Centro de Biotecnologa

Maldonado Fernndez

Univ. Miler

UNIVERSIDAD MAYOR DE SAN SIMN

FACULTAD DE CIENCIAS Y TECNOLOGA
CARRERA DE INGENIERA QUIMICA

MONITOREO DE LA VARIACION DE COMUNIDADES MICROBIANAS EN

FUNCION DE CUATRO ESPECIES DE GRAMINEAS EN ENSAYOS DE
FITORREMEDIACION DE SUELOS CONTAMINADOS CON DIESEL

Autor: Univ. Miler Maldonado Fernndez

Tutor: Univ. Lizeth P. Navarro
Materia: Laboratorio de Investigacin
Centro: Biotecnologa
Semestre: 1/2013

Cbba 2013

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MONITOREO DE LA VARIACION DE COMUNIDADES MICROBIANAS EN

FUNCION DE CUATRO ESPECIES DE GRAMINEAS EN ENSAYOS DE
FITORREMEDIACION DE SUELOS CONTAMINADOS CON DIESEL

OBJETIVOS
1.1 General: Determinar el rendimiento de degradacin microbiana en relacin a
llllllllllllllllllllos cuatro tipos de especies de gramneas en suelos contaminados
lllllllllllllllllllcon diesel.
1.2 Especficos:

MARCO TERICO

La biorremediacion es la utilizacin de organismos para degradar o remover

contaminantes de un ambiente especfico. Este proceso incluye la modificacin de este
ambiente para acelerar los procesos biolgicos con o sin aadir microorganismos
especficos.
Conocemos slo una pequea fraccin de los microorganismos que viven en el suelo.
Pasamos una gran cantidad de nuestra vida cotidiana sin reparar en ellos, y hay una
enorme riqueza en un gramo de suelo an por revelar.
La microbiologa es la ciencia que estudia a los seres vivos cuyo tamao hace que slo
puedan ser apreciados mediante el microscopio. El objeto de esta disciplina est
determinado por la tecnologa que permite evidenciar y estudiar a los microorganismos.
Por su parte, la microbiologa de suelos supone la aplicacin de tcnicas de biologa
molecular al estudio de una gran diversidad de microorganismos que resultaban
totalmente desconocidos porque no se haban obtenido en cultivos de laboratorio.
Mediante esta ciencia puede determinarse el papel funcional de los diferentes
microorganismos que constituyen las comunidades edficas.
La microbiologa aplicada a este proceso permite reducir la polucin ambiental, porque
cuando se utilizan fertilizantes qumicos se necesita gran cantidad de energa: Hay un
gran gasto de energa para producir el fertilizante nitrogenado por excelencia, que es la
urea. Adems, el fertilizante qumico no se aprovecha en su totalidad. En cambio, cuando
la planta genera una simbiosis con las bacterias del gnero rhizobium y forma una
estructura comn como los ndulos, tanto el cultivo como la bacteria se nutren.

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La produccin de inoculantes es un proceso que resulta de un complejo trabajo cientfico.

El productor recibe el inoculante a travs de la cadena de distribucin de agro insumos
tradicional y lo utiliza para tratar las semillas antes de sembrarlas, pero hay una gran
cantidad de microorganismos especficos para otros cultivos.
Sobre la receptividad del productor agropecuario para adoptar esta tecnologa, el
investigador precis que el 90 por ciento de los productores utiliza inoculantes porque ve
un beneficio de mayor rendimiento. Tal vez, lo ms importante desde el punto de vista
agronmico es que la asociacin de la planta a un microorganismo posibilita una
estrategia biolgica ms saludable. Es un excelente ejemplo de cmo pueden
complementarse el sector pblico y privado para que el productor adopte tecnologa, en
este caso, para una mejor nutricin de los cultivos.
El aporte de la microbiologa no se limita a la fijacin del nitrgeno sino que se traslada a
otras reas. El otro gran tema es ver cmo podemos controlar plagas, enfermedades y
malezas con el uso de microorganismos. Esto tambin hace a la sustentabilidad del
sistema y a una produccin ms amigable con el medio ambiente.
Los suelos contaminados por diesel vendran a ser uno de los varios problemas de
contaminacin que existen en nuestro planeta los cuales deberan ser tomados en cuenta
con bastante seriedad.
Microbiologa del suelo
Caractersticas fsicas y composicin del suelo
Hay diferentes tipos de suelo y sus caractersticas varan dependiendo de la localizacin y
el clima. Los suelos difieren en profundidad, propiedades fsicas, composicin qumica y
origen. Estos pueden clasificarse como suelos minerales y orgnicos. Los suelos
minerales contienen materia slida mayormente inorgnica. Los suelos orgnicos
contienen poca materia inorgnica.
El suelo est compuesto de diversas capas. A dichas capas se les llama horizontes y cada
una se caracteriza por su composicin abitica y/o bitica.
Horizonte A: Aqu encontramos los minerales y la materia orgnica en distintos estados
de descomposicin. En esta capa se localiza el humus. El humus se define como el
conjunto de residuos orgnicos, vegetales y animales que se incorporan al suelo y cuya
degradacin es difcil de realizar por microorganismos. La importancia de ste, es que
mejora la textura y estructura del suelo, aumentando as su capacidad de retener agua y
reduciendo los cambios en el pH. Adems sirve como reserva de materiales nutritivos en
el suelo.
Horizonte B: En esta capa encontramos partculas finas y minerales.
Horizonte C: Este se compone de materia mineral solamente.

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Horizonte D: Esta capa posee roca slida bajo el suelo, es importante para la formacin
de acuferos. En Puerto Rico los acuferos se localizan al norte de la isla, siendo stos
muy importantes como reserva de agua.
Cantidad de agua y composicin de gases en el suelo
En el suelo, adems de residuos orgnicos, encontramos agua y gases. La cantidad de
agua en el suelo depende de: la precipitacin y otras condiciones climticas, el drenaje,
ste depende del tamao de las partculas del suelo, la composicin del suelo ,la
poblacin viviente del suelo.
Encontramos el agua en los espacios que hay entre las partculas del suelo o adheridas a
la superficie de las partculas.
La fase gaseosa del suelo consiste mayormente de CO2, O2 y N2, stos se encuentran en
los espacios entre partculas donde no hay agua. La cantidad de gases es inversamente
proporcional a la cantidad de agua en el suelo.
Factores que contribuyen al nmero y tipo de microorganismos en el suelo:
Composicin del suelo (cantidad y tipo de nutrientes).
Caractersticas fsicas del suelo (grado de aireacin, humedad, temperatura y pH).
Tipo de plantas en el suelo (el sistema de races influye en el nmero y tipo de
organismos presentes).
Flora Microbiana en el Suelo: En un suelo frtil podemos encontrar races de plantas
superiores, diversos animales y una gran cantidad de microorganismos.

Bacterias: Estas exceden la poblacin de todos los otros grupos de

microorganismos. Encontramos todo tipo de bacterias desde autotrficas,
heterotrficas, aerobias y anaerobias.

Hongos: Cientos de especies se encuentran en el suelo, generalmente cerca de la

superficie donde prevalece una condicin aerobia. Los hongos son los
descomponedores de celulosa, lignina y pectina. La importancia del hongo en el
suelo es que mejora la estructura fsica mediante la acumulacin de sus micelios
en l. Adems los hongos forman unos agregados que ayudan a retener agua.

Algas: Mayormente encontramos algas verdes y diatomeas en la superficie o

cerca de sta ya que necesitan luz para llevar a cabo fotosntesis. Estas juegan un
papel importante en suelos erosionados o desrticos, ya que como son
fotosintticos inician la acumulacin de materia orgnica en esa rea.

Protozoarios: Son importantes en la cadena alimentaria, ya que su modo de

nutricin es la ingestin de bacterias controlando as la poblacin bacteriana.

Virus: Este grupo incluye fagos, virus de plantas y virus de animales.

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La rizsfera es la capa de suelo que se encuentra adyacente a las races. Esta regin se
caracteriza por una alta poblacin microbiana. Las bacterias que crecen en la rizsfera se
ven afectadas positivamente por substancias que liberan las plantas como aminos cidos,
vitaminas y otros. A la vez el crecimiento de las plantas se ve afectado por substancias
liberadas por la poblacin microbiana.
Interaccin entre los microorganismos del suelo
Relaciones simbiticas:
Neutralismo: Es esta relacin dos especies ocupan el mismo ambiente sin que se afecte
una o la otra (neutral).
Mutualismo: Es una asociacin donde cada uno de los organismos envueltos se
benefician (relacin positiva).
Comensalismo: Es esta relacin un organismo se beneficia mientras que el otro no se
afecta (relacin positiva). Un ejemplo lo observamos en los hongos que degradan celulosa
a glucosa y otros compuestos, las bacterias no pueden degradar celulosa, pero s glucosa
beneficindose de esta forma.
Antagonismo: Esto se observa cuando una especie afecta adversamente el ambiente de
otra especie, produciendo diferentes substancias inhibidoras o antibiticas (relacin
negativa). Un ejemplo lo vemos en la produccin de sustancias inhibidoras como:

antibiticos Es usual que un organismo produzca 5 6 diferentes agentes

antimicrobiano. Esto es para poder inhibir o matar una gran variedad de
microorganismos.

cianuro (producido por hongos)

metano

sulfuros

enzimas lticas (stas rompen la pared celular de las bacterias)

Competencia: Es una asociacin negativa que resulta de la competencia entre especies

por nutrientes esenciales.
Parasitismo: En esta relacin un organismo vive dentro o encima de otro (husped). El
parsito se alimenta de las clulas, el tejido o el fluido de otro organismo (relacin
negativa).
Rol biogeoqumico de los microorganismos del suelo
Los microorganismos del suelo funcionan como agentes biogeoqumicos para la
conversin de compuestos orgnicos complejos en compuestos inorgnicos simples y
elementos constitutivos, esto se llama mineralizacin. Estos microorganismos del suelo

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estn envueltos en los ciclos de nitrgeno, carbono, azufre y fsforo. Tambin estn
envueltos en los ciclos de hierro, manganeso, mercurio, selenio, zinc y potasio.

En la naturaleza existe una amplia variedad de microorganismos que se encuentran en el

medio de forma natural y que descomponen sustancias, incluidos los hidrocarburos, en
formas menos complejas. Este proceso de biodegradacin es caracterstico de todos los
sistemas ambientales. La introduccin de hidrocarburos, por ejemplo durante un vertido,
concede a estos organismos la oportunidad de proliferar si las condiciones son
adecuadas.
La biodegradacin de los hidrocarburos puede producirse en presencia de oxgeno
(condiciones aerbicas) o en ausencia del mismo (condiciones anaerbicas). Sin
embargo, en condiciones anaerbicas el proceso se produce de forma mucho ms lenta
y, des del punto de vista operacional, tiene poco inters para la biorremediacin.
Las bacterias, hongos, levaduras y algas que son responsables del proceso de
biodegradacin, requieren adems fuentes de alimento en forma de nitrgeno (N) y
fsforo (P), elementos que se encuentran de forma habitual en el medio marino. La
frmula siguiente representa el modelo tpico de biodegradacin en condiciones
aerbicas:
1 Kg. de hidrocarburos + 2,6Kg. de O2 + 0,07Kg. de N + 0,007Kg. de P=> 1,6Kg. de CO2
+ 1Kg. de H2O +1 Kg. de biomasa
En consecuencia, los productos del proceso de biodegradacin son: dixido de carbono,
agua y biomasa de microorganismos.
Esta reaccin metablica de origen natural puede emplearse como mecanismo de
remediacin de una contaminacin por derrame de hidrocarburos, y es en este punto
cuando se habla de Biorremediacin.
Es necesario, inicialmente, distinguir entre los siguientes conceptos:

BIODEGRADACION, se refiere al proceso natural mediante el cual bacterias u

otros microorganismos alteran y convierten molculas orgnicas en otras
sustancias, como cidos grasos y CO2.

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BIORREMEDIACIN, adicin de materiales a ambientes contaminados para

producir una aceleracin del proceso natural de biodegradacin.

FERTILIZACIN, mtodo de biorremediacin de adicin de nutrientes, como

Nitrgeno o Fsforo a un medio contaminado para estimular el crecimiento de
microorganismos nativos.

INOCULACIN, adicin de microorganismos a un sitio contaminado, los cuales

pueden adicionarse junto con nutrientes.

2. Fundamentos de la Biodegradacin
2.1. Organismos Hidrocarburoclsticos
Los llamados organismos hidrocarburoclsticos o petroleolticos son bacterias y hongos
capaces de degradar petrleo fisiolgica y metablicamente. Ms de 100 especies de 30
gneros microbianos son capaces de usar hidrocarburos, como mtodo de subsistencia.
Los gneros de organismos hidrocarbonoclsticos son: Pseudomonas, Nocardia, Vibrio,
Candida, Brevibacterium, Corynebacteium, Flavobacterium, Acinetobacter, Micrococcus,
Arthrobacter, Achromobacter, Rhodococcus, Alcaligenes, Mycobacterium, Bacillus,
Aspergillus,Mucor, Fusarium, Penicillium, Rhodotorula y Sporobolomyces. La fraccin del
total de organismos que metabolizan hidrocarburos es altamente variable, 6 a 82% para
hongos terrestres, 0,13% a 50% para bacterias de la tierra, y del 0,003% a 100% para
bacterias marinas.
En ecosistemas no contaminados, los microorganismos degradadores de hidrocarburos
constituyen menos del 0,1% de la comunidad microbiana; mientras que en ecosistemas
contaminados con hidrocarburos pueden constituir el 100% de la comunidad microbiana.
Las poblaciones dominantes en estas comunidades poseen caractersticas nutricionales
relacionadas al contaminante y pueden ser tambin resistentes a muchas formas de
estrs ambiental. Cuando la fuente de carbono es un substrato insoluble como un
hidrocarburo, los microorganismos facilitan su difusin hacia la clula produciendo
substancias como carbohidratos, cidos grasos, enzimas y biosurfactantes. Los
microorganismos utilizan estos compuestos a manera de un biofilm alrededor de la
molcula del hidrocarburo, para posteriormente ingerirlo o romperlo en compuestos
simples de carbono y oxgeno. Estos microorganismos usan la energa liberada para
manejar los procesos termodinmicamente no espontneos como la sntesis de
componentes celulares.

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Tabla 1. Principales microorganismos petroleolticos objeto de estudio en los ltimos aos (Fuente: Tratamiento
microbiolgico de la contaminacin por petrleo en ambientes marinos. Estudio de su posible optimizacin. M.A: Murado,
J.Mirn, M.P.Gonzlez)

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2.2. Biodegradabilidad de los Hidrocarburos

No todos los compuestos hidrocarburazos presentarn la misma biodegradabilidad, y por
tanto, el tipo de hidrocarburos y sus caractersticas son muy importantes. La complejidad
de los compuestos individuales determina si estos pueden degradarse y en qu medida.
Se pueden identificar diferentes grupos de compuestos, en orden de biodegradabilidad,
que van desde los hidrocarburos saturados (alcanos y ciclocalcanos) a los asfaltenos,
resinas y compuestos polares, pasando por los hidrocarburos insaturados y aromticos
(incluidos los hidrocarburos poliaromticos).
Fraccin de los alcanos, incluye alcanos normales, alcanos ramificados (isoalcanos) y
cicloalcanos (naptenos).
Compuestos aromticos e hidrocarburos policclicos aromticos. Dentro de los cuales
estn los monoaromticos voltiles como el benceno, tolueno, xileno, etc., los
naptenoaromticos y compuestos aromticos sulfurados como los tiopenos y
benzotiopenos. Estos compuestos son los de mayor importancia debido a su toxicidad y
tendencia a la bioacumulacin.
Fraccin polar que son las resinas (piridinas, quinolinas, carbazoles, sulfxidos y amidas)
y asfaltenos (fenoles, cidos grasos, cetonas, steres y porfirinas)
Tabla 2. Esquema de biodegradabilidad de los diversos hidrocarburos.

Por tanto, las diferentes partes de los hidrocarburos exhibirn tendencias de

biodegradacin muy diferentes. En general, los componentes ms ligeros se
descompondrn con mucha ms facilidad mientras que los componentes ms pesados y
complejos se biodegradarn con menos facilidad y durante un periodo de tiempo ms
largo o incluso pueden no descomponerse en absoluto. Los crudos ligeros con una
proporcin relativamente alta de componentes simples pueden ofrecer mayores
posibilidades para la biorremediacin que, por ejemplo, los crudos o fueles pesados, que
disponen de proporciones relativamente altas de componentes complejos. Se ha de
admitir tambin que los productos derivados del petrleo ligeros y el gasoil contienen una

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proporcin relativamente elevada de compuestos txicos, que pueden afectar o matar a

los microorganismos responsables de la biodegradacin.
Los alcanos (o saturados) se degradan con rapidez en presencia de oxgeno gracias a
una amplia gama de microorganismos. Pueden dividirse en parafinas normales
(compuestos de cadena lineal, n-alcanos), saturados en cadenas ramificadas y saturados
cclicos (o naftenos o alicclicos).
Mientras que los saturados en cadenas lineales o ramificados, pueden degradarse rpida
y completamente (la degradacin comienza con los compuestos de cadena lineal), los
compuestos cclicos se degradan con mayor lentitud y en menor grado.
Los aromticos son compuestos con uno o ms anillos aromticos condensados (o de
benceno), que tambin pueden estar ramificados (estos incluyen el benceno y sus
derivados, bencenos sustituidos, dos, tres, cuatro o cinco hidrocarburos poliaromticos
cclicos). Los compuestos ligeros (con uno o dos anillos de benceno) se degradan
bastante bien y con relativa rapidez, pero los compuestos con ms de cuatro anillos de
benceno son mucho ms resistentes a la degradacin.
Por ltimo, los asfaltenos y las resinas, que son mezclas de hidrocarburos
deficientemente definidas que se encuentran en las fracciones pesadas (compuestos con
elevado peso molecular) de los crudos y de los refinados pesados, tienen una velocidad
de degradacin muy baja (e incompleta) en comparacin con otros componentes que se
encuentran en el crudo. A pesar de que habitualmente estos compuestos constituyen una
pequea proporcin de los productos petrolferos, son extremadamente resistentes a la
biodegradacin, lo cual incrementa su peligrosidad.
2.3. Factores que afectan a la Biodegradacin del Petrleo
La concentracin y composicin de la comunidad microbiana y la tasa de transformacin
de contaminantes est influenciada por diversos factores:

Temperatura
Generalmente las especies bacterianas crecen a intervalos de temperatura
bastante reducidos en torno a un valor medio tpico de cada zona. Para aguas
canarias, este rango oscila entre -2 y 35C (condiciones mesfilas).
La biodegradacin decrece por desnaturalizacin de las enzimas a temperaturas
superiores a 40C, mientras que se inhibe con temperaturas bajas. Una
temperatura ptima de crecimiento bacteriano suele estar en torno a los 25 C. La
tasa de degradacin decrece exponencialmente cuando se baja de esta
temperatura, habindose comprobado que es 10 veces inferior a 5C.

Oxigenacin
La disponibilidad de oxgeno es fundamental para las degradaciones aerbias, que
son las que resultan ms eficientes. Aunque su disponibilidad no suele ser
limitante en ambientes marinos, la concentracin del mismo depende de su

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ubicacin en el ambiente marino; por ejemplo, es mucho menor en sedimentos de

baja granulometra y en playas de baja energa, etc.

Necesidad de nutrientes
El metabolismo microbiano est orientado a la reproduccin de los organismos y
stos requieren que los constituyentes qumicos se encuentren disponibles para su
asimilacin y sntesis. Los nutrientes principalmente requeridos son el fsforo y el
nitrgeno, cuya disponibilidad suele ser ms limitante que la de oxgen, siendo la
mayora de los ambientes marinos deficitarios en estos nutrientes, as como en
hierro.
Por lo general suele haber en el suelo una concentracin de nutrientes suficiente,
sin embargo, si estos no se encontrasen en el rango normal se puede adicionar
mayor cantidad al medio. El rango normal de C:N:P depende del sistema de
tratamiento a emplear, siendo de modo habitual 120:10:1.

pH del suelo
Afecta significativamente en la actividad microbiana. El crecimiento de la mayor
parte de los microorganismos es mximo dentro de un intervalo de pH situado
entre 6 y 8.
Asimismo, el pH tambin afecta directamente en la solubilidad del fsforo y en el
transporte de metales pesados en el suelo. La acidificacin o la reduccin del pH
en el suelo se puede realizar adicionando azufre o compuestos del azufre.

Humedad
Los microorganismos requieren unas condiciones mnimas de humedad para su
crecimiento. El agua forma parte del protoplasma bacteriano y sirve como medio
de transporte a travs del cual los compuestos orgnicos y nutrientes son
movilizados hasta el interior de las clulas.
Un exceso de humedad inhibir el crecimiento bacteriano al reducir la
concentracin de oxgeno en el suelo. El rango vara en funcin de la tcnica.

Estructura qumica del hidrocarburo

La inherente biodegradabilidad de un hidrocarburo depende, en gran medida, de
su estructura molecular. Siendo los parmetros que ms van a afectar la
halogenacin, la existencia de ramificaciones, la baja solubilidad en el agua y la
diferente carga atmica.

2.4. Ventajas e Inconvenientes de la Biodegradacin

Ventajas

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Generalmente solo origina cambios fsicos menores sobre el medio, con lo

que resulta una tcnica de bajo impacto ambiental.
Cuando se usa correctamente no produce efectos adversos significativos
en la biota local del medio contaminado.
Ofrece una solucin mas sencilla y completa que las tecnologas
mecnicas, y resulta menos costosa que stas tecnologas.

Inconvenientes
Para muchos tipos de vertidos su efectividad no ha sido determinada, y en
general es poco eficiente con compuestos pesados.
Su aplicacin en el mar reviste una elevada dificultad y en general no es
viable debido a la inestabilidad del medio
El tiempo necesario para la actuacin de los microorganismos es largo
Su implementacin es especfica para cada lugar contaminado, tanto en lo
referente al tipo de microorganismos empleados como a las tcnicas de
enriquecimiento nutricional y tcnicas de aplicacin.
Su optimizacin requiere informacin sustancial acerca del lugar
contaminado y las caractersticas del vertido, por lo que generalmente no
es una tcnica de aplicacin inmediata.

3. Tcnicas de Biorremediacin
Las medidas de biorremediacin pueden dividirse en aquellas que se llevan a cabo en el
lugar afectado por la contaminacin (In Situ) y aquellas que se llevan a cabo fuera de este
(Ex Situ), con el material que ha sido retirado de la zona contaminada y depositado en
zonas de tratamiento designadas.
Entra las tcnicas Ex Situ se incluyen el cultivo de tierras, la transformacin en abonos y
el bioapilamiento. Durante muchos aos se han empleado con xito algunas de estas
tcnicas, principalmente la de cultivo de tierras, que ha sido explotada como la forma ms
habitual de tratamiento de los residuos oleosos. Sin embargo, en el mbito de la
contaminacin del litoral por hidrocarburos, frecuentemente el gran volumen de residuos
hace que sean las tcnicas In Situlas ms adecuadas para su tratamiento.
Los principales factores que se incluyen en el proceso de biodegradacin son la
disponibilidad de oxgeno y nutrientes. En consecuencia, muchas tcnicas In Situ se
centran en medidas que pueden tomarse para manipular los niveles de estos elementos
con el objeto de crear condiciones ptimas que permitan potenciar el proceso de
biodegradacin. Estas tcnicas reciben habitualmente la denominacin de
Bioestimulacin.

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Un enfoque alternativo consiste en introducir microorganismos adicionales, que

complementen a los presentes o bien presenten una mayor eficiencia que los autctonos,
y estas reciben el nombre de Bioaumento. La Bioestimulacin y el Bioaumento no se
excluyen entre s, y pueden realizarse de forma conjunta.
Una medida adicional, la fitorrehabilitacin, se vale de un proceso biolgico alternativo
como es la tendencia de algunas plantas a extraer contaminantes del terreno o
transformarlos en el proceso bioqumico de su crecimiento, o incrementando la actividad
microbiolgica en los sedimentos (alrededor de las races). La fitorrehabilitacin tambin
se considera por tanto una tcnica de biorremediacin.
Otro tipo de biorremediacin consiste en la adicin de enzimas que actuan como
catalizadores en la degradacin de hidrocarburos.
I) Bioestimulacin
Tcnica Empleada
La Bioestimulacin consiste en la provisin activa de cantidades suficientes de oxgeno y
nutrientes para mantener a los microorganismos responsables de la degradacin de forma
que estos puedan continuar proliferando y desarrollando el proceso de biodegradacin.
Es el mtodo de biorremediacin ms estudiado, y actualmente se presenta como el de
ms factible aplicacin para la mayora de vertidos.
Generalmente, los litorales ms porosos (de arena, grava, bolos y cantos rodados)
poseen cantidades muy limitadas de carbono disponible, por lo que ste constituye un
recurso limitante, de manera que la introduccin de hidrocarburos durante un derrame
facilita la proliferacin de microorganismos.
Con concentraciones bajas (segn las investigaciones se ha estimado provisionalmente
como menores a 1g de hidrocarburos por Kg. de sedimento), la disponibilidad de oxgeno,
as como las concentraciones ambientales de nitrgeno y fsforo, suelen de ser
suficientes para permitir que el proceso de degradacin de los hidrocarburos se produzca
con rapidez. Sin embargo, con elevadas concentraciones de hidrocarburos, la actividad
biolgica reduce rpidamente los niveles de oxgeno y nutrientes, que se convierten en
recursos limitantes del crecimiento microbiano, y este es inhibido.
Adicin de nutrientes
Se pueden aplicar nutrientes en la zona litoral con la finalidad de mantener
concentraciones suficientes. Una relacin aceptada generalmente entre carbono,
nitrgeno y fsforo es C:N:P = 120:10:1.
El proceso de biodegradacin se produce en la interfaz entre las molculas de
hidrocarburos y el agua. Por tanto, los nutrientes han de encontrarse disponibles en forma
soluble entre las partculas individuales de sedimento que conforman el litoral.
Se han realizado pruebas de diversos mtodos de aplicacin que incluyen fertilizantes
lquidos y fertilizantes agrcolas de tipo comercial, que pueden obtenerse de forma
inmediata y aplicarse fcilmente. Tambin se han probado formas slidas de liberacin

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lenta, como briquetas, pero han de poseer la densidad suficiente y estar bien ligadas con
elementos de amarre para evitar la abrasin fsica y una disolucin rpida a causa de la
accin del oleaje y las mareas.
Los grnulos cilndricos y esfricos de liberacin lenta pueden ser una alternativa, ya que
liberan nutrientes en contacto con el agua de mar o el agua de lluvia, pero tambin
pueden ser arrastrados antes de que resulten eficaces.
Los avances ms recientes incluyen composiciones de nutrientes oleficos que pueden
ser atrados hacia los hidrocarburos reduciendo la tendencia a ser arrastrados.
Cuando se estn aplicando nutrientes en cualquiera de estas formas, se deber tener
especial cuidado para evitar una sobre aplicacin y la consiguiente acumulacin de
nutrientes, ya que esto podra producir fenmenos de eutrofizacin y afloramientos
txicos de algas.
Aireacin
La carencia de oxgeno puede producirse cuando la permeabilidad de los sedimentos del
litoral no es suficiente para permitir que el oxgeno acceda a los microorganismos. En
ciertos casos, puede ocurrir que la presencia de los hidrocarburos reduzca por s misma
la permeabilidad, al obstruir los espacios intersticiales de los sedimentos.
En estos casos, a fin de mantener las condiciones aerbicas que favorecen la
biodegradacin del hidrocarburo, es necesario perturbar fsicamente los sedimentos para
facilitar la entrada de oxgeno, mediante rastrillado o arado realizados de forma peridica,
bien de forma manual o mediante fresadora.
No obstante, ciertos sistemas ambientales son especialmente sensibles a cualquier tipo
de intromisin fsica. En general, en estos lugares se impiden los mtodos
convencionales de limpieza del litoral o se restringen duramente, por lo que se debe
considerar la perturbacin fsica con objeto de ventilacin nicamente si, y siempre n la
medida en que, no se cause perjuicio al medio ambiente. Adems, cuando se estn
moviendo o perturbando materiales en cualquier litoral, debe procurarse no enterrar los
hidrocarburos an ms dentro del sedimento.
Limitaciones
Esta tecnologa no es recomendable para suelos arcillosos, altamente estratificados o
demasiado heterogneos, ya que pueden provocar limitaciones en la transferencia de O2.
Otros factores que pueden limitar su aplicacin, incluyen:
a) que el tipo del suelo no favorezca el crecimiento microbiano
b) un incremento en la movilidad de los contaminantes
c) la obstruccin en los pozos de inyeccin provocada por el crecimiento microbiano
Costos y tiempos de remediacin

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La limpieza de una playa contaminada puede requerir de varios aos con tratamientos
repetidos. Su costo oscila entre 30 y 100 USD/m3. La naturaleza y profundidad de los
contaminantes y el uso de bioaumentacin puede aumentar sus costos (Van Deuren y
col., 1997).
II) Bioaumentacin
Tcnica Empleada
Esta tecnologa se utiliza cuando se requiere el tratamiento inmediato de un sitio
contaminado, o cuando la microflora autctona es insuficiente en nmero o capacidad
degradadora. Consiste en la adicin de microorganismos vivos, que tengan la capacidad
para degradar el contaminante en cuestin, para promover su biodegradacin o su
biotransformacin.
La bioaumentacin puede realizarse sembrando las reas afectadas con microorganismos
petroleolticos autctonos o alctonos, pero en ambos casos se deben aadir nutrientes
auxiliares (N, P y Fe) para favorecer el desarrollo de las especies, ya que el medio marino
es deficitario en stos y se deben equilibrar las proporciones de carbono que implica un
vertido de petrleo. El tamao del inculo a utilizar, depende del tamao de la zona
contaminada, de la dispersin de los contaminantes y de la velocidad de crecimiento de
los microorganismos degradadores.
La ventaja de la adicin de microorganismos alctonos es que stos son seleccionados
de entre los organismos con mayor poder de degradacin del petrleo. En la Tabla 1 se
puede contemplar una lista de las especies capaces de degradar diferentes fracciones
del petrleo.
Limitaciones
A fin de prevenir las posibles alteraciones a los equilibrios ecolgicos que frecuentemente
supone la introduccin en un determinado sistema de organismos forneos, el uso de
estos microorganismos se realizar siempre bajo las siguientes condiciones:
a) Los microorganismos introducidos no son fotosintticos y requieren carbono
orgnico para sobrevivir.
b) No pueden sobrevivir como parsitos de otros organismos, sino nicamente como
saprfitos.
c) No forman esporas o cualquier otra forma de resistencia.
Por otra parte, antes de llevar a cabo la bioaumentacin en un sitio, deben realizarse
cultivos de enriquecimiento, aislar microorganismos capaces de cometabolizar o utilizar el
contaminante como fuente de carbono, y cultivarlos hasta obtener grandes cantidades de
biomasa.
Costos y tiempos de remediacin
Es una tecnologa que puede durar varios meses o aos, y su utilizacin no implica
mucho capital ni costos de operacin.

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III) Fitorremediacin
Tcnica Empleada
Este es el proceso de utilizar el crecimiento de las plantas para acelerar la biodegradacin
natural de los hidrocarburos. Los hidrocarburos que se encuentran infiltrados en el terreno
son, o bien transformados en el proceso de crecimiento de las plantas, o bien asimilados
y metabolizados por la propia vegetacin.
Esta tcnica puede ofrecer buenos resultados en los derrames que afectan a zonas
frgiles como marismas o saladares, donde el tratamiento posible se reduce a una
limpieza suave
con tcnicas poco agresivas. Se puede potenciar el proceso estimulando el crecimiento
de las plantas existentes mediante la adicin de fertilizantes, o bien mediante la
introduccin de plantas nuevas, procurando que sean autctonas de la zona afectada.
En algunos casos, la restauracin del crecimiento vegetal tiene el beneficio aadido de
prevenir o reducir al mnimo los efectos perjudiciales de la erosin.
Los mecanismos por los que acta la fitorremediacin incluyen la rizodegradacin, la
fitoextraccin, la fitodegradacin y la fitoestabilizacin.
Rizodegradacin : Este proceso se lleva a cabo en el suelo que rodea a las races. Las
sustancias excretadas naturalmente por stas, suministran nutrientes para los
microorganismos, mejorando as su actividad biolgica.
Fitoextraccin : Durante la fitoextraccin, los contaminantes son captados por las races
(fitoacumulacin), y posteriormente stos son traslocados y/o acumulados hacia los tallos
y hojas (fitoextraccin).
Fitodegradacin : La fitodegradacin consiste en el metabolismo de contaminantes
dentro de los tejidos de la planta, a travs de enzimas que catalizan su degradacin.
Fitoestabilizacin : Las plantas limitan la movilidad y biodisponibilidad de los
contaminantes en el suelo, debido a la produccin en las races de compuestos qumicos
que pueden adsorber y/o formar complejos con los contaminantes, inmovilizndolos as
en la interfase races:suelo.
Limitaciones
Existen varias limitaciones que deben considerarse para su aplicacin:
a) El tipo de plantas utilizado determina la profundidad a tratar, ya que el tratamiento
del terreno contaminado slo se produce en la zona en que la planta arraiga.
b) Altas concentraciones de hidrocarburos pueden resultar txicas para el vegetal,
por lo que generalmente se requiere una retirada previa de los grandes volmenes
de contaminante.
c) La eficiencia del proceso y su viabilidad puede depender de la estacin del ao.

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d) Esta tcnica no es efectiva para tratar contaminantes fuertemente sorbidos al

sedimento.
e) La toxicidad y biodisponibilidad de los productos de la degradacin no siempre se
conocen, y pueden movilizarse o bioacumularse en animales.
4. Requerimientos Logsticos
Para realizar la limpieza final de una costa impregnada con hidrocarburos mediante la
adicin de nutrientes o introduccin de microorganismos alctonos, son necesarios los
siguientes requerimientos logsticos:
Cuba de plstico o fibra de vidrio de 10-15 m3. Si se han de aadir microorganismos
vivos, la cuba habr de cumplir los requisitos necesarios para mantenerlos en buenas
condiciones hasta su inoculacin en el medio.
Bomba de recirculacin de agua resistente al agua de mar; es aconsejable una bomba
de membrana, que puede ser elctrica, pero es mejor autnoma.
No se puede emplear agua de la red de abastecimiento debido a la cloracin
Polvo liofilizado, sepiolita u otros medios slidos de adsorcin para los nutrientes y
microorganismos, a fin de que estos sean liberados lentamente y no sean retirados de la
zona a tratar por el oleaje o la marea.
Se estima que se pueden tratar un promedio de 0,5 Ha en 10 horas, para lo cual se
recomienda un equipo de 5 personas, una de las cuales habr de ser un tcnico
especialista en Biorremediacin.
Es aconsejable disponer de un stock de seguridad de cultivo bacteriano liofilizado para
casos de emergencia. Generalmente estos cultivos requieren de varias horas (4-10 horas)
de fermentacin, y de 1 Kg de producto seco es posible obtener una media de 500-600
Kg de inculo derivado.
5. Resumen
La biorremediacin no es una tcnica para ser utilizada de forma general durante la
etapa de limpieza primaria, sino una estrategia de restauracin ambiental una vez ha
finalizado la fase de Emergencia.
Las tcnicas de biorremediacin se centran en manipular los niveles de oxgeno y
nutrientes con el objetivo de favorecer la proliferacin de microorganismos. Estas tcnicas
reciben el nombre de bioestimulacin. Otros sistemas se basan en la introduccin de
nuevos microorganismos que permiten una biodegradacin mas rpida del hidrocarburo,
lo que se conoce como bioaumentacin.
Otro tipo de biorremediacin se realiza mediante la introduccin de enzimas que actan
como catalizadores en la degradacin de los hidrocarburos.

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Si se aplica la biorremediacin, ser necesario vigilar la situaci de forma peridica para

realizar un seguimiento de las posibles variaciones en las condiciones que puedan estar
causadas por procesos naturales o que sean consecuencia del tratamiento.

MATERIALES Y EQUIPOS
3.1 Materiales

4 Muestras de suelo
6 frascos con tapas de 200ml (para cada muestra)
Solucin buffer PBS
Solucin PCA
Agua destilada
24 cajas Petri (4 por dilucin)
1 caja de tips (para dilucion)
1 caja de tips (para crudo)
1 caja de tips (para muestra)
4 marcadores permanentes
Papel cerafin (cant. considerada)
Papel aluminio (cant. considerada)
Papel madera (cant. considerada)
Bolsas plsticas (cant. considerada)
1 Matraz Erlenmeyer de 200 ml
1 Matraz Erlenmeyer de 1000 ml
1 probeta graduada de 1000 ml
1 Micro Pipeta (20- 200 L)
1 Micro Pipeta ( 800 L)
1 Micro Pipeta ( 200 L)
1Tijera
Pares de Guantes

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Recipiente de etanol
1 Encendedor
Hazas Drigalsky (para crudo y muestra)
1 Cronometro
1 tamiz de 200 micrones

3.2 Equipos
Autoclave
Hornilla
Incubadora
Campana de absorcin
Balanza analtica
Cmara frigorfica
PH metro

ASPECTOS PRELIMINARES
Registrar la temperatura del ambiente y hora de inicio de la prueba.
Previamente a la realizacin de la prueba, se deber determinar en laboratorio el
poder calorfico y el contenido de humedad del combustible.
Asimismo, antes de la realizacin de la prueba se requiere determinar el punto de
ebullicin local del agua, de la siguiente manera: hervir agua en una olla (5 litros);
cuando se produzca la ebullicin y sta se mantenga por unos cinco minutos,
medir la temperatura del agua con el termmetro digital colocado a 5 cm del fondo
de la olla. Se registrar la temperatura mnima y mxima, durante los cinco
minutos sealados. La temperatura de ebullicin corresponder al promedio de las
temperaturas mnima y mxima registradas.
Determinar las dimensiones promedio del combustible a utilizar (longitud x ancho x
altura). En lo posible se deber usar combustible en piezas similares para reducir
variaciones de las condiciones de la prueba; se recomienda usar combustible de
seccin transversal rectangular de alrededor de 3 cm x 4 cm y de longitud
adecuada al modelo de cocina en evaluacin. Se deber separar el combustible

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en tres lotes, los dos primeros de tres kilos y el ltimo de 4 kilos. Se pesar
previamente cada lote
Registrar el contenido de humedad de la madera utilizando un medidor de
humedad de madera o determinado en laboratorio acreditado.
Se usarn tantas ollas como hornillas tenga la cocina.
5

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

DATOS, CLCULOS Y RESULTADOS

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OBSERVACIONES

CONCLUSIONES

BIBLIOGRAFA

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[LIBRO DE TEXTO]
2. Internet Google,Altavista ,Terra,(microbiologa del suelo)
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wastewaters. Int. Biodet. Biodegr. 263270.
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6. Vela, G.R. y Rosenthal, S. (1972). The effect of peptone on azotobacter morfology.
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12. Soto J., Gutirrez T., Lemos A., Ortiz M., Pescador N., Varela L. (1996).
Biodegradacin y biotransformacin de molculas orgnicas. Manual de
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