ARTCULODEREVISIN

ANIMALESMODIFICADOSGENTICAMENTEENINVESTIGACINFARMACOLGICA
(GeneticallyModifiedAnimalsinPharmacologicalResearch)

MauricioD.Dorfman,Ph.D.

DivisionofNeuroscience,OregonNationalPrimateResearchCenter/OregonHealthandScienceUniversity,Beaverton,Oregon,USA.

RESUMEN

Losanimalesmodificadosgenticamente(AMG)sonunaherramientaampliamenteutilizadaenlainvestigacinbiomdica,ya
quepermitenmodelarenfermedades,estudiarlasbasesmolecularesdelascondicionespatolgicas,identificaryvalidarnuevos
blancos farmacolgicos, y estudiar la farmacocintica y toxicidad de los frmacos. Los AMG pueden sobreexpresar un gen
forneo(animaltransgnico),tenerinterrumpidalaexpresindeungen(knockout),otenerreemplazadoungenenparticular
(knockin).ElratneselanimaldelaboratoriodeeleccinparalageneracindeAMG,principalmenteporlafacilidadconque
esposiblemodificarlogenticamenteysubajocostoeconmicodemantencin.Entrelosavancesmsdestacadosdelltimo
tiempoenlastcnicasdeingenieragentica,estalaintroduccindemutacionesclulaotejidoespecfico,loscambiosenel
genomadelratnquepuedeninducirseoreprimirseenunmomentopuntualdelavidadelanimal,ylasustitucindegenesdel
ratnporsuortlogohumano.Laslimitacionestecnolgicasparaproducirmodelosderatonesmanipuladosgenticamenteson
cadavezmenores,mientrasquelasaplicacionesyejemplosdeusosdeestosanimalesenfarmacologa,quepodemosencontrar
en la literatura, son cada vez mayores. Por lo tanto, entender lo que se requiere experimentalmente para responder una
preguntacientficaestanimportante,comoconocerlasherramientasbiotecnolgicasdisponiblesenelmercado.Estarevisin
no tiene otro fin que informar de manera general los tipos de AMG que existen y ejemplificar los usos de estos en la
investigacinfarmacolgica.

Palabrasclaves:AnimalesModificadosGenticamente,Transgnicos,KnockOut,KnockIn,RatonesHumanizados.

PublicadoporlaSociedaddeFarmacologadeChile

INTRODUCCIN

La investigacin biomdica tiene por objetivo, no slo

entender los mecanismos moleculares involucrados en el
inicio y progresin de las enfermedades, sino tambin
desarrollar nuevas estrategias para el tratamiento y
prevencin de dichas anomalas. Para este propsito, la
validacinexperimentalylosensayospreclnicosutilizando
modelos animales son indispensables. Los modelos
animalesdeenfermedadespuedenser:

1) Naturales, es decir, que suceden espontneamente,

comoporejemplolaateroesclerosisenelmonoardilla.
2) Inducidosdeformafsica,comoenelcasodelasratas
ovariectomizadasparaelestudiodelaosteoporosis.
3) Generadosconelusodeagentesqumicos,comoesel
modelo de diabetes mellitus tipo 1 inducido con
estreptozotocina.
4) Originadoconunagentebiolgico,comoenelcasodel
modeloanimaldesepticemiainducidoconLPS.
5) Producido
mediante
manipulacin
gentica.

Correspondencia a: Dr. Mauricio D. Dorfman, Division of Neuroscience, Oregon National Primate Research Center/Oregon Health and Science University, 505
Northwest185thAvenue,Beaverton,Oregon97006,USA.Correoelectrnico:mauriciodorfman@yahoo.com

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Estos ltimos se definen como aquellos animales a los
cuales,mediantetcnicasdeingenieragentica,selesha
introducido, removido o reemplazado una regin
especfica de su genoma. Dentro de los animales
modificados genticamente (AMG) estn: 1) los animales
transgnicos, que se definen como aquellos en los cuales
se ha introducido un gen forneo en su genoma y por lo
tanto han ganado una funcin que anteriormente no
tenan; y 2) los animales knockout (KO), que se definen
comoanimalesaloscualesseleshaeliminadodemanera
especficalaexpresindeungenycomoconsecuenciahan
perdido una funcin que inicialmente posean. En este
ltimo grupo se incluyen tambin a los animales knockin
(KI), en los cuales se reemplaza una secuencia especfica
delgenomadelanimal,quepuedeirdesdeunsimplepar
de bases hasta el reemplazo de un gen completo.
Recientemente,graciasalosavancesenlatecnologaque
involucra a la ingeniera gentica, los modelos animales
transgnicos, KO y KI se han convertido en una
herramientadeusomasivo.

El mamfero de eleccin para la generacin de modelos

AMG es el ratn. Las ventajas del ratn por sobre otros
mamferos como la rata o el conejo, radican en la
posibilidad de disponer de cientos de organismos
genticamente homogneos en el corto plazo, la facilidad
con que es posible modificar genticamente su lnea
germinal y la gran disponibilidad de clulas embrionarias
indiferenciadas. Estas ventajas se deben en parte a la
facilidad para cruzarlos y el poco tiempo que demora
obtener nuevas camadas. El costo econmico de
mantencindeestosanimalesesotraventajaaconsiderar,
ya que por su tamao, el espacio requerido para albergar
un gran nmero de ellos es pequeo y la cantidad de
alimentonecesarioesbajo,locualmantieneelcostoenun
rangoasequible.

Elnmeroderatonesmodificadosgenticamentequeson
utilizados en instituciones de investigacin cientfica ha
crecido rpidamente en las ltimas dcadas. Un dato que
apoya el uso masivo de AMG proviene de un estudio
retrospectivo, en el que se correlacion positivamente el
efecto conocido de las 100 drogas ms vendidas, con el
fenotipo observado en los ratones KO para los blancos
moleculares de cada droga (1). Pero no slo la industria
farmacuticasehabeneficiadoconelusodelatecnologa
genticaenmodelosanimales,sinoquebsicamentetodas
las ramas de la farmacologa han logrado resultados
positivosconelusodemodelosdeAMG.Enestarevisin
bibliogrfica se abordar de manera general la forma de
generar los distintos tipos de ratones manipulados
genticamente, se discutirn las diversas aplicaciones que
tiene el uso de dichos modelos en los estudios
farmacolgicos y finalmente se analizar desde un punto
devistaprospectivolosenfoquesquetendrelusodelos
AMGenlainvestigacinfarmacolgicaenelfuturo.

ANIMALESTRANSGNICOS

El primer animal transgnico se gener hace ms de dos

dcadas, mediante la microinyeccin de una secuencia
lineal y purificada de cido desoxirribonucleico (DNA) en
ovocitos fertilizados (2) (Figura 1A). Desde entonces, la
tecnologa para generar animales transgnicos
convencionales, por medio de la microinyeccin de
embriones, no ha variado sustancialmente. Sin embargo,
varias de las limitaciones iniciales, como por ejemplo la
bajaeficienciadelmtodoylaintegracinazarosadelDNA
exgeno, que muchas veces causaba mutaciones dainas
en el genoma del animal, han sido resueltas a lo largo de
losltimosaos.LossistemasdetransferenciadeDNAque
hoy estn disponibles, como por ejemplo el uso de
vectores virales, transferencia de DNA por medio de
espermatozoides y clonamiento de clulas somticas,
permiten mejorar enormemente la eficiencia,
disminuyendoloscostosasociadosconlageneracindelos
ratones transgnicos (3). Por otra parte, se han
desarrollado mtodos para lograr la insercin del DNA
exgeno en sitios especficos del genoma, evitando la
produccin de mutaciones indeseadas y toxicas para el
animal. Adems, la utilizacin de promotores especficos
permite que el transgn (DNA exgeno) se exprese de
forma tejidoespecfico en el animal transgnico. Otro
avance obtenido en la tecnologa de los animales
transgnicos es la induccin temporal o condicional de la
expresin del transgn (4). La expresin inducida con
tetraciclina es un sistema ampliamente utilizado en
aquellosestudiosdondelaexpresindeltransgendurante
el desarrollo causa la muerte del animal. De esta manera
se puede encender o apagar al transgn mediante la
inyeccindeanlogosdelatetraciclina(Figura1B).

Un ejemplo de la utilidad de los transgnicos en la

validacin de una va de transduccin de seal
teraputicamente relevante, fue la expresin del gen
humano que codifica para el transportador de glucosa 4
(GLUT4) en una cepa de ratn diabtico (db/db). Los
resultados obtenidos demostraron que la expresin del
transgn GLUT4 mejor la resistencia a la insulina y
recuper el control de la glicemia en los animales
diabticos(5).

El descubrimiento de modelos animales que remeden las

enfermedades humanas es fundamental para la
identificacin de nuevas terapias. En el caso de la
enfermedad de Alzheimer (EA), no existen modelos
animales que desarrollen espontneamente las
caractersticas de esta enfermedad (depsitos de ovillos
neurofibrilaresyplacasamiloidesenelcerebro).Poreste
motivo, se han invertido muchos recursos para generar
modelos transgnicos de la EA. Un ejemplo de ellos es el
ratn transgnico Tg2576 (6), uno de los modelos de EA
msampliamenteutilizadosenelmundo.

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Figura1.

A) Produccin de un ratn transgnico mediante la microinyeccin de un

proncleo. El material gentico es inyectado directamente en un ovocito
fertilizado y posteriormente este ltimo es implantado en una hembra
pseudopreada. B) Sistema de regulacin de la expresin del transgen
mediante el sistema de la tetraciclina. Esta estrategia involucra dos
transgenes.Eltransgn1utilizaunpromotortejidoespecficoparaconducir
la expresin de un represor o activador reverso de la transcripcin del
opern de tetraciclina (representado en este esquema por el sitio de
respuesta a tetraciclina: ERT). El transgn 2 lleva en su construccin el
cDNA de inters, cuya expresin est controlada por el elemento de
respuestaatetraciclina.Enpresenciadelantibiticotetraciclinasebloquea
el efecto del represor (rtTA) y se induce la transcripcin del cDNA
(encendidodeltransgn2).Porelcontrario,enausenciadetetraciclina,el
represorrtTAmantieneapagadalaexpresindelcDNAdeinters.

Otroejemplodeunmodelotransgnicoquedesarrollauna
condicin patolgica, es el ratn transgnico de la 11
hidroxiesteroidedeshidrogenasa,cuyasecuenciagnicase
ha colocado bajo el control del promotor de la cadena
pesadadelamiosina,permitiendoaslasobreexpresin
de este transgn especficamente en clulas de la
musculatura cardiaca. Este animal transgnico tejido
especficopresentaunacondicindehipertrofia,fibrosisy
falla cardiaca (7). La administracin de eplerenona, un
bloqueador selectivo de la aldosterona, mejor
significativamente la condicin patolgica del animal.
Gracias a este transgnico se descubri que la activacin
inapropiada del receptor de mineralocorticoide provoca
daosanivelcardiacoyqueelbloqueodelaaldosterona
tienebeneficiosteraputicosenlafallacardiaca.

Los AMG adems se han utilizados ampliamente en

estudios farmacocinticos, permitiendo mejorar el
conocimiento de la funcin invivo de enzimas, protenas
transportadorasyreceptoresdexenobiticosinvolucrados
enelmetabolismoytransportededrogas.Unejemplode
animal transgnico utilizado para el estudio del
metabolismo de drogas, corresponde al ratn transgnico
delacitocromoP4503A4(CYP3A4),cuyoestudiomejorel
conocimiento del metabolismo de primer paso del
midazolam(8).
La toxicologa es otra rama de la farmacologa que ha
obtenido beneficios de la investigacin con animales
transgnicos. En esta rea, sin embargo, hay que tener
especial cuidado con las diferencias entre especies a la
hora de interpretar los resultados. Esto debido a que
muchasveceslainteraccindeunadrogaconunaenzima,
transportadororeceptornoserigualenelanimalqueen
elhumano,debidoalasdiferenciasenlacomposiciny/o
expresin gnica de las diferentes especies. En este
sentido, un avance importante ha sido la posibilidad de
generaranimaleshumanizados,esdecir,animalesenlos
cuales se reemplaza un gen del ratn por su ortlogo
humano,mejorandodeestaformalaprediccindelriesgo
del xenobitico en humanos (revisar en la seccin de
animalesKI).

ANIMALESKNOCKOUT

La generacin de animales KO fue precedida

principalmente por dos descubrimientos en la dcada de
1980, el aislamiento de clulas madre de embriones de
ratn (mES) y la posterior demostracin de la posibilidad
deinterrumpirungenparticularconungendeneomicina
en clulas mES. Estos eventos permitieron
posteriormente la produccin de ratones KO, mediante la
interrupcindeungenespecficoatravsdelatecnologa
de recombinacin homloga en clulas mES. La razn por
la cual se utilizan las clulas mES en la produccin de
ratonesKO,esqueestasclulassonpluripotentesyporlo
tanto, darn origen a los distintos tipos celulares del
animal adulto. Adems, estas clulas pueden mantenerse
en cultivo de manera indiferenciadas y escoger, mediante
laseleccinconantibiticos,aquellosclonesquetienenel
constructo en la regin correcta del genoma antes de
inyectarlasenelembrin(Figura2A).

El proceso para generar un ratn KO tiene dos etapas: la

construccin del vector (Figura 2A) y la inyeccin de las
clulas mES, que han incorporado correctamente el
constructo en su genoma, en la etapa de blastocisto del
embrin(Figura2B).Unodelosprincipalesinconvenientes
de esta tecnologa es que la mutacin (interrupcin del
gen)estransmitidaatravsdelalneagerminal,porloque
todaslasclulasdelorganismollevanlamutacininducida
(animalKOconvencional).Sinembargo,eldesarrollodela

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tecnologa CreLoxP ha permitido eliminar la expresin de

un gen de forma clulaespecfica (animal KO condicional)
(9). Para la utilizacin de esta tecnologa se requiere dos
tiposdeanimales:

1) Uno que exprese el gen Cre (nombre proveniente del

ingls: Causes Recombination) que codifica para la
enzima recombinasa, la cual producir la
recombinacinhomologaalreconocerlossitiosLoxP.

2) Unanimalquetengaelgendeinters,flanqueadopor
dossitiosLoxP,quecorrespondenasecuenciasgnicas
quesernreconocidasporlaenzimarecombinasaCRE.

Si la expresin del gen Cre est bajo el control de un

promotor de un gen que se expresa en un tipo celular
determinado, se obtendr como resultado un animal KO
condicional o tejidoespecfico. La figura 3 ilustra la
produccindeunratnKOparaungenX,especficamente
enhepatocitos,medianteelsistemaCreLoxP.Adems,es
posible inducir la expresin de la recombinasa en un
momentodeterminadodelavidadelanimalmediante,por
ejemplo, el uso de un sistema inductor como el de la
tetraciclina (animal KO condicional, inducible) (10). Una
alternativa al uso de vectores de expresin transgnicos
inducibles, es la infeccin de ratones con vectores de
expresin viral que expresen la protena CRE. Estos virus
puedenseradministradosenelanimaladultolocalmente,
conlocualselogralainfeccinenlasclulasquerodeanel
sitio de de inyeccin, o mediante inyeccin intravenosa,
conlocualsepierdeespecificidadenlainfeccin.

Durante los ltimos 20 aos se han generado miles de

ratones KO en todo el mundo, lo cual ha permitido a los
cientficosusarestaherramientaexperimentalentodaslas
areas de la biologa, fisiologa y farmacologa. Los
animalesKOsonutilizadosampliamentecomomodelosde
ciertascondicionesclnicasrelevantes.Ejemplodeelloson:
el ratn KO para Apoliproproteina E, utilizado como
modelo de ateroesclerosis (11); y los ratones KO para el
receptor de insulina, GLUT4, el receptor del factor de
crecimiento tipo insulina 1, el sustrato del receptor de
insulina 1 y 2, cuya finalidad es estudiar los mecanismos
moleculares asociados con la fisiopatologa de la
resistenciaalainsulinaydiabetesmellitustipo2(12).

Como ejemplos del uso de animales KO en estudios

farmacolgicos podemos mencionar al ratn KO para
glutatinStransferasapi(GstPKO).Estegencodificapara
una de las enzimas glutatin Stransferasas ms
importantes, la cual es responsable de la defensa celular
del organismo contra toxinas endobiticas y xenobiticas.
Los estudios con el modelo de ratn GstPKO permiti
determinar el efecto carcinognico del 7,12
dimetilbenceno antraceno (DMBA) (13), el efecto

hepatotxico del paracetamol (14) y la disfuncin

endotelialproducidaporeltabaco(15).

Figura2.

Proceso para generar un ratn KO mediante recombinacin homloga en

clulasmES.A)Elvectorcontieneelgen deinters(GenA),interrumpido
porelgenderesistenciaalaneomicina(neor)ytodoestoflanqueadopor
dosregionesdehomologa,quepermitenlainsercindelconstructoenel
lugar donde est ubicado el gen original en el genoma del ratn. Una vez
que el vector es introducido en las clulas mES, se seleccionan aquellos
clones que tienen el inserto, cultivando las clulas en presencia de
neomicina. B) Las clulas mES con el inserto en la ubicacin deseada, son
inyectadas en el blastocisto de un ratn de aproximadamente 4 das de
gestacinyposteriormenteelblastocistosetransplantaenelterodeuna
hembra pseudopreada. Los ratones de la primera camada son quimeras,
yaquetienenunamezcladelasclulaspropiasdelblastocistoylasclulas
mES inyectadas. Los animales KO homocigotos se obtienen haciendo una
seleccin mediante nuevos cruzamientos y la genotipificacin del
constructo.

Otro ejemplo son los ratones KO para las diferentes

isoformas de la GlicoprotenaP MDR1. Esta glicoprotena,
quetieneunaltoniveldeexpresinenlamembranaapical

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delosenterocitos,enlasuperficiebiliardeloshepatocitos
y en el lado luminal de las clulas del tubo proximal del
rin,participaenlaabsorcin,distribucinyexcrecinde
drogas. Estudios realizados con estos animales KO
demostraronlaimportanciadelasdiferentesisoformasde
esta glicoprotena en la farmacocintica y toxicidad de
varios frmacos como la invermectina, vinblastina,
dexametasona, digoxina, ciclosporina A, loperamida y
rodamina(16).

ANIMALESKNOCKIN

Estatecnologasebasaenlainsercinoreemplazodeuna
secuencia de DNA en un sitio definido del genoma del
animal, utilizando, al igual que en la tecnologa para
generarKO,larecombinacinhomologaenclulasmES.La
humanizacin de ratones mediante la tecnologa KI
(reemplazodeungendelratnporsuortlogohumano),
sehaconvertidoenunaherramientamuyimportantepara
evaluar in vivo la eficacia, perfiles farmacocinticos y
toxicolgicos de innumerables drogas. Por ejemplo, el
ratn KI humanizado para el receptor de quimioquina 1
(CCR1) se us para estudiar el efecto de antagonistas de
CCR1 especficos de humano sobre la modulacin de la
respuestainflamatoria(17).Enestemodeloanimal,elgen
Ccr1delratnfuereemplazadocompletamenteporelgen
CCR1 humano, sin embargo no siempre es necesario el
reemplazo completo del gen para lograr la
humanizacin. Un ejemplo deesto ltimo, es el estudio
realizado en un ratn KI para el receptor de
trombopoyetina (TPOr). En este KI humanizado se
reemplaz solamente los exones 8, 9 y 10, ya que esta
regin era la responsable de la especificidad de los
agonistas que se quera investigar. Los agonistas, con
especificidadporelTPOrhumano,fueroninyectadosenlos
ratones KI humanizados para TPOr y demostraron un
efectodosisrespuestarespectoalnmerodeplaquetas.

La tecnologa KI tambin se utiliza para introducir

mutaciones puntuales y modelar enfermedades humanas
enelratn,inactivarregionesesencialesdeunaprotena,
como el dominio cataltico de una quinasa, o el sitio de
unin a drogas de la protena blanco. Un estudio que
demuestra esto ltimo es el ratn KI 21 R217A, en el
cual se modific una arginina por una alanina en la
ubicacin 217 de la subunidad 21 del canal de calcio
dependiente de voltaje. Con este KI se demostr que el
mecanismodeaccindelefectoanalgsicodegabapentina
y pregabalina es mediado por una interaccin especfica
con el aminocido arginina 217 de la subunidad 21 del
canal de calcio (18). Con respecto a la utilizacin de la
tecnologaKIparamodelarunaenfermedadhumanaenel
ratn, en teora cualquier enfermedad humana causada
porunamutacinesposibleestudiarlaenunratnKIenel
que se ha mutado su ortlogo humano. Es el caso por
ejemplo, del ratn KI con repeticiones CAG en el gen de

Huntingtina,elcualremedalaenfermedaddeHuntington
(19).

Figura3.

Obtencin de ratones KO hepatocitoespecfico utilizando el sistema Cre

LoxP. Esta estrategia experimental requiere de dos tipos de ratones. El
primero(izquierda)esunratntransgnicoqueexpresaelgendelaenzima
recombinasa CRE bajo el control del promotor de la Albumina (Alb), cuya
expresinseproduceexclusivamenteenloshepatocitosdelratn.Elratn
deladerechatieneelgenquesedeseaeliminar(genX)flanqueadopordos
stios LoxP. El cruce de estos dos animales da origen a ratones KO para el
gen de inters especficamente en las clulas que expresan la enzima
recombinasaCRE.Enesteejemplo,loshepatocitossufrenlaeliminacindel
genXmedianterecombinacindelossitiosLoxP(ilustradoenelesquema
con una tijera). El resto de las clulas del ratn, que no expresan CRE,
tienenelgendeintersflanqueadoporlossitiosLoxP,locualnoafectala
transcripcindelgenotraduccinribosomaldesumRNA.

En esta revisin bibliogrfica se ha descrito de forma

general los diferentes tipos de modelos de animales
modificadosgenticamente,ejemplificandodeentremiles
deejemplosexistentes,algunasaplicacionesespecficasde
estos animales en investigaciones farmacolgicas. El gran
avance del ltimo tiempo en las tecnologas para
manipular el genoma de ratn, permiten al cientfico
innovar en las modificaciones genmicas casi sin
limitaciones. Por lo tanto, para determinar el tipo de
modeloAMGqueseratilgenerar,esrelevanteentender
cules son las necesidades del proyecto cientfico del que
separticipa.Porotraparte,aquelloscientficosinteresados
en adquirir modelos AMG pueden dirigirse a diferentes
empresas biotecnolgicas u organizaciones sin fines de
lucro que ofrecen sus servicios y productos a travs de
pginasweb.TheJacksonLaboratory(http://www.jax.org)
es una organizacin independiente y sin fines de lucro, la
cual est enfocada principalmente en la investigacin
genticademamferosconlafinalidaddeayudaramejorar
lasaludhumana.Porotrolado,elConsorcioInternacional
de Ratn KnockOut (IKMC), creado el ao 2007, y que
asocia tres de los consorcios ms importantes del mundo
en el mbito de los ratones KO, tiene como principal
aspiracin mutar todos los genes codificantes en el ratn
(alrededorde30.000)medianteingenieragenticadeuna
lneacelularestandarizadademESprovenientederatones

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C57BL/6.
El
sitio
web
del
IKMC
(http://www.knockoutmouse.org)permite,noslobuscar
y comprar un determinado ratn KO, sino que tambin
conocerelestadoenqueseencuentralageneracindeun
ratnKOparaungenparticular.

Finalmente es importante considerar que los modelos de

AMG, si bien son herramientas nicas y valiosas para las
investigacionesfarmacolgicasbsicasypreclnicas,tienen
limitacionesquenodebieransubestimarseunavezquese
obtienen los resultados de la investigacin. La insercin o
eliminacin de genes mediante las tcnicas de ingeniera
gentica, podra conducir a cambios no deseados en la
expresin de otros genes en el AMG y de esta forma
enmascararoexagerarelfenotipodelanimal.Adems,no
debemos olvidar que se trata de modelos animales que,
aunquecompartenunamuyaltahomologagenticaconel
ser humano, fenotpica y mdicamente hablando son
completamente diferentes. Por lo tanto, no debemos
esperarqueunmodeloanimalsimuledemaneraperfecta
una enfermedad, un proceso fisiolgico o el
comportamientodeunfrmacoenelhumano.

En el futuro se espera que la tecnologa avance hacia la

mejora en la humanizacin de los AMG, de tal forma que
losmodelosexperimentalesseancadavezmssimilaresa
los humanos. Con el mismo rumbo, las tcnicas de
ingeniera gentica en animales pretenden hacer viable
econmica y tcnicamente eficiente la generacin de
modelosfenotpicamentemsparecidosalhumano,como
eslamanipulacingenticaenprimatesnohumanos.

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