacin del ADN.
o til en la purificacin del ADN plasmdico.

Los geles de agarosa tambin sirven para resolver molculas de ARN. ste tiene una gran tendencia a
formar zonas de doble cadena al azar alteracin de la movilidad electrofortica mala resolucin
desnaturalizar ARN para romper los puentes de H intercatenarios y aadir formaldehdo que
interaccionar con las bases desparejadas evitando la formacin de puentes de H (el formaldehdo no
es un agente desnaturalizante).

4. Transferencia (tcnicas cualitativas).


Son tcnicas en las que se pretende que los cidos nucleicos o protenas se puedan transferir a una
superficie slida o a un filtro para detectar la presencia de ADN, ARN o protenas especficas.

Se utilizan filtros de nitrocelulosa (no se hace servir mucho) y nylon para c.nucleicos y PVDF
(polivinilo) para protenas.

Transferencia de ADN
Transferencia de ARN
Transferencia de prot.

Edwin Southern.
Northern.
Western.

* stas son tcnicas cualitativas.

4.1 Southern /Northern:


La transferencia es por capilaridad.
Se coloca un gel sobre una bandeja con unos depsitos en tampn de transferencia (solucin salina)
Papel de filtro sobre el tampn Transferencia de la solucin salina.
Colocacin del gel, la membrana de nylon, los 3 papeles de filtro y algo poroso que absorba la solucin
salina que pasa a travs de todo.

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Se establece una corriente de solucin de transferencia que en momento que pasa por el gel coge los
c.nucleicos que quedarn retenidos en la membrana ya que la nitrocelulosa o el nylon tienen una gran
afinidad por los c.nucleicos.
Se ha de aadir un peso para asegurar un buen contacto entre los diferentes elementos de la
transferencia.
El objetivo es detectar secuencias especficas en la membrana los c.nucleicos se transfieren
desnaturalizados del gel hacia el filtro.
Una vez termina la electroforesis trataremos el gel con NaOH para neutralizar bruscamente con una
solucin neutra o parcialmente cida (solucin Trys a pH = 7).
Si trabajamos con c.nucleicos e alto PM antes de desnaturalizar trataremos con EtBr + UV
introducir nicks y as obtendremos piezas pequeas que se transmitirn eficientemente a la membrana
(tambin podemos tratarla con HCl diludo que rompe algunos enlaces).
Con neutralizacin o sin ella renaturalizamos las molculas.
Una vez el ADN ha quedado fijado a la membrana se ha de hacer una rotura adicional para que no se
desenganche.
o En nitrocelulosa se rompe con calor a 80C (pero es explosivo al calentar se ha de sacar el
oxgeno mediante vaco).
o En nylon irradiamos con radiacin ultravioleta formacin de enlaces covalentes entre los
cidos y el gel.
En el Nothern no hay desnaturalizacin.
Cuando el Southern se hace a partir de ADN genmico (cortado con enzimas de restriccin) permite
detectar el nmero de copias del gen o la secuencia especfica y determina la organizacin de las
diferentes copias si hay.
En el Nothern transferimos el ARN total o el ARN poliA (Es un ARN que resulta de la transcripcin de
los genes).
o El ARN poliA se obtiene pasando el ARN total por una columna de afinidad en la que hay
oligonucletidos con T quedar retenido por complementariedad mientras que el ARNr y el
ARNt pasarn a travs de la columna.
o Deberemos elur el ARN polA disminuyendo el fuerza inica de golpe.
Informacin que ofrece el Northern:
o Presencia o ausencia den trascrito.
o Tamao del trascrito.

4.2 Hibridacin sobre membranas:


Sonda: Molcula de ARN o ADN complementaria a la secuencia que queremos detectar. Forma
puentes de H con la secuencia complementaria del gel.
Deteccin de las sondas marcadas con radiactividad (P32) o marcadas no radiactivamente (deteccin
por autorradiografas bandas).
En un Nothern la sonda no puede ser de ARN por las 2 molculas son monocadena (hay sistemas para
obtener ARN complementario que son mucho ms eficientes que la sonda).
5. Tcnicas cuantitativas.
5.1 Dot / Slot-Blot:
No se realiza electroforesis sino que directamente de la barrera de los c.nucleicos se pone una gota sobre
nitrocelulosa o nylon. Haciendo diferentes diluciones y aadiendo gotas (cada una de una dilucin
diferente).

Debajo poner diluciones similares de una muestra patrn (conocemos la presencia de cidos nucleicos
y su cantidad en cada dilucin).
Hibridacin con sonda y deteccin: sirve para conocer la cantidad de c.nucleico en la muestra
problema (se comparan las intensidades de las gotas (dot) con las de las muestras problema (slot))
Es mejor el slot porque en un dot la gota puede escamparse perdiendo intensidad las diferentes
diluciones han de estar concentradas de igual forma ya que las intensidades han de ser equiparables.
La nitrocelulosa se ha de neutralizar porque histricamente era muy sensible a pH alcalino se tena
que neutralizar para que no se deshiciera.
Si el ARN es de 6,7 Kb: deberemos romperlo en trocitos pequeos para asegurar la transferencia (rotura
con HCl diludo) despus del EF y antes de la transferencia.

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5.2 Hibridacin:
En la hibridacin nos aseguramos que slo hibridamos entre s secuencias estrictamente complementarias
de la siguiente manera:

La desnaturalizacin (mediante soluciones alcalinas y calor) y la siguiente renaturalizacin (devolviendo


las caractersticas anteriores muy lentamente con calor y soluciones cidas) se puede seguir mediante
la absorbancia.
Absorbancia: Las bases quedan expuestas a la luz y absorben ms (efecto hipercrmico) porque estn
separadas.
T, pH: Esta T corresponde ala T de fusin (T en la que tenemos la mitad del ADN desnaturalizado). La
T de fusin es caracterstica de cada muestra de ADN concreto.
Tm = 81,5 C + (16,6 Log [Na+ ]) + (%GC 0,41) (%MM)
Donde MM es el desparejamiento (ADN con 1000b de las cuales 900 estn apareadas y 100
desparejadas).

Podemos conseguir una T en la que se mantengan aparejadas secuencias de ADN que no son
completamente complementarias.
o Si una muestra de ADN est a la Tm sabremos que un 50% de las bases estn aparejadas.
o Por encima de la Tm la molcula se desnaturaliza.

Si en el filtro tenemos ADN humano y como sonda un gen determinado que proviene del ratn (es
parecido al del ser humano pero no idntico) fijaremos unas condiciones de T que permitan la
hibridacin ya que la sonda no ser completamente complementaria.
Para hibridar nicamente secuencias totalmente complementarias formaremos unas
condiciones de T o [Na+] para que en estas condiciones las secuencias estn 100% aparejadas.
Para hibridar secuencias parecidas pero no idnticas es hacen servir condiciones poco restrictivas).
o Restrictividad: Permite hibridar molculas parecidas pero no idnticas (se hacen servir
condiciones poro restrictivas como T bajas y altas [Na+]).

Para renaturalizar secuencias parecidas completamente idnticas se usan condiciones muy


restrictivas como T altas y bajas concentracin de [Na+].

Generalmente durante una hibridacin se hacen servir condiciones no restrictivas para que sta se de con
rapidez; si lo que queremos son condiciones restrictivas se hace un lavado en estas condiciones de forma
que lo que no sea idntico se separar.
En un Slot o Dot-blot tenemos una gota con todos los c.nucleicos (las condiciones son casi siempre muy
restrictivas ya que al haber una mezcla de c. nucleicos debemos saber exactamente qu gen estamos
comparando)

La T a la que realizamos la hibridacin determina la cintica del proceso de hibridacin.


o T inferiores (10, 15 o 20C) a Tm: ptimas para realizar la hibridacin porque es cuando la
reaccin de renaturalizacin es ptima.
o T muy superiores o muy inferiores a Tm: Renaturalizacin muy lenta.

Si la secuencia es de 2-25b la Tm se calcula muy fcilmente.


Ejemplo: Si la Tm = 8C:
A 8C la secuencia que tenga un nick entre la primera A y la primera G el 50% de las secuencia
estar separada.
A ms de 8C la secuencia siempre estar desnaturalizada.

6. Enzimas de restriccin.
6.1 Enzimas de restriccin tipo I:
Formadas por 3 subunidades.
1. Hsd R:
2. Hsd M:
3. Hsd S:

Peso de restriccin (corta).


Peso de metilacin.
Reconoce la secuencia.

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* hsd = host specifity DNA /determinante

Para cortar requieren de ATP y para metilar de SAM (S-adenosil metionina).


Son enzimas independientes, es decir, la misma enzima corta y metila.

6.1.1 Descubrimiento de las enzimas de restriccin:


En una progenie de fagos lambda podan infectar a E.Coli C pero no a E.Coli R ya que se metilan segn el
patrn de restriccin de E.Coli C podan volver a infectar a E.Coli C pero no a E.Coli R.

La subunidad Hds determina la secuencia diferente de la cepa C de la R.


La ER comprueba si existe una determinada secuencia dentro del ADN (la secuencia que determina la
subunidad hds) y:
o Si la secuencia no est metilada en ninguna cadena: la hds corta las 2 cadenas en una
distancia indeterminada de la secuencia reconocida.
o Si una de las 2 cadenas est metilada: si la hsd M introduce un grupo metilo a la cadena no
metilada sta no corta el ADN (cuando se acaba la replicacin la cadena nueva no est
metilada).
o Si las 2 cadenas estn metiladas: ER no hace nada.

En el genoma del fago lambda ninguna cadena est metilada ER reconocen el ADN forneo y lo
cortan. (los primeros fagos se descubrieron accidentalemente).
El primer fago que se descubri fue porque el mismo ya iba correctamente metilado de acuerdo con el
patrn de metilacin pero, cmo puede ser que E.Coli no lo destruyera y le incorporara el patrn de
metilacin?
o El primer fago puedo infectar porque entr en una cepa que era mutante en hsd R-.
o Porque la clula de E.Coli que tiene la subunidad M y S pero no la R reconocer el fago pero no
lo podr cortar al cabo de unas generaciones metilar al fago estos fagos podrn infectar
otras E.Coli.

Cualquier ADN lineal que aparezca dentro de E.Coli ser degradado por diferentes mecanismos los
fagos recortados por las ER se vuelven lineales sern degradados y posteriormente eliminados.
La frecuencia de mutacin en procariotas es relativamente baja, pero en el interior de mamferos se
encuentran muchos es relativamente fcil que por mutacin espontnea aparezca una cepa M+S+R-.

* Las ER del tipo I no son tiles para el ADN recombinante porque:


1. Cortan a una distancia indeterminada y a menudo larga (1kb) de secuencia de restriccin.
2. Son enzimas primarias, es decir, todo lo hace la misma enzima al igual que las ERs III.
3. Requieren de SAM, ATP y Mg.
* Las ER (I) que se utilizan en el ADN recombinante son las cepas de E.Coli que son hsd- (no cortan, ni
metilan ya que no reconocen ADN forneo no metilado segn el patrn) o hsd R- (metilando pero no
cortando).
6.2 Enzimas de restriccin del tipo II:
Son enzimas binarias y habitualmente homodmeros que estn formadas por 2 subunidades idnticas y
situadas simtricamente haciendo la misma funcin.

Cada subunidad reconoce la secuencia 5 3.


Cada subunidad se une a una cadena reconociendo secuencias palindrmicas (secuencias
simtricas que se leen ingual en sentido 5 3) el punto de corte siempre ser simtrico.
Las 2 cadenas se separan debido a que los puentes de H y las fuerzas de stekking son demasiado poco
estables a T ambiente para mantenerse unidas.
Los cortes que realizan son nicks porque slo se corta una de las dos cadenas:
o Si la secuencia no est metilada en ninguna cadena cortan.
o Si la secuencia est hemimetilada o las 2 cadenas lo estn no cortan.
Corte escalonado: los extremos resultantes son cohesivos (las bases libres de los extremos son
complementarias). Con el ADN ligasa se puede volver a unir la diana de restriccin se recicla
completamente.
Corte no es escalonado: los extremos romos tambin son reversibles pero no tan eficientes.

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Las ER (II) reconocen secuencias de 4 a 8 bases (si la secuencia tiene 5 o 7 b habitualmente se trata de
una palndorma interrumpida.
Ejemplo: Secuencia GATC
ER (II) San 3AI:
ER (II) MboI:
ER (II) DpuI:

Reconoce GATC y metila la C.


Reconoce GATC y metila la A.
Reconoce y corta ADN slo si est metilado o hemimetilado.

Esta secuencia es reconocida por el gen del sistema dam que consiste en:
Si se introduce una mutacin en la cadena hija despus de la replicacin habr una
distorsin de la doble cadena.
Para poder eliminar la mutacin hemos de saber cul de las 2 cadenas es la hija.
En la cadena paterna la secuencia GATC siempre est metilada en la A por lo que
tenemos que buscar la cadena que tenga esta secuencia sin metilar.

ER (II) MboI nunca la utilizaremos para cortar esta secuencia ya que el ADN ya estar
metilado o hemimetilado en la A nunca cortar.
Utilizaremos ER (II) San 3AI porque aunque el ADN est metilado no lo est en C.
En ADN de procedencia humana muchos GC estn metilados en C por lo que nunca o
casi nunca utilizaremos ER (II) San 3AI si no que usaremos ER (II) MboI porque en
humanos nunca metilamos la A.

6.2 Enzimas de restriccin del tipo IIs:


Cortan a una distancia fija de la diana.
Sus dianas no son palindrmicas.
Son binarias cada enzima corta o metila pero los dos reconocen la secuencia. (Si tenemos una
enzima binaria en un tubo de ensayo podremos metilar un ADN que no lo est en ninguna de las
regiones de reconociemiento porque slo ponemos la que metila (la que corta no).
o Esto no se puede hacer si tenemos ER (I) y (III) ya que la misma enzima corta y metila.

ER (II) slo necesitan SAM para metilar y Mg para cortar.


ER (II) cortan dentro de la secuencia de reconocimiento y las del tipo (II)s fuera de ella pero a una
distancia fija determinada (siempre en el mismo sitio) y cercana de la secuencia de reconocimiento.

6.2 Enzimas de restriccin del tipo III:


Son enzimas primarias con 2 subunidades (una corta y otra metila) en el que el punto de corte est a una
distancia fija de la secuencia de reconocimiento.

Necesitan ATP y SAM para poder cortar se usan muy poco en el ADN recombinante.

7. Nomenclatura:
E
Gnero

co
Especie

R
Cepa

I
Tipo Enzima

2 ER son isoquismeras cuando reconocen y cortan la misma secuencia pero provienen de especies
diferentes.
2 ER son neoquismeras si son isoquismeras que cortan la secuencia en un punto diferente
(provienen de diferentes especies y reconocen la misma secuencia).

8. Mapas de restriccin.
Es el uso fundamental de las ERs. A partir de las bandas aparecidas en una EF de ADN digerido con ER
asignamos las dianas de restriccin a cada una de las bandas que aparecen. Ahora se utilizan para
caracterizar las secuencias que acabamos de clonar.
8.1 ADN ligasas:
Las ADN ligasas sirven para introducir ADN cortado con ER en un vector de clonacin. stas son muy
eficientes sellando discontinuidades en una de las 2 cadenas y uniendo los extremos cohesivos.

ADN ligasa E.Coli:


ADN ligasa Fago T4:

Requiere NAD.
Requiere ATP (muy eficiente en sellar extremos romos que la otra no)

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* La T ptima de trabajo de las 2 enzimas es de 37C.

En el laboratorio se trabaja a unos 4-16 C porque as los extremos no estn muy separados (han de
estar unidos) por lo que la T debe ser menor a la Tm.
Se usa un ATP pro enlace fosfodister unido.
Las ligasas slo unen extremos cercanos.
Una reaccin de ligase efecta a 4C cuando nos interesa formar concatmeros.
Para ligar extremos romos lo hacemos a una T = 20-25C ya que en este extremo no hay bases
complementarias.
o Si queremos sellar nicks sin que se formen enlaces con otros extremos cohesivos usaremos
ADN ligasa de E.coli.
o Si queremos unir extremos romos o cohesivos derivados de la digestin con ER usaremos
ADN ligasa del fago T4.

8.2 Ligacin de fragmentos de restriccin:


Partiendo de una mezcla compleja de fragmentos de ADN la presencia de los extremos derivados del
corte determinar si la ligasa unir o no (slo las molculas con extremos cohesivos susceptibles son
selladas por las ADN ligasas).

ADN ligasa de E.Coli no sella extremos cohesivos con la misma habilidad que la T4 los romos.
Para favorecer el proceso de ligacin de muchas molculas diferentes a un mismo vector usamos
linkers o adaptadores.

8.2.1 Linkers:
Son oligonucletidos de ADN habitualmente fosforilados autocomplementarios (pueden formar puentes de H
entre s) donde todas las secuencias palindrmicas son autocomplementarias.

Se colocan a altas [] pueden formar enlaces fosfodiester fcilmente con una molcula de ADN romo.
Para eliminar los linkers que no nos interesan cortaremos con EcoRI.
Los linkers siempre dan lugar a una molcula de ADN roma que para generar extremos cohesivos
deben ser cortadas por ERs.
Ejemplo: Tenemos 100.000 molculas y nos interesa 1para el clonaje. Esta molcula tiene una
diana de EcoRI.
Para facilitar su posterior insercin en el vector (extremos cohesivos) trataremos con metilasa (que
metila la diana de nuestra molcula) y aadiremos un linker con el posterior corte de EcoRI
generacin de extremos cohesivos sin que nuestra molcula tambin sea cortada por la diana.

La ligacin a 4C favorece la formacin de concatmeros (fragmentos de ADN que pueden tener


extremos escalonados y que se van uniendo un tras otro favoreciendo la formacin de molculas
lineales).
A 16C se favorece la formacin de crculos.
En ADN recombinante nunca se ha de trabajar de la misma manera:
o Con plsmidos (circulares): a 16C.
o Con el fago T4:
a 4C.

8.2.2 Adaptadores:
Acostumbran a ser molculas de ADN no autocomplementarias (son necesarios 2 oligonucletidos para
formar un adaptador) y dan lugar a una molcula de doble cadena de ADN con un extremo sobresaliente y
el otro romo.

Se colocan a altas [] Forman enlaces fosfodiester fcilmente con una molcula de ADN romo.
Para eliminar los linkers que no nos interesan cortaremos con EcoRI.
Siempre que compremos oligonucletidos pediremos que sean 5P.
Una vez aadidos los oligont en la reaccin de ligacin puede darse que:
o Los 2 adaptadores liguen entre s por los extremos romos formando un dmero de adaptador
que tendr 2 extremos sobresalientes (por reaccin de ligacin con ADN ligasa T4) no
podrn ligarse a la molcula con extremos romos disminuye la cantidad de adaptador
disponible.

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Que los dos se liguen a la molcula que tiene extremos romos el inserto a partir de ahora
pasar a tener extremo cohesivos (estos extremos cohesivos los determinan los adaptadores).

* Con los adaptadores no es necesario cortan con ER ya que stos comportan la presencia de extremos
cohesivos.
Qu pasa con el extremo cohesivo?:
La ligacin del extremo 3-OH y 5-OH es imposible porque las ligasas necesitan un 3-OH y un 5-P.

El inserto no puede ligar con s mismo ya que se necesita un extremo 3-OH y uno 5-P puede ligar
con el vector mediante 2 enlaces tendremos 2 nicks y 4 bases aparejadas.
La estabilidad trmica de nuestra molcula recombinante es mayor que la de la otra molcula debido a
los puentes de H formados por el inserto (como hay ms bases aparejadas ms puentes de H). Su Tm >
T ambiente.
La otra molcula recombinante conceptualmente es igual que la otra pero entre los 2 nicks slo hay 4
bases desaparejadas Tm = 8C Tambiente > Tm la molcula estar en forma lineal.
Cuando introducimos este vector en la clula husped (ej, E.Coli), la maquinaria de la clula es capaz
de convertir los 2 extremos 5-OH en 5-P y con la ligasa sella los nicks (siempre que el vector sea
circular al entrar en la clula husped).
El inserto ser el conjunto formado por el inserto inicial + los 2 adapatadores.

* Tanto los linkers como los adaptadores sirven para aumentar la eficiencia de formacin de
extremos romos.
8.2.3 Fosfatasa alcalina:
Es una enzima capaz de coger un extremo 5-P y transformalo en 5-OH por lo que pueden usarse para
conseguir molculas similares a los adaptadores.

Trabajamos con un plsmido que recircularas muy fcilmente (se trata de un vector que en lugar de
ligar con el inserto tiene una gran tendencia a recircularizarse y reestructurarse).
Tratamos el vector con fosfatasa alcalina extremos 5-P se transforman a 5-OH no puede
recircularizarse con l mismo.
El inserto s tiene extremos 5-P el vector puede ligar y recircularizarse con el inserto.

No podemos desfosforilar el vector y el inserto a la vez porque de lo contrario no habra extremos 5-P el
vector o el inserto deben estar desfosforilados. Aumenta mucho el rendimiento de la ligacin cuando
queremos ligar un inserto de un largo determinado con un vector circular.
9. Ligacin o clonaje direccional.
Un vector que est cortado en 2 extremos por ER diferentes (EcoRI BamHI) por lo que no obtenemos los
mismo extremos cohesivos el vector no puede recircularizar nunca ya que los 2 extremos no son
compatibles.
El vector, pues, slo podr recircularizar con un inserto que tambin haya sido digerido por las mismas ER
aunque el inserto tambin se puede ligar con l mismo formando un concatmero. Pero ste concatmero
formado por el inserto unido con l mismo est invertido y repetido (palndromo) no se puede ligar todo
entero con el vector poque E.Coli no puede replicar el inserto, que es un palndromo con tantas bases, ni el
vector que lo contiene. Por lo tanto:

Siempre que haya ms de un inserto E.Coli no lo podr replicar.


Si tenemos el vector invertido y repetido (2 plsmidos que han ligado entre ellos) E.Coli tampoco lo
podr replicar.
Cuando tenemos el plsmido desfosforilado la ligacin es menos eficaz.
Si se puede hacer un clonaje direccional antes de tratar con fosfatasa alcalina realizaremos el clonaje
direccional (se dice direccional porque el inserto queda colocado dentro del vector direccionalmente).
La fosfatasa alcalina es ms cara que las ER.

9.1 Polinucletido quinasa T4:

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Hace el efecto contrario que la fosfatasa alcalina. Se obtiene un extremo 3-OH que puede estar saliente o
entrante, y esta enzima es capaz de intercambiar 1-OH por P (se gasta 1 ATP por cada P). Los usos son los
siguientes:

Reconvierte los extremos 5-OH suministrados por la casa comercial por extremos 5-P (aunque es
mejor encargarlos ya fosforilados).
Fundamentalmente se usa para marcar extremos de ADN.

9.2 ADN polimerasa:


Posee tres tipos de actividades.
1) Polimerasa 5-3:
La cadena de ADN crece en direccin 5.
Aade nt sobre el extremo 3 existente.
1. Primer o cebador (cadena sobre la cual se aaden los nts).
2) Exonucleasa 3-5:
Contraria al sentido de sntesis.
Es la actividad correctora de pruebas.
Esta actividad correctora est bastante inhibida sobre ADnds.
3) Exonucleasa 5-3:
Elimina nts en la misma direccin en la que los aade.
Es la actividad nick-translation.
Esta actividad se puede eliminar por tratamiento con subtilisma queda el fragmento Klewnow o
pol K (2 otros dominios).
9.2 Transcriptasa inversa:
Es una ADN polimerasa capaz de hacer servir como molde una cadena de RNA en lugar de ADN (tambin
puede usar ADN como molde pero con una eficiencia menor). Es una enzima bsica para los cADN. Se
obtiene en:

Virus de la meloblestosis aviar.


Virus del meloney murnico leutremia (cepa especial de virus que provoca leucemia a ratones).

Procesamiento de la enzima:
Cuanto ms nts aade la enzima antes de que la polimerasa se desenganche del molde y venga otra
polimerasa a suplir su funcin ms procesiva es la enzima.
Dependiendo de la actividad de las diferentes polimerasas podemos hacer servir una u otra:
o Para reacciones de secuenciacin las molculas que estamos sintetizando deben acabar donde
nosotros queremos y no donde la polimerasa se desenganche por lo que usaremos
polimerasas con una procesividad baja (ej: polimerasa del fago T7).
o Hay algunas ADN polimerasas T7 modificadas a las que se les ha eliminado actividades no
deseadas.
9.3 Nucleasas:
Cortan cualquier tipo de ADN independientemente de la secuencia (cortan cualquier cosa). Hay varios tipos:
9.3.1 Exonucleasa III:
Proviene de E.Coli y es muy activa.
Degrada extremos 3 de una doble cadena de ADN.
Slo es capaz de degradar extremos 3 de ADN sobre cadenas de ADN dobles en extremos 3
sobresalientes no hace nada (slo sobre extremos 3 romos y entrantes).
Muchas veces se utiliza con la nucleasa SI.
9.3.2 Endonucleasa SI:
Tiene actividad slo sobre ADN o ARN de cadena sencilla.
Corta al azar dentro de la cadena.
Corta la cadena complementaria de la cadena que presenta el nick.
Tambin corta los extremos cohesivos sobresalientes.
* La actividad conjunta de la exonucleasa III y la nucleasa SI produce una molcula de extremos romos ms
cortos que la anterior molcula de ADN.

Apuntes - Ingeniera gentica molecular

9.3.3 Nucleasa Bal 3I:


Presenta las 2 actividades anteriores puede cortar los 2 extremos de una molcula de ADN con
extremos romos favoreciendo su sntesis en lugares diferentes.
Las cadenas quedan paradas en diferentes lugares de la cadena molde pero como que hay muchas
molculas de ADN, las otras cadenas puede haber quedado paradas en otros lugares.
9.3.4 Terminal transferasa:
Es la nica ADN polimerasa capaz de aadir desoribonts a un extremo 3 en ausencia de la cadena
molde.
Se purifica a partir de clulas del sistema inmunitario y est disponible comercialmente.
Su mxima actividad se da sobre los extremos 3 de molculas de ADN de cadena sencilla.
Tambin tiene actividad en cadenas dobles pero con menos eficiencia:
o Si sus extremos son 3 salientes Eficiencia intermedia.
o Si sus extremos son 3 romos Poca eficiencia.

La eficiencia viene determinada por los nts que hayan en el medio. Si colocamos nicamente C slo se
colocar C, si hay C + G los colocar al azar.
Aplicacin fundamental:
o Construccin de bancos de cADN.
o Marcaje de extremos 3 de ADN.
o Construccin de colas homopolimricas para facilitar el clonaje de extremos romos.
Sobre esta cadena aadimos un encebador complementario a uno de los extremos de ADN para que de
lugar a un extremo 3-OH para que la polimerasa pueda polimerizar.

Primera fase:
Adicin de 4 nts normales (uno de ellos marcado radiactivamente) reaccin durante unos segundos
o minutos la polimerasa aade unos cuantos nts a continuacin del encebador (se hace toda la
reaccin en el mismo tubo.
Una vez ha progresado un poco esta reaccin tenemos un encebador un poco ms largo y marcado
radiactivamente (al hacerse ms largo presentar diversas marcas radiactivas).
Segunda fase:
Dividimos el tubo en 4 alcuotas diferentes:
o En una aadimos 1 desoxi A + los 4 nts normales.
o En una aadimos 1 desoxi C + los 4 nts normales.
o En una aadimos 1 desoxi T + los 4 nts normales.
o En una aadimos 1 desoxi G + los 4 nts normales.

Los desoxi tienen 1H en la posicin 3 en lugar de un OH.


Cuando aadimos un desoxi a la cadena en crecimiento la polimerasa lo coloca en la cadena pero al
tener un H en el extremo 3 la polimerasa no puede aadir ms nts.

Tercera fase:
Hacemos 4 tubos diferentes en los se dan:
1) Todas las reacciones de secuenciacin acabadas con una A.
2) Todas las reacciones de secuenciacin acabadas con una C.
3) Todas las reacciones de secuenciacin acabadas con una G.
4) Todas las reacciones de secuenciacin acabadas con una T.

Como adems hay nts normales la adicin de los desoxi es al azar y como partimos de muchas
molculas de ADN iguales tendremos una sucesin de cadenas que acabar la reaccin.

Para reacciones de relleno de fragmentos fragmento Klewnow de la ADN pol I o T4 ADNpol ya que
en estas 2 enzimas la actividad exonucleasa 5-3 se ha eliminado por lo que los extremos 5 no se
degradan.
Para degradar extremos 3 sobresalientes y convertirlos en romos fragmento klewnow o T4
ADNpol (siempre en presencia de nts). Cuando llega al 5 degrada el primer nt y si en el medio hay nts
se volver a unr a despus volver a degradar (es un cliclo ftil). Cuando se acaban los nts del medio
sigue degradando la cadena.

10

Apuntes - Ingeniera gentica molecular

* La ADNpol I, el fragmento de Klewnow y la T4ADNpol son muy malas para secuenciar porque tienen
procesividades muy bajas.
9.3.5 DNA pol Taq:
Proviene de Thermofilus aquaticus.
Tiene una procesividad y una velocidad de polimerizacin alta.
Tiene actividad exonucleasa 5-3 pero no 3-5 no tiene actividad correctora de pruebas.
Se usa en la PCR. A veces la actividad correctora es importante se hacen servir otras enzimas
termoestables que s tienen esta actividad.
Reaccin de secuenciacin:
Se debe disponer de grandes cantidades de molculas de ADN (habitualmente est en forma de
doble cadena).
Tenemos un tubo con esta nica molcula de ADN y separamos las 2 cadenas.

TEMA 2: Caractersticas generales de los vectores de clonaje.


Existen 3 tipos de vectores diferentes usados ms ampliamente en el ADN recombinante:
Plsmidos.
Bacterifago .
Bacterifago M13.
Vector:
Es una molcula de ADN autoreplicativa capaz de introducir fragementos de ADN forneo en una clula
husped permite amplificar indefinidamente el nmero de copias de una secuencia determinada.
1. Vectores basados plsmidos.
Se consideran molculas de ADN circulares capaces de replicarse solas.
Episoma: Molcula de ADN circular que debe integrarse en el ADN de la clula husped para
replicarse.
A menudo los plsmidos dan ventajas a los huspedes como:
Resistencia a Antibiticos.
Resistencia a metales pesados.
Sntesis de toxinas.

Plsmido crptico: Plsmido del cual se desconoce el factor de seleccin que aporta a la clula.
Formas de clasificacin:
o Capacidad de propagacin de plsmido a otros huspedes (conjugacin).
- Plsmidos conjugativos: Codifican los mecanismos necesarios para la propagacin. A
menudo son ms grandes (10,20 kb) que los no conjugativos.
- Plsmidos no conjugativos
o Tipo de control:
- Control relajado: no tienen limitado el nmero de molculas por clula. La segregacin de
las nuevas copias de los plsmidos dependen de la zona en la que est el plsmido cuando
se forme el septo.
- Control estricto: Es capaz de autolimitarse l mismo el n de copias de hay dentro de la
clula husped (factor F). Habitualmente, al tener un n pequeo de copias en la clula
disponen de una maquinaria que asegura una segregacin correcta a las clulas hijas.
o Grupo de incompatibilidad:
- Si una clula bacteriana lleva ms de 1 plsmido diferente stos coexisten en la clula y a
lo largo de las generaciones pertenecen a grupos de incompatibilidades diferentes.
- 2 plsmidos que pertenezcan a un mismo grupo de incompatibilidad no pueden coexistir
dentro de la misma clula.
- 2 plsmidos que pertenecen al mismo grupo de incompatibilidad son 2 plsmidos que
tienen el mismo sistema de replicacin.
- Existen 25 grupos descritos.
* En los plsmidos de control estricto esto no pasa porque:

11

Apuntes - Ingeniera gentica molecular

Si tenemos una clula que lleva 2 plsmidos F (como mucho pueden haber 2 por clula) y uno
de ello lleva un inserto de ADN forneo (los dos pertenecen al mismo grupo de
Incompatibilidad).
Como el factor F como mucho limita la replicacin a 2 plsmidos por clula cuando la clula
se divide una clula hija se lleva el plsmido F con ADN forneo y la otra el F sin el ADN.
La clula se ir replicando varias veces por lo que habrn poblaciones con inserto y poblaciones
si l.

* En los plsmidos de control relajado en cambio:


Si tenemos 2 plsmidos PBR (1 con un inserto que se replica hasta 25 copias y el otro sin
inserto que se replica hasta 25 tambin) las clulas que reciben plsmidos diferentes acaban
dando, al cabo de varias generaciones, bacterias con el mismo plsmido.
Nunca nos encontraremos mezclas de plsmidos al cabo de 6-8 generaciones.Por el azar y
cuantas ms generaciones pasan la proporcin de clulas que portan plsmidos con el mismo
GI se hacen prcticamente inexistentes.
Puede existir algn mecanismo que regule el nmero de copias de plsmido para la clula
aunque no sea muy eficiente.
Existe un balance entre la tasa de divisin (el n de copias del plsmido) y la tasa de divisin de
la clula husped.
Los plsmidos son sensibles al cloranfenicol (bloqueador de la sntesis proteica). En plsmidos
de control estricto dejan de dividirse cuando la clula deja de crecer. En plsmidos de control
relajado ste contina replicndose durante un cierto tiempo dentro de la clula auque esta deje
de crecer.
o

Configuracin:
- Crculos covalentemente cerrados sin grado de superenrrollamiento interno.
- Crculos covalentemente cerrados con superenrrollamiento (en presencia de ADNgirasa).
- ADN relajado debido a la formacin de nicks por parte de las endonucleasas (en presencia
de topoisomerasas vuelven a ser ccc sin superenrrollamiento).

1.1 Plsmido PBR-32:


Surgi para responder el siguiente problema:

Se utiliz el plsmido PSC 101 para clonar en su interior genes del ARNribosomal.
Se cort al PSC 101 con EcoRI y se le introdujo el ARNr cortado previamente con EcoRI ligasa lo
transformaron sobre E.Coli.
Aparecieron una serie de colonias cada una de ellas portadoras del plsmido (ya que este plsmido
codifica para un gen resistente a la tetraciclina) por lo que se cultivaron en un medio con tetraciclina.
El problema surgi porque el plsmido recircularizaba con l mismo antes de haberse incorporado el
inserto (entonces no se puede saber al cultivarlo si el plsmido contiene el inserto) y vieron que slo 1
plsmido tena el inserto con los genes de codifican para el ARNr.
El PBR-32 fue el primer plsmido que permiti saber de una forma simple si un plsmido determinado
portaba inserto o no.
Se construyeron unos a base de coger piezas de oros plsmidos mediante ER y ligasas:
o Trozo del plsmido rSF2124
gen de resitencia a la ampicilina.
o Trozo del plsmido pMB1 (de E.Coli)
origen de replicacin.
o Trozo del plsmido pSC101
gen de resitencia a la tetraciclina.
* Fue el primer ejemplo de construccin modular de plsmidos. Los plsmidos estn formados por
mdulos que se pueden pasar de un plsmido a otro como genes de resistencia, origen de
replicacin y otros.

Abrimos el plsmido pBR-32 y lo digerimos con Pst (ER) y le insertamos una ADN forneo digerido
previamente con Pst.
Como el Psr tiene la diana de restriccin en medio del gen de resistencia a Amp este gen se corta
se inactiva y pasa a ser un gen no funcional.
Transformamos el plsmido en E.Coli (transformamos 2 cosas diferentes);
o Plsmido con inserto.
o Plsmido sin inserto (ha recircularizado antes de incorporarlo).

12

Apuntes - Ingeniera gentica molecular

Las clulas que reciben el plsmido sin inserto conservan la resistencia a Amp.
Tanto los plmidos con inserto como los que no son del mismo GI a lo largo de las generaciones
slo habr colonias con el inserto o sin l.

1.1.1 Experimento:
Inicialmente cultivamos E.Coli en tetraciclina crecern todas las bacterias que hayan incorporado el
plsmido porque los que no lo tienen no sern resistentes a la tetraciclina.
Se hace una rplica de las colonias que han sobrevivido (cogemos diferentes colonias de la placa de
tetraciclina y las ponemos en una placa diferente en la misma posicin).
Nos interesan las bacterias que no crecen en Amp porque llevan el plsmido que ha incorporado el ADN
forneo.
En poco tiempo podemos saber si la colonia de bacterias lleva el inserto o no, pero se ha de esperar
24h para que las colonias crezcan en las placas al hacer las rplicas.
Si clonramos en la diana BamHI en lugar de la Pst habramos de hacer el experimento y las rplicas al
revs.
1.1.2 Viere y Massip (Genes reporter):
En el ao 1896 Viere y Massip Lnea pUC:
o Consiguieron eliminar a las 24h de espera y saber si en la placa de la reaccin de ligacin
original las bacterias llevaban el plsmido inserto o no.
o Se basaba en la incorporacin de un gen reporter (gen chivato).
o Los genes chivato codifican para enzimas de las que se dispone de un mtodo colorimtrico
(fcil y barato) que nos permite detectar la presencia de la enzima o no en lugar de inactivar
un gen de resistencia clonamos osbre un gen que codifica para algn producto celular (ej: Bgalactosa; este gen hace 3kb, muy grande, y al clonarlo con este gen que ser el gen reporter,
el plsmido ser demasiado grande y en E.Coli no replicar.
o

Jacob y Monod:
En los aos 60 descubrieron la alfa-complementacin gnica:
La enzima B-Galactosidasa es un tetrmero con cads suunidad de 1000 aa (para ser
activo).
Descubrieron que si se rompa el gen que codificaba para esta enzima en 2 trozos (uno
pequeo y otro relativamente grande) y cada uno de estos 2 se les colocaban en 2 regiones
del genoma, cada uno de los trozo daba lugar a un producto polipeptdico.
Si se ponan juntos estos 2 productos polipeptdicosstos son capaces de reconstruir un
monmero de la B-Galactosidasa (con 4 monmeros la B-galactosidasa es activa).

Por lo tanto no haca falta que al plsmido se le insertara todo el gen reporter entero ya que funcionaba
al introducirse slo un trozo en la serie pUC si se introducen 300 bases (codifican para la subunidad
alfa de la B-galactosidasa) y ya es suficiente y en el genoma para la subunidad W en el citoplasma
bacteriano se formar la B-galactosidasa.
Se debe trabajar con bacterias que sean Lec- y que lleven un plsmido F con el gen reporter
previamente se ha debido inactivar el opern Lac.
Si clonamos con ADN forneo sobre el fragmento alfa de la B-Galactosidadsa no se formar BGalactosidasa no habr actividad enzimtica:
o Si ponemos X-Gal no se podr degradar (X-Gal es un producto derivado de la lactosa).
o Normalmente la X-Gal es incolora y en presencia de B-Galactosidasa se vuelve azul (si es azul
significa que no lleva el inserto).
El pUC deriva del pBR-322 y conserva la resistencia a Amp y el origen de replicacin al cultivar con
Amp eliminamos las bacterias que no portan plsmido.
Las bacterias de entrada, deben ser Lec Z- y asociada a delecin se debe encontrar otra que de lugar a
la subunidad w, es habitual tener una delecin entera del opern Lac en el factor F estable al gen Lec
AM15 (subunidad w de la B-Glactosidasa).
En algunos casos la delecin Lec AM15 se sustituye en el opern Lac.

1.1.3 Lugar de clonaje mltiple:


Para clonar hacemos servir dianas de restriccin. Estas dianas se deben situar sobre el gen reporter.
Desde la diana de restriccin de EcoRI hasta la de Hindi se encuentran formando parte de la regin
codificante de la subunidad alfa de la B-Galactosidasa (poco despus del codn de inicio) slo es

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Apuntes - Ingeniera gentica molecular

necesario que introduzcamos una ADN forneo en la regin codificante del gen LecZ que es el que
codifica para la subunidad alfa.
Estas dianas no estn en ninguna otra regin del plsmido y las habituales con las que se trabaja en el
laboratorio.
El pBR-322 dispone del gen rho que se encarga de limitar el n de copias del plsmido hasta 25-50
es un regulador (-) del inicio de replicacin del plsmido.
En el pUC este gen est mutado en lugar de 25-50 copias se obtienen 25-500 se puede trabajar
con poco cantidad de plsmido (facilita la fabricacin del plsmido).

1.1.4 Aislamiento del plsmido en la bacteria:


Normalmente se hace en 2 estadios:
a) Lisis alcalina.
b) Centrifugacin en gradiente de cloruro de cesio (csCl) y bromuro de etidio.

Lisis alcalina:
o Se basa en 2 factores: Se ha de hacer en presencia de SDS (detergente inico)
rompimiento de la membrana celular y liberacin del genoma bacteriano y del plsmido al medio
y presencia de NaOH (0,2M) y pH = 12 el genoma bacterianose desnaturaliza muy
fcilmente mientras que los plsmidos quedan en la doble cadena.
o Si bajamos el pH = 12 Posiblemente el genoma no desnaturaliza.
o Si subimos el pH = 12 Posiblemente el genoma s desnaturaliza.
o La neutralizacin brusca debe hacerse con c. actico a pH = 4,5 el genoma bacteriano
intenta renaturalizar y forma entrantes (estructuras de gran PM).
o Si la neutralizacin no es brusca el genoma renaturaliza fcilmente. Estos entrantes de alto PM
despus de la centrifugacin bajan muy fcilmente a bajas g (10.000 g).
o Una vez centrifugamos obtenemos un sobrenedante en el que hay plsmidos recuperamos el
sobrenedante con alcohol obtenemos un pelet de plsmidos.
o Los plsmidos deben ser ccc porque si no, al tratarlos con NaOH pH = 12 se desnaturalizan y
al centrifugar sedimentaran juntamente con el genoma bacteriano.
o Al realizar la EF siempre nos encontramos una banda correspondiente a plsmdios nickados y
otra, ms gruesa, a plsmidos ccc (durante la isis alcalina normalmente se nickan algunos
plsmidos.
o Para obtener grandes cantidades de plsmido ccc debemos escalar el proceso:
- Si partimos de 1-2L de cultivo a veces, durante la lisis alcalina, nos queda ADN
bacteriano y una gran cantidad de plsmido nickado alcalino sobrenadante debemos
separarlo del plsmido ccc con centrifugacin en gradiente de CsCl y BrEt.
- [CsCl] elevada tienen una densidad muy similar a la del ADN.
- Al centrifugar se forma un gradiente de CsCl en el que en cada punto habr una
densidad y una [] diferente.
- Si colocamos una solucin que contiene ADN las molculas del ADN se situarn en los
puntos que corresponden a su densidad.
- El BrEt se intercala entre las bases modificando el grado de torsin de la cadena de
ADN (la desenrolla un poco).
- El ADN ccc se desenrolla sobre l mismo para compensar el desenrollamiento que
provoca el EtBr al insertarse en el ADN.
- El ADN lineal incorpora ms EtBr que una ADNccc ya que sus extremos estn abiertos
(no soporta tanta tensin).
- El plsmido admite EtBr pero llega un momento en el que se vuelve incapaz de
introducir ms porque est demasiado tenso.
- Al someter la preparacin contaminada con ADN lineal y nickado como el EtBr es
menos denso que el ADN y el lineal capta ms que el circular el ADN lineal ver muy
disminuida su densidad la haberle incorporado mientras que el ADNccc no tiene.
- Con 1 o 2 rondas de purificacin obtenemos un 99,999% de plsmido ccc.
o

Hace 7 u 8 aos se trataba el cultivo que portaba pBR322 con cloranfenicol pasamos de 2050 plsmidos /cl a 1000 ya que se inhiba la replicacin de la bacteria pero no la del plsmido
antes de que el cultivo llegara a la fase estacionaria (si la solucin se vuelve muy viscosa es
difcil trabajar con ella) por lo que obtenemos una suspensin mucho menos viscosa a la hora
de lisar el cultivo (esta viscosidad se debe al ADN bacteriano).
Ara este tratamiento ya no se hace porque con la lnea pUC ya se obtienen 200-500 copias/cl
el cultivo se procesa directamente.

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Apuntes - Ingeniera gentica molecular

o
o
o
o

El pBR322 como vector normal de clonaje ha pasado a la historia aunque se sigue usando en
los casos en los que nos interesa obtener un n pequeo de copias/cl (ej: expresin de
protenas recombinantes en E.Coli).
En el plsmido pUC tendremos (P, O y LecZ).
El gen reporter LecZ no slo consta de un promotor sino que tambin tiene un operador para
que las colonias se vuelvan azules debemos introducir un inductor en el sistema (IPTG).
No obstante no es estrictamente necesario ya que al tener unas 500 copias/cl y tener un nivel
basal de transcripcin ya obtenemos B-Galactosidasa (el nivel de LecZ es suficientemente
importante).

2. Vectores basados en Bacterifago .


Dispone de 2 estrategias para la infeccin de E.Coli. Se fija a la clula a travs del receptor de maltosa
entra en el ADN lineal de la clula se circulariza y la cobertura de la bacteria se desengancha de la
clula.
2.1 Infeccin por ciclo ltico:
Produce mltiples copias.
Se encapsidan.
Provoca la lisis celular y la muerte.
2.2 Infeccin por ciclo lisognico:
El ADN se inserta en el genoma de la cepa husped y se queda un n de generaciones indefinido hasta
que las condicones del medio hacen que entre en ciclo ltico.
2.3 Establecimiento de ciclo:
Existen 3 protenas diferentes que hacen que el fago entre en un ciclo u otro. Estas protenas son:
Represor: Molcula que evita la transcripcin de un determinado gen.
Activador: Molcula que estimula la transcripcin de un determinado gen.
Antiterminador: El promotor dirige la sntesis de un policistrn (conjunto de genes que caen dentro
de la misma unidad transcripcional). Si colocamos un terminador entre el gen 1 y 2 slo se expresar el
gen 1. Cuando la ARNpol va transcribiendo un antiterminador bloquea el loop del ARN haciendo que la
polimerasa pasa a travs suyo y siga transcribiendo.
o Genes que transcriben de forma inmediata:
N Antiterminador. La presencia del producto del gen N permite iniciar la
transcripcin de los genes medianos:
CIII estabiliza la protena CII.
O,PQ: O y P son protenas de replicacin del ADN viral. Q permite transcribir los genes
de la cpside y de la lisis de la clula husped.
CII: Activador de la transcripcin. Permite que se active la actividad de la integrasa que
en presencia de la secuencia att permite la integracin al cromosoma de la cl husped
y la activacin del represor CI.
CI: Inhibe la sntesis de N y Ro y por otro lado tambin inhibe la sntesis de CI. Este
represor tambin inhibe la transcripcin de genes O,P y Q.
Si hay mucha CII producir mucha CI inhibicin de Ro,O,P,Q y N. Los genes que
conducen a la bacteria y al fago a un ciclo ltico son bloqueados y como la integrasa
est presente ciclo lisognico favorecido.
Si hay poca CII Ciclo ltico. La protena CII es substrato de una proteasa celular
llamada Lom:
En medio rico la [cAMP] es baja alta [Lom] degradacin de CII favoreciendo
que el fago entre en ciclo ltico.

En medio pobre la [cAMP] es lata baja [Lom] CII alta Integrasa elevada
favorece el ciclo lisognico. Un ciclo ltico implica 100 genomas de fago 100
cpsides (energticamente es caro). Si la clula no tiene suficientes nutrientes no podr
acabar el ciclo ltico se integrar en el genoma del husped hasta que lleguen
mejores condiciones. El hecho de que el fago entre en lisis o en lisognia depende
fundamentalmente del balance entre Ro y CII.
o
o

El fago lambda aprovecha los niveles de protesas Lom para saber si entra en lisis o lisognia.
Lambda tiene un genoma de 48500 bases muy largo y tiene numerosas dianas de ER para
todas y cada una de las ER ms usadas en el ADN recombinante formalmente imposibilita

15

Apuntes - Ingeniera gentica molecular

que el fago sea un buen vector de clonacin ya que al digerirlo con ER se fragmenta todas
estas dianas de restriccin se van eliminando hasta dejar slo una.
En una poblacin de 1012 fagos es muy probable que haya mutantes espontneos que
presenten mutaciones en estas dianas (en algunos casos estas mutaciones producen individuos
inviables).

Ro Represor.

2.3.1 Experimento:
Se cogieron muchos fagos infectando a una E.Coli que llevara la diana de restriccin, es decir, el
sistema de restriccin que queremos eliminar puesto que E.Coli produce ER ER romper el genoma
en trozos de lambda (pero en las mutantes que hayan perdido ER y sean viables el fago dar
descendencia).
En los aos 60 -70 se dieron cuenta que la formacin de la cpside es una reaccin de autoasociacin
simplemente poniendo todas y cada una de las protenas ya se forma la cpside (todas se
transcriben a la vez y no es necesaria una asociacin ordenada) este descubrimiento permiti
obtener extractos de empaquetamiento (conjunto de protenas capaces de formar una partcula infectiva
nueva):
1) Lisgeno que slo produce protenas de la cabeza.
2) Lisgeno que slo produce protenas de la cola.

Si los inducimos por separado ninguno de los 2 podr encapsidarse ya que el genoma de lambda
debe ser mayor de 37Kb y menor de 53. Por lo tanto, si falta cabeza o cola el genoma ser menor de 37
kb los 2 genomas producen las protenas pero el genoma no se puede introducir ciclo lisognico.
Si aadimos genoma de lambda cuando ya est mezclado los 2 lisgenos y los inducimos
conjuntamente (ms de 37Kb) se encapsidarn ciclo ltico.
Esto es til para transformar genomas grandes ya que el rendimiento de la transformacin es muy bajo
y en cambio, por encapsidacin el genoma grande da lugar a nuevas partculas vricas.
Cmo usar estos extractos de empaquetamiento para seguir eliminando dianas de restriccin? (Ej:
diana PstI; E.Coli no tiene el ER para esta diana): Se deben coger 10 12 fagos y extraerles el ADN
genmico y cortarlo con PstI ponerlo en contacto con un extracto de empaquetamiento de manera
que los nicos fagos que no tengan dianas PstI podrn encapsidarse y dar lugar a partculas capaces
de infectar E.Coli (si hay una diana de restriccin el ADN del fago quedar lineal y se podr encapsidar,
pero al entrar en E.Coli ser degradado).
Si usamos el gen CI como diana de clonaje el fago slo podr hacer un ciclo ltico y prcticamente no
lisognico Manera de determinar si un fago lambda lleva inserto o no.
o Aunque el medio sea rico hay una pequea proporcin de fagos que siguen un ciclo lisognico
dentro de la calva es habitual encontrar bacterias calvas turbias.
o Si clonamos cobre CI el fafo slo podr seguir un ciclo ltico calva clara.
o Un fago normal siempre da lugar a calvas turbias.
o Un fago con inserto siempre da lugar a calvas claras.

2.3.2 Genoma del fago :


En la parte izquierda siempre estn agrupados los genes de la cpside (cabeza y cola).
En la parte derecha estn los genes de la regulacin y las protenas de replicacin.
En la parte central estn todo los genes implicados en la recombinacin y en la entrada del ciclo
lisognico esta parte es prescindible para el ciclo ltico si la eliminamos y la substitumos por un
inserto slo se producir el ciclo ltico.
Cmo dejar una diana de restriccin eliminando todo el resto?
o Eliminado todas las dianas que estn repetidas y nos fijamos en dianas de ER nicas.
o Diseando un adaptador que lleve en el extremo sobresaliente Nha y en medio del adaptador
meterle una secuencia GAATTC (diana de restriccin de EcoRI) incubarlo con fago lambda
ligasa obtendremos una genoma de lambda con una nica diana de restriccin EcoRI
(aunque la diana de restriccin Nha quedar doble).
2.3.3 Desarrollo de vectores basados en el fago :
Existen 2 estrategias para desarrolarlos:
Vectores de insercin:
o -gt 10:
Tiene una nica regin EcoRI en el gen CI.

16

Apuntes - Ingeniera gentica molecular

En genoma de Lambda tiene unos 48502 pb (una vez eliminadas las dianas) el fafo admitir
como mucho un inserto de 3,5kb (ya que si no el genoma hara ms de 52kb).
Para aumentar la longitud del ADN o clonar eliminaremos otros trozos del genoma prescindibles
para el ciclo ltico -gt 10 presenta una delecin de 3kb al lado de su regin att esto
dificulta pero no impide que el fago entre en lisogenia obtenemos un fago de 45.500pb
con este fago podemos clonar de forma normal un inserto de hasta 6,5kb.
ste se usa principalmente para clonar cADN para crear bancos de cADN.
Teniendo cepas de E.Coli con una mutacin en el gen Hfl (alta frecuencia de lisogenizacin)
cuando son infectadas por el fago ste siempre sigue un ciclo lisognico porque; el gen tiene la
misma diana que la proteasa Lom (es decir, el gen CII es tambin su diana), el fago,
normalmente, incrementa los niveles de CII ya que la proteasa Lom siempre est presente en
E.Coli (se protege frente a E.Coli), si tenemos una cepa Hfl- la proteasa Hfl no est presente y
aunque haya proteasa Lom habr mucha cantidad de CII el fago siempre seguir un ciclo
lisognico.

* Esto nos proporciona una manera fcil de permitir que slo aparezcan fagos recombinantes
evitamos as que nos aparezcan fagos sin inserto:
1) En E.Coli normal:
CI sin inserto ciclo ltico o lisognico segn las condiciones del medio.
CI con inserto CI no ser funcional siempre ciclo ltico.
2) En E.Coli Hfl-:
CI con inserto CI no ser funcional siempre ciclo ltico.
CI sin inserto [CII] es alta [CI] tambin siempre ciclo lisognico.
* Si la reaccin de ligacin la hacemos sobre una cepa de E.Coli Hfl- aquellas calvas claras que
aparezcan se debern siempre a los fagos que hayan incorporado el inserto.
o

-gt 11 o bancos de expresin:


Tiene una nica diana EcoRI sobre el gen LecZ (muy similar al del pUC) situado
en la regin central que es prescindible para el ciclo ltico (aunque pongamos un inserto en el
LecZ el fago podr llevar a trmino un ciclo ltico).
El lugar de clonaje de EcoRI en este gen LecZ est situado a unas 53 bases del
extremo 3 del gen crecern todos pero los que no lleven el inserto darn lugar a colonias
azules.
Esta proximidad de 53 pb permite conseguir protenas de fusin entre el trozo 5
del LecZ y el polipptido del gen (codificado por el ADN forneo) que hemos clonado si el marco
de lectura es favorable. Esto se debe a que en mucho casos este trozo de LecZ estabiliza
mucho el polipptido que viene a continuacin en una misma cadena.
Tenemos 6 posibilidades diferentes de clonar a EcoRI y slo 1 da lugar a un
marco de lectura favorable (los marcos de lectura vienen por 3 nts).
Si tenemos Ac contra el polipptido podremos detectar el gen que codifica para
el polipptido (insertos que se encuentran).
Ni -gt 10 ni -gt 11permiten la escisin in vivo de ADN clonado (para sacarlo
se ha de cortar con EcoRI).

Vectores de sustitucin:
o Cortan toda la parte central (antes de clonar) dedicada al ciclo lisognico (13-15kb) del fago
lambda y los substituyen por ADN forneo.
o Estos vectores permiten insertos mucho ms largos que los vectores de insercin.
o Siempre realizan un ciclo ltico.

3. Vectores basados en Bacterifagos filamentosos (M13, Fd y F1).


Estos fagos son un 97% homlogos y extraordinariamente parecidos. Reciben este nombre porque sus
cpsides son muy alargadas y tienen apariencia de filamento.

Contienen una molcula de ssADN de 6,4kb.


Ventaja: No lisan la clula que infectan si no que:
o Inyectan el ssADn en el citoplasma se convierte en dsADN que se replica como si fuera un
plsmido hasta obtener 100 copias/cl.

17

Apuntes - Ingeniera gentica molecular

o
o

o
o
o

Una vez han obtenido estas 100 copias modifican su replicacin (de replicacin bidireccional a
replicacin en forma de crculo rodante) obtenemos una serie de concatmeros de cadena
sencilla.
El producto codificado por el gen 2 va cortando y circularizando las diversas subunidades que
forman el concatmero las subunidades se encapsidan en las membranas de la clula (no en
el citoplasma) y conforme van a travesando la membrana se van encapsidando en el
citoplasma celular nunca hay partculas fgicas E.Coli nunca se lisa.
Si hacemos una extraccin del ADN circular en E.Coli podremos obtener el genoma del fago en
forma de dsADN como si fuera un plsmido mientras que en el sobrenedante hayaremos los
fagos filamentosos (los que son de ssADN).
Precipitando el sobrenedante con polietilenglicol recuperaremos los fagos filamentosos.
Adems no existe una limitacin a la hora de empaquetar un inserto ya que su cubierta puede
ser muy grande. El problema es que a la hora de replicarse son relativamente sensibles ala
medida del inserto introducido porque se inestabiliza mucho con insertos largos no se
hacen servir.

Los fagnidos tienen caractersticas de los fagos filamentosos pero se les ha introducido genes nuevos
para mejorar el M13.
Fago M13 HP18:
o Tiene LecZ clonado justo en la parte 3 (upstream) de la regin intergnica de este fago.
o Esta regin determina el inicio y el final de cada uno de los concatmeros de cadena sencilla y
adems contiene un terminador Rho independiente que es donde acaban todos los transcritos
iniciados a partir de los diferentes genes del fago.
o El gen LecZ se coloca con el multicloning site porque el pUC y el M13 son totalmente
intercambiables.

TEMA 3: Construccin y rastreo de bancos de cADN.


Un banco de cADn es una coleccin lo ms cuidadosa y representativa posible de los diferentes
transcritos dentro de una clula o tejidos en las que est pesados los ADN complementarios para poder ser
clonados dentro de un vector de clonaje.
Una clula de mamfero contiene entre 10.000 y 30.000 transcritos diferentes. Si todos estos trasncritos
estuviesen representados de la misma manera, planificar un banco de cADN sera muy fcil pero esto no es
as porque hay genes que tienen muchos transcritos de ARN que acostumbran a ser muy estables
(transcripcin constitutiva) y otros genes que tienen pocos transcritos de ARN esto genera un problema
porque si queremos obtener un banco representativo lo debemos de tener en cuanta ya que la probabilidad
de que aparezcan transcritos de n bajo de copias es menor que la que aparezcan transcritos de n alto de
copias.
Si el ARN pertenece a los transcritos de 15 copias/cl de los 33.333 mARN total de la clula slo 1 ser el
que nos interesa el nmero de clones que necesitaramos para tener una probabilidad fija de obtener los
genes clonados sera:

Log (1 p )
1

Log 1
u

Donde: u = recproco.
p = probabilidad.
Si p = 0,99 N = 1,5105 los bancos de cADN, para ser representativos, acostumbran a tener un nmero
grande de clones (cuantos ms clones ms representativa ser la genoteca).
Clones independientes:

18

Apuntes - Ingeniera gentica molecular

Son clones que aparecen inmediatamente despus de hacer todos los pasos necesarios para la realizacin
de un banco de cADN.

Si el n de clones independientes que obtenemos no es muy alto (10 4): Si infectamos E.Coli con estos
clones como mnimo obtendremos 10 6 clones que sern fotocopias de los 10 4 clones (lo que no haba
en los primeros no lo estar en los segundos) por lo tanto los 106 no son clones independientes.
Lo que nos interesa es el n de clones independientes iniciales.
A la hora de hacer un banco de cADN debemos afinar muy bien el tejido del cual queremos obtener los
genes (si los genes que nos interesan son muy abundantes en el cerebro y pocos en el hgado
realizaremos el banco a partir del cerebro para que el n de clones independientes sea el mayor posible.

1. Realizacin de un banco de cADN.


Extraccin del ARN total mediante un sistema de fibras de borosilicato que permiten capturar los
c.nucleicos con rapidez y eficiencia.
Purificacin del mARN mediante columnas de afinidad (con poliT que es donde se enganchan las colas
de poliA de los mARNs). Los genes de las histonas no estn poliadenilados nunca los
encontraremos en estos bancos.
Pueden hacerse mediante 2 estrategias; por el mtodo de autoprimado (ms simple) o por el mtodo de
primado por homopolmero.
1.1 Mtodo de autoprimado (ms simple):
De forma inherente se pierden frecuentemente la parte 5 de los transcritos. Va un oligonucletido T que
puede llevar o no un adaptador unido, ste anilla e hibrida con la cola poliA del mARN obteniendo un
extremo 3 donde la transcriptasa inversa puede hacer la cadena complementaria.

Esto es un hbrido ARN - ADN que no se puede clonar tratarlo con RNasa que hace cortes en el
esqueleto fosfodister del hbrido ADN-ARN (la RNasa se inactiva en dplex de ADN o de ARN) en lla
cadena de ARN.
Sobre este nick aadimos ADN polI que mediante su actividad polimerizadota y exonucleasa 5-3
extiende la molcula de ADN.
Hemos perdido una parte del extremo 5 del ARN (corresponde a la cabeza) ya que corresponde al
primer de la ADNpolI Nos queda un pequeo trozo de hbrido de ADN-ARN.
Tratamos con T4-ADNpol molcula de ADN doble con extremos romos.
Para facilitar el clonaje es mejor partir de una diana NotI despus de la cola poliT al ADN (al extremo 3).
Aadimos adaptadores EcoRI y digerimos con NotI molcula de ADN con un extremo con la diana de
EcoRI y en el otro extremo la diana NotI.
Obtenemos un inserto apto para realizar un clonaje direccional.
La prdida de la cabeza puede ser un problema si nos interesa el extremo 5 del mARN, no no (si nos
interesa la regin leader del mARN no utilizaremos este mtodo).

1.2 Mtodo primado por homopolmero:


Permite obtener transcritos completos. Se realiza mediante:

Adicin de un homopolmero al extremo 3 del cADN.


El oligonucletido poliT se utiliza como primer para la transcriptasa inversa.
Tratamos con una solucin relativamente alcalina que desnaturaliza el ARN pero no el ADN tenemos
una nica cadena de ADN.
Aadimos una cola al extremo 3 del cADN de G con la Terminal transferasa tenemos el cADN con un
extremo 3 con una ristra de G (la longitud de estas G depende del tiempo de trabajo de la Terminal
transferasa.
Hacemos la segunda cadena necesitamos un oligonucletido que contenga C dar lugar a un
extremo 3 que mediante el fragmento Klenowhar la cadena complementaria tendremos una
molcula de cADn romo con un extremo poliA y otro poliC.
Para facilitar el clonaje al poliT le aadiremos una secuencia que codifique para una diana de restriccin
y a la cola de poliC tambin (puede ser la misma diana o diferente).
Estas dianas tambin se copian en la cadena complementaria.
Cortamos con las ER queda clonable.
El problema es que la secuencia intermedia puede ser desconocida dentro puede haber dianas
de restriccin para evitar que el transcrito se corte debemos tratar previamente con la metilasa
correspondiente con los ER de esta diana. Pero no podemos mutilar si posteriormente debemos cortar
los extremos (simplemente dejamos los extremo romos, tratamos con metilasa y aadimos linker).

19

Apuntes - Ingeniera gentica molecular

Si nos queremos ahorrar el tratamiento con metilasa pero queremos metilar el ADN igualmente existen A
y C como nts disponibles comercialmente previamente metilados en la posicin 5 (posicin de
metilacin de las ER) al hacer la segunda cadena aadimos A o C metiladas asta estar metilada
y entonces la doble cadena estar hemimetilada la ER no cortar.
Otra opcin es colocar a los extremos dianas de restriccin poco probables (ej: SalI y NotI).
Ahora ya debemos clonar los cADNs.

3. Mtodos de screening.
Hasta los aos 80 se usaban vectores basados en plsmidos pero conllevaban problemas:
o Era relativamente difcil rastrear la genoteca obtenida.
o Era relativamente difcil conservar la genoteca obtenida (paso del clon independiente).
o Era relativamente difcil transformar la genoteca obtenida (paso del clon dependiente).

Despus se usaron vectores basados en lambda (serie gt):


El rastreo era mucho ms fcil porque en una calva, cuando un fago lisaba rompa la bacteria y
dejaba libre una gran cantidad de c.nucleicos no encapsidados (90%) del fago por lo que facilitaba
el rastreo y adems la concentracin de c.nucleicos no encapsidados era muy alta.
La conservacin del banco tambin era mucho ms sencilla (slo haca falta meter una gots de
cloroformo en la calva y mantenerla a una T = -80C).

3.1 Mtodo de screening ms comn:


Sobre las calvas blancas se aplica una redonda de nitrocelulosa del mismo dimetro de la placa de petri
el ADN sin encapsidar queda adsorbido. En la nitrocelulosa tenemos una rplica de los
c.nucleicos que podran haber en la placa.
Por otro lado preparamos la sonda (con el gen del cual queremos detectar su presencia en el banco)
con la que hibridaremos a la nitrocelulosa slo quedarn detectados los fagos que porten un cADN
que sean homlogos a la sonda que utilicemos (autoradiografa).
Para capturar el cADN que nos interesa volveremos a la placa de petri donde an hay c.nucleicos en
las diferentes calvas.
Si no tenemos ningn gen homlogo del gen que nos interesa la obtencin de la sonda ser
problemtica por lo que existen diferentes estrategias:
1) Construir un oligont que acte como sonda: Es un sistema que permite determinar la
secuencia N-terminal de una protena (mtodo Edman) de forma automatizada podremos
obtener rpidamente la secuencia correspondiente a los 20 aa del N-terminal mediante el
cdigo gentico podremos obtener la secuencia:
Si el primer aa es una Met ATG.
Escoger la parte de la secuencia que sea ms rica en Met y Pro (slo tienen un codn).
Mirar la presencia de Asn, Asp, Glu, His, Lys, Phe, Tyr (slo determinados por 2 codones)
E ir hacindolo as hasta obtener 60 nts pero con 20 o 30 nts ya es suficiente.
Debemos de conseguir unas condiciones de hibridacin en las cuales, en el caso de que
nos hayamos equivocado en algunos nts, las posiciones fijas puedan hibridar igualemente
condiciones poco restrictivas.
Tambin pueden realizarse todos los olints posibles pero si hay muchas indeterminaciones
diferentes la sonda efectiva que detectaremos ser muy baja.
Si hay pocas indeterminaciones es mejor hacer todas las secuencias posibles.
2) Obtener anticuerpos especficos para la protena.
3.1.1Reaccin de marcacin de la sonda:
Si es un oligont Terminal transferasa marca el extremo 5.
Si la sonda es un clon existente de ADN la sonda se ha de marcar por nick-translation o random
primed.
Nick-translation:
o ADNpol I + 4dNTPs (uno de ellos marcado con P32).
o La ADNpolI detecta los nicks y se coloca comenzando a aadir nts; al mismo tiempo que va
aadiendo va degradando el resto de ADN.
o La ADNasa I introduce nicks al ADN que queremos marcar.
o Es un mtodo muy irreproducible.

Random primed o primado al azar:

20

Apuntes - Ingeniera gentica molecular

o
o
o

Desnaturalizamos el molde de ADN que debemos marcar y aadimos olignts de 6 o 10 bases


hechos al azar.
Si la [oligonts] es baja la probabilidad de que alguno oalgunos hibriden es relativamente
elevada obtenemos una ADN marcado extraordinariamente bien.
Como mnima da lugar a sondas marcadas una unidad ms que la nick-translation.

Marcaje no radiactivo: Dioxigenina:


No da problemas de fondo porque slo se encuentra en digitalis purpure.
Existe un Ac que detecta este grupo con mucha diferencia.
La dioxigenina se incorpora a un nt por sntesis qumica (normalmente T) y no existe ningn
problema para incorporarla en el ADn ya que la ADNpol la puede polimerizar.
Detectamos la presencia de la sonda hbrida con un Ac especfico contra la dioxigenina.
Este anticuerpo estar marcado con una enzima como la fosfatasa alcalina.
Se lleva a cabo una reaccin para detectar la enzima aadiendo un sustrato incolor que la enzima
transformar en un producto con color (azul oscuro).

4. Rastreo de un banco de cADN.


La genoteca debe ser adecuada.
Sobre la placa de petri se hace una transfeencia a la nitrocelulosa los .n y alguna protena que
produce el fago lambda al lisarse la clula se transferirn.
Detectaremos la protena en lugar de los c.n mediante Ac contra esta protena.
Los c.n que codifican estas protenas los capturaremos ms adelante.
Se usan membranas de PVDF en lugar de nitrocelulosa.
Se hace la rplica sobre la placa de Petri y la incubamos directamente con el AC (srum policlonal o
monoclonal que hemos obtenido) para estas protenas los Ac se enganchan.
Detectamos la presencia de este Ac contra la membrana de PVDF:
o Usando un segundo Ac que habitualmente es una IgG de una especie heterloga conjugada
con enzimas (peroxidasa o fosfatasa alcalina).
o Incubando la membrsana con sustratos de la enzima que hayamos utilizado.

Con un palillo picamos sobre la colonia obteniendo el fago que contiene el gen que codifica para la
protena de inters.
En un banco de cADN adems de detectar y coger genes que codifican para una protena determinada
tambin puede verse cmo estn regulados los genes.

4.1 Expresin diferencial de genes:


Se trata de buscar genes que se expresen en un determinado teidos o en una etapa de desarrollo.
Preparamos un banco de ADN marcado con un mARN de gstrula; preparamos 2 o 3 (2
obligatoriamente) rplicas del banco de cADN que en la misma posicin de la placa de petri tienen el
mismo clon.
Hibridamos con un ADN marcado con un mARN de gstrula o de la fase huevo (marcar la primera
cadena suministra un nt marcado a la trascriptasa inversa al hacer la primera cadena de cADN; con
el mARN de la fase de gstrula hacemos lo mismo).
Con el mARN marcado hibridamos una placa de Petri y con el otro la otra placa:
o Con el mARN de la fase gstrula no se hibridan todos los clones porque:

Todos los clones provienen de la fase gstrula.

Para que una sonda sea efectiva ha de haber una cantidad mnima (entre 1-0,01 g)
cuando hacemos la reaccin de marcaje hacemos una extraccin de mARN total de la fase
gstrula (hay genes que tienen muchas copias y otros pocas) si ponemos 1 g de sonda
marcada estamos poniendo sondas correspondientes a genes de alto o mediano n de
copias pero no de los genes de bajo n de copias.

En la fase huevo, los genes que se estn expresando de forma abundante en la fase
gstrula, a la fase huevo se expresan menos (genes fundamentales para que se de el paso
de una fase a otra o genes muy importantes).
o

Para detectar genes que se expresan de forma poco abundante pero diferencial entre diferentes
tejidos o entre diferentes etapas embrionarias hacemos lo siguiente:

Cogemos las clulas que pueden estar expresando el mARN de inters.

Por otra parte debemos extraer otro poliA que no est en la misma fase embrionaria o que
no est tratado con un medicamento (son las clulas de referencia).

21

Apuntes - Ingeniera gentica molecular

Cogemos las primeras clulas y va transcriptasa inversa hacemos una cadena de cADN
se elimina el ARN por calor o con NaOH diludo de modo que slo quedar la secuencia
complementaria.
Juntamos estos sADNs con los mARNs de la clula de referencia los mARNs que se
estn expresando en los 2 caso se podrn hibridar.
Si un mARN ni estuviera en las clulas de referencia ste no hibridar.
Lo pasamos por una columna de de hidroxi-apetita (es capaz de retener doles cadenas
respecto a cadenas sencillas de forma diferencial) a una [] determinada de tampn fosfato
slo sale el cADN no hibridado (el que se expresa slo en las clulas tratadas con el
medicamento) y lo hacemos varias veces el 99% de los cADNs que obtendremos
provendrn slo de clulas tratadas.
Clonaremos este ADN.

5. Arrays.
Disponemos de 107-8 clones de cADN pero a la hora de hacer arrays queremos ver la expresin diferencial
de un gen en condiciones determinadas (slo se pondrn genes diferentes).

Seleccionamos diferentes genes dentro del banco de cADN ESTs (expressed sequence Taqs).
o Se secuencian los primeros 100-400 nts de cada uno de los clones del banco de cADN.
o La secuencia nos indica si el clon es diferente del resto de clones que y tenemos si el clon es
diferente entra a formar parte de la base de datos del EST podremos determinar todos los
clones diferentes de estos 107-8.
o Va PCR hacemos una extraccin de ADN directo obtenemos una gran cantidad (1,2 g) de
cada uno de los clones diferentes pondremos una cantidad relativamente pequea
(nanogota) sobre una porta de vidrio tratada con poliLys (da cargas +) mediante robots o
impresoras de chorro de tinta tendremos una porta en la que hay gotas de cada uno de los
cADNs diferentes que haba en el banco.
o Obtendremos un ARN de las clulas tratadas con el medicamento y de las de referencia.
o Usaremos nts marcados con fluorforos diferentes (cuando se iluminan con luz azul emiten luz
roja o verde) y:
Cy5 color rojo.
Cy3 color verde.

Cuando hacemo sla primera cadena ponemos nts + 1 nt marcado con fluorfor verde (clula tratada) o
roja (clula de referencia) + transcriptasa inversa lo mezclamos y lo ponemos a hibridar en el porta
en el que estn las cadenas complementarias.
Slo podemos hibridar con las cadenas del porta; entre ellos no pueden hibridar ya que son de cadena
sencilla (no hay ninguna cadena complementaria)
Color rojo: mARN que slo se expresa en clulas de referencia.
Color verde: mARN que slo se expresa en clulas tratadas.
Color amarillo plido o marronoso: Genes que se expresan en las dos clulas.
Para que el ADN pueda hibridar ha de estar desnaturalizado.
Con esta tcnica no se pueden detectar transcritos poco frecuentes en los arrays ya que tienen
limitaciones importantes el spot de ADN, una vez hecha la hibridacin, no es uniforme y la lectura se
hace con un liser puede ser que no detecte la fluorescencia donde debera haberla. Como el
segundo spot no es homogneo al atravesarlo el lser no lo detectar correctamente.

6. RT-PCR.
Es una variante de la PCR que se hace a partir de la cadena de cADN obtenida con transcriptasa inversa
(partiendo de un mARN). Con la primera cadena (no son necesarias las 2) y con un par de oligonts
especficos se puede hacer por PCR.
* Esto se realiza porque ninguna termopolimerasa copia ARN.
Ejemplo: Deteccin del gen de la hidroxalato reductasa y sus opciones:
a) Banco de cADN + hibridacin con una sonda heterloga.
b) Si disponemos previamente de la secuencia d la hidroxalato reductasa lo podemos amplificar por
RT-PCR:
Se tarda mucho menos tiempo pero es imprescindible conocer la secuencia que queremos
amplificar (con alguna excepcin).

22

Apuntes - Ingeniera gentica molecular

Nos basamos en una faena previa de bancos de cADN y determinacin de secuencia.


Realmente slo sera necesario conocer el extremo 5 del cADN para hibridar un oligont ya que en 3
el mARN tiene la cola poliA. Aunque lo normal es tener toda la secuencia.

TEMA 4: Bancos de ADN genmico.


En un banco de cADN pero ste no contiene intrones ni promotores Slo secuencias codificadas por los
genes, no elementos reguladores ni intrones
Para obtener estas secuencias moduladoras de la actividad gentica debemos poseer un banco de ADN
genmico que contiene las secuencias que hayaramos en un banco de cADN ms las secuencias
reguladoras secuencia del genoma entero o completo.
Para obtener la secuencia de un genoma ste debe ser cortado en fragmentos de cmo mximo 1Kb
(porque es lo mximo que se puede secuenciar).
1. Estrategias para la obtencin de bancos de ADN genmico.
Debe cogerse el genoma y cortarlo al azar en fragmentos de 1Mb, clonar los plsmidos y secuenciar
directamente. Con genomas simples se puede hacer, pero en genomas eucariotas existe ADN repetitivo
que es difcil de empalmar a la secuencia obtenida.
Si obtenemos una secuencia repetitiva que se encuentra en diversos cromosomas no sabremos a cul
de ellos pertenece; por ello sera necesario tener fragmentos muy largos.

23

Apuntes - Ingeniera gentica molecular

En lugar de tener clones con cADn de transcritos de la clula o de tejidos determinados tendremos
cADN correspondiente a fragmentos de un genoma.

Banco de cADN:
Habitualmente partimos de un tejido.
Banco de ADNgen:
No es necesario partir de un tejido concreto (los tejidos, en general,
contienen la misma informacin gentica).

2. Representatividad los los bancos genmicos.


2.1 Probabilidad de hallar un clon con la secuencia deseada:
1 L
P 1

Fijando una probabilidad del 99% y aislando n

2
1 L
Log

Donde: L = Longitud media de los fragmentos clonados (en kb)


M = Medida del genoma (en kb).
n = nmero de clones independientes de la genoteca.
* Cuanto mayor sea un genoma, ms clones deberemos obtener para que sea ms representativo.
Cuanto ms grandes son los fragmentos que clonamos menos clones sern necesarios para obtener
una elevada representatividad. El n de clones disminuye a medida que aumenta la longitud de los insertos
y el n de clones independientes aumenta a medida que aumenta la longitud del genoma. Debemos tener en
cuenta las caractersticas de los vectores que usaremos.
Plsmidos
Difcil clonar + de 10kb
Difcil obtener n grande
de transformantes de
ADN forneo.
Fcil extraccin y
manipulacin

Fago
Clonaje de hasta 22 kb
Fcil obtener + de 107
transformantes de ADN
forneo.
Extraccin y
manipulacin no difcil

Csmidos
Clonaje de hasta 40 kb
Fcil obtener + de 107
transformantes de ADN
forneo.
Extraccin y
manipulacin no difcil

BACs / YACs
Clonaje de hasta 2 Mb
Difcil obtener n grande
de transformantes de
ADN forneo.
Extraccin y
manipulacin difcil

2.2 Plsmidos:
Son poco usado sen bancos de ADNgen porque son difciles de conservar.
El rendimiento para clonar insertos en su interior es bajo.
Los sistemas para evitar la aparicin de colonias sin inserto no son muy eficientes (est ms
desarrolado en fagos lambda que en csmicos)
Sirven para clonajes rutinarios pero no para clonajes genmicos.
2.3 Fago :
Para poder realizar vectores de sustitucin necesitamos conocer su replicacin.
En el interior de la cpside poseen el genoma lineal (50 kb) con 2 extremos cohesivos (cuerpo) consigo
mismos.
Se circularas y comienza 1 o ms ciclos de replicacin bidireccional.
Se separan gracias a enzimas del husped o a partir del producto del gen Rad del fago.
Posteriormente se da un cambio en la forma de replicacin y pasamos a realizar una replicacin en
forma de crculo rodante (unidireccional) en el que se forman concatmeros del genoma del fago y
se genera un extremo lineal libre.
E.Coli dispone del sistema recBCD capaz de degradar estos extremos (acta una exonucleasa) pero el
fago labda, gracias a su propio gen gam inhibe directamente el sistema recBCD.
Se cortan los genomas encapsidados y se encapsidan.
Reaccin de empaquetamiento:
o La protena A es una prot. especfica del fago que reconoce 2 secuencias cuerpo y entra en el
genoma del fago (est en medio del cuerpo) dentro de la cpside previamente formada.
o La protA espera concatmeros si situamos un genoma del fago previamente cortado por la
secuencia cos, la protA no la puede encapsidar.
o Para que la reaccin de encapsidacin sea efectiva es necesario que el ADN se haya replicado
en forma de concatmeros.
o Los genomas circulares con un nico extremo cos son incapaces de encapsidarse.

24

Apuntes - Ingeniera gentica molecular

3. Vectores de sustitucin.
En los vectores de sustitucin se sustituye la regin no esencial (compuesta por genes) por un inserto de
ADN de inters.
3.1 Fago :
En ausencia de estos genes el fago lambda replica de forma diferente realiza la replicacin bidireccional
y no la unidireccional (crculo rodante) como si fuera un plsmido. El producto de una replicacin
bidireccional no se puede encapsidar.
Gen red:
Gen gam:

Participa en la recombinacin general del fago (recombinacin muy eficiente) y tambin est
implicado en la separacin de los crculos.
Inhibe el sistema recBCD.

* Por tanto el fago aprovecha la maquinaria de recombinacin general del husped (recA, recBCD de E.coli)
recBCD:
recA:

Protena que corta alrededor de la secuencia chi y desplaza una de las 2 cadenas de ADN
(tiene actividad helicasa y tambin es una endonulceasa de doble cadena).
Protena (terminasa) que reconoce la secuencia desplazada por recBCD y desplaza la
secuencia similar en la otra doble cadena del dsADN.

* recBCD y recA son imprescindibles para que haya recombinacin en E.Coli. Si el fago posee una
secuencia chi puede haber recombinacin entre 2 genomas de lambda entonces encontramos, almenos, 2
secuencias cuerpo en un concatmero circular esto ya se puede encapsidar.

El fago lambda podr replicarse de forma normal en ausencia de red y de gam y adems proporcionar
un mecanismo extra para seleccionar slo a fagos recombinantes.
Al sustituirse la protena control por ADN forneo pasa a ser red- gam- en ausencia del gen gam la
clula es recBCD+ ya que gam inhibe recBCD gam- = recBCD+.
El gen red en el fago y el gen recA y recBCD de E.COli seran grupos diferentes de genes implicados en
la recombinacin:
o Si el fago es gam-
E.Coli es recBCD+.
o Si el fago es gam+
E.COli es recBCD-.

3.1.1 Obtencin de banco genmico en el fago :


Sustituimos la regin central con un inserto cortado con BamHI.
Digerimos con BamHI y EcoRi (tambin tiene dianas SalI y EcoRI) simultneamente en la regin
obtenemos 2 brazos y un stuffer central.
Precipitamos con EtOH (el ADN precipita con ste dependiendo de su largo; hasta 15 oligonts unidos
entre ellos son solubles en EtOH).
Los 2 oligonts de 12 bases no precipitan pero el resto s. En el precipitado del tubo estn los 2 brazos y
el stuffer.
Eliminamos el sobrenedante y nos quedamos con el precipitado del fondo del tubo.
El stuffer ya no puede ligar con los brazos porque falta la pieza pequea que permite restaurar el
fragmento original.

Debemos partir de un ADN genmico de alto PM y hacer una digestin parcial con Sam3AI porque:
o El objetivo principal para conseguir un banco genmico es obtener la secuencia del gen.
o Por solapamiento de los diferentes fragmentos podemos reconstruir el genoma nunca
partiremos de un solo genoma si de muchas clulas de un tejido para tener ms de un genoma;
adems, cada genoma diferente est digerido con una ER diferente podremos solapar los
diferentes fragmentos (contiguos) que obtenemos.
o El proceso de solapamiento recibe el nombre de walking.
o Por lo que haciendo la digestin con Sam3AI hacemos posible la posterior
reconstruccin de la informacin.
o Los extremos derivados de la digestin son compatibles con los de BamHI. Si tenemos un
cromosoma de 10Mb y Sam3AI tiene una frecuencia de corte una vez cada 256 bases cortar
muchas veces. Si hacemos una digestin completa con SamAI obtendremos fragmentos de
256 bases por lo que deberemos realizar digestiones parciales para que slo corte 1 diana
cada 100 dianas (dejamos menos tiempo) cada cromosoma quedar cortado de forma
diferente porque los cortes de Sam3AI se hacen al azar. Cada genoma estar cortado por
una diana diferente.

25

Apuntes - Ingeniera gentica molecular

El genoma debe ser de alto PM porque:


o Si despus de hacer la extraccin obtenemos fragmentos de 20kb (el fago admite fragmentos
de hasta 20kb) con extremos romos estos no son clonables en el vector. Como que a estos
fragmentos hemos de realizarles una digestin parcial con Sam3AI obtendremos
fragmentos de 3kb (para hacer bancos de ADNgen queremos fragmentos de ADN largo)
deberemos evitar pues los pasos que rompan el ADN y a partir de elevadas cantidades (mg)
de ADN genmico.

Digestin parcial:
o Debemos aadir entre 10 y 100 unidades menos de Sam3AI que en ADN de partida que
tenamos.
o Realizaremos una calibracin tiempo de digestin respecto al tamao de los fragmentos.
o Trataremos el inserto con fosfatasa alcalina para que no se religuen con ellos mismos por que
de lo contrario podran ser que los pequeos fragmentos derivados de la digestin que antes
no estaba unidos liguen entre ellos cada uno de los fragmentos que obtenemos proviene de
una nica digestin parcial.

Los brazos ya los tenemos preparados (previamente hemos digerido con BamHI y EcoRI) y el stuffer
tambin.
Adjuntamos los fragmentos obtenidos de la digestin parcial con los brazos del fago:
o Estos brazos tienen extremos BamHI y pueden ligar entre s aunque no dan
descendencia. Al medir 32kb no encapsidan ya que como mnimo son necesarios 37kb.
o El stuffer es incapaz de ligar con brazos o con el inserto, slo liga con l mismo y como no
dispone de secuencias cuerpo no puede encapsidarse (el fago lambda slo se encapsida si
posee secuencias cos adyacentes).
o El nico que puede encapsidarse es el brazo derecho con un inserto y un brazo
izquierdo. Si ligan brazo D + D + inserto faltarn los genes que determinan la cabeza y la cola
no podr encapsidarse. Si ligamos 2 brazos I + inserto slo tendremos genes para la cabeza
y la cola pero no para la replicacin no podr encapsidar.

El lambda que usamos como vector es un genoma lineal que tiene 2 extremos cuerpo en forma de
cadena sencilla. Uno de estos extremos est en el extremo derecho y el otro en el izquierdo al hacer
la reaccin de ligacin anterior los diferentes brazos + el inserto podrn seguir unindose entre ellos
porque tienen secuencias cuerpo en los extremos (es favorable porque no tenemos muchos
concatmeros pero esto prcticamente no puede encapsidarse ya que para hacerlo las regiones
cuerpo deben ser de doble cadena).
Hacemos una reaccin de ligacin en condiciones que favorezcan la formacin de largos concatmeros
(T = 4C y alta [ADN]) ms inserto flanqueado por extremos cuerpo de doble cadena.
Una vez obtenidos estos largos concatmeros deberemos encapsidar in Vitro (es ms eficiente
comprar extractos de empaquetamiento que hacerlos).

3.2 Fago P2:


Es capaz de infectar a E.Coli y con una alta eficiencia entrar en lisogenia produce una protena que es el
producto del gen old. Este fago no tiene nada que ver con el fago lambda.
La protena del gen old es incompatible si E.Coli es recBCD- si el fago est en lisogenia y E.Coli es
recBCD- la bacteria ser inviable por un problema de interaccin gentica (no pueden convivir los 2 en
la misma clula) para ser viable E.Coli debe ser recBCD+.
Si un fago lambda infecta una clula que porta el fago P2 que est en lisogenia, si este lambda es
normal (no tiene la parte central alterada) lambda dejar de tener descendencia ya que E.Coli no es
viable.
Si realizamos un banco genmico usando un fago lambda sustituida la parte central por un inserto
(vector de sustitucin) e infectamos a E.Coli portadora del P2 slo saldrn calvas de infeccin de
aquellos lambdas que hayan incorporado el inserto porque sern red-gam-.
o Lambda red+ gam+
spI+ (sensible a la interferencia por el fago P2).
o Lambda red- gam-
spI- (insensible a la interferencia por el fago P2).
o A este mecanismo de seleccin se le conoce como spI+ y es un sistema muy eficiente evitando
que entren fagos sin inserto en la descendencia.
4. Genotipos de los huspedes de los vectores de sustitucin.

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Apuntes - Ingeniera gentica molecular

Si el vector no lleva inserto el husped no podr ser el fago P2.


4.1 LE-392:
No lleva el factor F en el citoplasma F mcrA-:
o Los sistemas mcr y mrr son ER que no pertenecen ni a los tipos I, II y III.
o Difieren del ADN metilado sobretodo en C y A. E
o Si la cepa en la que lo clonamos es mcr + o mrr+ ser cortado y degradado.
o Para que los huspedes puedan hacer crecer ADN eucariotas deben ser mcr- o mrr El 70% de las parejas GC del genoma humano tienen la C metilada.
Sup E44 (mutacin supresora):
o El gen A codifica para la terminasa que corta los genomas de lambda y encapsida.
o Si encontramos codones stop prematuros en el gen lambda (en casi todo los fagos lambda)
no se producir la protena A el fago no crecer.
o Por lo tanto utilizaremos huspedes con con mutaciones supresoras ya que el brazo anticodn
del del t-ARN reconoce un codn stop y es capaz de ponerle un aa.
o Un fago lambda con un codn stop prematuro en el gen A slo crecer en huspedes con
mutaciones supresoras.
o Se ponen codones stop en el gen A de lambda para ste slo crezca en huspedes
determinados.
o Si lambda fuera salvaje y se escapara cualquier clula salvaje sera capaz de hacerlo crecer
esto puede ser muy peligrosas si estamos clonando protenas txicas.
Delecin lac: Sirve para seleccionar.
Diferentes auxotrofias.
4.2 P2392:
Es un LE392 que es portador del fago P2 en lisogenia.
4.3 TAP 90:
Sirve para hacer crecer vectores que ya llevan un inserto.
Alec (IZ4)
Sup E44
RedD- El fago lambda con inserto progresan mejor.
4.4 Ton A1:
El fago T7 infecta a E.COli sobre el Ton A1 (es el receptor de ferricromo) E.COli Ton A1- es incapaz
de infectado por E.Coli.
T7 es una fago ambiental muy comn especfico de E.Coli.
4.5 XL1-blue MRA y MRAP2:
Nueva generacin de clulas husped que tambin se pueden usar en vectores de sustitucin.
Tienen una delecin completa de los genes mcr y mrr cualquier ADN metilado no ser ni detectado ni
degradado.
Sup E44
Thi gurA96 : Mutacin de la ADNgirasa e.COli ser resistente a inhibidores de la girasa.
5. Csmidos.
Son vectores de aceptan insertos de longitudes mayores a 22kb (insertos de ms de 55kb) y es un
plsmido derivado del pBR que porta los 2 extremos cuerpo (a derecha e izquierda) del fago lambda en
doble cadena en su interior.
Se aprovecha de la gran eficiencia de los extractos de empaquetamiento del interior de E.Coli porque son
las nicas secuencias imprescindibles para la encapsidacin del fago lambda permitirn encapsidar el
vector de forma efectiva.

Se cortan con SmaI:


o Extremos romos Digerimos con BamHI para obtener extremos cohesivos.
Hacemos una digestin piloto del ADN genmico para que de un mximo entre las 30 y 45 kb.
Ligamos preferentemente las dianas BamHI que las Sam3AI con el fragmento de ADN porque generan
extremos cohesivos.

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Apuntes - Ingeniera gentica molecular

Este ADN flanqueado por secuencias cuerpo puede encapsidar correctamente.


Este csmido, una vez dentro de E.Coli se comportar como un plsmido porque no posee
ninguna caracterstica ms del fago lambda (es un plsmido).

5.1 Rastreo de un banco de ADN genmico generado por csmidos:


Hacemos el cultivo con clulas transformadas y que hagan colonias.
Rastreamos las colonias (rastreo menos efectivo ya que las hemos de lisar) tratamiento con
protenas K un ADN de estas bacterias est fijado sobre un filtro de nitrocelulosa el rendimiento
es ms bajo que en el caso del fago lambda porque en lambda los c.n ya estn liberados.
6. YACs y BACs.
YACs: Cromosomas ratifcales de levadura permiten clonar insertos de 1 a 2Mb.
BACs: Son cromosomas de bacterias que permiten clonar insertos de hasta 300Kb.
6.1 BACs:
Factor F: Plsmido que dispone de una sistema de segregacin que hace que la misma clula hija
reciba 2 copias cromosmicas. ste factor incorpora:
o Resistencia a antibiticos.
o Gen repE codifica para la replicasa del factor F.
o Gen pecA y pecB cada clula recibir una copia del plsmido el plsmido no se perder.
o Mcs: Presencia de un lugar de clonaje mltiple. El promotor de la ARNpol del fago T7 y T3
flanqueando el Mcs.
o Una nica secuencia cuerpo que slo est para facilitar la construccin de mapas de restriccin.
El cuerpo usado conjuntamente con la protena A de lambda permite linealizar el plsmido por
muy grande que sea (el gen que codifica la protenaA reconoce la secuencia cuerpo) mapa
de restricciones hecho con digestiones parciales en la que se usa elcuerpo y no una diana ER
normal porque al poner un inserto de 300kb muy probablemente el inserto tendr esta diana
de restriccin.

Clonacin en un BAC:
o El ADN se obtiene a partir de cromosomas enteros porque debe ser AND de alto PM.
o Introduciremos las clulas de huevo para extraer el ADN en bloques de azarosa para evitar las
fuerzas de cizalla al pipetear.
o Digestin parcial con EcoRI de estos bloques anlisis de estas digestiones en geles de
azarosa de campo pulsado.
o Clonar el ADN en el banco una vez se haya obtenido.

6.2 YACs:
El mecanismo de clonacin en YAC es el mismo que en BACs. Los YACs, al ser vectores que
despus irn a un medio eucariota no estn sometidos a las condicones procariotas (los BACs no
pueden hacerlo) aunque determinadas secuencias pueden ser clonadas sin problemas.
Como que los YACs son cromosomas dentro de la clula puede haber ms de un YAC diferente.
Son vectores que permiten clonar secuencias ms largas (hasta 1 o 2Mb).
7. Walking.
Es el procedimiento que se sigue para reconstruir los clones obtenidos en la genoteca y reconstruir el
genoma original. No es necesario secuenciar el genoma para este procedimiento ya que a partir del
clon obtenido encontraremos otro que comparta un % de secuencia con el primer permiten colocar este
nuevo clon sobre el mapa del genoma (reconstruir el genoma por hibridacin). El primer clon que
obtenemos acostumbra a ser RFLP aunque tambin un ADN al azar. Si vamos solapando todos los
clones obtenidos perderamos mucho tiempo. Por lo tanto:
7.1 Procedimiento:
Sobre el primer clon (un inserto en un fago lambda) obtenemos una sonda de uno de los 2 extremos del
inserto del fago marcaremos esta sonda para usarla como tal e hibridar toda la genoteca es
posible que encontremos un nuevo inserto que nos hibride en la sonda ya que los fragmentos estn
solapados.
Limitaciones: Algunos de los fragmentos que estamos estudiando puede ser que no parezcan en la
genoteca son zonas inclonables por la presencia de secuencias repetitivas.
Cuando estamos haciendo un procedimiento de walking cogemos una sonda lo ms cercana posible
al extemo 3 del inserto. Y en cada paso utilizaremos una sonda diferente.

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Apuntes - Ingeniera gentica molecular

Deteccin de clones.
Extraccin del ADN: Los fragmentos a, b y c han hibridado con la sonda por lo que escojo el que
haya hibridado ms cerca del extremo 5 del inserto porque la probabilidad de coger clones que
solapen es mayor.
o Mapa de restriccin: Teniendo un inserto de 15-20kb se puede hacer un mapa de restriccin de
este fragmento debiendo optimizar el proceso de obtencin de la sonda:
Colocamos la secuencia promotora de la ARNpol del fago T3 y T7 al vector debido a que estas
2 secuencias promotoras estn compuestas aproximadamente de una caja de unos 20nt que
son reconocidos exclusivamente por estas polimerasas que la transcriben.
Si queremos obtener sonda del extremo 3 del inserto debemos coger el ADN y cortarlo con ER
de corte muy frecuente (digestin completa) brazos e insertos cortados de la mezcla de
fragmentos de 256 pb un trozo correspondiente al extremo 3 del inserto flanqueado por la
secuencia promotora de ARNpol del fago T7 (esta secuencia no ser nunca cortada por esta
ER).
Esto lo tenemos dentro de un tubo si al tubo le suministramos la ARNpol del fagoT7 + ribonts (uno de
ellos marcado) lo incubaremos 1h a 37C aparecer un ARN con una medida similar a la del inserto
que estar marcado obtendremos una ribosonda marcada que corresponde exclusivamente al
extremo 3 del inserto de 20kb. Cuanto ms corta se ala sonda mejor ser el walking.
Usar un vector que nos haga insertos mayor a 20kb (BAC o YAC) las secuencias repetitivas se
encontrarn con mayor probabilidad en medio del inserto por lo que hacer un banco con YAC (vectores
que permiten dar estas secuencias) evitan las secuencias inclonables que impiden el walking.
o
o

8. Jumping.
Es la alternativa para evitar trabajr con YACs.
El jumping alterna las secuencias inclonables o repetitivas que nos hacen perder la pista del
solapamiento de los diferentes clones que hemos ido reconstruyendo.
Partimos de una sonda inicial.
Obtenemos una nueva sonda situada a 300-500kb ms lejos de la primera sonda para saltarnos esta
secuencia.
Cogeremos ADN genmico de muy alto PM y lo digeriremos con ER de corte de poca frecuencia.
Obtendremos fragmentos de 250-300kb (a mayor longitud del fragmento ms largo el salto mejor).
Usaremos un vector plasmdico que porte un gen supresor lo linealizaremos con la misma diana
con la que hemos cortado los extremos del ADNgen para poder clonar.
Si las condiciones de ligacin son las ms favorables (alta [plasmdica]) baja [vector] obtendremos
crculos de contendrn el plsmido con el gen supresor + el inserto del genoma que puede ser tan largo
como queramos (este plsmido es inclonable).
Digerimo con una ER de corte frecuente que no nos corte el plsmido (el inserto se puede cortar)
obteniendo una colocacin de fragmentos muy pequeos del inserto (corresponden al extremo 3 y 5).
De esta mezcla slo debemos clonar el fragmento que porte al vector.
El vector de clonaje ser un lambda que porte un codn de stop prematuro al gen A no podr
crecer en E.COli salvaje pero s en una supresora que compense esta mutacin.
Usaremos lambda como vector de insercin abrindolo y clonndole todos los fragmentos de esta
mezcla slo en el caso de que el inserto que incorpore sea portador del vector lambda podr crecer
en una E.COli salvaje.
Seleccionamo slo el fragmento que porta los dos extremos juntamente con el gen supresor.
Si tenemos un lambda que hibrida con el fragmento x (si hemos hecho fragmentos de 200kb) a 200 kb
del fragmento x tendremos un fragmento Y que si lo marcamos podemos usar como nueva sonda (nos
hemos saltado las 200kb de en medio).
Nos quedamos con los extremos 5 y 3 de los fragmentos y lo que hay en medio lo abrimos.
Ejemplo: Aislamiento del gen de la fibrosis qustica.
Si el genoma est secuenciado los procedimientos a walking o jumping no hace falta hacerlos.
Si nos interesa secuenciar un genoma aunque no perfectamente s deberemos hacer walking y jumping.
Despus de un walking realizaremos una amplificacin para obtener la cantidad suficiente de sonda.
TEMA 5: Estrategias de clonacin en E.Coli.
1. Plsmidos como vectores de clonacin en E.Coli (Fagmidos).
El clonaje con M13 permite obtener una copia en forma de ssADn del inserto. Esto se puede utilizar para la
mutagnesis dirigida, secuenciacin No tiene limitaciones de tamao para los insertos pero s existe

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Apuntes - Ingeniera gentica molecular

limitacin a la hora de replicar el genoma + inserto se produciran deleciones. Para evitar esto se
busca un vector que pueda replicarse como un plsmido y hacer copia en ssADN fagmidos.
Fagmido:

Se trata de un plsmido que lleva incorporada la regin intergnica de M13.

Ejemplos:
pUC 118: Vector de clonaje. Es el pUC 18 pero lleva incorporado en una regin diferente a la regin de
clonaje la regin intergnica M13.
pBSK: Tiene el origen de replicacin de pC y los primeros 146 aa de gen LacZ y puede seleccionarse
por colonias coloreadas cuando se utiliza como plsmido. Se hace servir mucho.
pGEM
pT2
1.1 Conversin de plsmido a fagmido:
El pUC 118 como hemos dicho antes es un fagmido basado en el pUC18 pero que tiene la regin M13.
Todos los genes de M13 son importantes (esenciales) por eso es necesario un fago auxiliar para que
proporciones las funciones que no hemos inserido en el pUC18 en ausencia de induccin de un fago
el pUC118 no recibir ninguna seal y no expreser la regin intergnica funcionar como un
plsmido normal.
Pero si introducimos un M13 este fabrica la proteina II, el M13 fabrica M13 y hace iniciar al pUC118 a
realizar como M13 (el pUC118 tiene la regin intergenica del M13) el pUC118 saldr encapsulado
como M13 en forma de cadena sencilla. Adems tambin encapsidarn los diferentes M13 que
previamente han infectado.
Solo cogeremos pUC18 y no M13 Si introducimos mutaciones en la region intergenica del M13, la
proteina II ir a la regin intergenica de M13 o de pUC118 selecciona la de pUC118 ya que no tiene
ninguna mutacin prcticamente solo encapsida el pUC118.
Si E.Coli no lleva ningn plsmido y el M13 mutado (M13K07) la infecta, la descendencia que se
obtendr ser M13 mutado debido a que esta mutacin no evita el reconocimiento sin que lo dificulta
(ya que no tiene ningn competidor) ste M13K07 es el helper que proporciona toda la maquinaria
necesaria para que el fagmido sea encapsidado en forma de M13.
1.2 Cepas husped para trabajar con fagmidos:
Si M13 solo infecta por el pelo sexual F estas cepashan de ser F+. Aunque F sea un plsmido de
control estricto, se pierde muy fcilmente cuando el cultivo llega a la fase estacionaria.
Se han ideado cepas que evitan esta prdida del plsmido F.
DH5F: No tiene mecanismos activosque eviten la prdida del F en la fase estacionaria.
TG1: Tiene un sistema adicional que consiste en situar una auxotrofia (gen que codifica la Pro) sobre el
factor F. Si dejamos la cepa en un medio mnimo a la que se pierde el factor F se pierde la capacidad de
fabricacin de Pro la clula deja de crecer evita que las clulas que pierden F puedan crecer. Sin
embargo a veces no se puede trabajar en un medio mnimo (ej. Protenas recombinantes).
XL1-blue: El F lleva una insercin con un Tu estable que le posibilita una resistencia a Tc las clulas
que llevanel factor F son resistentes a Tc. Las clulas que pierdan el factor F en presencia de Tc no
podrn progresar tanto en medio mnimo como en medio rico.
RecA1: Son deficientes en recombinacin por el gen RecA. Nos interesa que no recombinen debido a
que as no se forman multmeros de plsmido los plsmidos se mantienen mayoritariamente como
monmeros.
ZAP: Es un que es un vector de insercin clonar fragmentos de 0-10 Kb. Es un mal vector si nos
interesa trabajar con inserto mejor tener el inserto en un plsmido. ZAP aprovecha el hecho de que
infecte muy bien E.Coli y de que sea muy fcilmente escaneado y tambin permite pasar el inserto al
plsmido.
1.3 Montaje
Coger y cortar el bluescript por la mitad de la regin intergenica (la mitad de esta region es el inicio de
replicacin y la otra mitad es el final de la replicacin) insertarlo en un ZAP. Este fago dispone de
todo lo que disponia el bluescript.
Hacer un banco de cDNA. En el medio del lugar de clonaje mltiple clonamos un banco de cDNA
encapsidacin screening clonar los cDNA que llevan el DNA
Coinfectar el que nos interesa con M13K07 el M13 producir la proteina del gen II que encuentra el
inicio y el final de la replicacin en forma de cadena sencilla.

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Apuntes - Ingeniera gentica molecular

E.Coli produce un M13 que contiene circularizado y en cadena sencilla el fagmido introducido dentro
de ZAP ms el clavo introducido en el lugar del clonaje mltiple.
Calentar para eliminar E.Coli + de M13 e infectar dentro E.Coli el ssDNA se convierte a dsDNA.

1.4 Clonacin de productos de PCR


Tenemos una doble cadena amplificada por PCR A independiente del molde (muchas polimerasas
cuando acaban de copiar, copian una A independiente del molde) los productos de PCR muchas
veces no son roms sin que son sobresalientes en el extremo 3 aprovechar esta A para hacer ms
eficiente el clonaje de estos productos de PCR.
T-vectores: fagmido que est previamente linealizado para una diana que da extremos roms (EloR5)
tratar el bluescript con EloR5 linealizar el vector por el lugar de clonaje mltiple extremos
sobresalientes.
Coger la Terminal transferasa + T didesoxi y tratar este vector linealizado se colocar una nica T en
el extremo 3 (es un didesoxi).
Este vector no puede religar con l mismo pero si circularizar y ligar en presencia del inserto (puentes
de H entre A y T) clonaje especfico.
Todas las polimerasas que no tienen actividad exonucleasa 3-5 tienen actividad correctora de pruebas
(el producto de la PCR puede tener mutaciones porque algunas polimerasas no tienen esta actividad
correctora) utilizar siempre polimerasas correctoras.
Polimerasas TAC, TC1, TTH:
o Ponen A en 3
o Actividad exonucleasa 5-3 no son correctoras.
o Se utilizan para el diagnstico y deteccin.
Otras polimerasas:
o Productos con extremos romos.
o No tienen actividad exonucleasa 5-3.
o Si tienen actividad correctora de pruebas exonucleasa 3-5 aseguran que lo que vamos a
clonar no tenga mutaciones.
o Al acabar los 25-30 ciclos PCR aadimos TAC polimerasa en el ltimo ciclo para que aada A
cuando el producto ya est hecho, o como alternativa se puede hacer ligacin por los extremos
romos.
Cuando el vector recircularza por EcoRV vuelve a dar la diana ER que ser cortada por la ER.
Cuando circularas con el inserto no se genera la diana no es cortado con la ER.
El inserto no puede ligar con l mismo porque tiene extremos 5-OH (deben ser 5P).
Pero si en medio del inserto hay esta misma diana ER este mtodo no se puede hacer servir.

El ADN recombinante es un buen mtodo para analizar genes de proyecto genoma (hay muchos
insertos a examinar y muchos posibles vectores) trabajaremos con ER y ligasas, la transferecia de
insertos entre vectores es lenta.
Se hacen servir las secuencias attp de lambda para que al entrar en E.Coli quede en lisogenia
(recombina con la secuencia attb de E.Coli):
o En presencia de la integrasa y el factor de integracin recombinacin especifica del lugar
(todo el genoma de lambda pasa a formar parte del de E.Coli) est linealizado.
o En presencia de integrasa, xis y YHF el fago se escinde fago en forma de genoma circular.
o Estas secuencias (attb y attp) se utilizan para tranferir secuencias entre el plsmido colocar
las regiones attb y attp flanqueando los insertos con la accin de las encimas YHF, int y xis
se podrn pasar insertos de un vector a otro.

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Apuntes - Ingeniera gentica molecular

TEMA 6: Mutagnesis in Vitro.


La disposicin de mutantes permite, en muchos casos, hacer estudios entre la estructura del gen y su
funcin (trabajando a nivel de genes). Antes, la obtencin de mutantes se haca mediante el azar en
procariotas y va radiacin UV y agentes mutagnicos en eucariotas este sistema no permita observar
mutantes en un gen u otro.
Mutagnesis en eucariotas:
Estos mutante no estn caracterizados (no sabemos dnde se posiciona la mutacin dentro del gen) los
mtodos para hacer que los procesos mutagnicos sean dirigidos (en qu gen hacer el cambio y qu tipo de
cambio) o que los procesos de mutagnesis al azar sean finos se hizo:
Creacin de protenas hbridas va PCR recombinante para unir diferentes secuencias por el punto
deseado protenas hbridas.
Anlisis mutacionales sistemticos.
La mutagnesis dirigida no se poda hacer hasta el nacimiento del ADN recombinante.
1. Mutaciones silenciosas.
Una mutacin silenciosa es aquella que provoca un cambio en la secuencia del ADN que no provoca cambio
en la secuencia de la protena.
Para realizar una mutacin por cassette es a menudo necesario poner dentro de una determinada
secuencia una diana de restriccin que no debe alterar al gen (mutacin silenciosa).
Usos:
o Introduccin de dianas de restriccin.
o Adaptar el uso de codones en la expresin de protenas recombinantes.
2. Mutagnesis dirigida.
2.1 Mutagnesis por cassette:
Se utiliza si nuestro gen dispone de dianas de ER relativamente cercanas a la secuencia de queremos
cambiar (100pb) y son nicas.
Las 2 dianas deben ser preferentemente diferentes.
Debemos cortar estas dianas digiriendo el plsmido en el que se haya esta secuencia con las 2ER
(como HindIII o EcoRI)
Separar mediante EF para eliminar el trozo de 100pb entre las 2 dianas.
Conseguir 2 oligonts complementarios (la secuencia de los cuales queremos cambiar segn nuestros
intereses) que deben tener una mutacin en el punto deseado y extremos cohesivos H y E.
Ligar el plsmido abierto con estos 2 oligonts sintticos.
Con las 2 dianas de ER la nica manera de circularizar el plsmido es que se coloquen los 2 oligonts
sintticos (el plsmido no puede recircularizar ya que las 2 dianas son diferentes) plsmido viable
que dar colonias al introducirlo dentro de E.Coli prcticamente todas las colonias aparecidas
tendrn el plsmido con la secuencia mutada.
Este mtodo es tan eficiente que se utiliza incluso para obtener colecciones de mutantes usando
oligonts degenerados que realizan 4 mutantes en lugar de 1 (pero si hacemos muchas mutacioneses
muy difcil escanear todas las colonias diferentes se debe trabajar como mximo con 4 mutaciones.
2.2 Mutagnesis por extensin del primer:
Debe hacerse con fagmidos, M13
Este mtodo ya no se hace servir porque ha isdo sustituido por la PCR recombinante.
Se usa el ssADN de la secuencia del gen donde introducimos la mutacin (queremos que una A del
molde se convierta en una G).
Encargamos una secuencia complementaria a la secuencia que queremos mutar con el cambio que
queremos introducir (encargar oligonts con una G).
El cambio debe estar situado en el centro del oligont que encargamos (a ser posible porque):
o Si est en el 3 este extremo puede quedar separado del molde se podr hacer la secuencia
complementaria al molde va ADNpol.
o No debe impedir que podamos hacer la cadena complementaria del ADN de ssADN (el oligont
es el cebador).
La ADNpol se coloca en 5 y extiende la mutacin hasta hacer toda la cadena nueva el 5 no debe
haber mutacin porque el oligont quedara desparejado tendramos un nick en la cadena doble
generada que no se podra sellar ni ligar.

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Apuntes - Ingeniera gentica molecular

Ligamos con T4 ADN ligasa y transformamos sobre E.Coli:


o La mutacin se puede haber dado o no casi todo los M13 introducidos deberan tener la
mutacin.
o Pero E.Coli, antes de replicar, repara esta mutacin debido al patrn de metilacin de la cadena
doble de ADN (no presenta mutilacin la doble cadena complementaria ya que viene in Vitro)
E.Coli corta el punto donde est introducida la mutacin por el oligont comercial produciendo
que casi todas las cadenas que obtenemos no estn metiladas deberemos hacerlo sobre
una E.Coli dam- para que el 50% de las colonias presenten mutacin screening muy serio.
o Para pasar del 50% al 100%: la cepa de partida es dam+ dnt- (defectivas en dUTPasa, niveles
de U muy altos) mug- defectivos en uracilo N-glicosilada. Mug si se ha incorporado alguna U al
ADN y si estn las escindir reparndolos por T estas cepas tienen un nivel de U
incorporados en el ADN muy altos.
o Si cogemos la cadena del M13 como secuencia para modificar (mutacin centrada), y la cadena
paterna (no mutada de M13 con muchas U) al transformar en E.Coli la cadena paterna ser
directamente degradada porque tiene demasiadas U la cadena con la mutacin es la nica
cadena de M13 que progresar.

2.3 Mutagnesis por PCR:


Se utiliza un megaprimer.
Se aprovecha la presencia previa a los plsmidos en los que clonamos el inserto de unas pequeas
secuencias flanqueando el lugar de clonaje mltiple que permiten amplificar de forma fcil y eficiente sin
optimizar la PCR lo que hay clonado en el lugar de clonaje mltiple (primers universales y reversos) si
ponemos los olignts adecuados.
Teniendo el vector con el inserto la PCR con el cebador A que amplifica en direccin 3 del primer A y
el mutagnico que lleva la mutacin deseada que amplifica en direccin primer universal ya tenemos
la mutacin en doble cadena en el producto de la PCR (se ha amplificado desde el primer A hasta el
lugar donde queramos introducir la mutacin).
Se realiza una segunda PCR con todo este producto + cebador reverse para obtener la mutacin en el
resto del gen:
o Cogemos el primer producto de la PCR y le ponemos el encebador reverse la ADNpol se
engancha y comienza a copiar.
o De esta forma obtenemos la doble cadena del gen con la mutacin en forma de doble cadena.
o Obtenemos prcticamente slo el gen mutado no har falta secuenciar este gen para ver si
est mutado.
o Al realizar una mutacin dirigida debemos hacerlo con insertos mximo de 500b ya que as la
probabilidad de aparicin de errores es menor.

Quick change:
Slo se hace una PCR.
Tenemos el ADN y el plsmido que contiene el vector + el inserto en forma de doble cadena.
Diseamos los olignts cebadores (los 2 deben llevar la mutacin en el medio y deben ser
complementarios al inserto).
Pondremos los oligonts + el ADN y el plsmido: Cuando las ADNpol copian se paran cuando
encuentran la cola del cebador.
Volvemos a poner los oligonts que priman hacia un lugar que no se puede copiar ya que no hay molde
el plsmido inicial puede volver a amplificarse.
Despus de hacerlo por ciclos el nico sustrato capaz de ser amplificado es el plmido.
La amplificacin es lineal porque el producto de la PCR no se puede amplificar la reaccin de PCR
no es en cadena, no es exponencial.
Digerimos con dpnI que corta y separa el produto de la PCR del plsmido porque el producto no est
metilado en las A de la secuencia GATC.
Al digerir los extremos del producto de la PCR sin complementarios deberemos hibridar y ligar con
T4ADNpol.
Los oligonts son complementarios la reaccin no es exponencial sino lineal el producto de la
PCR es lineal con extremos cohesivos.
Sistema que permite hacer una amplificacin exponencial:
Un oligont lleva una mutacin y el otro est situado en el extremo 3 del que lleva una mutacin (en lugar
de ser complementario)
Slo uno lleva la mutacin ya que no se solapan sino que uno comienza cuando el otro acaba.

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Obtenemos una PCR en la que se copia el molde donde nos hibrida el siguiente nt producto
exponencial y lineal producto con extremos romos ligasa.
Problema: Si en los extremos del nt slo que falte una base del extremo 5 tendremos una delecin en
los extremos 5 de los oligonts (deleciones en las regiones que separan los 2 oligonts).

* nicamente cuando tenemos claro el cambio que queremos hacer (requieren un conocimiento previo a la
secuencia, estructura o plegamiento de la protena) realizamos una mutagnesis dirigida lo que se hace
ahora ms es la mutagnesis al azar in Vitro.
3. Mutagnesis al azar.
3.1 Mutagnesis por bisulfito:
El bisulfito transforma las C en U por desaminacin.
Cogemos el plsmido cADN de doble cadena y producimos cadena selladora de este ADN.
Cogemos un primer no mutagnico hacer la segunda cadena (Klenow copia el molde y cuando
encuentra una U coloca una A)
Cortar con las ER con las que previamente habamos cortado elinserto separarlo del plsmido que
tambin estar mutado.
Introducir este inserto mutegenizado en un vector nuevo obtendremos muchos mutantes ver cul
de ellos ha cambiado sus funciones (las funciones del vector).
Estos sistemas de mutagnesis al azar deben ir asociados a sistemas de detecciones simples y rpidos
para analizar los mutantes.
3.2 PCR tendiente a error:
Utiliza una polimerasa que no tiene actividad correctora de pruebas.
Se colocan 3 nts con la concentracin habitual y uno con una [] 2 o 3 veces menor que las de los otros
cuando la polimerasa debe incorporar el nt de baja [] muy a menudo se equivoca y coloca un de los
nts de mayor [].
3.3 Cepas deficientes en reparacin:
Introducen mutaciones en del plsmido pero tambin en su propio genoma difcil trabajar con ellas.
Es como un sistema que combina 2 motores evolutivos (mutacin y recombinacin).
Para dar lugar a nuevos pasos en la evolucin es necesario que se produzcan conjuntos de mutacin.
3.4 ADN shuffling:
Usa la mutacin y la recombinacin.
En un ADN de procedencia arqueolgica es muy difcil obtener fragmentos de xKb ya que estn
fragmentados extensivamente. Para amplificar este tipo de ADN no se hace con una PCR normal.
Debemos partir de ms de una clula.
Si ponemos este ADN sin oligonts cebadores en un aparato de PCR no aumentaremos la
cantidad del ADN a lo largo de los ciclos pero en cambio s aumentaremos su largada es
entonces cuando s podemos amplififcar por PCR.
Estamos recombinando in Vitro las mutaciones que haba en las diferentes cadenas de ADN.
Realizamos unos cuantos ciclos por PCR sin oligonts cebadores obtenemos diferentes
combinaciones de los diferentes fragmentos de ADN (previamente hemos tratado con ADNasaI que
corta) que combinan las diferentes mutaciones que existen en diferentes posiciones.
Amplificacin con oligonts.
4. Anlisis mutacionales sistemticos.
Sirve para demostrar la presencia de regiones que codifican para una determinada funcionalidad (ej:
promotor). Se debe conocer la funcin.
4.1 Linker scanning mutagenesis:
Se trata de ir haciendo deleciones cada vez ms largas sobre el ADN que queremos averiguar si
codifica para una determinada funcin hasta que desaparece la funcin.
Debemos coger el ADN (clonado con 2 ER diferentes; combinacin de exonucleasa Exo3 + SI) o
directamente la exonucleasa Bal31 (dejan los extremos cohesivos) y clonarlo en un vector.
Cortamos el inserto para una diana ER el inserto y el vector se linealizarn.
Lo trataremos con Bal31 a diferentes tiempos colocacin de las deleciones.
Queremos eliminar slo el inserto por un extremo dejamos el plsmido.

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Cortamos con troa ER separacin del inserto y del plsmido.


Clonar direccionalmente estos insertos que son pregresivamente ms pequeos en un plsmido
diferente.
Obtendremos plsmidos diferentes los transformamos en E.COli y miramos la prdida de la funcin
en el momento en el que se pierde la funcin tenemos mapeada la localizacin de la mutacin.

4.2 Anlisis sistemtico:


Sustituimos un aa por los otros 20 ver si la funcin ha mejorado o no y cmo hacerlo:
1) Hacer 20 mutagnesis dirigidas.
2) Hacer 1 mutagnesis dirigida.
Cambiar los aa por un codn stop.
En E.Coli tenemos una gran cantidad de cepas supresoras para el codn stop.
Introducir por transformacin el gen mutado en 20 cepas supresoras diferentes que coloca el aa
deseado en la posicin del codn stop.
Con una nica mutagnesis podemos estudiar el efecto de esta mutacin.
4.3 Protenas quimricas:
Protenas que constan de 2 partes cada una de ellas provenientes de 2 protenas diferentes.
Estas protenas se consiguen va PCR recombinante.
Usos:
o Industriales (una protena con 2 centros activos diferentes).
o Para ver interacciones entre protenas.
4.4 Traduccin in Vitro:
Es posible crear un tARN que contenga un aa determinado.
Metilamos el aa de este tARN con una metilasa especficamente o introducir aa nativos.
Podemos modificar protenas mientras se estn sisntetizando (tARN) no se afecta la secuencia
codificante.

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TEMA 7: Expresin de protenas recombinantes en E.Coli.


Si tenemos una protena muy interesante pero muy difcil de producirla en grandes cantidades
convencionalmente debemos coger el gen y expresarlo en un husped muy conocido sustituiremos el
husped natural por el artificial estamos expresando protena de forma recombinante.
El husped artificial acostumbra a ser E.Coli ya que se conoce muchsimo. El problema de E.Coli es que
es procariota y si queremos expresar una protena eucariota tendr modificaciones
transcripcionales. Los huspedes pueden ser levaduras, clulas
La parte ms importante es la optimizacin de la expresin a nivel de:
Gen
Protena
Segn el tipo de plsmido que utilicemos.
1. Expresin de protenas a travs de genes.
1.1 Construccin y eleccin del promotor ptimo:
1.1.1 Promotores inducibles:
Debemos escoger un promotor inducible porque nos interesa producir la protena en grandes
cantidades por lo que la clula se somete a una situacin de estrs muy elevada.
Por lo que debemos inducir la expresin en las condiciones de crecimiento celular ms ptimas (a mitad
de la fase de crecimiento logartmico) en ese mismo momento induciremos dicha expresin.
Debemos usar plsmidos que contengan promotores inducibles como:
Promotor Lac con la mutacin uv5:
o Regulado por la lactosa y cAMP.
o Su expresin es independiente de los niveles de cAMP lo inducimos cuando queremos.
o Es un opern relativamente dbil acumulan protenas recombinantes pero no hasta unos
niveles txicos para la clula.
Promotor Trp, recA, :
Son ms fuertes que el opern Lac.
Promotores sintticos (Ptec):
o Mxima expresin del transcrito.
o Combina la regin -35 del opern Trp y la -10 del opern Lac.
o En condiciones adecuadas puede llegar hasta a un 30% de peso seco correspondiente a
nuestra protena.
Plsmido pMAL:
o Opern Lac con una mutacin Q en el LacI promotor ser inducible.
o Tiene el promotor Ptec que debemos bloquear para slo trascriba cuando nos interesa (es muy
fuerte).
o La mutacin Q hace que haya una cantidad muy grande de LacI el opern Lac est muy
reprimido nicamente cuando aadimos inductor habr expresin de las protenas.
o Este tipo de plsmido es til cuando la protenas que expresamos no es txica.
1.1.2 Sistema de promotores dobles:
3 Mecanismos de control:
Plsmido donde clonaremos el gen.
Cromosoma: segundo plsmido de la clula husped.
En otro plsmido ponemos un inhibidor de esta polimerasa (lisozima de T7).

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Hasta que no aadamos el inductor no se sintetizar el ARNpol del fago T7 y aunque se sintetizara esta
se vera bloqueada en el operador Lac del plsmido donde clonamos el gen el represor regula a 2
niveles.
Aadimos un tercer mecanismo de control para evitar las pequeas sntesis de ARNpol del fago T7 en
ausencia del inductor.
o En otro plsmido ponemos un inhibidor de esta polimerasa (lisozima de T7).
o Cuando se produce la lisozima significa que la clula ha de lisar ya no se ha de sintetizat la
ARNpol de T7.
o La expresin de esta lisozima debe ser constitutiva y muy baja para: no lisar la clula husped y
para ser fcilmente superable cuando aadamos el inductor.
Todos estos promotores son promotores de todo o nada, si queremos una situacin intermedia
deberemos escoger plsmidos que porten el promotor y el operador del opern arabinosa
podremos regular fcilmente la cantidad de protena recombinante dependiendo de la [arabinosa]. Por
ejemplo el plsmido pBAD.

1.2 Uso de codn:


La optimizacin del uso de codn es inherente de las secuencias especficas del gen.
AGA y AGG son muy frecuentes en eucariotas para codificar Arg y muy infrecuentes en E.Coli. Si
estos codones los expresramos en E.Coli pasara que:
o Se agotaran los pocos tARN de E.Coli para los codones AGA y AGG parada de la sntesis
proteica.
o Problemas en la estabilidad del ADN por al no traducirse se degrada.
o Problemas en la estabilidad del plsmido camabiar estos codones infrecuentes por
mutagnesis dirigida.
Si el 20% de lo codones son de los infrecuentes y el gen es pequeo (menos de 1,5kb)
construiremos un gen sinttico en lugar de cambiar codn por codn.
La sntesis de protenas puede ir mal debido a que hay codones infrecuentes o porque la traduccin no
est bien optimizada:
Cualquier codn acabado en C o en U especifican el mismo aa.
Si la ltima base es una C las 2 primeras debern ser A o U ya que traducen siempre ms
eficientemente C con A oT conjuntas (con los acabados en U pasa al revs).
o GGC, CCC
NO
o TTC, AAC, ATC
S
As se puede multiplicar por 10 la sntesis proteica.
1.3 Genes sintticos:
Se utilizan para cuando debe hacerse una gran cantidad de codones.
Cuando se dispone de la secuencia de la protena por no la del gen, a partir de la secuencia proteica +
el uso del codn podemos construir el gen.
Construccin de un gen sinttico:
o Es un procedimiento caro y se debe tener pptidos:
o Encargar oligonts los ms largos posibles (80b)
o Coger la secuencia del gen.
o Encargar piezas como los adaptadores sobre la secuencia del gen que solapamos se van
encabalgando.
o Poner los oligonts en un tubo de ensayo por complementariedad vuelven a generar la
secuencia original (despus de la hibridacin)
o Uso de la ligasa para la liga de los genes.
o Se debe vigilar que en las junturas no haya zonas capaces de reconocer otras zonas por
hibridacin. Las complementariedades deben ser amplias.
1.3.1 Elementos upsteam por encima de la caja -35:
Estos elementos aumentan la eficiencia de la traduccin si la secuencia existente es relatiamente parecida a
la secuencia consenso y rica en AT.
Estos elementos slo funcionan sobre productores de E.Coli.
Facilitan la interaccin de la suunidad alfa de los ARNpol y la caja TATA del promotor.
Pueden incrementar por 100 el inicio de la transcripcin.
Son elementos que se pueden poner delante del gen.
Regin Shine-Dalgarno:

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Apuntes - Ingeniera gentica molecular

o
o
o
o
o

Es una secuencia seal que hace que la subunidad pequea del ribosoma se enganche en el
ARN.
Si no est en un gen la transcripcin es poco eficaz.
No debe formar estructuras secundarias con el ARN que va detrs la caja shine-dalgarno
se bloquea y no se produce la traduccin.
Si se forma un bucle entre el Shine-Dalgarno y el extremo 5 del gen cambiaremos por
mutaciones silenciosas esta zona del 5 del gen no formacin del bucle.
La caja shine-dalgarno est en el plsmido y en el gen en el cromosoma.

1.3.2 Inclusin al plsmido de expresin recombinante de terminador de la trasncripcin:


Clonar el gen detrs del promotor del plsmido produccin del gen.
Nos interesa que la traduccin quede parada justamente detrs del gen.
o Menor gasto energtico celular.
o A otras zonas del plsmido hay otros genes que favorecern la produccin de otras protenas
que no nos interesan.
o Pueden haber antitranscritos que no se han de producir.
La mayora de los terminadores son Rho independientes.
1.4 Eleccin de la cepa husped:
Debemos seleccionar la cepa husped para incrementar la cantidad de mARN.
Uso de promotores fuertes aumentan el nivel de mARN.
Evitar que se degrade el ARN alargando su vida media mediante:
o Huspedes deficientes en ARNasas (mutantes de la ARNasaII y PNPasa).
o Inclusin en el extremo 5 y 3 del mARN secuencias complementarias porque este ARN es ms
resistente a as ARNasas (el bucle debe estar antes de la regin shine-dalgarno.
Factores atribuibles a las protenas que afectan:
o Saturacin del sistema de xaperonas: Al producir cantidades masivas de una determinada
protena la protena que estamos produciendo estar, como mnimo, mal plegada.
o Modificacin postraduccional: Existen otras protenas que requieren de modificaciones
postraduccionales para plegarse correctamente E.Coli no puede hacer estas modificaciones
no se podrn plegar.
o Aparicin de zonas hidrofbicas: Expuestas muy numerosas ya que las protenas van
agregndose entre ellas agragdos cada vez mayores que a menudo quedan localizados en
cuerpos de inclusin si intentamos producir una enzima esta no ser activa.
Soluciones:
o Bajar la T a la que estamos expresando la protena recombnate (uno 25-30C).
o Suministrar a la clula aquello en lo que es deficiente (Ej: cantidad de xaperonas para que en un
momento determinado sea adecuada para el plegamiento proteico) esto nos lleva a diseo
de plsmidos que porten un sistema de xaperonas introducido (Ej: Sist ADN-K, GroEL o
GroES):
Estos plsmidos no sirven para deshacer un agregado una vez ya se ha formado porque
simplemente evitan que se formen.
Los plsmidos deben estar construidos sobre vectores de grupos de incompatibilidad diferentes
de los de E.Coli para evitar cambiar el vector a la hora de expresar la protena recombinante
en E.Coli pueden coexistir todos (los genes de xaperonas pertenecen a GI diferentes).
Portan diferentes promotores y diferentes cassettes de xaparonas
Debemos inducir los plsmidos antes de la expresin de protenas recombinantes para evitar la
formacin de cuerpos de inclusin y maximizar la [protena] soluble.
Hay casos en los que es mejor obtener los cuerpos de inclusin por son estructuras globulares
con una excelente capacidad inmunolgica (funcionan muy bien como vacunas y son muy
fcilmente purificables).
o Produccin de la protena como protenas de fusin (fusiona nivel gnico, el gen sobre el cual
queremos expresa la protena a otra que de alguna manera ayuda a plegar la protena
recombinante)
Este tipo de fusiones hace que la protena recombinante se exprese bien en el extremo Cterminal de una protena bien plegada.
La protena pasagera queda bien plegada porque la protena acta como xaperona
intramolecula de la protena pasajera que ayuda a su plegamiento.

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Apuntes - Ingeniera gentica molecular

Una vez producida la protena recombinante eliminar la protena principal (MBP), muchas veces
la protena recombinante se insolubiliza al eliminarla.
Introducir en los plsmidos dianas de protelisis para facilitar la purificacin posterior:
Clonar como inserto la protena recombinante que queremos expresar.
Despus del promotor viene el gen malE (Codifica para la MBP) e inmediantamente hay un
lugar de clonaje mltiple.
Clonar el inserto depus de la MBP antes del LacZ.
Normalmente el lugar de clonaje mltiple existen varias dianas de protelisis: Las ms
frecuentes son las enteroquinasa o factor 10, cuanto ms grande es esta diana menos
posibilidad existe de cortar la secuencia pasajera porque hay una menor posibilidad de que esta
diana aparezca en esta diana.
Antes del lugar de clonaje mltiple ya hay normalmente las dianas de la protelisis; si no estn
debemos ponerlas vas colas de PCR.

Destino de la protena recombinante:


E.Coli est bastante compartimentada; la protena se hayara entre el periplasma y la pared.
Su citoplasma es ligeramente reductor, eso quiere decir que imposibilita la formacin de puentes
disulfuro si el plegamiento va a sociado a esta formacin habr problemas.
El periplasma es un medio oxidante pero el rendimiento de la acumulacin de protenas recombinantes
es menor que en el citoplasma.
Si queremos que se exprese en el periplasma deberemos incluir un pptido saal en la N-terminal (7 u 8
aa hidrofbicos segudiso de unos aa polares).
En el paso del citoplasma al periplasma se elimina el pptido seal.
Hay plsmidos que ya llevan estos pptidos seal.
Se puede sobresaturar el translocn 7 (enva la protena con el pptido al periplasma) si expresamos
mucha protena no utilizaremos promotores fuertes.
Soluciones:
Se han desarrollado mutantes que permiten formar puentes disulfuro en el citolplasma de E.Coli:
Trx- (tirodoxina- rompe especficamente los puentes disulfuro formados al azar en el citolplasma de
E.Coli).
Protena DsbC expresada en el citoplasma:
o Expresar la disulfur-isomerasa en el citoplasma en lugar de en el periplasma.
o Esta isomerasa es una xaperona que va iternado entre los diferentes puentes disulfuro.
Enviar la protena directamente al medio externo:
o E.Coli virulenta dispone de un nico sistema para hacerlo (lisis) fabricando un poro especfico
para excretar la toxina.
o La presencia de una determinada secuencia de aa en la toxina en la C-terminal permite el paso
a travs de los poros.
Fusionar la protena con un fago (phape display):
o Fusionar la protena a una de las protena de la cubierta del fago M13:
o Protena p3: est el extremo interior de la cpside, tolera fusiones de pptidos relativamente
grandes.
o Protena p8: no es tan frecuente y tolera fusiones de pptidos pequeos.
Procedimiento:
Fagmido que nos lleva el origen de replicacin del M13 y el gen que codifica la protena p3.
Clonar: Protena de fusin al extremo N-terminal de la protena p3 del M13 mediante ER vector
recombinante que es un fagmido donde nuestra protena recombine.
Introducir el fagmido en E.Coli e infectarla con el M1307 (helper) el fagmido se encapsida en forma
de M13y portar al extremo N-terminal la protena p3 que ste codifica con un promotor ms fuerte.

1.5 Phage display:


Ventajas: Fsicamente el vector, el plsmido, el M13 y el ADN quedan unidos con la protena que codifican
si tenemos un sistema para captar la protena, este sistema permite captar tambin el ADN. (Ej: Ac
monoclonal para desarrollar un diagnstico, este Ac en muchos casos la eficiencia de reconocimientos ser
discreta mejorar el Ac para el reconocimiento).

Procedimiento:
Clonar la parte que reconoce el Ag (dominio variable) bajo control del promotor del fagmido haciendo
expresar la parte fusionada en M13.

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Apuntes - Ingeniera gentica molecular

Las regiones de reconocimientos de Ag (CDS) estn en el extremo C-terminal de la subunidad pesada y


ligera (en el 5 del gen), el resto del Ac no participa en la unin del Ac.
Clonar la parte 5 del gen en una fagmido y expresar la CDS en el fagmido hacer reaccionar M13
con el Ag permite capturar la variante gentica que determina el Ac.
Planning: Capturar el gen a partir de la protena:
En todo los Ac la N-terminal son idnticos, la zona variable comienza uno 10-15 nt ms tarde.
Todos los anticuerpos comparten el mismo 5 y 3 de los CDS de la cadena ligera y pesada
independientemente de la secuencia intermedia (secuencia variable y desconocida) amplififcacin
por PCR.
Coger y unir los 2 genes por PCR haciendo serivr un linker y un sistema parecido a la PCR
recombinante.
Una vez unidos los linkers clonar el linker en el plsmido.
Transformar el fagmido a E.Coli y coinfectar el M13 heleper.
Hacer reaccionar los M13 con el Ag seleccionar aquellos que se unan mejor al Ag que al Ac inicial.
La variablidad se genera por mutagnesis al azar o por cassette.

1.6 Rapid translation system:


Expresar una protena in Vitro antes: Coger el ARN que est produciendo y ponerlo en contacto con
toda la maquinaria de traduccin.
Los sistemas actuales son extraordinarimente eficientes para producir ARN in Vitro:
o Agotamiento de los sustratos disminucin de traduccin proteica (fermentador en el que
vamos entrando los productos necesarios y eliminamos los productos que pueden inhibir como
los ya usados).
o Membrana que permite conservar los elementos necesarios (ribosomas, t-ARN).
o En continuo entra y salen productos: a partir de una machacado de E.Coli si lo colocamos
dentro junto con el plsmido que queremos clonar se pueden conseguir 5 mg de protena.
* Esto no es aplicable en la produccin industrial pero s para el laboratorio.

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Apuntes - Ingeniera gentica molecular

TEMA 8: Clonaje en organismos diferentes a E.Coli.


Cuando queremos producir el producto de una ruta bioqumica si el paso limitante se debe a una de las 3
enzimas en E.Coli no podramos clonar esta nica enzima para alterarlo si no que deberamos de clonar
las 3 enzimas.
De una bacteria patgena podemos extraer vacunas a partir de sta atenuada (atenuados algunos de sus
genes de toxicidad. Pero entrar ADN en una bacteria es muy difcil ya que las bacterias presentan barreras:
Derrotar barreras fsicas (membrana, pared):
Electroporacin:
Mediante dipolos a los 2 extremos de la membrana del organismo hacemos pasar una coleccin de
microorganismos bajo una E muy fuerte (Kv cm) las membranas se adelgazan. * Cada
microorganismo se electropora en condiciones diferentes.
Conjugacin:
Transfiere Adn de forma natural necesitan el contacto de dos microorganismos.
Derrotar barreras qumicas (enzimas..):
Introducir mucha cantidad de ADN por las ER:
Las ER pueden llegar a degradar al plsmido de entrada por lo que es aconsejable introducir mucha
cantidad de ADN.
Barrera a nivel de gen:
A veces se necesita la expresin de un Ab o promotor del Ab para que el plsmido sea estable:
Traduccin del gen en Gram+ vs Gram -:
Expresar un gen de Gram en Gram + no tarea fcil (al revs s) ya que la secuencia shine dalgarno
(GGAGG) es necesaria para iniciar la traduccin.
o En Gram -: es muy frecuente que el inicio de la traduccin se de un nts que tienen una parte de
la secuencia shine dalgarno conjunta con la protena ribosomal S1.
o En Gram +: la protena S1 es inexistente.
1. Alternativas para clonar en bacterias diferentes de E.Coli.
1.1 Colocar el gen en un plsmido:
Mirar si en la especie existe algn plsmido descrito y caracterizado (si no lo hay debemos usar un
plsmido de amplio rango de husped) plsmidos capaces de replicarse y ser funcionales en un
n ilimitado de especies bacterianas.
Existen 3 grupos de incompatibilidad: Q, P y W que codifican para una sistema de replicacin completo:

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Apuntes - Ingeniera gentica molecular

1.1.1 Rsf 1010:


Es el ms pequeo.
Replica prcticamente todos los Gram- y mucho Gram+ primera eleccin.
En su regin central posee:
o Genes rep (genes de replicacin): repA, repB, B y C
o 3 genes mob (movilizacin): Nickan en OriT ssADN en el plsmido que podr transmitirse.
o RepB y mobA son la misma enzima.
o Slo tiene 6 promotores que se encargan de traducir a partir de P1, P2, P3 justo sobre OriC y
P4 transcripcin de los genes mob y rep; P1 y P3 desde mob hasta repC.
No maquinaria Tra:
o Esta permite la formacin del pelo de conjugacin Rsf1010 no se puede transmitir por
conjugacin l mismo necesita la presencia de otro plsmido que s codifique la
maquinaria Tra.
Tiene 2 marcadores utilizables:
o 1 gen de resistencia a sulfamidas.
o 2 genes de resistencia a estreptomicina.
o Se transcriben bajo lo spormotores P5 y P6.
o Si clonamos r-sulfamida no inactivamos la resistencia a Strp.
o Si clonamos sobre P5 y P6 con Pst inactivamos Strp y sulfamida.
o Si clonamos sobre EcoRI slo inactivamos Strp pero es un mal marcador.
Todas las bacterias frente a un antibitico poseen una concentracin mnima inhibitoria por encima de la
cual no crecen a menos que tengan el gen de resistencia (este gen eleva el lindar de esta [] a 3 veces o
a 10 veces.
La sulfamida no eleva mucho esta [inhibitoria] ya que clonemos sobre lo que clonemos nunca
tendremos Strp como marcador. deberemos mejorar el plsmido (pBsK519).
1.1.2 pBsK 519 (Rsf1010 mejorado):
Tienen tambin los genes rep y mob.
Eliminamos los 2 genes de resistencia y los sustituimos por resistencia a canamicina (que proviene del
trasposn 903 muy buen marcador).
Agregamos dianas en un lugar de clonaje mltiple.
1.1.3 Plsmidos aislados del mismo grupo de incompatibilidad (RK2 RP4):
Tienen todo: rep, mob y tra.
Son transmisibles por conjugacin a prcticamente todo.
Replica a menos especies que el de antes pero mob y tra son lo smejores descritos hasta ahora (el
mejor sistema de conjugacin).
Dispone de medidas que evitan su prdida matando a las clulas que pierden el plsmido.
Se han desarrollado versiones ms pequeas para poder trabajar ( p5b).
o Slo tienen la maquinaria de replicacin.
o OriV, OriT y TraA (replicacin) no se transmite por conjugacin.
o Poseen genes de resistencia a Abs.
o Si en la clula donadora podemos integrar un RP4 que no disponga de OriT ste proporcionar
la maquinaria mob y tra en trans por lo que el pequeo plsmido podr conjugarse.
o La cepa receptora acostumbra a ser E.Coli S17-1 (portadora del plsmido RP4 que en su
OriT tiene una insercin por un Tn OriT mutada.
2. Transformacin por minitransposones.
Cuando queremos modificar un genoma bacteriano cuando no tenemos plsmidos o cuando queremos
introducir genes utilizamos los minitransposones o la recombinacin homloga.
2.1 Minitransposones:
Transposones compuestos:
2 IS que contienen los genes de la transposasa.
o Secuencias flanqueando 2 IS.
o En medio de las IS hay un gen resistente a un Ab los transposones irn muy bien si la cepa
receptora es estable.
Minitrasnposones:
Son transposones que se mantienen estables una vez insertados.

42

Apuntes - Ingeniera gentica molecular

Escogemos un plsmido donde colocamos el gen de la transposasa.


Cogemos las secuencias repetidas pequeas (1 y 2 que permiten transponer lo que hay en el medio) y
las colocamos.
En medio de estas secuencias ponemos el gen de resistencia al AB que queramos.
Cuando la transposasa funcione el gen de Km se transposar en un lugar del cromosoma pero el
transposon no podr transponerse.
Vector suicida: Vector que ser incapaz de replicarse en la cepa receptora. A ste lo colocamos en un
OriV de amplio rango de husped (r6K) que slo replicar en presencia de la protena pir al plsmido
le colocamos el gen pir. Vector con: OriV de R6K + transposn + resistencia a Km.
Cuando el plsmido se transfiere a la cepa receptora (sta no tiene pir) el plsmido no se puede
replicar implicando una transposicin del gen Km la transposicin queda fijada en el genoma.
Por lo tanto tenemos la garanta de que un vector suicida no podr replicarse cuando lo introducimos en
una especie bacteriana concreta necesita pir para poderlo hacer.
En el genoma de E.Coli colocamos el gen pir que determina la presencia de la protena II el plsmido
P6K se replicar bien ya que si no puede la resistencia no podr darse en la descendencia ya que la
bacteria no se replicar.
Para que el minitransposon se encuentre estable debe integrarse dentro del cromosoma y as la
descendencia s portar el gen resistente.

Ejemplo: de vectores suicidas basados en el miniTn:


El gen que determina para Tup est fuera de las zonas de insercin (IS) por lo que slo se transfiere la
zona de 19pb que codifica al sustrato de Tup.
Poner el gen Tub bajo el control del operador LAc: Debe ser lo ms silencioso posible cuando estemos
en el citoplasma de la bacteria receptora.
Como medida de control usar cepas Q o colocar en el mismo plsmido un vector suicida con el gen
LecIQ
En ausencia de IPTG y sal en el medio del plsmido se mantiene estable en la cepa receptora. Si
colocamos IPTG al pasar el plsmido a la cepa receptora ste se activa.
Usos:
Queremos saber qu genes son prescindibles/imprescindibles para el crecimiento de la bacteria en un
medio de cultivo genoma mnimo:
Debemos transformar la bacteria receptora con uno de estos plsmidos.
Como la transformacin es aleatoria cualquiera de los genes de la receptora podrn transformarse con
el marcador del plsmido (resistencia a Km) quedando bloqueados o inactivados.
Con cada experimento de transformacin se inactiva un gen conjugamos 109 donadoras con 109
receptoras y plaqueamos todo lo que crezca con Km crecern todas las conjugaciones en las que el
cassette de Km haya pasado a la receptora.
Si se deleciona un gen imprescindible para el crecimiento bacteriano, aunque haya incorporado el gen
Km no aparecer ninguna bacteria porque no puede sobrevivir.
EL Km slo lo aadimos para que slo aparezcan las receptoras que hayan incorporado el marcador de
Km significa que Km se ha incorporado y sustituido genes prescindibles.
Despus secuenciamos con un oligont del extremo 5 del gen Km para ver dnde se ha insertado.
Para saber si el lugar de insercin est situado sobre un gen que tiene un promotor fuerte o dbil:
o Unir el marcador (km) al GFP que corresponde a un gen reporter.
o Slo se ver la bacteria de color verde al ser iluminada con luz azul si hay mucho GFP.
o La GFP no lleva P la nica posibilidad de que se pueda expresar al ir a parar a un gen
determinado es que el P de este gen sea un promotor muy fuerte.
o Si el gen x se transcribe poco la GFP tambin tendr baja cantidad de trascrito. Para ver la
cantidad de trancrito iluminamos con luz azul; si el promotor es dbil las colonias serna
incoloras, si el P es fuerte sern verdes.

Transposones tapqmg:
Determinan la posicin de un gen en el genoma de la bacteria.
Debemos saber la funcin de este gen para poderlo hacer.
Queremos averiguar la posicin mediante:
Conjugacin y plaqueamiento.
La mayora de las colonias que aparezcan sern azules y unas pocas blancas elTnse habr
insertado en el gen Xgal all donde estTnen estas colonias all estar el gen que nos interesa.

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Apuntes - Ingeniera gentica molecular

Poner una marca sobre que gen que previamente conocemos su funcin bioqumica, determinar la
posicin del gen en el genoma.
Con un Tn no conocemos a priori en qu posicin de la bacteria se ha colocado el gen no
permite hacer cambios controlados en genes determinados debemos modificar el genoma del
receptor por recombinacin gentica.

3. Transformacin por recombinacin homloga.


Es necesario conocer la secuencia del lugar que modificamos porque deberemos de incluir parte de esta
secuencia en un vector suicida.

Situamos estas secuencias en el gen que queremos eliminar flanqueando un gen de resisencia al vector
suicida. Por recombinacin homloga se intercambian el gen X y el de la resistencia.
Pero los procariotas recombinan muy mal deberemos meter un gen de resistencia que mate a
todas las bacterias que no hayan hecho recombinacin de forma rpida y directa (marcador tipo
resistencia a Ab).
Con este esquema es muy difcil modificar el gen X ya que acompaando a la modificacin deberamos
incluir un gen de resistencia a Ab con este esquema es muy fcil eliminar pero muy difcil modificar
parcialmente el gen que nos interesa.
Adems, si se da una recombinacin se transferir todo el plsmido a uno de los 2 lugares tambin
incorporamos otro gen de resistencia a Ab.
Solucin:
Situar un segundo marcador fuera de las regiones flanqueantes ya que la receptora ser resistente a los
2 Ab, si la recombinacin se da por un punto (slo en el primer Ab) o en los dos puntos (a los 2 Ab).
Plaquearemos y seleccionaremos para los 2 Ab.
Si queremos hacer una recombinacin por homologa en las regiones de homologa pondremos otro
factor de seleccin esto imposibilita hacer modificaciones pequeas (como cambio de algunas bases,
pequeas deleciones) porque al insertarse el factor de seleccin en el interior del gen diana ste se
inactiva y pierde su funcin (el cambio deseado no implica la prdida de una funcin).
Estrategia para realizar modificaciones pequeas:
Es imposible screenar 108 colonias por falta de tcnicas masivas, para encontrar un recombinante en
concreto como la frecuencia es muy baja (10-8) hace falta screenar muchas colonias.
La recombinacin doble no se hace directamente si no que se hace en 2 veces (2 fases separadas)
uso de factores de contraseleccin.
Factores de contraseleccin: Es un gen que produce la inviabilidad de clulas husped bajo
condiciones determinadas (al contrario de los factores de seleccin que producen viabilidad).
Ejemplo: Gen SacB: Es originario de Bacillus Subtilis y cataliza la polimerizacin de la sucrosa a
polmeros de levaduras (fructosa). En un Gram la expresin del Gen SacB provoca la inviabilidad de la
clula en presencia de sucrosa en el medio.
Ejemplo: Gen rpsL20: Es el gen que codifica para la protena ribosomal L20, esta protena es la diana
del antibitico streptomicina. Si una bacteria es Strp- tiene la protena WT, si la bacteria es Strp+ tiene
una mutacin en el gen que codifica esta protena.
o Partimos de una cepa Strp+ esta ser resistente al gen rpsL20(r).
o Si transformamos un plsmido rpsWT sin Strp no pasar nada, pero si aadimos Strp al meio la
mitad de los ribosomas sern inhibidos porque tendremos un heterocigoto, el gen WT generar
ribosomas sensibles y el gen mutante originar ribosomas resistentes debido a las inhibicin
de la mitad de los ribosomas la clula ser inviables .
o Con este mtodo de seleccin eliminamos clulas que portan el factor de
contraseleccin, es decir, eliminamos las bacterias que portan el gen normal (sensible)
como rpsL20.

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Apuntes - Ingeniera gentica molecular

TEMA 9: Clonaje en levaduras.


Pasamos de procariotas a eucariotas:
1) En eucariotas no pasa nada si introducimos ADN lineal, da lo mismo transformar con ADN lineal que
circular.
2) Recombinan muy bien (alta frecuencia de recombinacin).
3) La levadura en particular: se puede tener y propagar de forma estable tanto en forma de clulas
diploides como haploides.
1. Clonaje en levaduras (Sacharomices Cerivisiae).
Son eucariotas unicelulares de cultivo sencillo y econmico que presentan muchos de los mecanismos
que encontramos en una clula compleja.
Permiten estudiar procesos moleculares de eucariotas de manera fcil y econmica.
Si debemos estudiar un proceso eucariota complejo no podemos utilizar un procariota.
Sacharomyces viene a ser la E.Coli eucariota:
Se puede manipular fcilmente.
Son organismos GRAS (Generally Regarded As Saved).
Picha Pastoris, fundamentalmente dedicada a la indstria fermentadora (proteinas recombinantes)
1.1 Ciclo de las levaduras
Hay dos tipos de cepas
1) Cepas haploides que secretan factor de aparejamiento A y disponen del receptor A.
2) Cepas haploides que secretan el factor de aparejamiento alfa y disponen de receptor A.
Al hacer un aparejamiento siempre se ha de escoger una cepa A y un alfa.
Para hacer un diploide juntamos las dos cepas en un medio de cultivo rico (el diploide formado es
estable siempre y cuando se haga crecer).
Para pasar a la forma haploide medio pobre + acetato sdico.

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Apuntes - Ingeniera gentica molecular

1.1.1 Ciclo:
Se inicia la meiosis y comienza el proceso de esporulacin que da lugar a un asco con 4 esporas
haploides que son bastante resistentes (2 A y 2 alfa). SI pusiramos este asco en medio rico las esporas
tenderan a formar 2 dilploides nuevamente.
Para evitar la formacin de nuevos diploides:
Tratar el asco con una enzima para deshacer la pared que es extraordinariamente resistente
(esferoplasto con 4 esporas).
Coger las 4 esporas y ponerlas cada una en un medio de cultivo separadas derivar las lneas
haploides que nos interese y mantenerlas separadas.
Si se trata de un gen recesivo podremos ver su efecto en una lnea haploide.
Para ver los efectos de las presencia/ausencia de agentes dominantes e importantes trabajar con
una lnea dilpoide.
1.2 Tipos de vectores:
1) Vectores plasmdicos.
2) Vectorres integrativos.
3) YACs se utilizan slo en bancos de ADngen.
Todos estos vectores habitualmente llevan un Ori de levadura + uno de E.COli o slo un ori de E.Coli
(los integrativos) pero las levaduras crecen peor que E.Coli.
Todos los vectores de levaduras se consideran vectores lazadera (crecen y se manipulan en E.Coli y se
transforman en las levaduras).
Factores de seleccin:
Se usan genes de auxotrofia siempre trabajar en cepas deficientes para algn metabolito (cepas
Leu2 cepas que slo crecen en presencia de Leu).
La cepa es deficiente y al vector le introducimos el gen de la auxotrofia salvaje si el vector se
introduce en la cepa esta clula crecer en ausencia de la auxotrofia del medio.
La cepa/cl es la levadura y el vector es un plsmido.
No hacemos servir Ab como factores de seleccin.
1.2.1 Vectores plasmdicos:
Todos derivan del 2m que es un plsmido natural de levaduras (5,4kb).
Incluir Ori del plsmido en un vector que lleve el ori de E.Coli es un ori que permite que crezca y sea
estable sin la presencia del centrmero.
Tienen un n de copias de 25-50/cl.
Previamente a estos se desarrollaron vectorers que tena el ori de replicacin propio de la levadura
(ARS) en lugar del de 2m pero rpidamente se v que eran muy insestables ya que estos vectores son
incapaces de segregar para la clula hija. Requieren de un telmero + centrmero para ser estables
YACs.
1.2.2 Vectores integrativos:
No tienen el Ori de E.Coli cuando entran en la levadura han de pasar parte o todo su contenido
dentro de un cromosoma de levadura por recombinacin homloga.
Transformacin de la levadura:
Tratar la levadura con cimoliasa.
Tratar el ADN a transformar con ?.
Tratar el esferoblasto con polietilenglicol.
Este mtodo ha quedado reemplazado por la electroporacin que no necesita romper la pared.
Existen dos formas para transformar:
o Integrar todo el plsmido en el cromosoma recombinacin por un solo punto que produce la
duplicacin del gen.
o Hacer una doble recombinacin para transferir slo lo que queremos.
Si queremos hacer por dos recombinaciones, hacemos servir DNA lineal (si se produce una nica
recombinacin el cromosoma tendr una delecin levadura inviable).
Si transformamos con ADN lineal obligamos a la descendencia a hacer dos recombinaciones, adems
las frecuencias de recombinacin del ADN lineal son mayores que las del ADN circular.
Habitualmente el resultado es un reemplazo gentico que puede dar lugar a una delecin del gen
correspondiente que en eucariotas recibe el nombre de through-out (el gen correspondiente se trunca
por el factor de seleccin del vector).
Clonaje por complementacin:

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Apuntes - Ingeniera gentica molecular

En el organismo (levadura) en el que haremos este clonaje obtendremos un mutante, que se obtiene
por:
Si el gen es no imprescindible obtenerlo como queramos.
Si el gen es imprescindible obtener un mutante TS: en la secuencia de aminocidos hay alguna
mutacin que hace que a 37-42C la proteina no se plegue bien. En una temperatura permisiva esta
proteina se comporta de una manera normal.
Ejemplo: Gen que dispara la fase S.
o Se deriv un mutante TS en el cual no haba entrada a fase S a 37C A 37C no puede
crecer.
o Hacer el clonaje por complementacin:
o Coger un banco de cADN humano y clonarlo en un plsmido de 2m + URA Leu (genes de
seleccin).
o En este banco nuevo transformaremos la cepa que no crezca a 37C.
o Con la mejor parte de los cADN esta cepa no podr crecer, slo en el caso de que la cepa TS
reciba un plsmido de 2 m que porte el inserto, capaz de restaurar el paso de inicio a fase S
la cepa podr crecer.
De esta restauracin se dice complementacin, porque complementa una actividad que previamente
hemos eliminado al mutante TS.
Porque un banco de cDNA y no uno genmico para el inserto?
La maquinaria de procesamiento de intrones a levaduras es diferente de las eucariotas superiores.
En eucariotas superiores hay 3 secuencias que permiten el procesamiento de intrones.
La secuencia Branch-point es la responsable de la escisin del intrn porque forma un bucle con la
secuencia GT.
En levaduras, el branch-point debe tener exclusivamente 8 bases para que se de el procesamiento
correcto del intrn.

2. Doble hbrido.
Permite detectar in vivo interacciones entre dos proteinas diferentes.
2.1 Promotores de levaduras
Habitualmente son relativamente diferentes de los promotores eucariotas y procariotas, ya que hay 2
cajas adicionales de la caja TATA.
o UAS: secuencias reconocidas por factores de transcripcin que sin estan impiden que el
ARNpol reconozca la caja TATA Upstream Activating Secuency.
o URS: hacen el contrario que las UAS; si el factor de la transcripcin se une a ellas la ARNpol no
se une a TATA Upstream Repression Secuence.
Usaremos la caja UAS porque produce una encima que cataliza esta reaccin. El gen GAL1 que
fosforila la Gal.
La proteina GAL4 es el factor de transcripcin que interacciona con la caja UAS y adems tambin con
el GAL80 (es el sensor de Gal).
La Gal es reconocida por GAL80.
o Si GAL80 no tiene inductor estar interaccionando con GAL4; en presencia de Gal se separa
de GAL4.
o Cuando GAL80 no est unida a GAL4 GAL4 queda libre para interaccionar con la caja UAS
(proporciona la ARNpol para que se pueda transcribir el gen de inters, y a que reconoce la caja
TATA).
o Si no hay Gal en el medio no hay transcripcin de los genes.
GAL4 es una proteina bipartida: la parte de la proteina que reconoce la UAS (unin del ADN hecha
estos dominios se pueden separar y hacer sus funciones por separado) se puede separar de la parte de
la proteina que codifica el factor de activacin, pero si fsicamente no estan juntos la ARNpol no se
posiciona correctamente.
Los 2 hbridos consisten en clonar por separado estos 2 dominios (unin y activacin) y en los dos
casos hacerlos proteinas de fusin:
o Fusionar el dominio de unin con proteina X.
o Fusionar el dominio de activacin con la proteina Y.
o Si las dos protenas X e Y interaccionan entre s, reconstruyen la proteina GAL4 funcional (el
dominio de activacin se podr posicionar correctamente, la ARNpol sobre la caja TATA del gen
GAL1).
Estos 2 dominios se sintetizan por separado porque si estuviesen juntas la ARNpol siempre se
posicionaria correcta aunque las proteinas X e Y no interaccionaran.

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Apuntes - Ingeniera gentica molecular

La proteina X recibe el nombre de BAIT (presa o vctima) y la 4 PRAY (cebo).


El plsmido donde se monta la proteina 4 recibe el nombre de hunter:
Usar una cepa de levadura especfica que porte la UAS del GAL4 y la caja TATA correspondiente + un
gen chivato para detectar la actividad a nivel bioqumico (lecZ o His3). El P para este gen es el P del
GAL1.
o El plsmido 1 est basado en el 2m y porta todas las caractersticas de un plsmido replicativo
a levadura. Tambin lleva la fusin de BD + la proteina X.
o Un segundo plsmido hunter que porta una fusin entre AD + proteina Y + el ORi de replicacin
de 2m + un gen para Leu:
Si X e Y reconstruyen GAL4 funcional en presencia de GAL se producir lecZ colonias azules.
o Si en presencia de XGAL aparecen colonias blancas lecZ no se transcribe y por lo tanto X e
Y no interaccionan.
o En lugar de tener un nico plsmido hunter podemos tener diferentes (cada cual conteniendo un
inserto diferente de un banco de cADN detrs del AD). Si sale alguna de estas colonias azules
significa que esta proteina X interacciona con este inserto (este inserto est sustituyendo la
protena Y).
o Leu y Ura sirven para seleccionar las levaduras que hayan incorporado ambos plasmidios.

3. Pichic pastoris.
Todas las auxotrofias de Sacaromyces son funcionales podemos utilizarlas todas.
Esta levadura no tiene ningn plsmido descrito sin que se requiere de una expresin recombinante.
Gen AOX: proteina que metaboliza el met-OH. Cualquier proteina que se exprese bajo el P del AOX
puede llegar a un 30% del total de la protena.
P.Pastoris no se puede hacer servir sin haber pegado al invitrogeno.
Ventajas extras:
Produce una gran cantidad de proteinas.
Glicosilaciones: estas que aaden las levaduras (slo aaden manosas sin ramificar sobre esparagina)
con las de los eucariotas P.Pastoris aade unas glicosidaciones menores (ms cercanas a las
eucariotas que las de sacaromyces) al introducirlo en una eucariota, como que estas glicosidaciones
seran menores no sern tan reconocidas como extraas por SI.
o Una proteina en eucariotas solo se glicosida en una secuencia si la protena A debe ser dirigida
al exterior celular debe contener un pptido seal para glicosidarse;
o Si la glicosidamos (aunque no tenga pptido seal) en P. Pastoris, esta proteina la
encontraremos en el medio de cultivo purificacin ms econmica puesto que no hay
disrupcin de la levadura. El problema ser que aparecer glicosidada y a lo mejor no lo
queremos as.

TEMA 10: Clonaje en clulas animales


Alternativas para clonar:
Clonacin directa en clulas de cultivo. Es relativamente fcil clonar ADN forneo en clulas de cultivo.
Clonacin sobre el organismo obtendremos un animal transgnico (ser portador de un trnsgeno =
DNA forneo). Cuando clonemos sobre organismos siempre utilizaremos vectores del tipo integrativo.
1. Clonacin directa en lineas de cultivo.
Usar vectores replicativos que permitan la expresin transitoria de proteinas.
Usar vectores replicativos que permitan la expresin permanente de proteinas lineas celulares que
expresan proteinas continuamente con el vector.
Transferir el gen deseado a alguno de los cromosomas de la clula destino vectores integrativos (no
son replicativos)
1.1 Factores de seleccin
Clulas de cultivo:
Electroporacin y lipopectinas introduccin del vector y nunca llegamos a un nivel superior del 1-5%
de clulas transformantes usar factores de seleccin para seleccionar las clulas transformantes.
Ejemplo: usar el gen de la timidn quinasa TK:

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Apuntes - Ingeniera gentica molecular

Seleccionar positivamente las clulas que lo portan o negativamente en las clulas que lo portan (factor
de contraseleccin): Para seleccionar positivamente previamente debemos dividir una linea TK-:
o Dos rutas de biosntesis de aa ruta novo y ruta de reciclaje.
o Cualquier clula puede sobrevivir con 1 de las 2 rutas.
o La TK no est implicada en la ruta de novo.
o Aadimos un compuesto 5-fluorouracilo al medio de cultivo la TK lo transforma en un
derivado trifosfato que es un inhibidor muy potente de la replicacin del ADN al aadir el 5fluorouracilo mataremos las clulas que dispongan del gen TK.
o Si la clula pierde la TK obtendremos una linea TK- ha sido por mutacin previa.
o Al aadir un plsmido con el gen de la TK, aadimos al cultivo un producto (aminohepterina)
que inhibe la dihidrofoliatreductasa que bloquea la sntesis de novo evitamos que las clulas
utilicen esta ruta (sobretodo a nivel de T) ya que las clulas TK- slo puede hacer ir la ruta de
novo la clula se muere a menos que lleve un plsmido TK+.
Para seleccionar negativamente:
Usamos el gen de la TK del virus del herpes simple tipo 1 (TK1) ya que hace lo mismo que el de las
eucariotas, aunque puede metabolizar 2 o 3 componentes (ganciclobis y eciclobis) 200 veces ms
eficiente que la TK celular produciendo un producto txico una vez la TK1 trabaja sobre estos
compuestos que son profrmacos.
Ponemos este gen dentro de un plsmido y aadimos estos profrmacos cuando nos interese si lo
aadimos las clulas que portan el TK1 morirn las seleccionamos negativamente.
Ejemplo: Gen de resistencia a gentamicina G418:
o La Gentamicina es un Ab que inhibe la sntesis de proteinas y es especfico de clulas
eucariotas.
o El gen de resistencia a neomicina puede degradar el G418.
o Si el medio contiene G418 y el plsmido el peor seleccionaremos positivamente las clulas
que portan el plsmido.

1.2 Vectores replicativos


Por expresin transitoria:
Llevan todos el Ori de replicacin de SB-40.
Para que el Ori de replicacin sea funcional requieren el Ag-T El plsmido ha de llevar el Ag-T o tener
en la clula el Ag-T clonado. Los que no llevan son dependientes de clulas que s lo lleven clulas
cuerpo:
o Derivan de una linea de fibroblasto de rin de mono.
o Esta linea ha sido transformada con un SB-40 defectivo en el origen.
Tambin puede utilizarse el ori de replicacin del virus del polioma permite utilizar clulas derivadas
de ratn que previamente han sido transformadas con el Ag-T de un polioma virus de ratn.
Estos plsmidos no funcionan a nivel transitorio porque mueren de xito:
El sistema de replicacin es tan eficiente que en unas 90 horas se pueden obtener unos 10 5
plsmidos/cel al cabo de las 90 horas la clula muere aunque se habr producido una gran cantidad
de proteina recombinante para hacer un animal transgnico no podemos usar este tipo de plsmido.
Por expresin permanente:
Integrando el DNA cromosmico del husped por recombinacin homloga, que adems tambin se da
recombinando con secuencias que no tienen nada que ver con las secuencias clonadas en el plsmido
(se puede recombinar sin que haya homologia) para recombinar nicamente por homologia, a
menudo es necesario flanquear con el gen de la TK1.
o Si la recombinacin tiene lugar entre A y B, el cromosoma nunca recibir el gen de la TK1.
o Si la recombinacin tiene lugar en las zonas distintas de A y B, el cromosoma habr integrado
todo el plsmido.
o Si aadimos gamiciclobit o aciclobit, seleccionamos las clulas que han sufrido la
recombinacin entre A y B.
Usar el Ori de replicacin y la maquinaria del virus del popiloma bobino:
Tiene una zona que codifica (en 5,5 Kb) este orgen y maquinaria.
Meter esta secuencia en el plsmido permiten una replicacin harmoniosa dentro del plsmido dentro
de la clula husped (el plsmido se mantiene en niveles de 20-30 2 plsmidos/clula).

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