ABSTRACT

In this review, we mainly focused on characterization of the taxol producing endophytic fungi
frommedicinal plants. The different endophytic fungi were isolated and characterized for its
potential in taxol production in past two decades. All the strains were identified based on the
morphology of the fungal culture and the characteristics of the spores and with specific
molecular techniques. The endophytic strains were grown in MID liquid medium for the taxol
production. The qualitative and quantitative measures were analyzed to confirm the
presence of taxol. The amounts of taxol production were quantified by high performance
liquid chromatography which suggests that the fungus can serve as a potential material for
genetic engineering to improve the taxol production. Further, the endophytic fungal taxol
have strong cytotoxic activity on different human cancer cells in vitro, tested by apoptotic
assay
ABSTRAK
Dalam ulasan ini, kami terutama berfokus pada karakterisasi taxol memproduksi
jamur endofit tanaman frommedicinal. Jamur endofit yang berbeda diisolasi dan
dikarakterisasi untuk potensinya dalam produksi taxol dalam dua dekade terakhir.
Semua strain diidentifikasi berdasarkan morfologi kultur jamur dan karakteristik
spora dan dengan teknik molekuler tertentu. Strain endofit ditumbuhkan dalam
media cair MID untuk produksi taxol. Langkah-langkah kualitatif dan kuantitatif
dianalisis untuk mengkonfirmasi kehadiran taxol. Jumlah produksi taxol yang diukur
dengan kromatografi cair kinerja tinggi yang menunjukkan bahwa jamur dapat
berfungsi sebagai bahan potensial untuk rekayasa genetika untuk meningkatkan
produksi taxol. Selanjutnya, taxol jamur endofit memiliki aktivitas sitotoksik yang
kuat pada sel kanker manusia yang berbeda in vitro, diuji dengan uji apoptosis

KEY WORDS
Anticancer drug, Cancer cell lines, Endophytic fungi, Medicinal plant, Taxol, Taxus.
KATAKUNCI
Obat antikanker, baris sel kanker, jamur endofit, tanaman obat, Taxol, Taxus.

INTRODUCTION
Medicinal plants
A medicinal plant is any plant which in one or more of the organ contains substance
that can be used for therapeutic purpose or which is a precursor for synthesis of
useful drugs. Plants are one of the most important sources of medicine in the recent
years. Plant products have been a source of medicinal agent since time immemorial.
From the dawn of civilization, human have been utilizing the important biological
properties of various plants for treat different types of the diseases. Even today,
plants are the most exclusive source of drugs for the majority of worlds population
and plant products constitute about 25% of prescribed medicines 5. Medicinal plants
have their values in the substance(s) present in various plant tissues. These produce
specific physiological action in the human body. The more important of these
substances are alkaloids, compounds of carbon, hydrogen, oxygen and nitrogen.
These substances glucosides, essential fatty oils, resins, gums, mucilage, tannins
and secondary metabolites etc. are also of large use. These active principles may be
present in the storage organs of the plant.
PENDAHULUAN
tanaman obat
Sebuah tanaman obat adalah setiap tanaman yang pada satu atau lebih dari organ
mengandung zat yang dapat digunakan untuk tujuan terapeutik atau yang merupakan

prekursor untuk sintesis obat yang berguna. Tanaman adalah salah satu sumber yang
paling penting dari obat-obatan dalam beberapa tahun terakhir. Produk tanaman telah
menjadi sumber agen obat sejak jaman dahulu. Dari awal peradaban, manusia telah
memanfaatkan sifat biologis yang penting berbagai tanaman untuk mengobati berbagai
jenis penyakit. Bahkan saat ini, tanaman adalah sumber yang paling eksklusif dari obatobatan untuk mayoritas penduduk dan pabrik produk dunia merupakan sekitar 25% dari
medicines5 ditentukan. Tanaman obat memiliki nilai-nilai mereka dalam substansi (s) hadir
dalam berbagai jaringan tanaman. Ini menghasilkan tindakan fisiologis tertentu dalam tubuh
manusia. Yang lebih penting dari zat ini alkaloid, senyawa karbon, hidrogen, oksigen dan
nitrogen. Zat-zat ini glukosida, lemak esensial minyak, resin, gusi, lendir, tanin dan
metabolit sekunder dll juga penggunaan besar. Prinsip-prinsip aktif ini dapat hadir dalam
organ penyimpanan tanaman.
Endophytes
Endophytes, microorganisms that reside in the internal tissues of living plants
without causing any immediate overt negative effects have beenfound in every plant
species examined to date and recognized as the potential sources of novel natural
products for exploitation in medicine, agriculture and industry with more bioactive
natural products isolated from the microorganisms 1,27. Endophytes are ubiquitous
with rich biodiversity, which have been found in every plant species examined to
date. It is noteworthy that, of the nearly 3,00,000 plant species that exist on the earth,
each individual plant is the host to one or more endophytes 27. In this view of the
special colonization in certain hosts, it is estimated that there may be as many as 1
million different endophyte species.
However, only a handful of them have been described 19, which means the
opportunity to find new and targeting natural products from interesting endophytic
microorganisms among myriads of plants in different niches and ecosystems is
great. Some of the endophytes are the chemical synthesizers in inside the plants 18.
Many of them are capable of synthesizing bioactive compounds that can be used by
plantsfor defense against human pathogens and some of these compounds have
been proven useful for novel drug discovery. Recent studies have reported hundreds
of natural products including substance of alkaloids, terpenoids, flavonoids,
steroids, etc. from endophytes. Up to now, most of the natural products from
endophytes are antibiotics, anticancer agents, biological control agents and other
bioactive compounds by their different functional roles.
endofitik
Endofitik, mikroorganisme yang berada dalam jaringan internal tanaman hidup
tanpa menimbulkan efek negatif yang jelas langsung telah beenfound di setiap
spesies tanaman diperiksa sampai saat ini dan diakui sebagai sumber potensial
produk alami baru untuk eksploitasi di bidang kedokteran, pertanian dan industri
dengan lebih bioaktif alami produk diisolasi dari microorganisms1,27 tersebut.
Endofit mana-mana dengan keanekaragaman hayati yang kaya, yang telah
ditemukan di setiap spesies tanaman diperiksa sampai saat ini. Perlu dicatat bahwa,
hampir 3,00,000 spesies tanaman yang ada di bumi, masing-masing individu
tanaman adalah tuan rumah untuk satu atau lebih endophytes27. Dalam
pandangan ini dari penjajahan khusus di host tertentu, diperkirakan bahwa mungkin
ada
sebanyak
1
juta
spesies
endofit
yang
berbeda.
Namun, hanya sedikit dari mereka telah described19, yang berarti kesempatan
untuk menemukan baru dan menargetkan produk alami dari mikroorganisme
endofit menarik di antara berjuta tanaman di relung yang berbeda dan ekosistem

besar. Beberapa endofitik adalah synthesizer kimia di dalam plants18 tersebut.

Banyak dari mereka yang mampu mensintesis senyawa bioaktif yang dapat
digunakan oleh pertahanan plantsfor terhadap patogen manusia dan beberapa
senyawa ini telah terbukti berguna untuk penemuan obat baru. Penelitian terbaru
telah melaporkan ratusan produk alam termasuk zat alkaloid, terpenoid, flavonoid,
steroid, dll dari endofitik. Hingga saat ini, sebagian besar produk alami dari endofitik
adalah antibiotik, agen antikanker, agen pengendalian biologis dan senyawa
bioaktif lain dengan peran fungsional yang berbeda.
Endophytic fungus
Endophytic fungi are increasingly recognized assources of novel bioactive
compounds and
secondary metabolites for biological control. In addition to studying the distribution
and ecology of fungal endophytes from medicinal plants, special attention should be
given to screening them for potent metabolites. The endophytic fungi are of
biotechnological importance as new pharmaceutical compounds, secondary
metabolites, agents of biological control and other useful characteristics could be
found by further exploration of endophytes. Therefore, the use of endophytic fungi
opens up new areas of biotechnological exploitations, which leads to the necessity
of isolation and cultivation of these organisms.
Jamur endofit
Jamur endofit semakin diakui assources senyawa bioaktif baru dan metabolit
sekunder untuk pengendalian biologis. Selain mempelajari distribusi dan ekologi
endofitik jamur dari tanaman obat, perhatian khusus harus diberikan untuk skrining
mereka untuk metabolit ampuh. Jamur endofit sangat penting bioteknologi sebagai
senyawa farmasi baru, metabolit sekunder, agen kontrol biologis dan karakteristik
lain yang berguna dapat ditemukan oleh eksplorasi lebih lanjut dari endofitik. Oleh
karena itu, penggunaan jamur endofit membuka daerah baru eksploitasi
bioteknologi, yang mengarah pada perlunya isolasi dan budidaya organisme ini

Taxol
Taxol is an important anticancer drug used widely in the clinical field. Taxol is a
diterpenoids, which was first extracted in the bark of yew (Taxus brevifolia)33. It can
kill tumor cells by enhancing the assembly of microtubules and inhibiting their
depolymerisation24. This compound is the worlds first billion dollar anticancer drug
and it is used to treat breast, lung, ovarian cancer and otherhuman tissue
proliferating disease31. Taxol is a white to off white crystalline power contains 11
sterocenters and with the empirical formula C 47H51NO14 (molecular weight 853.9). It is
highly lipophillic, insoluble in water and melts at around 216-217C. Structurally, it
can be viewed as the N-benzoyl--phenylisoserine ester of diterpenoid bacentia III
with a very characteristic oxetane ring. Kingson 10 have completely studied the
chemical structure of the taxol which is classified as taxane diterpenoids or taxoid.
Taxol has a unique mode of action when compared to other anticancer drug. It acts
as a promoter of tubulin polymerization and stabilizes microtubules to
depolymerization by different agents, both in vitro and in vivo24. Taxol has been well
established and approved by Food and Drug Administration (FDA) as a very
important effective chemotherapeutic agent against a wide range of tumors since
199211. However, the supply of Taxol has been very limited since the discovery of this
natural product and with increasing the applications in chemotherapy, the availability

and cost of the drug will remain an important issue 12.Taxol used in cancer
chemotherapy and scientific research is isolated from yew tree or semisynthesized
from its precursors such as baccatin III and 10-deacetylbaccatin III which are all
isolated from this natural plant4. However, this natural resource is being threatened
day by day due to the destructive collection of Taxus bark for
Taxol. In order to protect Taxus in the world and lighten the pressure of Taxol
sourcing, other approaches to obtain Taxol have been under investigation and some
progresses have been made. Besides semi-synthesis and isolation from plant, there
are several other possible routes to industrialize Taxol production: tissue or cell
culture3,9, total chemical synthesis8,16,17, endophytic fungal fermentation 14,26,29,32 and
a potential way of engineering for Taxol production.
Taxol
Taxol adalah obat antikanker penting yang digunakan secara luas dalam bidang
klinis. Taxol adalah diterpenoid, yang pertama kali diekstrak dalam kulit yew (Taxus
brevifolia) 33. Hal ini dapat membunuh sel tumor dengan meningkatkan perakitan
mikrotubulus dan menghambat depolymerisation24 mereka. Senyawa ini
merupakan obat antikanker miliar dolar pertama di dunia dan digunakan untuk
mengobati kanker payudara, paru-paru, kanker ovarium dan jaringan berkembang
biak otherhuman disease31. Taxol adalah putih untuk aliran listrik kristal putih
mengandung 11 sterocenters dan dengan rumus empiris C47H51NO14 (berat
molekul 853,9). Hal ini sangat lipophillic, tidak larut dalam air dan meleleh pada
sekitar 216-217C. Secara struktural, dapat dilihat sebagai ester N-benzoil-phenylisoserine dari diterpenoid bacentia III dengan cincin oxetane sangat khas.
Kingson10 telah benar-benar mempelajari struktur kimia dari taxol yang
diklasifikasikan sebagai diterpenoid taxane atau taxoid. Taxol memiliki modus yang
unik tindakan bila dibandingkan dengan obat antikanker lainnya. Bertindak sebagai
promotor tubulin polimerisasi dan menstabilkan mikrotubulus untuk depolimerisasi
oleh agen yang berbeda, baik in vitro dan in vivo24. Taxol telah mapan dan disetujui
oleh Food and Drug Administration (FDA) sebagai agen kemoterapi yang sangat
penting efektif terhadap berbagai tumor sejak 199211. Namun, pasokan Taxol telah
sangat terbatas sejak ditemukannya produk alami ini dan dengan meningkatkan
aplikasi dalam kemoterapi, ketersediaan dan biaya obat akan tetap menjadi
issue12.Taxol penting yang digunakan dalam kemoterapi kanker dan penelitian
ilmiah diisolasi dari pohon yew atau semisynthesized dari prekursor yang seperti
Baccatin III dan 10-deacetylbaccatin III yang semuanya terisolasi dari plant4 alami
ini. Namun, sumber daya alam ini sedang terancam dari hari ke hari karena koleksi
merusak Taxus kulit untuk Taxol. Untuk melindungi Taxus di dunia dan meringankan
tekanan Taxol sourcing, pendekatan lain untuk mendapatkan Taxol telah diselidiki
dan beberapa kemajuan telah dibuat. Selain semi-sintesis dan isolasi dari tanaman,
ada beberapa rute lain mungkin untuk industrialisasi produksi Taxol: tisu atau
culture sel, jumlah synthesis kimia, fermentasi jamur endofit dan cara potensi
rekayasa untuk produksi Taxol.
TAXOL FROM ENDOPHYTIC FUNGI
The first Taxol producing fungus Taxomyces andreanae was reported26. Although the
yield of Taxol is only as low as 24-50 ng/L, this finding causes scientists great
interest. Ever since, there have been a few reports on the isolation of Taxol
producing endophytic fungi, demonstrating that organisms other than Taxus species
could produce Taxol. Thus, the Taxol producing microorganisms may be an
alternative promising way to produce using fermentation process. Meanwhile, the

biggest problem of using fungi fermentation to produce Taxol is its very poor yield
and unstable production. The Taxol yield of
such reported fungi varies from 24 ng to 70 g/L of culture. One strain of
Pestalotiopsis
microspora CP-4 produces Taxol varying from 50 to 1487 ng/L, indicating that it is
genetically unstable14. To solve such a problem, current studies mainly focuses on
the tedious work of finding and isolating fungi with high, stable yield of Taxol, as well
as optimization of fermenting conditions. The genetic origin of fungal taxol
production has been speculated to have arisen by horizontal gene transfer from host
plant to its endophytes. Little documentation exists with regards to gene transfer
from a higher plant to an endophyte or parasite. Alternatively, fungi might be an
independently evolved system for taxol production. Some endophytic fungi
belonging to different genera such as T. andreanae, Pestalotiopsis microspora,
Alternaria alternata, Periconia sp., Pithomyces sp., Chaetomella raphigera,
Monochaetia sp. and Seimatoantlerium nepalense are reported to produce Taxol.
Recently, our research group has isolated the several endophytic fungal strains
(more than 100 strains) from varoius medicinal plants in India for the taxol
production6. The higher taxol producing endophytic fungal strains such as
Botryodiplodia theobromae from Taxus baccata and leaf spot strain, Phyllosticta
citricarpa from Citrus medica were reported. In addition, a simple and rapid method
for the determination of taxol produced by fungal endophytes from medicinal plants
using high performance thin
layer chromatography has been well established. The optimization of fermenting
conditions on the taxol producing endophytic fungal starins is under progress. An
endophytic fungus, Pestalotiopsis terminaliae was isolated from the Terminalia
arjuna plant was produced the highest amount of Taxol.
Taxol DARI jamur endofit
Pertama Taxol memproduksi jamur Taxomyces andreanae adalah reported26.
Meskipun hasil Taxol hanya serendah 24-50 ng / L, temuan ini menyebabkan minat
besar para ilmuwan '. Sejak saat itu, telah ada beberapa laporan tentang isolasi
Taxol memproduksi jamur endofit, menunjukkan bahwa organisme selain spesies
Taxus bisa menghasilkan Taxol. Dengan demikian, produksi mikroorganisme Taxol
mungkin menjadi cara alternatif yang menjanjikan untuk menghasilkan
menggunakan proses fermentasi. Sementara itu, masalah terbesar dari
menggunakan fermentasi jamur untuk menghasilkan Taxol adalah hasil yang sangat
miskin
dan
produksi
stabil.
The
Taxol
hasil
jamur dilaporkan seperti bervariasi dari 24 ng 70 mg / L budaya. Salah satu strain
Pestalotiopsis
microspora CP-4 menghasilkan Taxol bervariasi 50-1487 ng / L, menunjukkan bahwa
secara genetik unstable14. Untuk mengatasi masalah tersebut, penelitian saat ini
terutama berfokus pada pekerjaan membosankan untuk menemukan dan
mengisolasi jamur dengan tinggi, hasil stabil Taxol, serta optimasi kondisi
fermentasi. Asal genetik produksi taxol jamur telah berspekulasi untuk muncul
melalui transfer gen horizontal dari tanaman inang untuk endofit tersebut. Sedikit
dokumentasi yang berkaitan dengan transfer gen dari tanaman yang lebih tinggi ke
endofit atau parasit. Atau, jamur mungkin sistem independen berevolusi untuk
produksi taxol. Beberapa jamur endofit milik genera yang berbeda seperti T.
andreanae, Pestalotiopsis microspora, Alternaria alternata, Periconia sp., Pithomyces

sp., Chaetomella raphigera, Monochaetia sp. dan Seimatoantlerium nepalense

dilaporkan untuk menghasilkan Taxol. Baru-baru ini, kelompok riset kami telah
mengisolasi beberapa strain jamur endofit (lebih dari 100 strain) dari tanaman obat
varoius di India untuk production6 taxol. Semakin tinggi taxol memproduksi strain
jamur endofit seperti Botryodiplodia theobromae dari Taxus baccata dan daun
tempat ketegangan, Phyllosticta citricarpa dari Citrus medica dilaporkan. Selain itu,
metode yang sederhana dan cepat untuk penentuan taxol diproduksi oleh endofit
jamur dari tanaman obat dengan menggunakan kinerja tinggi tipis kromatografi
lapis telah mapan. Optimalisasi fermentasi kondisi di taxol memproduksi starins
jamur endofit masih dalam proses. Sebuah jamur endofit, Pestalotiopsis terminaliae
diisolasi dari tanaman arjuna Terminalia diproduksi jumlah tertinggi Taxol.

Extraction of taxol
The standard extraction procedure29 was followed for the taxol isolation from
endophytic fungal strains. All the strains were grown in 2 LErlenmeyer flasks
containing 500 mL of standard liquid medium for taxol production supplemented with
1 g/L soytone. The fungi were individually inoculated and incubated for 21 days. After
the incubation, the cultures were filtered through four layers of cheesecloth to
remove the mycelia. 0.25 g Na 2CO3 was added to the culture filtrate with frequent
shaking, to reduce the amount of fatty acids that may contaminate taxol in the
culture. Then, the culture filtrate was extracted with two equal volumes of solvent
dichloromethane. The organic phase was collected and the solvent was
then removed by evaporation under reduced pressure at 35C using a rotary vacuum
evaporator. The dry solid residue was redissolved in methanol for subsequent
separation.
The crude extracts were analyzed by chromatographic separation and spectroscopic
analyses.
Ekstraksi taxol
The procedure29 ekstraksi standar diikuti untuk isolasi taxol dari strain jamur
endofit. Semua strain ditumbuhkan dalam 2 termos LErlenmeyer mengandung 500
mL media cair standar untuk produksi taxol dilengkapi dengan 1 g / L soytone.
Jamur secara individual diinokulasi dan diinkubasi selama 21 hari. Setelah inkubasi,
kultur disaring melalui empat lapisan kain tipis untuk menghilangkan miselia. 0,25 g
Na2CO3 ditambahkan ke filtrat kultur dengan sering gemetar, untuk mengurangi
jumlah asam lemak yang dapat mencemari taxol dalam budaya. Kemudian, filtrat
kultur diekstraksi dengan dua volume yang sama diklorometana pelarut. Fase
organik dikumpulkan dan pelarut adalah kemudian dihapus oleh penguapan pada
tekanan rendah di 35C menggunakan evaporator vakum rotary. Residu padat
kering dilarutkan kembali dalam metanol untuk pemisahan berikutnya. Ekstrak
kasar dianalisis dengan pemisahan kromatografi dan analisis spektroskopi.
Thin layer chromatographic (TLC) analysis
The TLC analysis was carried out on 1 mm (2020 cm) silica gel pre-coated plate
developed insolvent A, chloroform:methanol (7:1, v/v) followed by solvent B,
chloroform:acetonitrile (7:3, v/v); solvent C, ethyl acetate:2-propanol (95:5, v/v);
solvent D, methylenechloride:Tetrahydrofuran (6:2, v/v) and solvent E,
methylenechloride : methanol:dimethylformamide (90:9:1, v/v/v). Taxol was detected
with 1% w/v vanillin in sulphuric acid reagent after gentle heating. The fungal taxol

was identified by comparison with the authentic taxol. The fungal taxol had identical
and positive reactivity with the
spray reagent, which yielded a blue spot and turned to dark gray after 24 hours. The
endophytic fungal compounds are with the same chromatographic mobility as the
authentic taxol were recorded and they showed the Rf values ranged between 0.22
0.24. Some of the
endophytic fungal strains did not show evidence of taxol production.
Lapisan tipis kromatografi (TLC) analisis
TLC Analisis dilakukan pada 1 mm (20 20 cm) silika gel pra-dilapisi pelat
dikembangkan bangkrut A, kloroform: metanol (7: 1, v / v) diikuti oleh pelarut B,
kloroform: asetonitril (7: 3, v / v); pelarut C, etil asetat: 2-propanol (95: 5, v / v); D
pelarut, metilenklorida: Tetrahydrofuran (6: 2, v / v) dan pelarut E, metilenklorida:
metanol: dimetilformamida (90: 9: 1, v / v / v). Taxol terdeteksi dengan 1% w / v
vanillin dalam pereaksi asam sulfat setelah pemanasan lembut. The taxol jamur
diidentifikasi oleh perbandingan dengan taxol otentik. The taxol jamur memiliki
identik dan positif reaktivitas dengan reagen semprot, yang menghasilkan titik biru
dan beralih ke abu-abu gelap setelah 24 jam. Senyawa jamur endofit yang dengan
mobilitas kromatografi sama dengan taxol otentik dicatat dan mereka menunjukkan
nilai Rf berkisar antara 0,22-0,24. Beberapa strain jamur endofit tidak menunjukkan
bukti produksi taxol.
Ultraviolet (UV) spectroscopic analysis
The presence of taxol in the fungal extract was further confirmed by UV
spectroscopy. After the TLC method, the area of plate containing putative taxol was
carefully removed by scrapping off the silica at the appropriate R f and exhaustively
eluting it with methanol. After the elution, the crude taxol was performed for the
qualitative and quantitative analyses. The taxol samples were analyzed by UV
absorption (Beckman DU-40 Spectrophotometer), dissolved in 100% methanol and
compared with authentic taxol (Paclitaxel, Sigma Grade). They had a characteristic
absorption peak at 235273 nm, similar to those previous reports.
Ultraviolet (UV) analisis spektroskopi
Kehadiran taxol dalam ekstrak jamur selanjutnya dikonfirmasikan dengan
spektroskopi UV. Setelah metode TLC, area piring berisi taxol diduga hati-hati
dihapus oleh scrapping dari silika di Rf yang tepat dan mendalam eluting dengan
metanol. Setelah elusi tersebut, taxol mentah dilakukan untuk analisis kualitatif dan
kuantitatif. Sampel taxol dianalisis dengan penyerapan UV (Beckman DU-40
Spektrofotometer), dilarutkan dalam 100% metanol dan dibandingkan dengan
otentik taxol (Paclitaxel, Sigma Grade). Mereka memiliki puncak serapan
karakteristik pada 235-273 nm, mirip dengan laporan sebelumnya.

High performance thin layer chromatography (HPTLC) analysis

The prepurified fungal taxol samples obtained in TLC were further subjected to
HPTLC (CAMAGPlanar HPTLC, Anchrom). With the automatic TLC Sampler, all the
extracted taxol samples and authentic taxol (5 L for each samples) were injected
into their respective tracks separately, with the data pair technique, with the band
length being 5 mm, the distance from lower edge 10 mm, the distance from the side
20 mm and the track distance 6.4 mm, on a pre-coated silica gel 60 F254 (20 cm 10
cm) plate (Merck, Germany). After loading, the plate was dried for 30 s using a plate

heater. After loading, the TLC plate was developed in a CAMAG pre-saturated flat
bottom developing chamber with chloroformmethanol (9:1, v/v) for 20 min.
Documentation of the TLC plate was performed under a shorter wavelength (254 nm)
UV lamp and a longer wavelength (366 nm) UV lamp, prior to derivatization. The
presence of the taxol was visualized after it was sprayed with 1% (w/v) vanillin
sulfuric acid and heated gently for 2 min.
After derivatization with the spray reagent, documentation was performed under the
UV lamp at 366 nm and white light, which was used to visualize the colored
substance after derivatization. In HPTLC, the amount of taxol produced by the fungi
was calculated through
comparing the area and the height of peaks observed in fungal taxol with that of
authentic
taxol. The results obtained in HPTLC technique can be used for rapid separation and
high throughput screening for taxol producing endophytic fungi and used for
quantification of the
amount of taxol. The best results were achieved using visualization after
derivatization by spraying a reagent and by identifying with the help of the fingerprint
technique. This validated method was found to be simple, reliable and convenient for
routine analysis. In HPTLC, the principal requirement for the documentation was the
visibility of the chromatogram with or without derivatization. The substances with the
absorbance of UV light at 254 nm were visualized as dark zones on the plates, with a
fluorescence indicator, which was excited to emit green light under a shorter
wavelength (254 nm) UV lamp. A longer wavelength (366 nm) UV lamp was used to
excite substances that were able to fluoresce. White light was used to visualize
colored was performed under a shorter wavelength (254
nm) UV lamp.
Kinerja tinggi kromatografi lapis tipis (HPTLC) analisis
Sampel taxol jamur prepurified diperoleh di TLC yang lebih mengalami HPTLC
(CAMAGPlanar HPTLC, Anchrom). Dengan otomatis TLC Sampler, semua sampel
taxol yang diekstrak dan taxol otentik (5 uL untuk setiap sampel) yang disuntikkan
ke dalam trek masing-masing secara terpisah, dengan teknik pasangan data,
dengan panjang pita menjadi 5 mm, jarak dari tepi bawah 10 mm , jarak dari sisi 20
mm dan track jarak 6,4 mm, pada pra-dilapisi gel silika 60 F254 (20 cm x 10 cm)
piring (Merck, Jerman). Setelah loading, piring dikeringkan selama 30 s
menggunakan pemanas piring. Setelah loading, pelat TLC dikembangkan dalam
Camag pra-jenuh dasar datar mengembangkan ruang dengan chloroformmethanol
(9: 1, v / v) selama 20 menit. Dokumentasi dari pelat TLC dilakukan di bawah
gelombang lebih pendek (254 nm) lampu UV dan gelombang yang lebih panjang
(366 nm) lampu UV, sebelum derivatisasi. Kehadiran taxol yang divisualisasikan
setelah disemprot dengan 1% (b / v) asam sulfat vanili dan dipanaskan dengan api
kecil selama 2 menit. Setelah derivatisasi dengan reagen semprot, dokumentasi
dilakukan di bawah lampu UV pada 366 nm dan cahaya putih, yang digunakan
untuk memvisualisasikan bahan berwarna setelah derivatisasi. Di HPTLC, jumlah
taxol yang dihasilkan oleh jamur yang dihitung melalui membandingkan daerah dan
ketinggian puncak diamati dalam taxol jamur dengan taksol otentik. Hasil yang
diperoleh dalam teknik HPTLC dapat digunakan untuk pemisahan cepat dan
penyaringan throughput tinggi untuk taxol memproduksi jamur endofit dan
digunakan untuk kuantifikasi jumlah taxol. Hasil terbaik dicapai dengan
menggunakan visualisasi setelah derivatisasi dengan menyemprotkan reagen dan

dengan mengidentifikasi dengan bantuan teknik sidik jari. Metode ini divalidasi
ditemukan untuk menjadi sederhana, handal dan nyaman untuk analisis rutin. Di
HPTLC, persyaratan utama untuk dokumentasi adalah visibilitas kromatogram
dengan atau tanpa derivatisasi. Zat dengan absorbansi cahaya UV pada 254 nm
divisualisasikan sebagai zona gelap di piring, dengan indikator fluoresens, yang
bersemangat untuk memancarkan cahaya hijau di bawah panjang gelombang lebih
pendek (254 nm) lampu UV. Sebuah panjang gelombang (366 nm) lampu UV
digunakan untuk merangsang zat yang mampu berpendar. Cahaya putih digunakan
untuk memvisualisasikan berwarna dilakukan di bawah gelombang lebih pendek
(254 nm) lampu UV.

Infrared (IR) spectroscopic analysis

IR spectrum of the fungal taxol was recorded on Shimadzu FT IR 8000 series
instrument. The partially purified fungal Taxol was ground with IR grade potassium
bromide (KBr) (1:10) pressed into discs under vacuum using spectra lab Pelletizer
and compared with authentic Taxol. The IR spectra were recorded in the region 4000
500/cm. Further, the extracted fungal taxol were analysed by IR spectrum for the
confirmation. The IR spectrum showed a broad peak at 3434.99/cm which was
assigned for the presence of the Ogroup in the parent compound, as evidenced by its
OH stretch. The aliphatic CH stretch was observed at 2927.74/cm. The C=O (keto
group) stretch was positioned at 1724.24 and 1656.74/cm. The registration peak
observed at 1485.08 and 1450.37/cm was due to the NH stretching frequency. The
COO stretching frequency was observed at 1371.29 and
1242.07/cm. The peaks in the range between 1070.42 and 979.77/cm were due to the
presence of aromatic C and H bends. Fungal taxol was further confirmed by IR
fingerprints recorded between 1000 and 3500/cm, which were also identical in
comparison to the standard taxol. Therefore, it was evident that the endophytic
fungus showed positive results for taxol production in M1D medium. For example,
the IR spectral data of fungal Taxol from C. raphigera showed a broad peak in the
region 3417.6/cm was described to hydroxyl (OH) and amide ( NH) groups stretch.
The esters and ketone (C=O )groups stretch was observed in the region of
1,724.2/cm. The aromatic ring (C=C) stretching frequency was observed in the region
1,658.7/cm. A peak observed in the region 1026.1/cm is due to the presence of
aromatic C, H bends.
Inframerah (IR) analisis spektroskopi
IR spektrum taxol jamur tercatat pada Shimadzu FT IR 8000 instrumen seri. The
Taxol jamur sebagian dimurnikan adalah tanah dengan IR kelas kalium bromida
(KBr) (01:10) ditekan ke cakram kondisi vakum menggunakan lab spektrum
Pelletizer dan dibandingkan dengan otentik Taxol. Spektrum IR tercatat di wilayah
4000- 500 / cm. Selanjutnya, taxol jamur diekstraksi dianalisis dengan IR spektrum
untuk konfirmasi. Spektrum IR menunjukkan puncak luas di 3.434,99 / cm yang
ditugaskan untuk kehadiran Ogroup dalam senyawa induk, sebagaimana dibuktikan
oleh peregangan OH nya. CH alifatik peregangan diamati pada 2.927,74 / cm. C = O
(gugus keto) peregangan diposisikan di 1.724,24 dan 1.656,74 / cm. Puncak
pendaftaran diamati pada 1.485,08 dan 1.450,37 / cm disebabkan frekuensi
peregangan NH. The COO Frekuensi peregangan diamati pada 1.371,29 dan
1.242,07 / cm. Puncak dalam kisaran antara 1.070,42 dan 979,77 / cm adalah
karena adanya aromatik C dan H tikungan. Taxol jamur selanjutnya dikonfirmasikan
oleh IR sidik jari yang tercatat antara 1000 dan 3500 / cm, yang juga identik

dibandingkan dengan taxol standar. Oleh karena itu, tampak jelas bahwa jamur
endofit menunjukkan hasil positif untuk produksi taxol dalam medium M1D. Sebagai
contoh, data spektral IR Taxol jamur dari C. raphigera menunjukkan puncak luas di
wilayah 3.417,6 / cm digambarkan dengan hidroksil (-OH) dan amida (- NH)
kelompok peregangan. Ester dan keton (C = O) kelompok peregangan diamati di
wilayah 1,724.2 / cm. Aromatik cincin (C = C) Frekuensi peregangan diamati di
wilayah 1,658.7 / cm. Sebuah puncak diamati di wilayah 1.026,1 / cm ini disebabkan
adanya aromatik C, H tikungan.

High performance liquid chromatography (HPLC) analysis

Taxol was analyzed by HPLC (Shimadzu 9A model) using a reverse phase C18
column with UV detector. Twenty microliters of the sample was injected each time
and detected at 232 275 nm. The mobile phase was methanol/acetonitrile/water
(25:35:40, by v/v/v) at
1.0 ml/min. The sample and the mobile phase were filtered through 0.2 m PVDF filter
before entering the column. Taxol was quantified by comparing the peak area of the
samples with that of the standard taxol. Results of HPLC analysis showed the
presence of taxol by recording a peak with a specific retention time HPLC analysis of
the fungal extract gave a peak when eluting from a reverse phase C 18 column, with
about the similar retention time as authentic taxol and the fungus produced taxol in
liquid culture. For example, HPLC analysis showed the presence of taxol by showing
a peak with a retention time of 4.7 min. P. tabernaemontanae produced a high content
of taxol in M1D (461 g/L) when compared with PDB (150 g/L). Taxol detection was
not observed in the blank culture samples, in which they showed negative results in
all the analyses. The fungal taxol yield was easily quantified with HPLC analysis
since the production was found to be higher (in micrograms). Where as, in the earlier
reports it was quantified with the aid of immunoassay since the yield level was
recorded to be low (in nanograms)14,28,29. The biggest problem of usingfungi in
fermentation is the low level of yield with unstable taxol production. Although the
amount of taxol produced by the endophytic fungi associated with yew trees is
relatively small, when compared with the host trees, the short generation time and
high growth rate of fungi will make it worthwhile to continue investigation on
endophytic fungi isolated from the medicinal plants
Kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC) analisis
Taxol dianalisis dengan HPLC (model 9A Shimadzu) menggunakan fase terbalik
kolom C18 dengan detektor UV. Dua puluh mikroliter sampel disuntikkan setiap
waktu dan terdeteksi pada 232-275 nm. Fase gerak adalah metanol / asetonitril / air
(25:35:40, oleh v / v / v) pada 1,0 ml / menit. Sampel dan fase gerak disaring
melalui 0,2 m PVDF filter sebelum memasuki kolom. Taxol dihitung dengan
membandingkan daerah puncak sampel dengan bahwa dari taxol standar. Hasil
analisis HPLC menunjukkan adanya taxol dengan merekam puncak dengan analisis
HPLC waktu retensi spesifik ekstrak jamur memberi puncaknya ketika eluting dari
fase balik kolom C18, dengan sekitar waktu retensi yang sama taxol sebagai otentik
dan jamur yang dihasilkan taxol dalam kultur cair. Sebagai contoh, analisis HPLC
menunjukkan adanya taxol dengan menunjukkan puncak dengan waktu retensi 4,7
menit. P. tabernaemontanae menghasilkan tingginya kandungan taxol di M1D (461
mg / L) jika dibandingkan dengan PDB (150 mg / L). Deteksi Taxol tidak diamati
pada sampel kultur kosong, di mana mereka menunjukkan hasil negatif dalam

semua analisis. Hasil taxol jamur mudah dihitung dengan analisis HPLC karena
produksi itu ditemukan lebih tinggi (dalam mikrogram). Sedangkan, dalam laporan
sebelumnya itu dihitung dengan bantuan immunoassay sejak tingkat yield tercatat
menjadi rendah (di nanogram) 14,28,29. Masalah terbesar dari usingfungi dalam
fermentasi adalah rendahnya hasil produksi taxol tidak stabil. Meskipun jumlah taxol
yang dihasilkan oleh jamur endofit yang berhubungan dengan pohon yew relatif
kecil, jika dibandingkan dengan pohon-pohon inang, waktu generasi pendek dan
tingkat pertumbuhan yang tinggi jamur akan membuatnya berharga untuk
melanjutkan penyidikan terhadap jamur endofit diisolasi dari tanaman obat.

LC-MS analysis
Further evidence confirming the identity of taxol was obtained by LC-MS
spectroscopic analysis. LC-MS analysis was carried out on all the samples dissolved
in methanol:water (9:1 v/v). Each sample was injected in Varian LC/MS 1200L Single
Quadrupole MS with a spray flow of 2 L/min and a spray voltage of 2.2 kV via the
loop injection method. Characteristically, standard taxol yielded both a (M +H) + peak
at a molecular weight of 854 m/z and a (M +Na) + peak at a molecular weight of 876
m/z. On comparison, fungal taxol also produced peaks (M +H) + at m/z 854 and (M +Na)
+ at m/z 876 with characteristic fragment peaks at 344, 367 and 395 m/z. Major
fragment ions observed in the mass spectrum of taxol are divided into three
categories, which represent the major portion of the respective taxol molecule. The
peaks analogous to taxol exhibited mass-to-charge (m/z) ratios corresponding to the
molecular ions (M+H)+ of the standard taxol (854 m/z), confirming the presence of
endophytic taxol. It was evident that the diterpene taxol was much more complex
since its molecular weight from high resolution MS is 854, corresponding to the
molecular formula of C47H51NO14 as reported earlier. By comparison, fungal taxol also
yielded a peak MH+ at m/z 854 with characteristic fragment peaks at 569, 551, 509,
464, 286 and 268. Major fragment ions observed in the mass spectrum of taxol can be
placed into three categories which represents major portions of the molecule 15. The
peaks corresponding to taxol, exhibited mass-tocharge (m/z) ratios corresponding to
the
molecular ions (M+H)+ of standard taxol (854) confirming the presence of taxol in the
fungal extracts. As detailed report33, the esterified position was found to be the allylic
C13 hydroxyl moiety.
Analisis LC-MS
Bukti lebih lanjut mengkonfirmasikan identitas taxol diperoleh dengan analisis
spektroskopi LC-MS. Analisis LC-MS dilakukan pada semua sampel dilarutkan dalam
metanol: air (9: 1 v / v). Masing-masing sampel disuntikkan di Varian LC / MS 1200L
Tunggal quadrupole MS dengan aliran semprot dari 2 uL / menit dan tegangan
semprot dari 2,2 kV melalui metode injeksi lingkaran. Secara karakteristik, taxol
standar menghasilkan baik (M + H) + puncak pada berat molekul 854 m / z dan (M
+ Na) + puncak pada berat molekul 876 m / z. Perbandingan, taxol jamur puncak
juga menghasilkan (M + H) + pada m / z 854 dan (M + Na) + pada m / z 876
dengan puncak fragmen karakteristik di 344, 367 dan 395 m / z. Ion fragmen utama
diamati pada spektrum massa taxol dibagi menjadi tiga kategori, yang merupakan
bagian utama dari molekul taxol masing. Puncak analog dengan Taxol dipamerkan
massa terhadap muatan (m / z) rasio sesuai dengan ion molekul (M + H) + dari
taxol standar (854 m / z), membenarkan adanya taxol endofit. Itu jelas bahwa taxol
diterpen jauh lebih kompleks karena berat molekul dari resolusi tinggi MS adalah

854, sesuai dengan rumus molekul C47H51NO14 seperti yang dilaporkan

sebelumnya. Sebagai perbandingan, taxol jamur juga menghasilkan puncak MH +
pada m / z 854 dengan puncak fragmen karakteristik di 569, 551, 509, 464, 286 dan
268. ion fragmen utama diamati pada spektrum massa taxol dapat ditempatkan
dalam tiga kategori yang mewakili bagian utama dari molecule15 tersebut. Puncak
sesuai dengan taxol, dipamerkan massal tocharge (m / z) rasio yang sesuai dengan
ion molekul (M + H) + dari taxol standar (854) mengkonfirmasi kehadiran taxol
dalam ekstrak jamur. Sebagai report33 rinci, posisi diesterifikasi ditemukan menjadi
bagian allylic C13 hidroksil.

Nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopic analysis

H NMR spectra were recorded to confirm the structure of fungal taxol at 23C in CDCl 3
using a JEOL GSX 500 spectrometer (operating at 499.65 MHz) and were assigned by
comparison of chemical shifts and coupling constants with those of related compounds.
Chemical shifts were reported as values relative to tetramethylsilane (TMS) as internal
reference and coupling constants were reported in Hertz. Samples dissolved in CDCl 3
(Sigma) were used for the analysis. Proton spectrums were assigned by comparison of
chemical shifts and coupling constants with those of related compounds. Chemical shifts
were reported as -values relative to TMS as an internal reference and coupling constants
were reported in Hertz. In 1H NMR spectroscopic analysis, almost all signals were
well-resolved and distributed in the region between 1.0 and 8.5 ppm. The strong three
proton signals caused by the methyl and acetate groups lie in the region between 1.0 and
2.5 ppm (H17, H19, H18, H6, 10-OAc, H14, 4-OAc and H2O), together with multiplets
caused by certain methylene groups. Most of the protons in the taxane skeleton and the
side-chain were observed in the region between 2.5 and 7.0 ppm (H3, H2O, H2O, H7, H2
, H5, H2, H3, H13,H10 and NH) and the aromatic proton signals caused by C-2 benzoate,
C-3 phenyl and C-3 benzamide groups appeared between 7.0 and 8.3 pm. The 1H NMR
spectrum of the fungal taxol was identical in comparison with standard taxol. The taxol
assignments obtained was confirmed with the earlier reports 2. The method has been
established for isolation, identification and characterization of a novel fungal endophyte
(Trametes hirsute) that produces aryl tetralin lignans detected by HPLC, LC-MS, LC/MSMS
and NMR.

Resonansi magnetik nuklir (NMR) analisis spektroskopi

H NMR spektrum tercatat untuk mengkonfirmasi struktur taxol jamur pada 23 C di
CDCl 3 menggunakan JEOL GSX 500 spektrometer (beroperasi pada 499,65 MHz)
dan ditugaskan oleh perbandingan pergeseran kimia dan konstanta kopling dengan
orang-orang dari senyawa terkait. Pergeseran kimia dilaporkan sebagai nilai relatif
terhadap tetrametilsilan (TMS) sebagai acuan dan kopling konstanta internal yang
dilaporkan di Hertz. Sampel dilarutkan dalam CDCl3 (Sigma) digunakan untuk
analisis. Spektrum proton ditugaskan oleh perbandingan pergeseran kimia dan
konstanta kopling dengan orang-orang dari senyawa terkait. Pergeseran kimia
dilaporkan sebagai -nilai relatif terhadap TMS sebagai referensi dan kopling
konstanta internal yang dilaporkan di Hertz. Dalam analisis spektroskopi 1H NMR,
hampir semua sinyal yang baik diselesaikan dan didistribusikan di wilayah ini antara
1,0 dan 8,5 ppm. Kuat tiga sinyal proton disebabkan oleh metil asetat dan kelompok
terletak pada daerah antara 1,0 dan 2,5 ppm (H17, H19, H18, H6, 10-OAc, H14, 4OAc dan H2O), bersama-sama dengan multiplet disebabkan oleh metilen tertentu

kelompok. Sebagian besar proton dalam kerangka taxane dan sisi-rantai yang
diamati di wilayah ini antara 2,5 dan 7,0 ppm (H3, H2O, H2O, H7, H2, H5, H2, H3,
H13, H10 dan NH) dan sinyal proton aromatik yang disebabkan oleh C-2 'benzoat, C3' fenil dan kelompok benzamide C-3 'muncul antara 7,0 dan 08:03. 1H NMR dari
taxol jamur identik dibandingkan dengan taxol standar. Tugas taxol diperoleh
dikonfirmasi dengan laporannya2 sebelumnya. Metode ini telah didirikan untuk
isolasi,
identifikasi
dan
karakterisasi
endofit
jamur
baru
(Trametes berbulu) yang menghasilkan aril tetralin lignan terdeteksi oleh HPLC, LCMS,
LC
/
MSMS
dan NMR.

ANTICANCER AGENTS FROM ENDOPHYTES

The cytotoxic effect of fungal taxol isolated from the culture filtrate of M1D and PDB,
was detected and quantified by using in vitro apoptotic method of assay23 on various
cancer cells, at various concentrations. The human cancer cell lines (HLK210, H116,
Int407, HL251 and BT220) were procured from the National Centre for Cell
Sciences (NCCS), Pune, India. The morphological changes of the cancer cells which
were treated with different concentrations of fungal taxol ranging between 0.005 M
and 5 M were incubated for 48 h. The cells were then stained (DNA staining) with 0.5
mg/ml propidium iodide in phosphate buffered saline (PBS) for 15 min and de-stained
in PBS solution. After treatment with different concentrations of fungal taxol, the cell
morphology was determined by light microscopy. In all, five different fields were
randomly selected for counting at least 500 cells. The percentage of apoptotic cells
was calculated for each experiment. Cells designated as apoptotic were those that
displayed the characteristic morphological features of apoptosis, including cell
volume shrinkage, chromatin condensation and the presence of membrane bound
apoptotic bodies. The cells in the apoptosis were calculated by using the following
formula. Percentage of apoptotic cells = Number of apoptotic cells/ Total number of
cells 100 Cytotoxicity effect of fungal taxol isolated from the endophytic fungus
was detected and quantified using apoptotic assay23 on various cancer cellsThe
taxol-producing endophytic fungi had previously tested for their cytotoxic activity via
an apoptotic assay against different cancer cell lines. They showed strong cytotoxic
activity in the presence of BT220, H116, Int407, HL251 and HLK210 human cancer
cells in vitro. Previous report of the endophytic fungus showed the
strong cytotoxic activity towards BT 220, H116, Int 407, HL 251 and HLK 210 human
cancer cells in vitro, tested by Apoptotic assay13,30. Recently, Taxol was tested using
an in vitro cytotoxicity assay against human cancer cell lines (A-549 for lung cancer,
HEP-2 for liver cancer, OVCAR-5 for ovarian cancer) in comparison with the standard
authentic example, resulting in comparable activities 20.
Cytotoxicity effect of fungal taxol from medicinal plants were further tested using
apoptotic assay on various cancer cells viz., human breast cell BT220, human colon
H116, human intestine Int407, human lung HL251 and human leukemia HLK 210. It is
indicated that with
the increase of taxol concentration from 0.005 M to 0.05 M, taxol induced increased
cell death through apoptosis. With further increase of taxol concentration from 0.05
M to 0.5 M, the taxolinduced cell death through apoptosis only increased slightly.
When the taxol concentration was increased from 0.5 M to 5 M, the taxolinduced
cell death through apoptosis decreased dramatically. It was observed at low to
medium concentration (0.0055 M), the efficacy of fungal taxol was quite dependent

on the specific cell type. It has been reported that taxol at low concentrations (nM)
induces cell apoptosis and the efficacy of taxol is quite dependent on the specific
cell type. This also supports the previous findings of other groups that at low
concentration, taxol inhibits cell proliferation by blocking mitosis.
AGEN ANTIKANKER DARI endofitik
Efek sitotoksik taxol jamur diisolasi dari filtrat kultur M1D dan PDB, terdeteksi dan
diukur dengan menggunakan metode in vitro apoptosis assay23 pada berbagai sel
kanker, pada berbagai konsentrasi. Garis sel kanker manusia (HLK210, H116,
Int407, HL251 dan BT220) yang diperoleh dari Pusat Nasional untuk Cell Ilmu
(NCCS),
Pune,
India.
Perubahan
morfologi
sel-sel
kanker
yang
diperlakukan dengan konsentrasi yang berbeda taxol jamur berkisar antara 0,005
pM dan 5 pM diinkubasi selama 48 jam. Sel-sel kemudian diwarnai (DNA pewarnaan)
dengan 0,5 mg / ml iodida propidium fosfat buffered saline (PBS) selama 15 menit
dan de-bernoda dalam larutan PBS. Setelah pengobatan dengan konsentrasi yang
berbeda taxol jamur, morfologi sel ditentukan dengan mikroskop cahaya. Dalam
semua, lima bidang yang berbeda dipilih secara acak untuk menghitung setidaknya
500 sel. Persentase sel apoptosis dihitung untuk setiap percobaan. Sel yang
ditunjuk sebagai apoptosis adalah mereka yang menampilkan fitur morfologi
karakteristik apoptosis, termasuk penyusutan volume sel, kondensasi kromatin dan
adanya membran terikat badan apoptosis. Sel-sel di apoptosis yang dihitung
dengan menggunakan rumus berikut. Persentase sel apoptosis = Jumlah sel
apoptosis / Jumlah sel 100 efek sitotoksisitas dari taxol jamur yang diisolasi dari
jamur endofit dideteksi dan dihitung menggunakan assay23 apoptosis pada
berbagai cellsThe kanker taxol memproduksi jamur endofit sebelumnya diuji untuk
aktivitas sitotoksik mereka melalui assay apoptosis terhadap lini sel kanker yang
berbeda. Mereka menunjukkan aktivitas sitotoksik yang kuat di hadapan BT220,
H116, Int407, HL251 dan HLK210 sel kanker manusia in vitro. Laporan sebelumnya
jamur
endofit
menunjukkan
aktivitas sitotoksik yang kuat terhadap BT 220, H116, Int 407, HL 251 dan 210 HLK
sel kanker manusia in vitro, diuji oleh apoptosis assay13,30. Baru-baru ini, Taxol
diuji menggunakan uji sitotoksisitas secara in vitro terhadap lini sel kanker manusia
(A-549 untuk kanker paru-paru, HEP-2 untuk kanker hati, OVCAR-5 untuk kanker
ovarium) dibandingkan dengan standar otentik contoh, sehingga activities20
sebanding
.
Efek sitotoksisitas taxol jamur dari tanaman obat yang lebih diuji dengan
menggunakan uji apoptosis pada berbagai sel kanker yaitu, BT220 manusia sel
payudara, usus H116 manusia, usus manusia Int407, HL251 paru-paru manusia dan
leukemia
manusia
HLK
210.
Hal
ini
menunjukkan
bahwa
dengan
peningkatan konsentrasi taxol dari 0,005 pM 0,05 pM, taxol diinduksi peningkatan
kematian sel melalui apoptosis. Dengan peningkatan lebih lanjut konsentrasi taxol
dari 0,05 pM sampai 0,5 pM, kematian sel taxolinduced melalui apoptosis hanya
meningkat sedikit. Ketika konsentrasi taxol meningkat dari 0,5 pM sampai 5 pM,
kematian sel taxolinduced melalui apoptosis menurun drastis. Hal ini diamati pada
konsentrasi rendah menengah (,005-5 M), khasiat taxol jamur itu sangat
bergantung pada jenis sel tertentu. Telah dilaporkan bahwa taxol pada konsentrasi
rendah (nM) menginduksi apoptosis sel dan kemanjuran taxol sangat bergantung
pada jenis sel tertentu. Ini juga mendukung temuan sebelumnya kelompok lain
yang pada konsentrasi rendah, taxol menghambat proliferasi sel dengan
menghalangi mitosis.

CONCLUSION
The aim of this review clearly mention about the isolation and characterization of taxol
producing endophytic fungi from medicinal plants. In the review, it is confidently evident that
the spectroscopic and chromatographic estimates are close to reality, given fact that the
fungal taxol and standard taxol give identical results. It also indicates that the formation of
taxol by endophytic fungus was found to be the highest and suggests that the fungus can
serve as a potential species for genetic engineering to enhance the production of taxol. The
significance in the discovery of fungi that produce taxol indicate that there are
abundant resources of fungi that produce taxol. A background understanding that involves
some specific examples and rationale of the presence of endophytic microorganisms in
higher plants will aid in the development of a drug discovery program involving these
organisms. A search for a rare and thus, expensive product such as Taxol may be facilitated
by examining the endophytic microorganisms of certain plants for their ability to make this
drug. To meet the urgent need of clinic and scientific research, besides Taxus supply, other
approaches to obtain Taxol have also been discussed here.

ACKNOWLEDGEMENTS
We are gratefully acknowledged Prof. R. Rengaswamy, Director, CAS in Botany, Chennai,
India.
KESIMPULAN
Tujuan dari tinjauan ini jelas menyebutkan tentang isolasi dan karakterisasi taxol
memproduksi jamur endofit dari tanaman obat. Dalam review, itu adalah percaya
diri jelas bahwa spektroskopi dan kromatografi perkiraan yang dekat dengan
kenyataan, mengingat fakta bahwa taxol jamur dan taxol standar memberikan hasil
yang identik. Hal ini juga menunjukkan bahwa pembentukan taxol oleh jamur
endofit ditemukan tertinggi dan menunjukkan bahwa jamur dapat berfungsi sebagai
spesies yang potensial untuk rekayasa genetika untuk meningkatkan produksi taxol.
Signifikansi dalam penemuan jamur yang menghasilkan taxol menunjukkan bahwa
terdapat sumber daya yang melimpah dari jamur yang menghasilkan taxol.
Pemahaman latar belakang yang melibatkan beberapa contoh dan alasan kehadiran
mikroorganisme endofit pada tanaman yang lebih tinggi tertentu akan membantu
dalam pengembangan program penemuan obat yang melibatkan organisme ini.
Sebuah pencarian untuk produk langka dan dengan demikian, mahal seperti Taxol
dapat difasilitasi dengan memeriksa mikroorganisme endofit tanaman tertentu
karena kemampuan mereka untuk membuat obat ini. Untuk memenuhi kebutuhan
mendesak dari klinik dan penelitian ilmiah, selain pasokan Taxus, pendekatan lain
untuk mendapatkan Taxol juga telah dibahas di sini.
UCAPAN TERIMA KASIH
Kami hargai Prof. R. Rengaswamy, Direktur, CAS di Botani, Chennai, India

REFERENCES
1. Bacon CW and White JF, Microbial Endophytes, New York, Marcel Dekker: 341 388,
(2000).
2. Chmurny GN, Hilton BD, Brobst S, Look SA, Witherup KN, Beutler JA, 1H- and 13C-NMR
assignments for Taxol, 7-epi-Taxol and Cephalomannine. J Nat Prod, 55:414423,(1992).
3. Christen AA, Bland J, Gibson DM, Cell cultures as a means to produce Taxol. Proc.Am.
Assoc. Cancer Res, 30: 566, (1989).
4. Denis JN, Greene AE, Guenard D, Guritte- Voegelein F, Mangatal L, Potier P, Highly
efficient practical approach to natural Taxol. J. Am. Chem. Soc, 110: 5917-5919, (1988).

5. Fransworth MR and Bingel AS, New natural products and plants drug with
pharmacological, biological or therapeutical activity, Springer: New York, 61-73, (1977).
6. Gangadevi V, Muthumary J, A simple and rapid method for the determination of taxol
produced by fungal endophytes from medicinal plants using high performance thin layer
chromatography. Chinese Journal of Chromatography, 26 (1): 5055, (2008).
7. Gangadevi V, Muthumary J, Taxol production by Pestalotiopsis terminaliae, an endophytic
fungus of Terminalia arjuna (arjun tree). Biotechnology and Applied Biochemistry, 52: 915,
(2009).
8. Holton RA, Somoza C, Kim HB, Liang F, Biediger RJ, Boatman PD, Shindo M, Smith
CC, Kim S, Nadizadeh H, Suzuki Y, Tao C, Yu P, Tang S, Zhang P, Murthi KK, Gentile LN,
Liu JH, First total synthesis of Taxol. J. Am. Chem. Soc, 116: 1597-1600, (1994).
9. Hu YM, Gan FY, Lu CH, Ding HS, Shen YM, Production of Taxol and related taxanes by
cell suspension cultures of Taxus yunnanensis. Acta. Bot. Sin, 45: 373-378, (2003).
10. Kingston DGI, ACS Symposium Series 583, Taxane Anticancer Agents, 203, Georg, G.I.
et al.,eds, Chap. 15, American Chemical Society, (1995).
11. Kohler J, Goldspiel BR, Evaluation of new drug Paclitaxel (Taxol). Pharmacotherapy,
14:m3-34, (1994).
12. Kwon IC, Yoo YJ, Lee JH, Hyun JO, Enhancement of Taxol production by in situ
recovery of product. Process Biochem, 33: 701-707, (1998).
13. Lee JC, Strobel GA, Lobkovsky E, Clardy JC, J. Org. Chem. 61: 32323233, (1996).
14. Li JY, Stroble GA, Sidhu R, Hess WM, Ford EJ, Endophytic Taxol producing fungi from
bald cypress, Taxodium distichum. Microbiology, 142: 2223-2226, (1996).
15. McClure TD, KH Schram, The mass spectrometry of taxol. J. Am. Soc. Mass Spectrom.
3: 672-679, (1992).
16. Morihira K, Hara R, Kawahara S, Nishimori T, Nakamura N, Kusama H, Kuwajima I,
Enantio-selective total synthesis of Taxol. J. Am. Chem. Soc, 120: 12980-12981, (1998).
17. Nicolaou KC, Yang Z, Liu JJ, Ueno H, Nantermet PG, Guy RK, Claiborne CF, Renaud J,
Couladouros EA, Paulvannan K, Sorensen EJ, Total synthesis of Taxol. Nature, 367: 630634, (1994).
18. Owen NL, Hundley N, Endophytes-the chemical synthesizers inside plants. Sci. Prog,
87: 7999, (2004).
19. Petrini O, Microbial Ecology of Leaves, New York, Springer-Verlag:179197, (1991).
20. Puri SC, Verma V, Amna T, Qazi GN, Spiteller MJ, Nat. Prod. 68: 17171719, (2005).
21. Puri SC, Nazir A, Chawla R., Arora R, Amna T, Ahmed B, Verma V, Singh S, Sagar R,
Sharma A, Kumar R, Sharma RK, Qazi GN, J. Biotechnol. 122: 494510, (2006).
22. Raja V, Kamalraj S, Muthumary J, Taxol from Botryodiplodia theobromae (BT 115) - AN
endophytic fungus of Taxus baccata. Journal of Biotechnology, 136: 187197, (2008).
23. Ruckdeschel K, Roggenkamp A, Lafont V, Mangeat P, Hessmann J, Rouot B, Interaction
of Yersinia enterocolitica with macrophages leads to macrophage cell death through
apoptosis. Infect Immun, 65:48134821, (1997).
24. Schiff PB, Fant J, Horowitz SB, Promotion of microtubule assembly in vitro by taxol.
Nature, 277:665667, (1979).
25. Senthil Kumaran R, Muthumary J, Hur BK, Taxol from Phyllosticta citricarpa, a Leaf Spot
Fungus of the Angiosperm Citrus medica. Journal of BioScience and BioEngineering,
106(1): 103-106, (2008).
26. Stierle A, Strobel GA, Stierle D, Taxol and taxane production by Taxomyces andreanae,
an endophytic fungus of Pacifi c yew. Science, 260: 214216, (1993).
27. Strobel GA, Daisy B, Bioprospecting for Microbial Endophytes and Their Natural
Products. Microbiol. Mol. Biol. Rev, 67: 491 502, (2003).

28. Strobel GA, Hess WM, Li JY, Ford E, Sears J, Sidhu RS, Summerell B, Pestalotiopsis
guepinii a taxol producing endophyte of Wollemi Pine - Wollemi nobilis . Aust. J. Bot.,
45:10731082, (1997).
29. Strobel GA, WM Hess, E Ford, RS Sidhu, X Yang, Taxol from fungal endophytes and
the issue of biodiversity. J. Ind. Microbiol, 17: 417-423, (1996).
30. Wagenaar M, Corwin J, Strobel GA, Clardy J, Three new chytochalasins produced by
an endophytic fungus in the genus Rhinocladiella. J. Nat. Prod, 63, 16921695,(2000).
31. Wall ME, Wani MC, Cooke CE, Palmer KT, McPhail AT, Sim GA, J. Am. Chem. Soc, 88:
38883890, (1966).
32. Wang JF, Li GL, Lu HY, Zheng ZH, Huang YJ, Su WJ, Taxol from Tubercularia sp. Strain
TF5, an endophytic fungus of Taxus mairei. FEMS Microbiol. Lett, 193: 249-253, (2000).
33. Wani MC, Taylor HL, Wall ME, Coggon P, McPhail A, Plant antitumor agents. VI. The
isolation and structure of Taxol, a novel antileukemic and antitumor agent from Taxus
brevifolia. J. Am. Chem. Soc, 93: 2325-2327, (1971).
34. Yeung TK, Germond C, Chen X, Wang Z, The mode of action of taxol: apoptosis at low
concentration and necrosis at high concentration. Biochem Biophy Res Comm, 263:398
404, (1999).