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Matrise des gots de moisi dans les vins : recherche des conditions

optimales de macration des bouchons en lige en vue de lvaluation des


quantits en chloroanisoles relargables
Jean-Michel RIBOULET(1), Michel DUMOULIN(2), Stphanie BARTHAS, Luiz ALVES
(1) CEVAQOE. 12 rue Clment Ader. 31170 TOURNEFEUILLE France.
Tel : +33 5 61 07 24 03. E-mail : CEVAQOE-RIBOULET@wanadoo.fr.
(2) LABORATOIRE EXACT. 69 rue Lacretelle. 71000 MACON France.
Tel : +33 3 85 20 93 25. E-mail : michel.dumoulin@labo-exact.com
Mots cls : bouchons, lige, chloroanisoles relargables, TCA, macration, contrle qualit,
probabilit, adsorption.
RESUME :
Dans le cadre de la prvention de lapparition de dsordres organoleptiques dans les vins
associs au bouchage, les professionnels des filires bouchonnires et vitivinicoles se sont
dots dun outil analytique permettant lvaluation du risque dapparition de gots de moisi
sur les lots de bouchons. Cet outil repose sur la mesure du 2,4,6-trichloroanisole diffus (TCA
relargable) par un prlvement de bouchons immergs dans un liquide macration constitu
deau et dthanol 12% en volume. Le principe en est dj retenu dans la norme ISO 20752 :
2007, la norme UNE 56930 : 2005 et le projet de norme AFNOR.
Ltude que nous avons mene sur plusieurs lots de bouchons avait pour objectif la
dtermination des conditions optimales de macration (effectif, nombre de rptitions)
permettant datteindre lestimation la plus prcise du risque dapparition de gots de moisi
associ un lot de bouchons en lige.
Les lots de bouchons en lige sont constitus dune majorit de bouchons exempts de TCA
relargable et dune faible proportion de bouchons trs contamins.
Quel que soit leffectif de bouchons mis en macration, un minimum de trois prlvements
savre ncessaire pour sassurer de la prsence dau moins un bouchon contamin et
permettre ainsi une valuation la plus fiable possible du risque dapparition de got de moisi
dans les vins.
Concernant la macration en elle-mme, lutilisation de bouchons contamins ,
pralablement slectionns par dgustation des macrats correspondants, a permis de mettre
en vidence lextraordinaire capacit dadsorption des bouchons sains , qui peuvent fixer
jusqu 97 % du TCA apport par des bouchons contamins.
Enfin, la concentration en TCA relargable mesure dans les macrats est une valeur
dquilibre entre le TCA diffus et le TCA adsorb par lensemble des bouchons.
1 - INTRODUCTION
Lapparition de dfaut de type moisi dans les vins est souvent le fait de composs
organochlors appartenant la famille des haloanisoles. Le 2,4,6-trichloroanisole (TCA) fait
partie de cette famille et provient de la bio-mthylation du 2,4,6-trichlorophnol.
La matrise des gots de moisi dans les vins passe donc obligatoirement par un contrle des
bouchons en lige avant les mises en bouteille. Pour rpondre une exigence dvaluation
systmatique des lots de bouchons, linterprofession sest dote dun outil de contrle bas sur
la quantification des chloroanisoles relargables dans un liquide de macration.

Les conditions danalyse des chloroanisoles relargables par technique de Micro Extraction en
Phase Solide (SPME) sont aujourdhui bien matrises. Les conditions de macration des
bouchons sont multiples et ont fait lobjet dtudes internes dans des laboratoires qui la
mettent en uvre. Considrant que la rpartition du TCA sur les planches de lige et donc sur
les bouchons est naturellement htrogne, il est fondamental de sinterroger sur les
conditions de macration qui vont permettre dvaluer au plus juste le niveau de risque
associ un lot. Trois questions se posent alors naturellement :
Quel nombre de bouchons doit tre mis en macration ?
Combien de fois doit tre rpt lanalyse sur un mme lot de bouchons ?
Quelle est la valeur limite acceptable en TCA relargable en fonction de la taille de
lchantillon mis en macration ?
Lobjectif de notre tude est de tenter de rpondre ces trois questions en utilisant, la fois
les rsultats danalyse de TCA relargable sur des macrations de bouchons de diffrents
effectifs, lapproche probabiliste pour calculer la probabilit de prsence de bouchons
contamins dans les prlvements de bouchons mis en macration et les observations faites
sur le comportement des bouchons en lige dans les conditions de macration vis--vis des
phnomnes dadsorption et de diffusion du TCA.
2 PROTOCOLES EXPERIMENTAUX
2.1 Slection des bouchons en lige
Tous les essais sont conduits sur des bouchons en lige naturel.
Ltude des conditions optimales de macration est ralise sur dix lots de 2000 bouchons en
lige naturel.
Ltude des phnomnes dadsorption du TCA par le lige dans les conditions de macration
est conduite sur des bouchons en lige naturel pralablement slectionns par dgustation de
leur macrt respectif dans leau minrale. Chaque bouchon est caractris par sa quantit de
TCA relargable obtenu par macration dans un mlange simulant vin.
2.2 Macration des bouchons en lige
Dans les conditions de macration, le taux de migration du TCA du lige vers le liquide est
fonction la fois des conditions ambiantes (temprature, pression, volume de liquide), de la
rpartition du TCA sur le lige et de la qualit mme du lige. Il convient donc pour conclure,
afin dobtenir des valeurs comparables et utilisables en pratique, dappliquer des conditions de
macration trs rigoureuses et rptables dun essai lautre.
Les macrations sont ralises dans un mlange simulant vin constitu dun mlange deau
distille et dthanol absolu (99,9%) 12% en volume. Ce mlange est pralablement analys
pour vrifier labsence dhaloanisoles.
Les conditions de macration sont testes sur des effectifs de 5, 10, 20, 50 et 100 bouchons,
qui sont entirement immergs dans respectivement 0,25, 0,5, 1,0, 2,0 et 5,0 litres de simulant
vin dans des flacons en verre pralablement rincs avec le liquide de macration et obturs
avec des bouchons vis munis dun joint recouvert de tflon.
Les macrations sont conduites sur 24 heures 0,5 heure une temprature ambiante de 20
2C.
Pour tudier les phnomnes dadsorption et de relargage du TCA dans les conditions de
macration, les essais ont t conduits sur des effectifs de 10 ou 20 bouchons auxquels ont t

ajouts des bouchons contamins pour lesquels la teneur en TCA relargable a t


pralablement mesure.
2.3 Mesure du TCA relargable
Les chloroanisoles prsents dans les macrats de bouchons sont analyss selon la procdure
retenue par la norme ISO 20752 : 2007. 5 ml de macrt sont placs dans un vial de 20ml
contenant 3 g de chlorure de sodium et 5 ml deau qualit HPLC. Une quantit connue de
TCAd5 (talon interne) est galement introduite, puis le vial est serti.
Lanalyse des chloroanisoles est effectue par SPME couple un chromatographe en phase
gazeuse spectromtrie de masse (GC-MS). Ladsorption est ralise sur une fibre en PDMS
de 100m 40C sous agitation pendant 30 minutes.
Le GC-MS est un appareil VARIAN 3900 coupl une trappe ionique SATURN 2100T et
quip dun passeur automatique COMBIPAL.
La sparation des composs est obtenue sur une colonne VF5-MS (longueur : 30m, diamtre :
0,25mm, film : 0,25m) selon la programmation suivante : 50C-1 minute, 25/min jusqu
200C, 25/min jusqu 280C, 280C-1,8 minutes. Linjecteur est 260C, le gaz vecteur est
de lhlium N60 1ml/min et lanalyse des composs est effectue en mode MS/MS.
Dans ces conditions, la mthode prsente une limite de dtection de 0,2 ng.L-1 et une limite de
quantification de 0,4 ng.L-1. Pour vrifier labsence de drive sur la mthode, un chantillon
de contrle est ralis toute les dix analyses. De plus, les performances de la mthode sont
values tous les deux mois travers un test inter laboratoire (Interlab), regroupant entre 20
et 30 laboratoires.
3 RESULTATS ET DISCUSSION
3.1 Influence de leffectif de bouchons mis en macration sur la teneur en TCA
relargable
Sur dix lots de 2000 bouchons en lige naturel des macrations sur des prlvements de 5, 10,
20, 50 et 100 bouchons sont mis en uvre, dans le but de mettre en vidence une influence de
leffectif de macration sur le niveau en TCA relargable. Pour chaque lot de bouchons, dix
prlvements de chaque effectif test est ralis.
Pour lensemble des lots tests et quel que soit leffectif de bouchons plac en macration, les
valeurs en TCA relargable sont relativement uniformes lexception dune ou deux valeurs
significativement plus importantes.
Pour pouvoir valuer une possible influence de leffectif de bouchons mis en macration sur
la teneur en TCA relargable, il faut considrer, pour des lots donns, dune part les valeurs
maximales obtenues sur les dix macrations successives et dautres part les valeurs moyennes
en TCA relargable calcules en liminant les trois concentrations les plus leves. Lvolution
de ces deux paramtres en fonction de leffectif de bouchons est reprsente sur la figure n1.
Que lon considre les valeurs maximales ou les valeurs moyennes, il nest pas possible de
mettre en vidence une corrlation entre le nombre de bouchons placs en macration et la
teneur en TCA relargable.
Ces rsultats sont trs intressants, puisquils confirment lhtrognit des lots de bouchons
et labsence de prvalence dun effectif de macration sur les autres. Lobtention ponctuelle
de macrats prsentant une forte teneur en TCA semble tre le fait de la prsence, dans le
prlvement soumis lanalyse, dun ou plusieurs bouchons plus fortement contamins que

les autres. De ce fait, lvaluation du niveau de contamination dun lot de bouchons doit plutt
tre envisage en considrant la probabilit de prsence de bouchons contamins en fonction
de la taille du prlvement mis en macration.
Figure n1 : Valeur moyenne des 7 concentrations les plus faibles et valeur maximale en
TCA relargable pour 4 lots de bouchons et pour diffrents effectifs mis en macration.
VALEURS MAXIMALES EN TCA RELARGABLE

INFLUENCE DE L'EFFECTIF MIS EN MACERATION


20 bouchons

50 bouchons

10 bouchons

100 bouchons

20 bouchons

50 bouchons

100 bouchons

60

1,60
1,40
1,20
1,00
0,80

TCA relargable (ng/l)

TCA relargable (ng/l)

10 bouchons

0,60
0,40
0,20
0,00

50
40
30
20
10
0

Lot de bouchons

Lot de bouchons

3.2 Approche probabiliste du prlvement de bouchons en vue de lvaluation du TCA


relargable
Sur la base des expriences prcdemment menes, les lots de bouchons apparaissent comme
tant constitus dune majorit de bouchons sains dans lesquels sont disperss une
certaine proportion de bouchons contamins . Lchantillonnage des lots de bouchons doit
alors tre envisag en considrant la probabilit de prsence de bouchons contamins dans
les diffrents effectifs de prlvement.
Pour simplifier le raisonnement nous avons considrs des taux de contamination compris
entre 1 et 10%. Le calcul des valeurs de probabilits davoir dans un prlvement un ou
plusieurs bouchons contamins permet alors dobtenir pour chaque effectif une valeur de
probabilit maximale fonction du taux de contamination.
La dtermination de leffectif optimal de bouchons placer en macration peut tre choisit en
se basant sur lvolution des courbes de probabilit maximale davoir un nombre donn de
bouchons contamins dans le prlvement en fonction du taux de contamination du lot (figure
n2).
Quel que soit leffectif de bouchons choisit, les courbes de probabilit maximale prsentent
un optimum compris entre 30 et 40%. Cela signifie quun minimum de trois prlvements
sera ncessaire pour obtenir au moins un bouchon contamin.
Pour des prlvements de 50 bouchons et plus, la probabilit maximale davoir un ou
plusieurs bouchons contamins diminue au del dun taux de contamination de 2%. Au del
dun taux de contamination de 5%, la probabilit maximale pour des prlvements dau moins
50 bouchons devient infrieure 20%. Le nombre de prlvements raliser pour assurer la
prsence dun ou plusieurs bouchons contamins doit alors tre au minimum de cinq.
Pour des prlvements de 10 et 20 bouchons et pour des taux de contamination compris entre
3 et 10%, la probabilit maximale est de lordre de 30%. Un minimum de 3 prlvements
permet de sassurer de la prsence dau moins un bouchon contamin.

Figure n2 : Evolution de la probabilit maximale en fonction du taux de contamination.


5 bouchons

10 bouchons

20 bouchons

50 bouchons

100 bouchons

40

Probabilit maximale (%)

35
30
25
20
15
10
5
0
1

10

Taux de contamination (%)

3.3 Mesure de la capacit dadsorption du lige vis--vis du TCA


Puisque pour des prlvements de grandes tailles la prsence de plusieurs bouchons
contamins est favorise, la dtermination de leffectif optimal de prlvement revient
sinterroger sur le comportement (adsorption, dsorption) du TCA relargable entre bouchons
contamins au sein du liquide de macration.
Nous avons considr lajout dun ou plusieurs bouchons contamins dans des
macrations de 10 et 20 bouchons. Chaque bouchon contamin remplace un bouchon
sain dans leffectif du macrt. La figure n3 montre lvolution du TCA relargable dans
les macrats de 10 et 20 bouchons en fonction de la teneur en TCA relargable apporte par un
bouchon contamin .
Figure n3 : TCA relargable dans des lots de bouchons sains dans lesquels a t introduit un
bouchon contamin.
10 bouchons

20 bouchons

TCA relargable par le lot de bouchon (valeur


corrige) (ng/litre)

2,5

y = 0,0238x + 0,6209
2

R = 0,8577
2

1,5
y = 0,0139x + 0,3051

R = 0,786

0,5

0
0

10

20

30
40
50
60
70
TCA relargable par le bouchon contamin (ng/litre)

80

90

100

Il est intressant de noter que les capacits dadsorption du TCA pour des effectifs de 10 et 20
bouchons sont comprises entre 92 et 97%.
TCA relargable (ng.L-1)
Bouchons seuls (avant macration)
182
482
70 102 102
Macration de 10 bouchons avec n bouchons contamins
19,2
<0,2
Tableau n1 : Ajout de plusieurs bouchons contamins dans des macrats de bouchons sains.
Enfin, que se passe-t-il si plusieurs bouchons contamins sont prsents dans un mme
prlvement de 10 bouchons mis en macration ? Nous avons essay de rpondre cette

question en remplaant deux puis trois bouchons dans des effectifs de 10 bouchons sains
par des bouchons contamins . Les rsultats de ces essais sont reports dans le tableau n1.
Sur la base de ces observations, laddition de plusieurs bouchons contamins dans une
macration de bouchons sains ne conduit pas laddition des teneurs en TCA relargable
mesure initialement pour chaque bouchon contamin , mais minimise la valeur.
4 - CONCLUSIONS
Les essais de macration conduits sur des lots de bouchons ont permis de dmontrer labsence
dinfluence de leffectif mis en macration sur les quantits mesures en TCA relargable. La
multiplicit des essais a permis dobserver systmatiquement, pour chaque effectif, dau
moins un macrt prsentant une valeur significative en TCA relargable. Cette observation
permet de proposer une modlisation des lots de bouchons : un ensemble de bouchons
sains , gnrant un bruit de fond en TCA relargable et des bouchons contamins ,
induisant des pics de concentration en TCA relargable.
Sur la base de cette modlisation, le choix dun effectif optimal revient considrer la
probabilit de prsence de bouchons contamins dans les prlvements mis en macration et
le taux de contamination des lots tester.
Pour des prlvements de 5 100 bouchons, la probabilit de prsence dau moins un
bouchon contamin nexcde jamais 40%. Cela signifie, quun minimum de trois
prlvements permet de garantir la prsence dau moins un bouchon contamin.
Compte tenu de labsence dadditivit du TCA relargable au sein dun mme milieu de
macration, il semble plus efficace de raliser des prlvements de 10 ou 20 bouchons
maximum pour reprer des lots de bouchons contamins plus de 4%.
En effet, les exigences des utilisateurs, en relation avec les seuils de dtection et les seuils
didentification du TCA dans les vins sont telles, que les valeurs acceptes pour les macrats
de bouchons naturel haut de gamme sont 3ng.L-1 voire 2ng.L-1 pour des chantillons de 20
bouchons. Ainsi, avec un chantillon de 50 bouchons, les taux de re-fixation sont tels que ces
spcifications devront tre abaisses.
La problmatique restera donc de dterminer le mode de prlvement des chantillons pour
analyse sur un lot de bouchons en fonction de sa taille. Il faudra galement fixer, outre les
spcifications, les pourcentages de risques acceptables. La rponse ne pourra obtenue pour un
lot considr quavec un nombre suffisant danalyses dchantillons de 20 bouchons, en
association avec des tests sensoriels.
5 BIBLIOGRAPHIE
(1) Riboulet JM, Alves L, Urreizti N. Determination of chloroanisoles by solid phase
microextraction (SPME) and gas chromatography (GC) with mass spectrometry
detection (MS), in cork soaks or in wine. Cienca e Tecnica Vitivinicola. 2002, 17(2),
61-71.
(2) Dumoulin M, Riboulet JM. Chloroanisoles relargables dans les bouchons de lige :
recherche des conditions optimales de macration. Projet CE-Lige. Septembre 2004
(3) Herv E. Screening natural corks by their releasable TCA : does it work ?. ETS
Laboratories, St Helena, CA. Juillet 2005.
(4) ISO 20752 : 2007. Bouchons en lige. Dosage du 2,4,6-trichloroanisole (TCA)
relargable.

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