Obtencin de Etanol por la Fermentacin Alcohlica de Bagazo de Caa de Azcar

Production of Ethanol by Fermentation of Sugarcane Bagasse

Fontalvo. M, Gil. A, Monsalve. C, Patio. Sara, Rivas. R.

Laboratorio de biotecnologa para ingenieros. Departamento de ingeniera qumica. Facultad de
ingeniera. Universidad de Antioquia. Medelln, Colombia.

Resumen
En esta prctica se estudi el proceso de fermentacin alcohlica que llevan a cabo las levaduras.
La levadura que se utiliz es Saccharomyces cerevisiae. En la fermentacin alcohlica se produce
dixido de carbono y alcohol etlico (etanol). Se usaron concentraciones de 15, 30, 45 y 50 g/L de
glucosa como azcar total reductor, tomando muestras cada hora para medir absorbancia a 600nm
para la determinacin de la concentracin de la biomasa.

----- Palabras clave: fermentacin, Saccharomyces cerevisiae, Azcar,

Biomasa

Abstract
In this work we studied the alcoholic fermentation process carried out by yeasts. The yeast used
is Saccharomyces cerevisiae. In the alcoholic fermentation produces carbon dioxide and ethyl
alcohol (ethanol). Concentrations were used 15, 30, 45 and 50 g / L glucose as reducing the total
sugar, taking samples every hour to measure absorbance at 600nm for the determination of the
concentration of biomass.

----- Keywords: fermentation, Saccharomyces cerevisiae, Glucose,

Biomass

Introduccin

La fermentacin alcohlica es un proceso

biolgico en ausencia de oxgeno (O2),
originado por la actividad de algunos
microorganismos como la levadura y
bacterias, que procesan los azcares
(carbohidratos. Los productos finales que se
obtienen de este proceso son: etanol, dixido
de carbono, NADH y ATP [1].
Las levaduras son hongos microscpicos
unicelulares importantes por su capacidad
para realizar descomposicin mediante la
fermentacin
de
varios
compuestos
orgnicos principalmente los carbohidratos
[3].
En la actualidad, ha surgido un inters
creciente en la inmovilizacin de clulas
para la produccin de alcohol, debido
principalmente a las numerosas ventajas que
ofrece. La inmovilizacin celular permite el
aumento en la productividad, la factibilidad
del proceso en continuo, la estabilidad
celular y los bajos costos de recuperacin y
reciclo en los procesos de separacin. Sin
embargo, su implementacin en los procesos
industriales es aun limitada y su aplicacin
depender de los futuros desarrollos en los
procedimientos de inmovilizacin que
puedan ser fcilmente escalables.
La mayor parte del etanol es producido
mediante fermentaciones por lotes. La
concentracin de sustrato al inicio del
proceso es de 15-25% (p/v) y el pH se ajusta
a un valor de 4-5 para disminuir los riesgos
de infeccin. El proceso se lleva a cabo a 3035C. Generalmente el rendimiento es del
90% del mximo terico. El resto de sustrato
es convertido en biomasa y otros
metabolitos.

La concentracin de etanol al trmino de la

fermentacin es de 80-100 g/L. En la
mayora de las destileras, el tiempo de
fermentacin es de 24 horas, aumentndose
6 horas para la sedimentacin de las
levaduras en los tanques.
Los procesos por lotes tienen mayores costos
del biorreactor, mayores requerimientos de
mantenimiento y operacin, bajo control del
proceso y menores productividades que los
procesos continuos. Sin embargo, a nivel
industrial, aunque la productividad es
importante, es ms relevante la conversin
de sustrato considerando que la mayor parte
de los costos de produccin corresponden a
la materia prima.
Adems de esto existen algunos factores que
pueden afectar positiva o negativamente la
fermentacin ya sea actuando sobre el
desarrollo de las levaduras o incidiendo
directamente sobre la propia fermentacin.
Los ms relevantes son los siguientes:
Temperatura: A mayor temperatura la
fermentacin transcurre ms rpidamente,
sin embargo es menos pura, es decir, se
produce menos etanol y ms cantidad de
compuestos secundarios. Las levaduras a
30C tienen su temperatura ptima de
desarrollo. Por encima de 35C la actividad
disminuye rpidamente y mueren antes de
45C.
Oxigeno: Aunque la fermentacin es un
proceso anaerbico, las levaduras mantienen
una leve respiracin utilizando para ello el
oxgeno disuelto en el mosto.

Nutrientes: Los azcares son fuente de

energa para las levaduras [4].

Materiales y mtodos

Erlenmeyer
Tarro de vidrio de 4 litros
Peachimetro
Puntas de micropipetas
Contenedores de muestras
Alcohol 70 %

Materiales

Bagazo de caa y zumo

Cajas Petri con agar nutritivo
Incubadora.
Mechero
Cmara de flujo laminar
Agar bacteriolgico
Cajas Petri con agar nutritivo con colonias.
Colorantes Gram.
Microscopio.
Estereoscopio.
Porta objetos.
Cubre objetos.
Aceite de inmersin.
Micropipeta de 1000L
Micropipeta de 200L
Micropipeta de 100L
Bano termostatico
Espectrofotometro
Bano de hielo
Tubos tapa rosca
Gradillas
Balones volumetricos de 100 ml
Glucosa
DNS
Solucin madre de levadura
MgSO4.7H2O
KH2PO4
(NH4)2 SO4
Extracto de levadura
Peptona universal
Balanza Analitica
Autoclave
Agitadores

Mtodos
En el laboratorio es de vital importancia
conocer los requerimientos mnimos para el
manejo de microorganismos [1]. Todo
microorganismo en el laboratorio se debe
manipular como si fuera potencialmente
perjudicial para la salud. En la siembra que
realizamos en el laboratorio a partir del
bagazo de caa y del lquido en las cuales se
pretenda obtener levadura obtuvimos en
mayor cantidad hongos de color negro o
blanco los cuales los caracterizamos porque
son de crecimiento moderado, abundante,
algodonosa, generalmente redondos o de
forma irregular, predomina el aspecto
cremoso
y
opaco,
superficie
con
levantamiento central,
posteriormente
aislamos en el agar nutritivo levadura pura
(sacharomyces cereviseae) proporcionada
por la profesora y tratamos de aislar la poca
levadura que se pudo observar de la obtenida
del bagazo de caa y del lquido del mismo
por el mtodo siembra por agotamiento
(figura 1).

Figura1: Siembra por agotamiento

Realizamos la caracterizacin de una

bacteria por el mtodo de gran en el cual
tomamos el material a observar en una
mnima cantidad con agujas finas o asa
estril, procurando arrancarla desde la base y
ponerlo con cuidado en una gota de agua que
se haba echado en el portaobjetos, la cual se
sec con la ayuda del mechero para fijarla,
posteriormente se trat con cristal
violeta(Impregna si es Gram +) por 1 minuto
se lav se le adiciono lugol (mordiente) por
1 minuto se lav, se lav con alcohol cetona
y
finalmente
se
adiciono
por
safranina(Impregna si es Gram -) por 30
segundos se lav y se dej escurrir.

Figura 3: hongo Gram +

2) Se observ a 100X una bacteria la cual se le
adiciono unas gotas de aceite de inmersin
proveniente del pino o del rbol de sauce, en
la cual se caracteriz como Gram - ya que
se observaron los bacilos pseudomonas de
color rosa-rojas.(Figura 4)

Se tom una muestra de un hongo obtenido

de la siembra del bagazo de caa en fresco
se coloc en un portaobjetos le adiciono azul
de metileno, un cubreobjetos y se llev para
la observacin en el microscopio, (Figura 2).

Figura 4: Bacteria Gram -

Figura 2: Hongo en fresco

Observaciones en el microscopio
1) En el microscopio se observ a 40X el
hongo en fresco que se form en nuestro
cultivo de bagazo de caa en el cual se
pudieron observar las hifas septadas, base
ensanchada, crecimiento definido y algunas
esporas.(Gram positiva en mayor parte) la
muestra se encontraba contaminada ya que
haban leves coloraciones rosadas.(Figura 3)

3) Se observ a 100X una bacteria la cual se

caracteriz como Gram +
ya que se
observaron los filamentos de color azul
oscuro o violeta, forma de capsula o puntos,
(Figura 5)

Figura 5: Bacteria Gram +

Pre tratamiento del bagazo de caa

Figura 6: Bagazo Neutralizado

Elaboracin de la curva estndar de
glucosa
Se prepar una solucin madre de glucosa a
1g/L en un baln de 100ml y se hicieron las
siguientes diluciones en tubos de ensayo
usando las micropipetas (Tabla 1)[2].

Solucin

Concentracin (g/L)

Volumen de solucin madre

(L)

Volumen de agua destilada (L)

Se tomaron 150 gramos de bagazo de caa

triturado donde se adicionaron 22,5 g de
NaOH a 2250 ml de agua en un recipiente de
vidrio de tal forma que el NaOH adicionado
se encontraba a 1 % (P/V), se coloc en el
autoclave por 30 minutos, posteriormente se
procedi a neutralizar con HCl [5M] hasta
que el PH se mantuviera estable en PH=5
(Figura 6), se dej reposar por 24 horas, se
revis que la solucin se encontrara neutra
(PH=7), se procedi a escurrir el slido y se
puedo en secado por 24 horas, obtenindose
65 gramos de material slido.

Blanco
1
2
3
4
5

0
0,125
0,25
0,5
0,75
1

0
125
250
500
750
1000

1000
875
750
500
250
0

A las diluciones preparadas SE LE adiciono a

cada una 1000 L de DNS, incluyendo al
blanco. Se tapo cada tubo para evitar prdidas
de muestra por evaporacin, se llevaron todas
las soluciones al bao termosttico a una
temperatura de 80-90C durante 5 minutos.
(Figura 7)
Pasados los 5 minutos exactos, se llevaron las
soluciones a un bao de hielo durante 5
minutos se leyeron las absorbancias de las
soluciones a 540 nm, para poder realizar la
calibracin cuyos datos sern presentados
posteriormente

Tabla 1: Diluciones para curva estndar de

glucosa.

Figura 7: Diluciones de glucosa

Preparacin del inoculo

Se activ la levadura en incubndola en el

siguiente medio de cultivo
Reactivo

Figura 7. Fermentmetro

Cantidad
(g/L)
60
1
2
3
de 4

Glucosa
MgSO4.7H2O
KH2PO4
(NH4)2 SO4
Extracto
levadura
Peptona universal
3,6
A las condiciones: 30C y 150 rpm durante
24 horas.
Montaje para la determinacin de etanol.
[4]
La cantidad de etanol producido se
cuantifica de manera indirecta a partir del
CO2 liberado durante la fermentacin,
apoyados en la relacin estequiomtrica:
La determinacin de etanol se realizan tres
montajes con erlenmeyers de 100 mL con un
volumen de fermentacin de 60 mL, se
adicionaron en promedio 4 gramos de
bagazo de caa, se adicion 54 mL de
medio de cultivo y 6 mL de biomasa. La
diferencia del montaje para la determinacin
con respecto al montaje para la
determinacin de biomasa y consumo de
sustrato es que este montaje lleva un
fermentmetro (ver figura 7 y 8)[3]

Figura 8. Montaje con fermentmetro

Mediante la relacin estequiomtrica de la
reaccin de fermentacin se sabe que por
cada mol de dixido de carbono que se
libera, se produce una mol de etanol; lo que
permite determinar la cantidad de etanol
equivalente (g/L), conociendo el volumen de
lquido en el interior del reactor, as:
Donde
Es la concentracin de etanol equivalente en
el reactor en g/L.
Cantidad de dixido de carbono liberado en
gramos.
Volumen del lquido en el reactor en litros.
Toma de muestra de los montajes en batch
[4]
La determinacin de glucosa se realiz en
erlenmeyers de 250 mL con un volumen de
fermentacin de 150 mL, se adicionaron 10
gramos de bagazo de caa,135 mL de medio
de cultivo y 15 mL de inoculo.
Se tomaron muestra entre el rango de dos o
tres horas durante un dia, en los cuales se
realizaro el siguiente procedimiento:
1. Se tom el cultivo del agitador y llevarlo a
la cmara de flujo laminar.
2. Se tomaron muestras de 1 ml cada una con
micro pipeta en epperndorf de 2mL.
3. Se centrifugar 1 muestra (5000 rpm por 5
min)

Cuantificacin de Glucosa:
1. Se Trasvaso el sobrenadante de la muestra
que fue centrifugada.
2. Se Cuantifico los azucares reductores
(ATR) por el mtodo de DNS.

Cuantificacin de Etanol indirecto:

1. Al montaje del ferment metro se le registro
el peso, con el fin de determinar la cantidad
de CO2 producido.
Resultados
Anlisis de Resultados y Conclusiones
De los datos experimentales podemos notar
que la velocidad de la fermentacin
disminuye respecto a la concentracin de
sustrato. Esto puede ser debido a que cuando
se trabaja con concentraciones de azcares
muy altas, se produce una deficiencia
respiratoria en la levadura y un descenso de
la velocidad de fermentacin; por el
contrario, se debe tener en cuenta que al
trabajar con concentraciones muy bajas, el
proceso resulta antieconmico ya que
requiere un mayor volumen para la
fermentacin. De igual manera podemos ver
que la levadura es afectada en alto grado por
la concentracin de alcohol dado que una
pequea concentracin alcohlica ya influye
sobre el crecimiento, y una concentracin
alta influye tanto sobre el crecimiento como
en la fermentacin.
Por otra parte, esta prctica es muy
importante para los futuros ingenieros
qumicos ya que podemos conocer todo el
proceso de fermentacin que se requiere para
la produccin de etanol y todo los aspectos

que estn relacionados con ste, tales como

las variables que lo afectan directa o
indirectamente, como la temperatura, el PH,
concentracin de nutrientes, aireacin; y
dado que el conocimiento de las levaduras y
microorganismos influyentes en la industria
no solo es importante para la elaboracin de
cervezas y vinos esto hace de este
laboratorio una abertura de conciencia con
respecto a los procesos industriales.

Referencias
[1]Universidad de Antioquia, Manual
estudiantes de biologa para ingenieros,2014,
24p.
[2]Universidad de Antioquia, Manual
estudiantes de biologa para ingenieros,2014,
35p.

[2]Universidad de Antioquia, Manual

estudiantes de biologa para ingenieros,2014,
35p.
[3]Universidad de Antioquia, Manual
estudiantes de biologa para ingenieros,2014,
40p.
[4]Universidad de Antioquia, Manual
estudiantes de biologa para ingenieros,2014,
41p.