A simplified method of constructing infectious clones

of Begomovirus employing limited restriction enzyme

digestion of products of rolling circle amplification.
Abstract
Most infectious clones of geminiviruses consist of (partial)
tandem repeats of viral genomes in the vectors, which usually
involve tedious, multi-step assemblies of genomic fragments
in the construction process. A simplified procedure was
devised to circumvent these problems, which employs limited
restriction digestion of multimeric viral genomes produced by
rolling circle amplification (RCA), followed by direct cloning
into appropriate vectors. The efficiency of the procedure, and
infectivity of the dimeric constructs it produced, were
demonstrated using three different geminiviruses, namely
ageratum yellow vein virus, tomato leaf curl virus, and squash
leaf curl virus.
Geminiviruses are characterized by single-stranded, circular
DNA (sscDNA) genomes, which are encapsidated in geminate
virions approximately 18 nm30 nm (Stanley et al., 2005).
Whitefly transmitted geminiviruses with mono- or bi-partite
sscDNAgenomes comprise the genus Begomovirus of the
family Geminiviridae. Although excised unit-length DNA or
cloned DNA containing single copies of certain geminiviruses
is infectious (e.g., Stanley and Townsend, 1986; BonillaRamirez et al., 1997; Unseld et al., 2004; Lapidot et al., 2007),
earlier studies have shown that most infectious clones require
(partially) tandem-repeat constructs of geminivirus genomes
to increase their infectivity (Boulton and Davies, 1988;
Chatani et al., 1991; Donson et al., 1988; Elmer et al., 1988;
Stanley et al., 1990; Stenger et al., 1991), which makes the
cloning process more difficult. The existing procedures to
produce multimeric constructs of geminiviruses require
delicate selection and design of cloning sites, followed by
assembling viral genomic fragments generated by restriction
enzymes, which is a laborious process (e.g., Xiong and Zhou,
2006; Xiong et al., 2007). Moreover, orientations of the inserts

have to be monitored to select clones that contain tandemly

repeated viral genomes.
Recently, rolling circle amplification (RCA) technology has
been developed for linear or geometric amplification of target
DNA for research and diagnostic purposes (Fire and Xu, 1995;
Liu et al., 1996; Lizardi et al., 1998) with sensitivities
approaching those of polymerase chain reactions (PCR), and
multimeric infectious clones of geminiviruses have been
generated using the RCA technique (Inoue-Nagata et al.,
2004; Haible et al., 2006; Knierim and Maiss, 2007). However,
the procedures used in these studies still require extra steps
for fragment assembly following extensive digestions of the
RCA products with different restriction enzymes. In this study,
a simplified procedure was devised, which limited the
digestion of RCA reaction products with restriction enzymes to
generate tandemly repeated concatamers of Geminivirus
genomes for the construction of infectious clones. The
feasibility of this methodwas demonstrated using three
different begomoviruses as templates.
A Nan-Tou isolate of Ageratum yellow vein Taiwan virus
(AYVTV-[NT], GenBank accession no. EF458639) recently
collected from Ageratum conyzoides in Nan-Tou County,
Taiwan, was used as an initial example for this simplified
cloning method. Total DNA was extracted from leaves of A.
conyzoides showing the characteristic symptoms essentially
as described by Grimsley et al. (1987). Briefly, the leaf simple
(0.1 g fresh weight) was ground to a fine powder in liquid
nitrogen, thawed in 300 _l DNA extraction buffer (50mM Tris
HCl, pH 8.0, 20mM EDTA, 50mM NaCl, 1% Triton X- 100, and
0.25% Tween-20), extracted twice with equal volumen of
phenol/chloroform/isoamyl alcohol (25:24:1), precipitated with
ethanol, resuspended in 10 _l of deionized H2O, and stored at
20 C until needed. The circular genomic DNA of AYVTV-[NT]
was amplified by RCA using the TempliPhi Amplification kit
(Amersham Bioscience, NJ, USA) as follows (Fig. 1A): 0.5_l of
the DNA sample was added to 5_l of the sample buffer, heated
to 95C for 3 min to denature the DNA, snap-chilled on ice,

and combined with 5 _l of reaction buffer plus 0.2 _l of enzyme

mix (containing Phi29 DNA polymerase and random hexamers
in 50% glycerol). The reaction mixtures were then incubated
for 18 h at 30 C, followed by inactivation of the enzyme at 65
C for 10 min. Agarose gel analysis revealed mixtures of RCA
reaction products longer than 12 kbp (Fig. 2A, lane 2),
indicating that the circular DNA templates in the samples had
been extensively amplified.
Fig. 1. Schematic representation of the workflow and
construction of multimeric clones of begomoviruses by limited
digestion of rolling circle amplification (RCA) products.
Ageratum yellow vein Taiwan virus Nan-Tou isolate (AYVTV[NT]) was used as a representative for circular templates in
the following diagrams. (A) Illustration of the workflow. (1)
Annealing of random hexamers (short arrows) to singlestranded circular DNA templates; (2) Extension of the primers
by Phi29 DNA polymerase. The newly synthesized first-strand
ss-DNA products were displaced from the 3_-termini which
could serve as templates for the synthesis of second-strand
DNAs using the random hexamers as primers; (3) The
synthesized polymeric DNA products were partially digested
with restriction enzyme under controlled conditions to yield
DNA products of various unit-lengths of target genome
(indicated by 1X, 2X, and 3X). The stem-loop signs
indicate the origin of replication of geminiviruses. (B)
Diagrams of the infectious constructs for agroinfection. The
CaMV 35S promoter is represented by white arrows marked
35Sp. The unmodified regions of pBin19 are represented
with the dashed lines. The origin of replication is represented
by a stem-loop structure on top of the AYVTV-[NT] genome.
The relative positions and orientations of the Rep and CP
genes of AYVTV-[NT] are indicated by black arrows. The names
of the clones, right and left borders of T-DNA (RB and LB,
respectively), and recognition sites of the restriction enzymes
BamHI (B), EcoRI (E), and HindIII (H) are indicated. Note that
pBinAY1.10 and pBinAY4.2 contain AYVTV genomes in different
orientations.

Fig. 2. Construction of multimeric infectious clones of AYVTV[NT] with limited

restriction enzyme digestion. (A) Agarose gel analysis of
restriction enzyme digestion products. The polymeric DNAs
generated by rolling circle amplification were digested with
restriction enzyme BamHI, using 2 units for 1 h at 37 C (lane
3) or 0.02 unit for 15 min at 25 C (lane 4). The digestion
products were then analyzed by electrophoresis through 1%
agarose gel and staining with ethidium bromide. Lane 1, DNA
size marker; lane 2, undigested RCA products as the negative
control. (B) Southern blot analysis of the products of limited
digestion. To verify identities, the partially digested (0.02 unit
of BamHI for 15 min at 25 C) RCA products (lane 15 min)
was Southern-transferred to a nitrocellulose membrane
following electrophoresis through 1% agarose gel and
hybridized with Digoxigenin-labeled probes specific to AYVTV
genomic DNA(Wu et al., 2007). Encapsidated DNA extracted
from AYVTV virions (lane Virion DNA) was used as a positive
control to indicate the relative position of unit-length viral
genome.
To generate tandem dimers of AYVTV genomic DNA for direct
cloning, the products of the RCA reactions (1_g) were purified
by phenol extraction and subjected to either limited digestion
using 0.02 unit of the restriction enzyme BamHI at 25 C for
15 min or to extensive digestion using 2 units at 37 C for 1 h
as a control. The digestions were terminated by adding
formamide and EDTA (to final concentrations of 40% and 20
mM, respectively) and heating at 65 C for 15 min. The limited
BamHI digestion of the RCA products resulted in DNA
fragments with lengths corresponding to mono-, di-, and trimeric geminivirus DNA A (Fig. 2A, lane 4) whereas the
extensive digestion (Fig. 2A, lane 3) yielded two major
products approximately 2.7 kbp and 1.4 kbp in length. To
verify the identities of the observed DNA bands, the same
batch of partially digested RCA products was analyzed by
Southern blot hybridization using probes specific to AYVTV
genomic DNA (Wu et al., 2007). As shown in Fig. 2B, reaction
products corresponding to various unit-lengths of AYVTV

genomes were identified by the probes (lane 15 min). The

product approximately 1.4 kbp long (indicated by the * sign)
also hybridized with the probes, suggesting that the DNA
products were incomplete copies of the AYVTV genome instea
of satellite DNAs, DNA-1 or DNA _, associated with AYVV
(Saunders and Stanley, 1999; Saunders et al., 2000), because
satellite DNAs do not share significant similarity with the
AYVTV genome. However, the possibility that these DNAs
represent a defective DNA of AYVTV could not be ruled out.
Following purification by phenol extraction and ethanol
precipitation, the partially digested RCA products were
inserted into the BamHI site of the binary vector pBin19
(Bevan, 1984) (Fig. 1B). To examine whether the presence of a
constitutive promoter could increase the infectivity of the
Geminivirus constructs, the 35S promoter region of
Cauliflower mosaic virus (CaMV 35S promoter) was amplified
by
PCR
with
the
primer
pair
35SHindF,
5_TGAAGCTTGCATGCCTG-3_
and
35SHindR,
5_
GTAAGCTTCCAGGCCTCTCCAAATG-3_ using pCass plasmid
(Ding et al., 1995) as the template, digested with restriction
enzyme HindIII, and inserted into the HindIII site of pBin19
vector immediately upstream of the Geminivirus DNA
insertion site, resulting in a new vector, namely pBin19- 35S
(Fig. 1B).
To test whether this simplified procedure is applicable to other
viruses with circular genomes, dimeric constructs of two other
begomoviruses, tomato leaf curl virus (TLCV, a mono-partite
begomovirus) and squash leaf curl virus (SqLCV, with bipartite genome designated asDNAAandDNAB), isolated
respectively from Tainan and Yunlin County in Taiwan, were
generated following the same procedure. The selected clones
shownin Fig. 1B and Table 1 were identified on the basis of
restriction digestions and DNA sequencing.
The integrity and infectivity of the begomovirus clones were
assayed by agroinfection (Grimsley et al., 1986, 1987; Elmer
et al., 1988; Hayes et al., 1988). Three to five Nicotiana

benthamiana plants were inoculated with Agrobacterium

tumefaciens strain C58C1 harboring either pBin19-35S vector
alone or dimeric constructs of the begomoviruses described
above. As shown in Table 1, the dimeric constructs showed
infection rates ranging from 62.5 to 100%. The orientations of
the inserts relative to CaMV 35S promoter did not affect the
infectivity: the infection rate was 100% in the case of
pBinAY4.2, the same as that in the case of the majority of
constructs with the opposite orientation. However, whether
these clones share similar DNA accumulation levels or
replication efficiencies is unknown, as the quantities of
replication intermediates corresponding to these clones were
not determined. The release of circular viral DNA during
replication from the input dimer template, which might result
from the nicking and re-ligating activities of viral Rep protein
(Heyraud-Nitschke et al., 1995; Laufs et al., 1995) or the
recombination events between the homologous sequences
(Stenger et al., 1991; Rigden et al., 1996), followed by
subsequent DNA synthesis in plant nuclei may have
contributed mainly to the intracellular viral growth irrespective
of the orientations of the clones.
Table 1: Infectivity of various begomovirus constructs in N.
benthamiana plants inoculated by agroinfection.
To verify the presence of AYVTV-[NT] in the affected leaves of
the inoculated N. benthamiana, Western blot analysis was
performed to detect the viral coat protein (CP) which further
confirmed the infectivity of these dimeric constructs (Fig. 3).
The results indicated that the dimeric clones constructed
using limited restriction enzyme digestion of the RCA products
still remained highly infectious.
Fig. 3. Confirmation of infectivity byWestern blot analysis.Total
proteins equivalent to 2.5 mg of fresh-leaf weight from each
sample were separated using a 12.5% polyacrylamide gel
containing 1% sodium dodecyl sulphate (Laemmli, 1970),
transferred to a membrane, and probed with antiserum
specific to the coat protein (CP) of AYVTV, followed by color

development using nitroblue tetrazolium (NBT) and 5-bromo4-chloro-3-indodyl phosphate (BCIP) as substrates (Sambrook
and Russell, 2001). The identities of the samples are indicated
on top of each lane. Lane AYVTV-CP, E. coli expressed CP of
AYVTV (15 ng) as a positive control. The position of AYVTV-CP
is indicated on the right.
In conclusion, the simplified procedure reduces the time
required for the construction of infectious clones of
geminiviruses. The need to select single-cut restriction
enzymes and to verify the orientation of the inserts is
eliminated. By appropriately modifying the conditions of
restriction digestion, the procedure can be applied to studies
of viruses with circular genomes.

Un mtodo simplificado de la construccin de clones

infecciosos de Begomovirus empleando limitada
digestin con enzimas de restriccin de los productos
de amplificacin por crculo rodante.
Abstracto
La mayora de los clones infecciosos de geminivirus consisten
en repeticiones en tndem (parcial) de los genomas virales en
los vectores, que generalmente implican tediosas, conjuntos
de varios pasos de fragmentos genmicos en el proceso de
construccin. Un procedimiento simplificado se concibi para
evitar estos problemas, que emplea la digestin de restriccin
limitado de genomas virales multimricas producidos por
amplificacin por crculo rodante (RCA), seguido por clonacin
directa en vectores apropiados. La eficacia del procedimiento,
y la infectividad de los constructos dimricos que produjo, se
demostraron utilizando tres diferentes geminivirus, virus de la
vena amarilla ageratum a saber, el virus de enrollamiento de
las hojas de tomate, y virus del enrollamiento de la hoja
squash.
Los geminivirus se caracterizan por (sscDNA) genomas de una
sola hebra, ADN circular, que estn encapsulados en viriones
geminadas aproximadamente 18 nm x 30 nm (Stanley et
al., 2005). Mosca
Blanca
transmite
geminivirus
con
sscDNAgenomes
mono
o
bi-partita
comprender
el
gnero Begomovirus de la familia Geminiviridae. Aunque el
ADN unidad de longitud extirpado o ADN clonado que
contiene copias individuales de ciertos geminivirus es
infecciosa (por ejemplo, Stanley y Townsend, 1986;. BonillaRamrez et al., 1997; Unseld et al., 2004; Lapidot et
al, 2007),Estudios anteriores han demostrado que los clones
ms infecciosas requieren construcciones (parcialmente) la
repeticin en tndem de los genomas de geminivirus para

aumentar su infectividad (Boulton y Davies, 1988;. Chatani et

al, 1991; Donson et al., 1988; Elmer et al., 1988; Stanley et al.,
1990; Stenger et al., 1991), lo que hace que el proceso de
clonacin ms difcil. Los procedimientos existentes para
producir constructos multimricas de geminivirus requerir
delicada seleccin y diseo de sitios de clonacin, seguido por
el montaje de fragmentos genmicos virales generados por
enzimas de restriccin, que es un proceso laborioso (por
ejemplo, Xiong y Zhou, 2006; Xiong et al., 2007). Por otra
parte, las orientaciones de los insertos tienen que ser
monitoreados para seleccionar clones que contienen repetidas
en tndem genomas virales.
Recientemente, la tecnologa de amplificacin por crculo
rodante (RCA) ha sido desarrollado para la amplificacin lineal
o geomtrica de ADN diana para fines de investigacin y de
diagnstico (fuego y Xu, 1995; Liu et al., 1996; Lizardi et
al, 1998) con sensibilidades se aproximan a las de reacciones
en cadena de la polimerasa (PCR), y clones infecciosos
multimricas de geminivirus se han generado utilizando la
tcnica de RCA (Inoue-Nagata et al, 2004;.. Haible et al.,
2006; Knierim
y
Maiss, 2007). Sin
embargo,
los
procedimientos utilizados en estos estudios todava requieren
pasos adicionales para el montaje fragmento siguientes
extensas digestiones de los productos de RCA con diferentes
enzimas de restriccin. En este estudio, un procedimiento
simplificado se ide, lo que limitaba la digestin de los
productos de reaccin RCA con enzimas de restriccin para
generar concatmeros repetidas en tndem de los genomas
de geminivirus para la construccin de clones infecciosos. La
viabilidad de este methodwas demostr utilizando tres
diferentes begomovirus como plantillas.
Un Nan-Tou aislar de la vena amarilla virus Taiwn
Ageratum (AYVTV- [NT], la adhesin GenBank no. EF458639)
recientemente recogida
deAgeratum
conyzoides en
el
Condado de Nan-Tou, Taiwn, se utiliz como un ejemplo inicial
para este clonacin simplificada mtodo. El ADN total se
extrajo de las hojas de A. conyzoides que muestran los
sntomas
caractersticos
esencialmente
como

describen Grimsley et al. (1987). Brevemente, la hoja sencilla

(0,1 g de peso fresco) se moli a un polvo fino en nitrgeno
lquido, se descongela en tampn de extraccin de ADN 300
_L (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 20 mM EDTA, 50 mM NaCl, 1%
Triton X-100, y 0,25% de Tween-20), se extrajo dos veces con
igualdad de volumen de fenol / cloroformo / alcohol isoamlico
(25: 24: 1), se precipit con etanol, se resuspendi en 10 _L
de H2O desionizada, y se almacenaron a -20 C hasta que se
necesite. El ADN genmico circular de AYVTV- [NT] se
amplific por RCA utilizando el kit de amplificacin TempliPhi
(Amersham Bioscience, NJ, EE.UU.) como sigue (Fig 1 A.): 0.5_l
de la muestra de ADN se aadi a 5_l de la memoria tampn
de muestras , se calent a 95 C durante 3 min para
desnaturalizar el ADN, complemento enfri en hielo, y
combinado con 5 _L de tampn de reaccin ms 0,2 _L de
mezcla de enzimas (que contiene ADN polimerasa Phi29 y
hexmeros al azar en 50% de glicerol). Las mezclas de
reaccin se incubaron a continuacin durante 18 horas a 30
C, seguido de la inactivacin de la enzima a 65 C durante
10 min. El anlisis en gel de agarosa revel mezclas de
productos de reaccin RCA ms largo que 12 kpb (Fig. 2 A,
carril 2), lo que indica que los moldes de ADN circulares en las
muestras haban sido amplificadas ampliamente.
Fig. 1. Representacin esquemtica del flujo de trabajo y la
construccin de clones multimricas de begomovirus
mediante digestin limitada de productos de amplificacin por
crculo rodante (RCA). Ageratum yellow vein virus de Taiwn
Nan-Tou aislar (AYVTV- [NT]) fue utilizado como un
representante para las plantillas circulares en los siguientes
diagramas. (A) Ilustracin del flujo de trabajo. (1) El recocido
de hexmeros aleatorios (flechas cortas) a las plantillas de
ADN circular de cadena sencilla; (2) La extensin de los
cebadores de ADN polimerasa Phi29. Los productos de ADN-ss
de primera hebra recin sintetizados fueron desplazadas de la
3_-terminales que podra servir como plantillas para la sntesis
de ADN de segunda hebra utilizando los hexmeros aleatorios
como cebadores; (3) Los productos de ADN polimricos
sintetizados se digiri parcialmente con la enzima de
restriccin en condiciones controladas para producir productos

de ADN de diferentes longitudes de unidad de genoma diana

(indicados por "1X", "2X", y "3X"). Los signos "tallo-bucle"
indican el origen de replicacin de geminivirus. (B) Diagramas
de los constructos infecciosas para agroinfeccin. El promotor
35S de CaMV est representado por flechas blancas marcadas
"35Sp". Las regiones no modificadas de pBin19 se representan
con las lneas de trazos. El origen de replicacin est
representado por una estructura de tallo-bucle en la parte
superior del genoma AYVTV- [NT]. Las posiciones relativas y
orientaciones de los genes rep y CP de AYVTV- [NT] se indican
con flechas negras. Los nombres de los clones, derecha e
izquierda bordes de T-ADN (RB y LB, respectivamente), y sitios
de reconocimiento de las enzimas de restriccin BamHI (B),
EcoRI (E) y HindIII (H) se indican. Tenga en cuenta que
pBinAY1.10 y pBinAY4.2 contienen genomas AYVTV en
diferentes orientaciones.
Fig. 2. Construccin de clones infecciosos multimricas de
AYVTV- [NT] con limitada
restriccin de la digestin enzimtica. (A) anlisis en gel de
agarosa de los productos de digestin de enzimas de
restriccin. Se digirieron los ADNs polimricos generados por
amplificacin por crculo rodante con enzima de restriccin
BamHI, utilizando 2 unidades por 1 h a 37 C (carril 3) o
unidad de 0,02 durante 15 min a 25 C (carril 4). Los
productos de la digestin fueron entonces analizados por
electroforesis a travs de gel de agarosa al 1% y tincin con
bromuro de etidio. Carril 1, marcador de tamao de ADN; carril
2, los productos de RCA no digeridos como el control
negativo. (B) Anlisis de transferencia Southern de los
productos de la digestin limitada. Para verificar las
identidades, el digerido parcialmente (0,02 unidad de BamHI
durante 15 min a 25 C) productos de RCA (carril "15 min")
era a una membrana de nitrocelulosa despus de la
electroforesis a travs de gel de agarosa 1% y se hibrid con
marcado con digoxigenina transferido Sur sondas especficas
para
AYVTV
ADN
genmico
(Wu
et
al.,
2007). FromAYVTVvirions EncapsidatedDNAextracted (carril

"virin ADN") se utiliz como control positivo para indicar la

posicin relativa de la unidad de longitud del genoma viral.

Para generar dmeros en tndem de AYVTV ADN genmico

para la clonacin directa, los productos de las reacciones RCA
(1_g) se purificaron mediante extraccin con fenol y se
sometieron a digestin ya sea limitada, usando 0,02 unidad
de la enzima de restriccin BamHI a 25 C durante 15 min o a
la extensa la digestin usando 2 unidades a 37 C durante 1 h
como control. Las digestiones se terminaron mediante la
adicin de formamida y EDTA (a concentraciones finales de
40% y 20 mM, respectivamente) y calentamiento a 65 C
durante 15 min. La digestin BamHI limitado de los productos
de RCA dio lugar a fragmentos de ADN con longitudes que
corresponden a mono-, di-, y tri-geminivirus meric DNA
A (Fig.2 A, carril 4), mientras que la extensa digestin (Fig. 2 A,
carril
3
)
produjo
dos
productos
principales
de
aproximadamente 2,7 kpb y 1,4 kpb de longitud. Para verificar
las identidades de las bandas de ADN observados, el mismo
lote de productos RCA parcialmente digeridas se analiz
mediante hibridacin por transferencia Southern utilizando
sondas especficas para AYVTV ADN genmico (Wu et
al., 2007). Como se muestra en la Fig. 2 B, productos de
reaccin correspondientes a diversas longitudes de unidad de
genomas AYVTV fueron identificados por las sondas (carril "15
min"). El producto de aproximadamente 1,4 kpb de largo
(indicado por el smbolo "*") tambin se hibrid con las
sondas, lo que sugiere que los productos de ADN eran copias
incompletas de la INSTEA AYVTV genoma de ADN satlite,
DNA-1 o ADN _, asociado con AYVV (Saunders y Stanley,
1999;. Saunders et al, 2000), porque los ADN satlite no
comparten similitud significativa con el genoma AYVTV. Sin
embargo, la posibilidad de que estos ADN representan un ADN
defectuoso de AYVTV no se puede descartar.
Despus de la purificacin por extraccin con fenol y
precipitacin con etanol, los productos de RCA parcialmente
digeridos se insertaron en el sitio BamHI del vector binario

pBin19 (Bevan, 1984) (Fig. 1 B). Para examinar si la presencia

de un promotor constitutivo podra aumentar la infectividad
del geminivirus construcciones, la regin del promotor 35S del
virus del mosaico de la coliflor (CaMV 35S) se amplific por
PCR
con
el
par
de
cebadores
35SHindF,
5_TGAAGCTTGCATGCCTG-3_
y
35SHindR,
5_
GTAAGCTTCCAGGCCTCTCCAAATG-3_ utilizando el plsmido
pCass (Ding et al.,1995) como plantilla, se digiri con la
enzima de restriccin HindIII, y se insert en el sitio HindIII del
vector pBin19 inmediatamente aguas arriba del sitio de
insercin de ADN de geminivirus, resultando en un nuevo
vector, a saber pBin19 - 35S (Fig. 1 B).
Para comprobar si este procedimiento simplificado es
aplicable a otros virus con genomas circulares, construcciones
dimricas de otros dos begomovirus, hoja de tomate curl virus
(TLCV, un begomovirus mono-partita) y la hoja de calabaza
curl virus (SqLCV, con genoma bipartito designado
asDNAAandDNAB ), aislado, respectivamente, de Tainan y el
condado de Yunlin en Taiwn, se generaron siguiendo el
mismo
procedimiento. Los
clones
seleccionados
shownin Fig. 1 B y en la Tabla 1 se identificaron sobre la base
de las digestiones de restriccin y secuenciacin de ADN.
La integridad y la infectividad de los clones de begomovirus
se ensayaron mediante agroinfeccin (Grimsley et al, 1986,
1987;. Elmer et al., 1988;Hayes et al., 1988). De tres a cinco
plantas de
Nicotiana
benthamiana fueron
inoculados
con Agrobacterium tumefaciens C58C1 cepa que alberga ya
sea solo o vector pBin19-35S construcciones dimricas de los
begomovirus descritos anteriormente. Como se muestra en la
Tabla 1, las construcciones dimricas mostraron tasas de
infeccin que van desde 62,5 hasta 100%. Las orientaciones
de los insertos en relacin con el promotor CaMV 35S no
afectaron la infectividad: la tasa de infeccin fue del 100% en
el caso de pBinAY4.2, el mismo que en el caso de la mayora
de las construcciones con la orientacin opuesta. Sin
embargo, si estos clones comparten niveles de acumulacin
de ADN similares o eficiencias de replicacin es desconocido,
ya que no se determinaron las cantidades de intermediarios

de replicacin correspondientes a estos clones. La liberacin

de ADN viral circular durante la replicacin de la entrada de
dmero plantilla, que podran resultar de las actividades
nicking y re-ligadura de la protena Rep viral (HeyraudNitschke et al, 1995;.. Laufs et al, 1995) o los eventos de
recombinacin entre las secuencias homlogas (Stengeret al,
1991;.. Rigden et al, 1996), seguido por la sntesis de ADN
posterior en los ncleos de las plantas pueden haber
contribuido principalmente al crecimiento viral intracelular,
independientemente de las orientaciones de los clones.
Tabla 1: La infectividad de diferentes begomovirus construye
en N. benthamiana plantas inoculadas por agroinfeccin.
Para verificar la presencia de AYVTV- [NT] en las hojas
afectadas del N. inoculado benthamiana, se realiz anlisis de
transferencia Western para detectar la protena de la cubierta
viral (CP), que confirm adems la infectividad de estas
construcciones dimricas (Fig. 3). Los resultados indicaron que
los clones dimricos construidos usando limitada digestin
con enzimas de restriccin de los productos de RCA todava
permanecieron altamente infecciosa.
Fig. 3. Confirmacin de las protenas analysis.Total infectividad
blot byWestern equivalente a 2,5 mg de peso fresco de hojas
de cada muestra fueron separados usando un gel de
poliacrilamida al 12,5% que contena 1% de dodecil sulfato de
sodio (Laemmli, 1970), se transfirieron a una membrana, y se
sonde con antisuero especfico para la protena de cubierta
(CP) de AYVTV, seguido por el desarrollo de color utilizando
nitroazul de tetrazolio (NBT) y fosfato de 5-bromo-4-cloro-3indodyl (BCIP) como sustratos (Sambrook y Russell, 2001). Las
identidades de las muestras se indican en la parte superior de
cada carril. Carril AYVTV-CP, E. coli expresa CP de AYVTV (15
ng) como control positivo. La posicin de AYVTV-CP se indica a
la derecha.
En conclusin, el procedimiento simplificado reduce el tiempo
necesario para la construccin de clones infecciosos de los
geminivirus. La necesidad de seleccionar enzimas de

restriccin de un solo corte y para verificar la orientacin de

los insertos se elimina. Por apropiadamente la modificacin de
las condiciones de digestin de restriccin, el procedimiento
se puede aplicar a los estudios de los virus con genomas
circulares.