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El Western blot, o inmunoblot, es una tcnica analtica usada para detectar protenas
especficas en una muestra determinada (una mezcla compleja de protenas, como un
extracto tisular). Mediante una electroforesis en gel se separan las protenas atendiendo
al criterio que se desee: peso molecular, estructura, hidrofobicidad, etc. Hay casi tantas
posibilidades como tipos de electroforesis existen. Luego son transferidas a una
membrana adsorbente (tpicamente de nitrocelulosa o de PVDF) para poder buscar la
protena de inters con anticuerpos especficos contra ella.[1] [2] Finalmente, se detecta la
unin antgeno-anticuerpo por actividad enzimtica, fluorescencia... De esta forma se
puede estudiar la presencia de la protena en el extracto y analizar su cantidad relativa
respecto a otras protenas.
Esta tcnica es hoy en da imprescindible en varios campos de la biologa, como la
biologa molecular, la bioqumica, la biotecnologa o la inmunologa. Existe toda una
industria especializada en la venta de anticuerpos (monoclonales y policlonales) contra
decenas de miles de protenas diferentes.[3] [4]
El Western blot fue desarrollado en el laboratorio de George Stark, en la Universidad de
Stanford.[2] El nombre (Western, occidental en ingls) le fue dado por W. Neal Burnette,
[5]
y consiste en un juego de palabras con una tcnica anloga pero que usa DNA, el
Southern (sureo) blot, que en este caso debe su nombre a su descubridor, Edwin
Southern. Otras tcnicas que fueron nombradas siguiendo este criterio son el Northern
blot (en el que se separa e identifica RNA), el Eastern blot, el Southwestern blot.
Antecedentes
Antes de la aparicin del Western blot, ya existan diversas tcnicas capaces de detectar
un antgeno determinado en una muestra, como la inmunoelectroforesis, la
inmunodifusin doble de Ouchterlony, la inmunoprecipitacin...
La aparicin del Western no fue posible hasta la aparicin de las membranas. En 1975,
Edwin Southern demostr que la nitrocelulosa era capaz de capturar cidos nucleicos
separados previamente por electroforesis. De esta forma, se permita el anlisis de una
mezcla compleja de molculas de ADN, como un genoma tratado con enzimas de
restriccin.[6] Se desarroll as el Southern blot, usando el nombre del descubridor como
epnimo; es por ello que tanto esta tcnica como sus derivadas (Western blot, Northern
blot...) se escriben con mayscula.
Ms tarde, Towbin (1979) y Burnette (1981) demostraron que tambin era capaz de
unirse a protenas. Ya en 1986, Millipore desarroll la primera membrana de PVDF
diseada para la transferencia de protenas, la membrana de transferencia ImmobilonTM
Las clulas pueden lisarse por uno de esos mtodos mecnicos. Tambin
pueden usarse detergentes, sales o tampones que favorezcan la lisis y
solubilicen las protenas. A veces se aaden inhibidores de proteasas y
fosfatasas que evitan la digestin por las enzimas celulares de las
protenas y de las fosfoprotenas, respectivamente.[8]
Los materiales deben estar a bajas temperaturas (~4 C) para evitar la desnaturalizacin
proteica. Para separar protenas de compartimentos y orgnulos celulares es preciso
combinar tcnicas mecnicas - como filtraciones y centrifugaciones - y bioqumicas.
Electroforesis en gel
Artculo principal: Electroforesis en gel
Las protenas de la muestra sern separadas mediante una electroforesis en gel en
funcin de uno o varios (en las electroforesis bidimensionales) de estos criterios: punto
isoelctrico, peso molecular y carga elctrica. La naturaleza de la separacin depende
del tratamiento de la muestra y de la naturaleza del gel.
La electroforesis en gel ms frecuente, conocida como SDS-PAGE, hace uso de gel de
poliacrilamida y de tampn con dodecilsulfato (SDS). En esta tcnica las protenas
sufren un tratamiento por agentes reductores que provocan la prdida de las estructuras
secundaria y terciaria (por ejemplo, reduciendo los puentes disulfuro (S-S) a grupos tiol
(SH + SH)) y mantiene los polipptidos en este estado desnaturalizado. De este modo,
la estructura tridimensional de las protenas no influye en la electroforesis, y pueden
separarse nicamente en funcin del tamao.
[editar] Transferencia
Para que las protenas sean accesibles a la deteccin por anticuerpos, se las transfiere
desde el gel de poliacrilamida a una membrana de nitrocelulosa o de PVDF. Esta
transferencia puede realizarse por difusin, por vaco o por accin de un campo
elctrico (electrotransferencia).
Las membranas que se emplean en el Western blot se caracterizan por su capacidad de
unir protenas de forma inespecfica (es decir, se adhieren a todas las protenas con
idntica afinidad):
Las membranas de nitrocelulosa son ms baratas que las de PVDF, aunque son tambin
ms frgiles, tienden a tornarse quebradizas cuando se secan y no pueden ser sometidas
a varias pruebas consecutivas.[9]
Tambin pueden usarse otros soportes, como las membranas de nylon o el papel
activado. Sin embargo, no son tan usados como los anteriores.
Difusin simple
En la transferencia por difusin simple se ponen en contacto las superficies del gel
electrofortico y de la membrana y, sobre sta, se dispone un taco de papeles de filtro.
Con el fin de facilitar el proceso, puede ponerse encima una placa de vidrio y un objeto
pesado. Este montaje se coloca sobre un tampn, que ascender por capilaridad hacia el
papel de filtro arrastrando consigo las protenas. Al llegar a la membrana, quedarn
retenidas en ella.
Este protocolo no est muy extendido actualmente, puesto que la cantidad de protena
transferida a la membrana es muy baja, mucho menor que con la electrotransferencia.
Sin embargo, ha ganado cierta popularidad por una modificacin que permite obtener
mltiples transferencias de un mismo gel, permitiendo de esta forma realizar varias
pruebas sobre geles virtualmente idnticos. Esta modificacin es viable cuando no es
necesaria una transferencia cuantitativa de protena.[10] [11]
Transferencia al vaco
En esta tcnica, se aade el poder de succin de una bomba conectada a un sistema de
secado de planchas de gel, el cual lleva las protenas desde el gel hasta la superficie de
la membrana de nitrocelulosa.[12] Este mtodo es vlido tanto para protenas de alto
como de bajo peso molecular.[11]
Electrotransferencia
Este mtodo se basa en una corriente elctrica y un tampn de transferencia para llevar
las protenas desde el gel hacia la membrana. Para ello, se apilan en el orden descrito los
siguientes elementos (del polo negativo o ctodo al positivo o nodo): esponja, varios
papeles de filtro empapados en buffer de transferencia, gel, membrana, ms papeles de
filtro empapados y otra esponja. Este montaje, llamado coloquialmente sandwich, se
dispone en el sistema de transferencia y se aplica una corriente elctrica, de magnitud
acorde a los materiales empleados, al tiempo disponible,... Las protenas del gel se
desplazan hacia el polo positivo y quedan atrapadas por la membrana.[1]
Tras la transferencia, se suele proceder a la tincin del gel con Coomassie Brilliant Blue
(un colorante de protenas) para comprobar que en efecto una parte importante del
material proteico ha pasado a la membrana.
Anticuerpo primario
Mtodo en un paso
Histricamente la deteccin se ha realizado en dos pasos por la relativa facilidad que
supone producir anticuerpos primarios y secundarios en procesos separados. Esto ofrece
a investigadores y empresas enormes ventajas en lo que a flexibilidad se refiere, y aade
un efecto amplificador al proceso. Sin embargo, debido a la llegada de los anlisis de
protenas de alto rendimiento y los menores lmites de deteccin ha crecido el inters
por desarrollar sistemas de deteccin en un solo paso que aumentaran la rapidez del
proceso al tiempo que reducen los consumibles. Esto requiere un anticuerpo que
reconozca al mismo tiempo la protena de inters y una "etiqueta" detectable. Se incuba
de manera similar al anticuerpo primario del proceso en dos pasos, y, tras una serie de
lavados, ya se puede detectar directamente.
Anlisis
Tras el lavado de las sondas marcadas no unidas, se procede a la deteccin de aquellas
que s se han unido a la protena de inters.
Deteccin colorimtrica
La deteccin colorimtrica depende de la incubacin del Western blot con un sustrato
que reacciona gracias a la enzima reporter (una peroxidasa, por ejemplo) unida al
anticuerpo secundario. Pasa as de ser un compuesto soluble a una forma insoluble de
otro color que precipita cerca de la enzima tiendo as la membrana. Se procede despus
a un lavado en el que se elimina el tinte soluble. La cuantificacin proteica se evala por
densitometra (cuan intensa es la mancha) o por espectrometra.
Deteccin quimioluminiscente
La deteccin quimioluminiscente requieren la incubacin de la membrana con un
sustrato, que emitir luminiscencia al ser expuesto al reporter que trae unido el
anticuerpo secundario. La luz emitida es captada por una pelcula fotogrfica o, ms
recientemente, por cmaras CCD, que toman una imagen digital del Western blot. Se
analiza la imagen por densitometra para evaluar la cantidad relativa de mancha y
cuantifica el resultado en trminos de densidad ptica. Actualmente hay programas que
permiten realizar anlisis ms profundos si se aplican ciertos estndares, como la
obtencin del peso molecular.
] Deteccin radiactiva
Los marcadores radiactivos no requieren sustratos enzimticos; en su lugar se coloca
una pelcula fotogrfica contra el Western blot y la actividad radiactiva del marcador
provoca la aparicin en ella de regiones oscuras. stas se correspondern con las bandas
de las protenas de inters. Su alto precio y su riesgo para la salud y la seguridad han
provocado su desuso en los ltimos tiempos.
Deteccin fluorescente
En la deteccin con marcadores fluorescentes se procede a la excitacin lumnica de
stos que les provoca una excitacin. sta es detectable por un fotosensor, como una
cmara CCD equipado con los filtros de emisin apropiados. Se consigue as una
imagen digital del Western blot que puede ser analizado para obtener el peso molecular
[
Enlaces externos
Referencias
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
[1]
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/15222683%28%2922:5%3C874::AID-ELPS874%3E3.0.CO;2-U/abstract.
Consultado el 30 de septiembre de 2010.
17.
18.
19.
Eugene Garfield (2005). The Agony and the Ecstasy The History
and Meaning of the Journal Impact Factor. International Congress on Peer
Review And Biomedical Publication (Chicago).
http://www.garfield.library.upenn.edu/papers/jifchicago2005.pdf. Consultado el
19 de septiembre de 2010. El artculo Electrophoretic transfer of proteins from
polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets - Procedure and some applications
es el sexto artculo ms citado de la historia.
Obtenido de http://es.wikipedia.org/w/index.php?
title=Western_blot&oldid=50210562