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Maldonado Fernndez
Univ. Miler
Cbba 2013
Centro de Biotecnologa
Maldonado Fernndez
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OBJETIVOS
1.1 General: Determinar el rendimiento de degradacin microbiana en relacin a
lllllllllllllll lllllos cuatro tipos de especies de gramneas en suelos contaminados
llllllll lllllllllllcon diesel.
1.2 Especficos:
MARCO TERICO
=>
1,6Kg.
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Fundamentos de la Biodegradacin
Organismos Hidrocarburoclsticos
Los llamados organismos hidrocarburoclsticos o petroleolticos son bacterias y hongos
capaces de degradar petrleo fisiolgica y metablicamente. Ms de 100 especies de 30
gneros microbianos son capaces de usar hidrocarburos, como mtodo de subsistencia.
Los gneros de organismos hidrocarbonoclsticos son: Pseudomonas, Nocardia, Vibrio,
Candida, Brevibacterium, Corynebacteium, Flavobacterium, Acinetobacter, Micrococcus,
Arthrobacter, Achromobacter, Rhodococcus, Alcaligenes, Mycobacterium, Bacillus,
Aspergillus,Mucor, Fusarium, Penicillium, Rhodotorula y Sporobolomyces. La fraccin del
total de organismos que metabolizan hidrocarburos es altamente variable, 6 a 82% para
hongos terrestres, 0,13% a 50% para bacterias de la tierra, y del 0,003% a 100% para
bacterias marinas.
En ecosistemas no contaminados, los microorganismos degradadores de hidrocarburos
constituyen menos del 0,1% de la comunidad microbiana; mientras que en ecosistemas
contaminados con hidrocarburos pueden constituir el 100% de la comunidad microbiana.
Las poblaciones dominantes en estas comunidades poseen caractersticas nutricionales
relacionadas al contaminante y pueden ser tambin resistentes a muchas formas de
estrs ambiental. Cuando la fuente de carbono es un substrato insoluble como un
hidrocarburo, los microorganismos facilitan su difusin hacia la clula produciendo
substancias como carbohidratos, cidos grasos, enzimas y biosurfactantes. Los
microorganismos utilizan estos compuestos a manera de un biofilm alrededor de la
molcula del hidrocarburo, para posteriormente ingerirlo o romperlo en compuestos
simples de carbono y oxgeno. Estos microorganismos usan la energa liberada para
manejar los procesos termodinmicamente no espontneos como la sntesis de
componentes celulares.
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Tabla 1. Principales microorganismos petroleolticos objeto de estudio en los ltimos aos (Fuente: Tratamiento
microbiolgico de la contaminacin por petrleo en ambientes marinos. Estudio de su posible optimizacin. M.A: Murado,
J.Mirn, M.P.Gonzlez)
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Temperatura
Generalmente las especies bacterianas crecen a intervalos de temperatura
bastante reducidos en torno a un valor medio tpico de cada zona. Para aguas
canarias, este rango oscila entre -2 y 35C (condiciones mesfilas).
La biodegradacin decrece por desnaturalizacin de las enzimas a temperaturas
superiores a 40C, mientras que se inhibe con temperaturas bajas. Una
temperatura ptima de crecimiento bacteriano suele estar en torno a los 25 C. La
tasa de degradacin decrece exponencialmente cuando se baja de esta
temperatura, habindose comprobado que es 10 veces inferior a 5C.
Oxigenacin
La disponibilidad de oxgeno es fundamental para las degradaciones aerbias, que
son las que resultan ms eficientes. Aunque su disponibilidad no suele ser
limitante en ambientes marinos, la concentracin del mismo depende de su
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Necesidad de nutrientes
El metabolismo microbiano est orientado a la reproduccin de los organismos y
stos requieren que los constituyentes qumicos se encuentren disponibles para su
asimilacin y sntesis. Los nutrientes principalmente requeridos son el fsforo y el
nitrgeno, cuya disponibilidad suele ser ms limitante que la de oxgen, siendo la
mayora de los ambientes marinos deficitarios en estos nutrientes, as como en
hierro.
Por lo general suele haber en el suelo una concentracin de nutrientes suficiente,
sin embargo, si estos no se encontrasen en el rango normal se puede adicionar
mayor cantidad al medio. El rango normal de C:N:P depende del sistema de
tratamiento a emplear, siendo de modo habitual 120:10:1.
pH del suelo
Afecta significativamente en la actividad microbiana. El crecimiento de la mayor
parte de los microorganismos es mximo dentro de un intervalo de pH situado
entre 6 y 8.
Asimismo, el pH tambin afecta directamente en la solubilidad del fsforo y en el
transporte de metales pesados en el suelo. La acidificacin o la reduccin del pH
en el suelo se puede realizar adicionando azufre o compuestos del azufre.
Humedad
Los microorganismos requieren unas condiciones mnimas de humedad para su
crecimiento. El agua forma parte del protoplasma bacteriano y sirve como medio
de transporte a travs del cual los compuestos orgnicos y nutrientes son
movilizados hasta el interior de las clulas.
Un exceso de humedad inhibir el crecimiento bacteriano al reducir la
concentracin de oxgeno en el suelo. El rango vara en funcin de la tcnica.
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Ventajas
Generalmente solo origina cambios fsicos menores sobre el medio, con lo
que resulta una tcnica de bajo impacto ambiental.
Cuando se usa correctamente no produce efectos adversos significativos
en la biota local del medio contaminado.
Ofrece una solucin mas sencilla y completa que las tecnologas
mecnicas, y resulta menos costosa que stas tecnologas.
Inconvenientes
Para muchos tipos de vertidos su efectividad no ha sido determinada, y en
general es poco eficiente con compuestos pesados.
Su aplicacin en el mar reviste una elevada dificultad y en general no es
viable debido a la inestabilidad del medio
El tiempo necesario para la actuacin de los microorganismos es largo
Su implementacin es especfica para cada lugar contaminado, tanto en lo
referente al tipo de microorganismos empleados como a las tcnicas de
enriquecimiento nutricional y tcnicas de aplicacin.
Su optimizacin requiere informacin sustancial acerca del lugar
contaminado y las caractersticas del vertido, por lo que generalmente no
es una tcnica de aplicacin inmediata.
Tcnicas de Biorremediacin
Las medidas de biorremediacin pueden dividirse en aquellas que se llevan a cabo en el
lugar afectado por la contaminacin (In Situ) y aquellas que se llevan a cabo fuera de este
(Ex Situ), con el material que ha sido retirado de la zona contaminada y depositado en
zonas de tratamiento designadas.
Entre las tcnicas Ex Situ se incluyen el cultivo de tierras, la transformacin en abonos y
el bioapilamiento. Durante muchos aos se han empleado con xito algunas de estas
tcnicas, principalmente la de cultivo de tierras, que ha sido explotada como la forma ms
habitual de tratamiento de los residuos oleosos. Sin embargo, en el mbito de la
contaminacin del litoral por hidrocarburos, frecuentemente el gran volumen de residuos
hace que sean las tcnicas In Situlas ms adecuadas para su tratamiento.
Los principales factores que se incluyen en el proceso de biodegradacin son la
disponibilidad de oxgeno y nutrientes. En consecuencia, muchas tcnicas In Situ se
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centran en medidas que pueden tomarse para manipular los niveles de estos elementos
con el objeto de crear condiciones ptimas que permitan potenciar el proceso de
biodegradacin. Estas tcnicas reciben habitualmente la denominacin de
Bioestimulacin.
Un enfoque alternativo consiste en introducir microorganismos adicionales, que
complementen a los presentes o bien presenten una mayor eficiencia que los autctonos,
y estas reciben el nombre de Bioaumento. La Bioestimulacin y el Bioaumento no se
excluyen entre s, y pueden realizarse de forma conjunta.
Una medida adicional, la fitorrehabilitacin, se vale de un proceso biolgico alternativo
como es la tendencia de algunas plantas a extraer contaminantes del terreno o
transformarlos en el proceso bioqumico de su crecimiento, o incrementando la actividad
microbiolgica en los sedimentos (alrededor de las races). La fitorrehabilitacin tambin
se considera por tanto una tcnica de biorremediacin.
Otro tipo de biorremediacin consiste en la adicin de enzimas que actuan como
catalizadores en la degradacin de hidrocarburos.
Fitorremediacin
Este es el proceso de utilizar el crecimiento de las plantas para acelerar la biodegradacin
natural de los hidrocarburos. Los hidrocarburos que se encuentran infiltrados en el terreno
son, o bien transformados en el proceso de crecimiento de las plantas, o bien asimilados
y metabolizados por la propia vegetacin.
Esta tcnica puede ofrecer buenos resultados en los derrames que afectan a zonas
frgiles como marismas o saladares, donde el tratamiento posible se reduce a una
limpieza suave
con tcnicas poco agresivas. Se puede potenciar el proceso estimulando el crecimiento
de las plantas existentes mediante la adicin de fertilizantes, o bien mediante la
introduccin de plantas nuevas, procurando que sean autctonas de la zona afectada.
En algunos casos, la restauracin del crecimiento vegetal tiene el beneficio aadido de
prevenir o reducir al mnimo los efectos perjudiciales de la erosin.
Los mecanismos por los que acta la fitorremediacin incluyen la rizodegradacin, la
fitoextraccin, la fitodegradacin y la fitoestabilizacin.
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Limitaciones
Existen varias limitaciones que deben considerarse para su aplicacin:
a) El tipo de plantas utilizado determina la profundidad a tratar, ya que el tratamiento
del terreno contaminado slo se produce en la zona en que la planta arraiga.
b) Altas concentraciones de hidrocarburos pueden resultar txicas para el vegetal,
por lo que generalmente se requiere una retirada previa de los grandes volmenes
de contaminante.
c) La eficiencia del proceso y su viabilidad puede depender de la estacin del ao.
d) Esta tcnica no es efectiva para tratar contaminantes fuertemente sorbidos al
sedimento.
e) La toxicidad y biodisponibilidad de los productos de la degradacin no siempre se
conocen, y pueden movilizarse o bioacumularse en animales.
Crecimiento Microbiano
Entendemos por crecimiento microbiano el aumento del nmero de microorganismos a lo
largo del tiempo. Por tanto, no nos referimos al crecimiento de un nico microorganismo
que denominaremos ciclo celular, sino al demogrfico de una poblacin.
Cultivo de Microorganismos
El cultivo de microorganismos consiste en proporcionarles las condiciones fsicas,
qumicas y nutritivas adecuadas para que puedan multiplicarse de forma controlada. En
general, podemos distinguir cultivos lquidos y slidos en funcin de las caractersticas del
medio y cultivos discontinuos y continuos en funcin de la disponibilidad de nutrientes en
el medio.
Medios de Cultivo
Un microorganismo necesita para crecer nutrientes que le aporten energa y elementos
qumicos para la sntesis de sus constituyentes celulares. Dependiendo de la fuente de
carbono que utilizan, los microorganismos se pueden clasificar en autotrofos si es el CO2
atmosfrico (microorganismos que fotosintetizan) y heterotrofos si utilizan carbono
orgnico.
La frmula elemental de un microorganismo es, aproximadamente, C4H7O2N lo que
supone que los componentes de las clulas son: carbono que representa alrededor del
50% del peso seco, oxgeno (32%), nitrgeno (14%), fsforo (3%), azufre (en torno al 1%)
y otros elementos traza entre los que se encuentran Fe, K, Mg, Mn, Co, Mb, Cu y Zn. La
elaboracin de medios de cultivo requiere proporcionar los elementos antes citados en
una forma asimilable. As, por ejemplo, el C debe estar en forma de carbono orgnico
para los heterotrofos y como CO2 para los autotrofos, el N en forma de NH4, de NO3 - o
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de NO2 - o en forma de aminocidos a los que se pueda tomar su grupo amino; el P debe
estar en forma de PO4 3-, el S procede de aminocidos sulfurados o de SO4 2-, etc.
Adems, en ciertos casos, es necesario aadir a los medios de cultivo algunos
aminocidos o vitaminas que determinados tipos de microorganismos no pueden
sintetizar.
Mtodos de Aislamiento
El aislamiento de bacterias a partir de muestras naturales se realiza, en la mayora delos
casos, mediante la produccin de colonias aisladas en cultivos slidos. El crecimiento
explosivo de las bacterias permite producir un gran nmero de ellas a partir de una nica
clula inicial de forma que, tras un periodo de incubacin en las condiciones ambientales
adecuadas, se produce una colonia observable a simple vista y formada por individuos
iguales (un clon bacteriano).
Concepto de Cultivo Puro
Se denomina cultivo puro (axnico) al que contiene slo un tipo de microorganismos. Los
cultivos puros se inician a partir de colonias aisladas, de manera que todos los individuos
del mismo tengan la misma composicin gentica. Los cultivos puros son esenciales para
poder estudiar las caractersticas de los microorganismos y para poder identificarlos con
seguridad. Sin embargo, cada vez se va conoce ms sobre el funcionamiento de las
comunidades bacterianas lo que debe hacernos reflexionar sobre el hecho de que un
cultivo puro supone unas condiciones no naturales y que, por consiguiente, la fisiologa de
los microorganismos en ambientes naturales puede ser diferente de la que presentan en
condiciones de cultivos puros.
Crecimiento Microbiano en Medio Lquido
Si crece en un medio lquido, en la mayora de los casos las clulas que se producen en
cada divisin continan su vida independientemente formndose una suspensin de
clulas libres.
En un cultivo discontinuo de microorganismos en medio lquido, se pueden diferenciar
cuatro fases en la evolucin de los parmetros que miden el crecimiento microbiano:
1.- Fase lag o de adaptacin durante la que los microorganismos adaptan su
metabolismo a las nuevas condiciones ambientales (abundancia de nutrientes y
condiciones de cultivo) para iniciar la fase de crecimiento exponencial.
2.- Fase exponencial o logartmica: en ella la velocidad de crecimiento es mxima y el
tiempo de generacin es mnimo. Durante esta fase las bacterias consumen a velocidad
mxima los nutrientes del medio. La evolucin del nmero de clulas durante esta fase se
explica con los modelos matemticos que describiremos a continuacin.
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1 Cronometro
1 tamiz de 200 micrones
3.2 Reactivos
Agua destilada
Solucin buffer PBS (para 1000ml)
8g NaCl
0.2g KCl
1.44g Na2HPO4
0.24g KH2PO4
3.3 Equipos
Autoclave
Hornilla
Incubadora
Campana de absorcin
Balanza analtica
Cmara frigorfica
PH metro
ASPECTOS PRELIMINARES
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Las cajas petrie a usar tienen que estar completamente secas (sin agua) y se
debe de trabajar en la cmara de absorcin.
Es muy importante mencionar que las cajas petrie con las que se est
trabajando estn bien selladas con parafin de otra forma podra contaminar y
variar nuestro anlisis posterior.
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
1. Seleccionar 6 frascos con tapas de 200ml con 20g de piedritas (limpias)dentro.
2. Preparar la solucin PBS (180ml para cada frasco), colocara en cada frasco y
luego regular el pH a 7.4 2
3. Preparar la solucin PCA para 24 cajas petrie (aprox 20ml en cada caja),
posterior mente realizar el plaqueado y dejar que solidifique.
4. Realizar el etiquetado y las diluciones en los 6 frascos (101,102,103,104,105,106) primeramente agitando 1min la muestra(101) y luego traspasndo 20ml
a la siguiente dilucin(102) y sucesivamente hasta la dilucion106
5. Realizar el sembrado colocando en dos cajas petrie la muestra de suelo sin
crudo y en otras dos la muestra de suelo despus del crudo para cada dilucion.
6. Sellar y etiquetar las cajas para luego incubarlas hasta el siguiente da (durante
tres das) ,luego realizar el conteo correspondiente de cada caja.
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OBSERVACIONES
CONCLUSIONES
BIBLIOGRAFA
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