UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA

CENTRO TECNOLGICO
DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA QUMICA E
ENGENHARIA DE ALIMENTOS
PS-GRADUAO EM ENGENHARIA QUMICA

ESTUDO DA REMOO BIOLGICA DE NITROGNIO A

PARTIR DE LODO NITRIFICANTE CULTIVADO EM MEIO
AUTOTRFICO SOB CONDIES ANXICAS

DIRLEI DIEDRICH KIELING

ORIENTADOR: Prof. PhD. Hugo Moreira Soares

CO-ORIENTADORA: Prof. Dr. Valria Reginatto Spiller

Florianpolis,
Fevereiro de 2004

ii
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA
DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA QUMICA E
ENGENHARIA DE ALIMENTOS
PS-GRADUAO EM ENGENHARIA QUMICA

ESTUDO DA REMOO BIOLGICA DE NITROGNIO A

PARTIR DE LODO NITRIFICANTE CULTIVADO EM MEIO
AUTOTRFICO SOB CONDIES ANXICAS

DIRLEI DIEDRICH KIELING

Dissertao apresentada Universidade

Federal de Santa Catarina, como parte dos
requisitos para obteno do ttulo de Mestre em
Engenharia Qumica, rea de Concentrao:
Desenvolvimento de Processos Qumicos e
Biotecnolgicos.

ORIENTADOR: Prof. PhD. Hugo Moreira Soares

CO-ORIENTADORA: Prof. Dr. Valria Reginatto Spiller

Florianpolis,
Fevereiro de 2004

iii

Felizes somos ns que colocamos alto o

sonho de nossas vidas, porque Deus trabalha
acima de nossos sonhos.
Paulo Coelho

iv
AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Hugo Moreira Soares, pela orientao, amizade e apoio no
desenvolvimento da dissertao.
A Prof. Valria Reginatto, pela orientao e empenho na realizao deste
trabalho, pela amizade e ateno a mim dedicada.
Ao Prof. Willibaldo Schmidell, por partilhar seus conhecimentos e lies de vida.
A Prof. Regina Vasconcellos Antnio, pela amizade e pacincia e por
disponibilizar seu laboratrio para o procedimento de fixao das amostras para FISH.
Aos pesquisadores do Uruguai, Lucia Muxi, Javier e Cludia, participantes do
projeto CNPq Pr-Sul, por viabilizarem as anlises FISH.
A Heike Hoffmann, por disponibilizar seu laboratrio para a anlise de
microscopia.
Aos queridos amigos, com os quais partilhei duras horas de estudo, descontrados
churrascos e festas, e muitos desabafos, Cristiane, Alexsandra, Marcelo, Dbora, Isaura,
Luciani, Rafael, Keli e Jaqueline.
Especialmente a Cristiane, pela amizade, e a Mariana, pelo carinho e por cuidar
muito bem de seus afilhados em minha ausncia.
A Sandra e ao Rodrigo, pelo auxlio no trabalho atravs da realizao das anlises
de NMP.
Aos amigos e colegas de trabalho do Laboratrio de Tratamento de Efluentes,
Cristiane, Mariana, Franciny, Sandra, Fabrcio, Alex, Angelina, Joo, Estela, Camila,
Mnica e Rodrigo.
Aos professores e funcionrios do departamento de Engenharia Qumica da
UFSC, pelo apoio no trabalho e contribuio no aprendizado.

v
secretaria da Ps-graduao, especialmente ao Edevilson, que se mostrou
sempre prestativo, atencioso e paciente.
A minha famlia, em especial minha me e irms, que mesmo distantes se fizeram
presentes atravs do carinho, fora e incentivo.
Ao Gilberto, meu namorado, por se fazer presente a todo momento, com gestos
de

carinho,

incentivo

pacincia,

reanimando-me

diante

das

dificuldades

compartilhando as novas conquistas.

Aos anjos em minha vida (Cirilo, meu pai, e Igor Mateus, meu sobrinho) e s
bnos que eles tm me presenteado.
A Deus, por iluminar meu caminho e abrir portas que possibilitam meu
crescimento profissional e pessoal.
Ao CNPq, pela concesso da bolsa de mestrado.

NDICE
LISTA DE TABELAS............................................................................................................... iii
LISTA DE FIGURAS...............................................................................................................iv
LISTA DE SMBOLOS ............................................................................................................vi
RESUMO ...............................................................................................................................vii
ABSTRACT........................................................................................................................... viii
1. INTRODUO.................................................................................................................... 1
2. OBJETIVOS........................................................................................................................ 4
2.1 Objetivo Geral............................................................................................................... 4
2.2 Objetivos especficos.................................................................................................... 4
3. REVISO BIBLIOGRFICA ............................................................................................... 5
3.1 Metabolismo Microbiano do Nitrognio ........................................................................ 5
3.2 Importncia da Remoo Biolgica de Nitrognio........................................................ 9
3.3 Processo de Nitrificao e Desnitrificao ................................................................. 12
3.3.1 Sistema de Lodos Ativados ................................................................................ 15
3.4 Novos Processos de Remoo Biolgica de Nitrognio ............................................ 17
3.4.1 Desnitrificao Aerbia ....................................................................................... 17
3.4.2 Anammox............................................................................................................ 19
3.4.3 Processos Envolvendo Nitrificao Parcial e Oxidao Anaerbia do Amnio.. 24
3.4.2.1 SHARON.................................................................................................... 25
3.4.2.2 OLAND....................................................................................................... 26
3.4.2.3 CANON ...................................................................................................... 27
3.4.2.4 Desamonificao em Sistemas de Biofilmes ............................................. 29
3.4.4 Desnitrificao por Bactrias Nitrificantes .......................................................... 30
3.5 Tcnicas Empregadas para o Estudo de Populaes Microbianas ........................... 32
3.5.1 Nmero Mais Provvel........................................................................................ 32
3.5.2 Fluorescent In Situ Hybridisation ........................................................................ 33
4. METODOLOGIA ............................................................................................................... 35
4.1 Caracterizao do Inculo .......................................................................................... 35
4.1.1 Determinao dos Slidos Suspensos Totais .................................................... 36
4.1.2 Determinao da Atividade Nitrificante............................................................... 36
4.1.3 Determinao do Nmero Mais Provvel ........................................................... 38
4.1.3.1. Nmero mais Provvel de Nitrosomonas ................................................. 39
4.1.3.2. Nmero Mais Provvel de Nitrobacter ...................................................... 40
4.1.4 Anlise FISH ....................................................................................................... 41
4.1.4.1 Fixao com paraformaldedo ................................................................... 41
4.2 Montagem e Operao dos Reatores......................................................................... 43
4.3 Anlises para o Acompanhamento dos Reatores ...................................................... 47
4.3.1 Determinao de Amnio ................................................................................... 48
4.3.2 Determinao de Nitrito ...................................................................................... 48
4.3.3 Determinao de Nitrato ..................................................................................... 49

ii
4.3.4 Determinao de DQO ....................................................................................... 49
4.3.5 Determinao da alcalinidade............................................................................. 50
4.3.6 Determinao dos Slidos em Suspenso Totais e Volteis ............................. 50
4.3.7 Nmero Mais Provvel........................................................................................ 51
4.3.8 Fluorescent In Situ Hybridisation ........................................................................ 51
4.4 Microscopia................................................................................................................. 51
4.5 Cintica de Consumo de Substrato ............................................................................ 52
5. RESULTADOS E DISCUSSO........................................................................................ 53
5.1 Caracterizao do Inculo .......................................................................................... 53
5.1.1 Determinao da Atividade Nitrificante.............................................................. 53
5.1.2 NMP e FISH........................................................................................................ 54
5.2 Acompanhamento dos Reatores ................................................................................ 55
5.2.1 Concentrao Celular e Microscopia .................................................................. 55
5.2.2 Acompanhamento das Formas Nitrogenadas .................................................... 60
5.2.3 Acompanhamento da DQO................................................................................. 70
5.2.4 Acompanhamento da Alcalinidade ..................................................................... 71
5.2.3 Quantificao e Caracterizao das Populaes ............................................... 74
5.2.4 Cintica de Consumo do Substrato .................................................................... 82
6. CONCLUSES................................................................................................................. 86
7. SUGESTES PARA TRABALHOS FUTUROS ............................................................... 87
8. REFERNCIAS BIBLIOGRFIAS.................................................................................... 88
ANEXOS E APNDICES.......................................................................................................95

iii
LISTA DE TABELAS
Tabela 3.1: Transformaes biolgicas do nitrognio ............................................................ 8
Tabela 4.1: Composio do meio nitrificante........................................................................ 35
Tabela 4.2: Composio da soluo de micronutrientes...................................................... 35
Tabela 4.3: Composio do meio anammox ........................................................................ 44
Tabela 4.4: Composio das solues de micronutrientes .................................................. 44
Tabela 4.5: Freqncia analtica para acompanhamento dos reatores RI e RII .................. 47
Tabela 5.1: Resultados de NMP e FISH para o lodo nitrificante adaptado .......................... 54
Tabela 5.2: Resultados da determinao de SST durante acompanhamento dos reatores. 57
Tabela 5.3: Dados comparativos das anlises de slidos em suspenso ........................... 60
Tabela 5.4: Nmero mais provvel de Nitrosomonas e Nitrobacter em RI .......................... 75
Tabela 5.5: Nmero mais provvel de Nitrosomonas e Nitrobacter em RII ......................... 75
Tabela 5.6: Dados comparativos de NMP e FISH obtidos para RI ...................................... 79
Tabela 5.7: Dados comparativos de NMP e FISH obtidos para RII ..................................... 79
Tabela 5.8: Valores de velocidades de consumo de amnio e nitrito para RI...................... 84
Tabela 5.9: Valores de velocidades de consumo de amnio e nitrito para RII..................... 84

iv
LISTA DE FIGURAS
Figura 3.2: Curva de equilbrio entre on amnio e amnia em funo do pH ..................... 10
Figura 3.3: Eficincia terica em funo da razo de reciclo para o sistema utilizado
no experimento ................................................................................................. 11
Figura 3.4: Remoo de nitrognio pelo sistema de lodos ativados .................................... 16
Figura 3.5: Possvel rota metablica para oxidao anaerbia do amnio .......................... 21
Figura 3.6: Oxidao anaerbia do amnio por Planctomyces a nvel celular..................... 23
Figura 3.7: Efeito da temperatura na mxima velocidade de crescimento de bactrias
amnio e nitrito oxidantes ................................................................................... 25
Figura 3.8: Processos de nitrificao parcial e desamonificao em biofilme...................... 29
Figura 3.9: Representao esquemtica da tcnica empregada para anlise FISH ........... 33
Figura 4.1: Sistema operacional para o estudo da remoo biolgica de nitrognio ........... 46
Figura 5.1: Velocidade especfica de consumo de substrato em funo da concentrao de
amnio e ajuste pelo modelo de Andrews .......................................................... 53
Figura 5.2: Variao da concentrao de SST durante a lavagem do reator RI .................. 55
Figura 5.3: Microscopia tica mostrando a estrutura dos flocos do reator RI com aumento de
100X ................................................................................................................... 58
Figura 5.4: Microscopia tica mostrando a estrutura do floco do reator RI com aumento de
400X.................................................................................................................... 58
Figura 5.5: Microscopia tica mostrando a estrutura dos flocos do reator RII com aumento
de 100X............................................................................................................... 59
Figura 5.6: Microscopia tica mostrando a estrutura do floco do reator RII com aumento de
400X.................................................................................................................... 59
Figura 5.7: Concentrao das formas nitrogenadas na entrada (E) e sada (S) do reator
RI ....................................................................................................................... 61

v
Figura 5.8: Concentrao das formas nitrogenadas na entrada (E) e sada (S) do reator
RII ...................................................................................................................... 61
Figura 5.9: Relaes molares de consumo de substrato e formao de produto

no reator

RI em comparao a estequiometria do processo anammox............................. 64

Figura 5.10: Relaes molares de consumo de substrato e formao de produto no reator
RII em comparao a estequiometria do processo anammox............................ 65
Figura 5.11: Eficincia de remoo de nitrognio com relao a carga de entrada e sada do
reator RI .............................................................................................................. 68
Figura 5.12: Eficincia de remoo de nitrognio com relao a carga de entrada e sada
do reator RII ........................................................................................................ 68
Figura 5.13: Valores mdios da remoo especfica de nitrognio a cada intervalo

de

75dias ................................................................................................................. 70
Figura 5.14: Valores de DQO em RI (a) e RII (b) durante o perodo de companhamento. .. 70
Figura 5.15: Valores de alcalinidade de entrada (E) e sada (S) do reator RI...................... 72
Figura 5.16: Valores de alcalinidade de entrada (E) e sada (S) do reator RII..................... 72
Figura 5.17: Relao molar de consumo de carbono e amnio ........................................... 73
Figura 5.18: Desenvolvimento das populaes de Nitrosomonas e Nitrobacter durante o
acompanhamento do reator RI ........................................................................... 77
Figura 5.19: Desenvolvimento das populaes de Nitrosomonas e Nitrobacter durante o
acompanhamento do reator RII .......................................................................... 77
Figura 5.20: Resultados experimentais do ensaio cintico para o reator RI ........................ 82
Figura 5.21: Resultados experimentais do ensaio cintico para o reator RII ....................... 82

vi
LISTA DE SMBOLOS
G0

variao da energia livre de Gibbs

velocidade especfica de crescimento

mx

velocidade especfica mxima de crescimento

CS

concentrao de saturao

KS

constante de afinidade pelo substrato

QO2

velocidade especfica de consumo de oxignio

QO2X

velocidade de consumo de oxignio

velocidade de consumo de substrato

concentrao de substrato

ADE

atividade desnitrificante especfica

ATP

adenosina trifosfato

Anammox

Anaerobic ammonium oxidation

CANON

Completely Autotrophic Nitrogen removal Over Nitrito

DBO

demanda bioqumica de oxignio

DNA

cido desoxirribonuclico

DQO

demanda qumica de oxignio

FISH

Fluorescent In Situ Hybridisation

NADH

hidrognio dinucleotdeo adenina-nicotinamida

NMP

nmero mais provvel

OD

oxignio dissolvido

OLAND

Oxygen Limited Autotrophic Nitrification Denitrification

PCR

polymerase chain reaction

RBC

Rotating Biological Contactor

RDNA

Reduo Desassimilatria do Nitrato a Amnio

RDS

Reduo Desassimilatria do Sulfato

RNA

cido ribonucleico

rRNA

RNA ribossmico

SBR

Sequencing Batch Reactor

SHARON

Single reactor system for High Ammonium Removal Over Nitrito

SSV

slidos suspensos volteis

SST

slidos suspensos totais

ST

slidos totais

SV

slidos volteis

TRH

tempo de reteno hidrulico

vii
RESUMO

O descarte de efluentes contendo concentraes elevadas de nitrognio, pode

comprometer o equilbrio ambiental, causando prejuzos para a flora e a fauna aqutica.
A remoo deste poluente por processo de nitrificao e desnitrificao, requer eficiente
aerao e fonte de carbono orgnico, alm da eficincia de remoo ser funo da razo
de reciclo. A aplicao de novos processos biotecnolgicos, nos quais amnio
convertido em nitrognio gasoso sob condies anxicas, com nitrito como aceptor de
eltrons, permite uma economia de energia para a aerao, alm de dispensar fonte de
carbono orgnico. Dentre estes novos processos, a oxidao anaerbica do on amnio
por bactrias da famlia Planctomycetae (Anammox) e a desnitrificao por bactrias
nitrificantes (Nitrosomonas) tm sido amplamente citados. Neste contexto, o trabalho teve
por objetivo estudar a remoo biolgica de nitrognio em reatores inoculados com lodo
nitrificante cultivado em meio autotrfico, sob condies anxicas, bem como
acompanhar o desenvolvimento das populaes microbianas. O lodo nitrificante
proveniente de um sistema de lodos ativados para tratamento de esgoto domstico foi
adaptado em meio autotrfico, sob aerao, por 130 dias. Aps este perodo, este lodo
foi inoculado em dois reatores RBS (Reatores Sequencial em Batelada): RI e RII. O
reator RI, aps ser submetido a uma lavagem celular inicial, e o reator RII foram
operados com reteno de clulas, sendo aplicado um TRH de 5dias. Ambos os reatores
foram alimentados com meio autotrfico contendo amnio e nitrito mantidos sob
condies anxicas, a 35C e pH em torno de 7,5 e acompanhados por um perodo de
225dias. A remoo biolgica de nitrognio no perodo de estabilidade (150 a 225dias) foi
de 30-40% para RI e em torno de 20% para RII. Apesar do RI possuir menor
concentrao celular, apresentou uma eficincia de remoo especfica mdia de
25mgN.(gSST)-1.d-1 a partir de 150dias, muito superior ao RII (5mgN.gSST-1.d-1) no
mesmo perodo. A lavagem inicial de clulas pode ter favorecido o desempenho do reator
RI, no qual desenvolveu-se uma populao mais especializada do que em RII,
justificando sua maior eficincia de remoo de nitrognio. Tanto o NMP quanto a anlise
por FISH revelaram um enriquecimento de Nitrosomonas em relao as Nitrobacter nos
reatores RI e RII, ao longo do perodo de acompanhamento, comparado ao inculo. A
anlise FISH identificou a presena de bactrias anammox no reator RI, submetido a
lavagem celular, evidenciando um enriquecimento do lodo em biomassa anaerbia
amnio-oxidante a partir do lodo nitrificante de um sistema de lodos ativados.

viii
ABSTRACT

Effluent discharge with high nitrogen content can damage the environmental equilibrium
and cause problems to aquatics organisms. This polutant removal by nitrification and
denitrification process demands efficient aeration and biodegradable carbon source. In
addition, nitrogen removal efficiency is a function of the recycle ratio. The application of
new biological processes, where ammonium is converted to nitrogen gas under anoxic
conditions using nitrite as electron acceptor, promotes an energy economy used for
aeration and no necessity of external carbon source addition. Among the new processes
the anaerobic ammonium oxidation by Planctomyces (Anammox) and the denitrification
by nitrifiers (Nitrosomonas) have been mostly cited. In this context, the aim of this work
was to investigate the biological nitrogen removal in reactors seeded with a nitrificant
sludge maintained under anoxic and autotrophic conditions as well as the development of
microbial populations monitoring. Sludge from an activated sludge system treating
domestic wastewater was adapted to an autotrophic medium with constant aeration during
130 days. After this period the sludge was seeded in two ASBR reactors (anaerobic
sequential batch reactor), RI and RII. The reactor RI, after a cell washout at the beginning
of the process, and reactor RII were operated with cells retention. Both reactors were fed
with autotrophic medium containing ammonium and nitrite, maintained in anoxic
conditions and they were operated with 5 days HRT at 35C and pH around 7,5. The
reactors were monitored for 225 days. Nitrogen elimination in the steady-state, (150 225
operation days) was 30 - 40% for reactor RI and about 20% for RII. Besides the RI low
biomass

concentration
-1

-1

its

specific

nitrogen

removal

efficiency

average

was
-1

25mgN.(gSST) .d after 150 days, higher than the one obtained in RII (5mgN.gSST .d-1)
in the same period. The initial cells washout could be favored the RI reactor performance,
where developed a more specialized microbial population than in the reactor RII,
responsible for the higher nitrogen elimination. Methods like MPN and FISH revealed an
enrichment of Nitrosomonas regarding Nitrobacter in reactors RI and RII, when compared
with the inoculum. FISH analysis identified the anammox bacteria in the reactor RI (with
initial cell washout) showing an enrichment of anaerobic ammonium oxidizers from a
nitrifying sludge originated in an activated sludge system treating domestic wastewater.

1
1. INTRODUO

O aporte de nitrognio pelo organismo humano provm da ingesto de protenas,

sendo o nitrognio excedente do metabolismo excretado na forma de uria. Outras fontes
de nitrognio orgnico so os dejetos de animais e efluentes industriais ricos em
protena. O nitrognio orgnico presente no esgoto, hidrolisado liberando on amnio.
Devido aos riscos inerentes ao lanamento de efluentes com elevada concentrao deste
componente, a legislao brasileira limita a concentrao de amnio em 5mg N-NH4+.L-1,
para efluentes de qualquer natureza.
Dentre as implicaes ecolgicas da insero de elevadas cargas de amnio no
ambiente est o consumo do oxignio dissolvido no meio, devido a nitrificao, uma vez
que para oxidar 1mg de NH4+ so necessrios cerca de 4,3mg de O2, podendo ocasionar
a morte dos organismos aquticos. Alm disso, o nitrognio residual descartado nos
cursos dgua estimula a atividade autotrfica, ocasionando a eutrofizao devido a
produo de uma grande quantidade de biomassa na forma de algas. Com relao ao
nitrato, formado a partir da reao de nitrificao no prprio ambiente, os padres de
potabilidade do Ministrio da Sade (portaria 1469/2000) sugerem nveis abaixo de
10mgN-NO3-.L-1 para gua potvel, pois, embora no cause danos diretos sade, o
nitrato se reduz facilmente a nitrito no trato digestivo, tornando-se nocivo devido ao seu
efeito cancergeno.
O tratamento de efluentes por processos de nitrificao e desnitrificao, envolve
uma primeira fase aerbia de nitrificao, na qual bactrias nitrificantes oxidam amnio a
nitrito e nitrato. Num segundo passo, o nitrato formado na primeira etapa convertido em
nitrognio gasoso, por bactrias quimorganotrficas que requerem uma fonte de carbono
para a desnitrificao. Assim, h necessidade de um eficiente sistema de aerao, para
adequado desenvolvimento das nitrificantes, e a adio de um substrato apropriado pode
se fazer necessria para completar a desnitrificao. A eficincia de remoo de
nitrognio do sistema depende da razo de reciclo empregada no processo. Ainda,
devido a elevada quantidade de biomassa gerada, h uma preocupao com o
tratamento e descarte do lodo excedente.
Tendo em vista a importncia da remoo de nitrognio, frente aos rigorosos
padres ambientais, bem como as desvantagens oferecidas pelos processos de

2
nitrificao e desnitrificao, as pesquisas mais recentes em tratamento biolgico de
efluentes esto voltadas para melhorar a eficincia da remoo de nitrognio e reduzir
custos, otimizando as estratgias de tratamento usuais ou buscando implementar novos
processos com microrganismos capazes de converter nitrognio na forma amoniacal e
nitrito em nitrognio gasoso. O processo ou sistema de tratamento biolgico a ser
escolhido estar intrinsecamente relacionado ao tipo especfico de microrganismo que se
pretende selecionar, uma vez que a oxidao dos compostos nitrogenados pode ocorrer
por diferentes vias do metabolismo bacteriano, possibilitando o desenvolvimento de
processos aerbios e anaerbios.
At a dcada de 90, apenas processos aerbios vinham sendo discutidos para
oxidao do amnio. No entanto, elevadas perdas de nitrognio foram observadas em
plantas de tratamento de efluentes, bem como em reatores com baixa concentrao de
oxignio dissolvido e baixa quantidade de matria orgnica presente no efluente,
indicando que um processo de oxidao anaerbia do amnio poderia estar ocorrendo.
Estudos posteriores demonstraram que em um novo processo biolgico autotrfico,
amnio poderia ser convertido em nitrognio gasoso sob condies anxicas com nitrito
como aceptor de eltrons, o qual foi nomeado Anaerobic Ammonium Oxidation
(Anammox).
As vantagens do processo Anammox sobre a tradicional combinao de
nitrificao e desnitrificao para tratamento de efluentes so a economia da energia que
seria gasta com aerao e nenhum requerimento de fonte externa de carbono orgnico,
uma vez que o processo autotrfico. Entretanto, o start-up do processo poderia ser
muito prolongado pela relativamente baixa velocidade de crescimento das bactrias
Anammox. Por outro lado, esta caracterstica tem como vantagem a pequena quantidade
de lodo gerada.
Tendo em vista que os organismos anammox identificados at o momento
(Candidatus Brocadia anammoxidans e Kuenenia stuttgartiensis) tm sido extremamente
difceis de cultivar em cultura pura, torna-se de grande importncia identificar outras
bactrias capazes de oxidar amnio em anaerobiose, de modo que o processo possa ser
amplamente difundido em plantas de tratamento de efluentes. Bactrias amnio
oxidantes do gnero Nitrosomonas tm despertado interesse, pois so capazes de
nitrificao e simultnea desnitrificao a baixas concentraes de oxignio, com amnio
servindo como doador e nitrito como aceptor de eltrons.

3
De maneira geral, com o emprego de processos anaerbios ou anxicos, alm da
economia com oxignio, tem-se a vantagem de que a quantidade de biomassa gerada
muito menor do que em aerobiose, devido baixa velocidade de crescimento,
dispensando a etapa de tratamento do excesso de lodo. Em face disso, o
desenvolvimento adequado de um sistema para tratamento de efluentes com baixa
relao C/N, fazendo uso de microrganismos capazes de oxidar amnio a nitrognio
gasoso sob condies anxicas, promete ser uma alternativa promissora remoo de
nitrognio por processos de nitrificao e desnitrificao, oferecendo melhor eficincia
com menores custos.
Neste contexto, o foco de estudo deste trabalho a remoo biolgica de
nitrognio de efluente sinttico pelo processo de oxidao anaerbia do amnio,
englobando

atividade

autotrfica

de

bactrias

do

gnero

Nitrosomonas

e,

possivelmente, bactrias anammox, resultante do cultivo de um lodo nitrificante de um

sistema de lodos ativados da Companhia de Saneamento do Estado de Santa Catarina
(CASAN), em condies especficas para o desenvolvimento da reao de interesse.

4
2. OBJETIVOS

2.1 Objetivo Geral

Estudar a capacidade de remoo de nitrognio de um lodo nitrtificante
alimentado com meio autotrfico contendo amnio e nitrito mantido sob condies
anxicas.

2.2 Objetivos especficos

Testar duas estratgias de partida de reatores do tipo Reator Sequencial em
Batelada (RBS) para enriquecimento da cultura em oxidadoras de amnio, utilizando
lavagem celular inicial e reteno total de clulas.
Verificar o desempenho dos reatores em funo da remoo de nitrognio.
Avaliar o enriquecimento de um lodo nitrificante em microrganismos capazes de
realizar a oxidao anaerbia do on amnio, utilizando as tcnicas de determinao do
Nmero Mais Provvel (NMP) e Fluorescent In Situ Hybridisation (FISH).
Determinar a cintica de consumo de substrato do lodo enriquecido.

5
3. REVISO BIBLIOGRFICA

3.1 Metabolismo Microbiano do Nitrognio

A maior parte do nitrognio global existe sob a forma de nitrognio gasoso, no

prontamente disponvel para a biota terrestre. O suprimento, bem como a ciclagem
ambiental das formas disponveis deste elemento, so largamente dependentes da
decomposio biolgica do nitrognio, presente nos componentes acumulados dentro da
biota (MCELDOWNEY et al *., apud PRATES, 1997).
As vias metablicas envolvidas no ciclo do nitrognio inorgnico tm sido
conduzidas tanto por microrganismos amplamente descritos na literatura, bem como por
alguns ainda pouco conhecidos. Os possveis caminhos para obteno de energia e as
enzimas envolvidas, esto relacionadas com a adaptao e sobrevivncia destes
microrganismos sob uma variedade de condies ambientais (YE & THOMAS, 2001).
Na

Figura

3.1

esto

representadas

as transformaes dos compostos

nitrogenados no ciclo do nitrognio, resultantes do metabolismo microbiano nos

processos de fixao, nitrificao, desnitrificao, oxidao anaerbia do amnio via
nitrito e reduo desassimilatria do nitrato.

N2

N 2O
Reduodissimilatria
do xido ntrico

Fixao do
nitrognio

NH 2OH

Oxidao
da amnia

NH 4+

biomassa

Oxidao
do nitrito

NO
Reduo dissimilatria do nitrito

NO 2-

NO 3Reduo
do nitrato

Figura 3.1: Representao esquemtica das reaes envolvidas no ciclo

do nitrognio (Fonte: YE & THOMAS, 2001).
*

MCELDOWNEY, S.; HARDMAN, D. J.; WAITE,S. Pollution ecology and biotreatmente. London,
Longman Scientif & Technical. 1993.

6
Na biosfera, o nitrognio encontra-se, principalmente como um gs altamente
estvel, que pode ser utilizado pelas bactrias fixadoras de nitrognio, tais como
Rhizobium, Azobacter e Cianobactrias. O processo metablico de fixao biolgica de
nitrognio molecular atmosfrico, que corresponde a uma reduo do nitrognio gasoso a
on amnio, bastante importante para as plantas e animais, uma vez que fornece um
composto nitrogenado assimilvel pelos seres vivos (VIEIRA et al., 1991; BROCK, 1994).
A fixao bacteriana do nitrognio um processo metablico que necessita de
energia para quebrar a ligao do nitrognio (NN). Tal processo pode tambm ocorrer
quimicamente na atmosfera, via descargas eltricas (relmpagos), atravs da fixao
industrial (indstria de fertilizantes) ou por processos de queima de combustveis fsseis.
Contudo, cerca de 85% da fixao de nitrognio na Terra so de origem biolgica
(BROCK, 1994).
O on amnio produzido pela fixao bacteriana do nitrognio ou pela
amonificao de compostos nitrogenados orgnicos pode ser assimilado para sntese
celular ou oxidado a nitrato pela atividade de bactrias nitrificantes abundantes no solo.
O nitrato formado convertido, atravs do processo de desnitrificao, a xido nitroso e
nitrognio gasoso, que liberado para a atmosfera (BROCK, 1994; VIEIRA et al., 1991).
O nitrato pode, ainda, ser assimilado (reduo assimilatria do nitrato) ou
desassimilado, atravs da reduo desassimilatria do nitrato a on amnio.
A reduo assimilatria do nitrato leva formao do on amnio, que ser
utilizado para a biossntese celular. Este processo ocorre sob condies aerbias e
anaerbias, no resultando em rendimento energtico, e o produto, on amnio, no
excretado para o meio. A quantidade de nitrognio reduzido proporcional aos
requerimentos celulares para a produo de biomassa. Quando existe grande
concentrao do on amnio, o processo inibido ou torna-se insignificante (TIEDJE,
1988).
A reduo desassimilatria do nitrato a on amnio (RDNA) ocorre sob condies
de oxignio limitante e serve para dissipar o excesso de potencial redutor ou gerar
amnia para assimilao e crescimento celular anaerbio (YE & THOMAS, 2001). Esse
processo regulado pelo oxignio, mas no afetado pelo on amnio e o nitrognio
reduzido no utilizado pela clula. Este processo tem sido verificado em bactrias de
metabolismo fermentativo (PRATES, 1997).

7
A primeira reao da via da RDNA a reduo do nitrato a nitrito, denominada
respirao do nitrato. Esse passo acoplado produo de energia na maioria dos
organismos. Apesar de necessrio, no passo limitante. Alm do mais, o nitrito formado
poderia prontamente ser convertido em gs pelas desnitrificantes presentes na
comunidade. Portanto, o passo crtico a converso do nitrito em on amnio. A RDNA
seria benfica para a clula bacteriana, pois constituiria um mecanismo de retirada do
nitrito acumulado no meio, uma reserva de eltrons que permitiria a reoxidao do NADH,
e a produo de energia atravs do transporte de eltrons por fosforilao oxidativa,
como ocorre na reduo do nitrito pelas desnitrificantes. Dentre os benefcios citados, o
mais postulado o da reserva de eltrons (TIEDJE, 1988).
Outro processo possvel de ocorrer a reduo desassimilatria do sulfato (RDS),
citada por POLANCO et al. (2001) como uma alternativa para remoo simultnea de
nitrognio e enxofre, sob condies anaerbias. Segundo estes autores, bactrias
redutoras de sulfato usam sulfato como aceptor final de eltrons para a degradao de
componentes orgnicos e hidrognio. A rota de degradao de nitrognio e enxofre pode
interagir a vrios nveis. Sulfito pode ser o doador de eltrons, sendo reoxidado a S0 ou
sulfato por Thiobacillus denitrificans usando nitrato como aceptor de eltrons. Apesar de
a RDS ser considerada uma rota de desnitrificao alternativa, h uma converso de
nitrato a amnio. Nenhuma referncia sobre o papel do sulfato como aceptor de eltrons
produzidos na oxidao do amnio a nitrito ou a nitrognio gasoso tem sido encontrada.
Em relao ao ciclo do nitrognio, a reao mais recentemente descoberta a
oxidao anaerbia do on amnio, via nitrito, possibilidade encontrada pelo metabolismo
microbiano para converter amnio em nitrognio gasoso na ausncia de oxignio e de
matria orgnica. As atividades microbianas de oxidao anaerbia do amnio e
desnitrificao so os mecanismos majoritrios na converso de nitrognio combinado a
nitrognio gasoso, completando o ciclo do nitrognio (YE & THOMAS, 2001).
As reaes das quais participam as espcies inorgnicas de nitrognio envolvem
um sistema enzimtico bastante variado, que em algumas vias bem elucidado, embora
em outras seja, ainda, pouco conhecido. Entre estas enzimas esto a nitrogenase, que
leva formao do on amnio, a amnia monoxigenase, que produz hidroxilamina e
nitrito redutase e xido redutase, que formam xido nitroso e nitrognio gasoso,
respectivamente (YE & THOMAS, 2001).

8
Na tabela 3.1 esto representadas a estequiometria de cada processo de
tranformao biolgica do nitrognio (reaes e produtos), bem como a variao de
energia livre envolvida. Como pode ser observado, constam tanto as equaes qumicas
fundamentais quanto conjuntos de equaes sugeridas por vrios autores para os
processos de remoo de nitrognio, tais como: Anammox, SHARON e OLAND, que
sero descritos ao longo deste captulo.
Tabela 3.1: Transformaes biolgicas do nitrognio
Processos, Reaes e Produtos

G0, (kJ.mol-1)

Fixao do Nitrognio
1) 0,5N2 + 1,5H2 + H+ NH4+

-39,4

Nitrificao e Desnitrificao convencional

2) NH4+ + 1,5O2 NO2- + 2H+ + H2O

-290,4

3) NO2- + 0,5O2 NO3-

-72,1

4) NO3- + 1,25{CH2O} + H+ 0,5N2 + 1,75H2O + 1,25CO2

-594,6

Desnitrificao Autotrfica
5) 3NO3- + 5NH4+ 4N2 + 9H2O + 2H+

-297

Anammox
6) NO2- + NH4+ N2 + H2O

-358

7) NH4+ + 1,32NO2- + 0,066HCO3- + 0,13H+ 1,02N2 + 0,26NO3- +

0,066CH2O0,5N0,15 + 2,03H2O
SHARON
8) NH4+ + 1,5O2 NO2- + H2O + 2H+

-290,4

OLAND
9) 0,5NH4+ + 0,75O2 0,5NO2- + 0,5H2O + H+

-271

10) 0,5NH4+ + 0,5NO2- 0,5N2 + H2O

CANON
11) NH4+ + 1,5O2 NO2- + H2O + 2H+

-290,4

12) NH4+ + 1,32NO2- + H+ 1,02N2 + 0,26NO3- + 2H2O

RDNA
13) NO3- + 2{CH2O} + 2H+ NH4+ + 2CO2 + H2O

-655

Fonte: STUMM, 1996; JETTEN et al., 1999; SLIEKERS et al., 2001; JETTEN et al., 2002.

9
3.2 Importncia da Remoo Biolgica de Nitrognio
A atividade microbiana combinada, conforme anteriormente descrito, completa o
ciclo do nitrognio na natureza. No entanto a entrada de altas cargas de nitrognio devido
atividade humana, seja na forma de esgoto domstico ou efluentes industriais, causa
um grande desequilbrio no sistema. Neste contexto, conhecer o metabolismo microbiano
do nitrognio de grande importncia para o tratamento e biorremediao destes
compostos.
As principais fontes de nitrognio orgnico lanados na naturezas so o esgoto
domstico, os dejetos de animais e os efluentes altamente proticos de certos processos
industriais. Na forma de esgoto, tanto domstico quanto industrial, o nitrognio orgnico
rapidamente desaminado e uria que hidrolisada pela enzima urease para liberar
amnia (GRAY, 1992), conforme a reao a seguir.
NH2
C = O + 2H2O

(NH4+) : CO3-2

NH3

NH2
(uria)

(carbonato de amnio)

(amnia)

At o esgoto domstico entrar na planta de tratamento, 90% do nitrognio est

presente como amnia ou componentes orgnicos instveis que so rapidamente
transformados em amnia, devido a reao de amonificao, que em pH neutro encontrase em meio aquoso como on amnio (NH4+). Esgoto domstico, com uma concentrao
de nitrognio amoniacal de 35mgN-NH4+.L-1, extremamente diludo comparado com
outros efluentes ricos em nitrognio, tais como efluentes de indstria frigorfica com
concentrao mdia de 170mgN-NH4+.L-1 (GRAY, 1992; MIRANDA et al., 2000).
A concentrao de nitrognio presente no esgoto domstico excede o
requerimento microbiano para oxidar a quantidade de carbono presente, ento somente
parte do nitrognio removida por atividade heterotrfica convencional, sendo
incorporado na biomassa microbiana. O nitrognio residual estimula a atividade
autotrfica, que, se descartado nos cursos dgua, ocasionar a eutroficao devido
atividade fotoautotrfica. A utilizao do nitrognio por fotoautotrficos produz uma
grande quantidade de biomassa na forma de algas (GRAY, 1992).

10
Alm disso, elevadas concentraes do on amnio podem ter implicaes
ecolgicas, como influenciar fortemente a dinmica do oxignio dissolvido no meio, uma
vez que, para oxidar 1,0mg de amnio so necessrios cerca de 4,3mg de oxignio.
Portanto, o lanamento de um efluente contendo um elevado valor de DBO nitrogenada
(devido aos compostos de nitrognio), poder resultar em consumo de oxignio, devido a
nitrificao, o que pode interferir, de forma bastante negativa na comunidade aqutica.
Por outro lado, em pH bsico o on amnio se transforma em amnia conforme
apresentado na Figura 3.2, que, dependendo de sua concentrao, pode ser txica para
estes organismos (PRATES, 1997).

100
90

N-NH4

Concentrao (%)

80
70
60
50
40
30
20

N-NH3.H2O

10
0
6

6,5

7,5

8,5

9,5

pH

Figura 3.2: Curva de equilbrio entre on amnio e amnia em funo do pH

No caso de tratamento de efluentes que apresentam uma baixa relao C/N,
utilizando um sistema de nitrificao e desnitrificao, o contedo de carbono orgnico
biodisponvel pode ser insuficiente para uma completa desnitrificao, fazendo-se
necessria a adio de uma fonte externa de carbono orgnico. Alm disso, a eficincia
de remoo de nitrognio nestes sistemas funo da razo de reciclo. TEIXEIRA et al.
(2002) determinaram a eficincia terica de remoo de nitrognio, em funo da vazo
de reciclo entre os reatores de nitrificao e desnitrificao por eles estudados. Conforme
pode ser observado na Figura 3.3, para a razo de reciclo experimental utilizada (R=1,8),
a mxima eficincia de remoo terica de 64,3%, podendo ser alcanada uma
eficincia de remoo de 100% apenas para uma razo de reciclo infinitamente elevada.

Eficincia

11

1,0
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0,0

0,643

Razo de reciclo (R)

Figura 3.3: Eficincia terica em funo da razo de reciclo para o sistema

utilizado no experimento (Fonte: TEIXEIRA et al., 2002)
Frente aos riscos ambientais, os efluentes industriais ou municipais necessitam
atender a rigorosos padres de concentrao de nitrognio para serem descartados, ao
final do tratamento. A Resoluo N 20 do CONAMA (Conselho Nacional de Meio
Ambiente) estipula como mximo valor permissvel 5mg N-NH4+.L-1, para efluente de
qualquer fonte poluidora, sendo esta a nica meno com relao a compostos
nitrogenados (Legislao Federal, 1993).
As pesquisas recentes em remoo de nitrognio esto voltadas para melhorar a
eficincia e reduzir custos, otimizando as estratgias de tratamento disponveis ou
buscando implementar novos processos e, possivelmente, novos microrganismos
capazes de converter nitrognio amoniacal em nitrognio gasoso, sua forma inerte
(POLLICE, A. et al., 2001). A eliminao qumica de amnio por precipitao com
amnio-fosfato de magnsio ou por stripping vivel, mas gera custos mais elevados
que os processos de tratamento biolgicos (FUX et al., 2002).
O processo ou sistema de tratamento biolgico a ser escolhido est
intrinsecamente relacionado ao tipo de microrganismo que se pretende favorecerr. Os
biorreatores que operam sob condies de aerao possibilitam o desenvolvimento de
microrganismos aerbios, que atravs da respirao aerbia oxidam as molculas
orgnicas e/ou inorgnicas. Nos biorreatores anaerbios, por sua vez, so selecionados
microrganismos capazes de utilizar o metabolismo fermentativo ou respirao anaerbia.
Portanto, a oxidao dos compostos pode ocorrer por diferentes vias do metabolismo

12
microbiano, possibilitando o desenvolvimento de vrios aspectos da engenharia dos
biorreatores e resultando em variantes dos processos aerbios e anaerbios usuais
(VAZOLLER, 1988).

3.3 Processo de Nitrificao e Desnitrificao

Amnio, a forma reduzida de nitrognio, oxidado por bactrias autotrficas
nitrificantes a nitrato, via nitrito, por um processo conhecido como nitrificao. Somente
uma pequena proporo de nitrognio amoniacal assimilada pela biomassa
heterotrfica durante o tratamento de efluentes e o remanescente oxidado por bactrias
quimio-autotrficas. Bactrias autotrficas so hbeis em utilizar o nitrognio em uma via
no assimilativa, como fonte de energia, ento somente uma pequena quantidade de
biomassa produzida (GRAY, 1992).
A oxidao microbiana do on amnio ocorre em dois distintos estgios,
envolvendo diferentes bactrias nitrificantes quimio-autotrficas, que utilizam amnio ou
nitrito como uma fonte de energia, oxignio como aceptor final de eltrons, amnio como
fonte de nitrognio e carbonato como fonte de carbono (GRAY, 1992).
O primeiro estgio do processo a oxidao do on amnio a nitrito:
NH4+ + 1,5O2 NO2- + 2H+ + H2O
Esta reao geralmente considerada ser catalisada pelo gnero Nitrosomonas
e duas espcies, N. europaea e N. monocella, so freqentemente isoladas. Entretanto,
outros gneros tm tambm sido identificados como Nitrosospira, Nitrosococcus,
Nitrosocytis e Nitrosogloea. O on hidrognio liberado na oxidao da amnia a nitrito
ocasiona uma queda no pH do efluente, o que pode ser um problema em sistemas
fechados, ou com longo tempo de reteno, pois a reduo do pH poder inibir ou
mesmo parar a nitrificao (GRAY, 1992).
Em um segundo estgio, nitrito oxidado a nitrato:
NO2- + 0,5O2 NO3-

13
O gnero Nitrobacter considerado ser responsvel pela segunda reao
nitrificante, mas Nitrocystis, Nitrococcus e Nitrospina tambm tm sido citadas. A reao
global da nitrificao de amnio para nitrato requer o fornecimento de uma alta quntidade
de oxignio, em torno de 4,5gO2 para cada 1gN-NH4 oxidado (GRAY, 1992).
Desnitrificao um processo biolgico aplicado para remover NO3 ou NO2 de
efluentes pela reduo a N2. Muitas variedades de bactrias heterotrficas so hbeis em
desnitrificar efluentes em condies anxicas (Pseudomonas, Paraccocus, Alcaligenes,
Thiobacillus, Bacillus). Este processo ocorre na presena de uma fonte de carbono que
funciona como doador de eltrons, enquanto NO3 age como aceptor de eltrons na
cadeia respiratria (SNCHEZ et al., 2000).
A Portaria 1469 do Ministrio da Sade (2000), que define os padres de
potabilidade da gua, sugere nveis de nitrato abaixo de 10mgN-NO3-.L-1 para a gua
potvel, j que o NO3 se reduz facilmente a NO2 no trato digestivo humano, tornando-se
nocivo para a sade devido ao seu efeito cancergeno.
Quando o efluente a ser tratado apresenta altas concentraes de nitrognio
amoniacal e baixas concentraes de compostos orgnicos biodegradveis, uma fonte
suplementar de carbono requerida para propiciar a adequada desnitrificao. Metanol
comprovadamente uma excelente fonte de carbono (ILIES & MAVINIC, 2000). No
entanto, existe uma gama de compostos naturais que podem ser usados como substrato
pelas bactrias desnitrificantes, como detergentes no inicos, compostos aromticos e
sintticos e solventes clorados (MUX, 1994).
A determinao da atividade desnitrificante especfica (ADE) possibilita calcular a
mxima carga de nitrognio que pode ser tratada por um sistema. Baseados nisso,
SNCHEZ et al. (2000) estudaram os efeitos da relao C/N, concentrao de SSV
(slidos suspensos volteis) e agitao na determinao da ADE e estes parmetros
foram avaliados para estabelecer as condies operacionais timas. A mxima ADE
obtida foi com 1,5g SSV.L-1, uma relao C/N de 1,3 e frascos agitados a 180rpm, sendo
observada, neste caso, uma completa desnitrificao a N2 (98-99% de N2 na composio
do gs).
Segundo ILIES & MAVINIC (2000), a temperatura afeta ambos os processos,
nitrificao e desnitrificao. Estes autores investigaram a capacidade de remoo de
nitrognio de um sistema 4-estgio Bardenpho (caracterizado por um pr e ps-

14
processo de desnitrificao), para tratar lquidos percolados de atrros contendo acima
de 2200mgN-NH4+.L-1, sob progressivo decrscimo da temperatura ambiente (de 20C
para 10C), ao longo de 311dias. Durante 260dias, a 20C, o sistema manteve-se
estvel, gerando efluente livre de amnia e com baixa concentrao de NOX. Quando a
temperatura foi diminuda para 17C, a concentrao de NOX do sistema aumentou
enquanto a concentrao de amnia no efluente permaneceu zero, evidenciando uma
inibio apenas da etapa de desnitrificao. O processo de nitrificao pareceu no ser
afetado pela diminuio da temperatura at 14C. Entretanto, quando a temperatura
alcanou 10C, o percentual de remoo de amnia passou de 100% para menos de
50% e a remoo de nitrognio por desnitrificao diminuiu para menos de 5% do seu
potencial, resultando num progressivo acmulo de NOx no efluente. Mesmo elevando
novamente a temperatura, no houve qualquer sinal de recuperao da nitrificao ou
desnitrificao.
A temperatura tima para o crescimento de bactrias nitrificantes est na faixa
entre 28 e 36C, esperando-se pouco ou escasso crescimento abaixo de 4C (MUX,
1994).
Os valores de pH timo para a nitrificao esto ao redor de 7,5. O pH tem
acentuado efeito inibitrio para Nitrobacter, alm de governar a dissociao do on
amnio. O amnio e o cido nitroso no dissociado so txicos para as bactrias da
nitrificao, sendo que valores de 10-150mg/L so inibitrios para Nitrosomonas e 0,11mg/L inibem Nitrobacter (MUX, 1994).
HUNIK et al. (1993) determinaram a cintica de Nitrobacter agilis sob extremas
concentraes de substrato (NO2-) e produto (NO3-) a vrios valores de pH. Os
parmetros de afinidade pelo substrato e inibio pelo produto, combinados com efeitos
do pH, foram derivadas da equao de Michaelis-Menten para cintica enzimtica. A
constante de afinidade pelo substrato (KS) apresentou uma diminuio em funo do pH
num intervalo de 8,5 a 6,5 (de 1,11 a 0,29mM NO2-), demonstrando que a atividade de N.
agilis decresce com o valor de pH. Este efeito realado pela concentrao elevada de
NO2- que inibe ambos microrganismos, Nitrobacter e Nitrosomonas. Foi observada, ainda,
uma severa inibio de N. agilis pelo NO3-, o que se torna um inconveniente no
tratamento de efluentes concentrados, pois no h um como evitar o acmulo deste
produto da nitrificao. No entanto, a combinao com processos de desnitrificao
simultnea parece uma alternativa promissora. Os presentes autores propem a

15
utilizao de biofilme imobilizado em material suporte, formando uma dupla camada com
microrganismos nitrificantes na parte externa e desnitrificantes na parte interna.
Estudos microscpicos tem revelado que sob condies de boa nitrificao,
microrganismos amnio-oxidantes e nitrito-oxidantes esto em perfeita simbiose
formando o floco. Ento, em condies timas, no esperado um acmulo de nitrito no
lodo ativado aerbio. Na prtica, em um timo processo de desnitrificao, a velocidade
de reduo de nitrito maior que a velocidade de reduo de nitrato, no sendo usual um
acmulo de nitrito tambm durante a desnitrificao. Fatores que podem induzir o
acmulo de nitrito so alta concentrao de amnia livre, baixo pH, baixa concentrao
de oxignio dissolvido, baixa temperatura e aumento da carga volumtrica (PHILIPS &
VERSTRAETE, 2001).
LAANBROEK & GERARDS (1992) verificaram que a reduo da tenso de
oxignio em uma cultura mista de Nitrosomonas europaea e Nitrobacter winogradskyi
inibiu a oxidao de nitrito em maior proporo que a oxidao de amnio, ocorrendo um
acmulo de nitrito no reator. Os valores de Km encontrados foram na faixa de 1-15 e 22166 MO2 para as clulas de amnio e nitrito-oxidantes, respectivamente. A
concentraes de oxignio de 16kPa, 90 a 97% do amnio adicionado foi convertido a
nitrato pelas clulas. A concentrao de amnio, mas no de nitrito, aumentou a 2kPa e a
concentrao de nitrato diminuiu. Quando a tenso de oxignio diminuiu para 0kPa, foi
verificado acmulo de amnio e nitrito, com fraca produo de nitrato.
No entanto, em alguns processos, tais como SHARON, OLAND e CANON, os
quais so descritos adiante, ocorre uma nitrificao parcial at nitrito e desnitrificao de
nitrito para nitrognio gasoso, o que implica em altas concentraes de nitrito no meio.
Nestes casos, precaues especiais devem ser tomadas devido ao risco de perdas de
nitrito para o ambiente via efluente, pois, devido a sua toxicidade, pode trazer prejuzos
para as plantas, fauna aqutica, microrganismos nitrificantes e at mesmo para sade
humana (PHILIPS & VERSTRAETE, 2001).

3.3.1 Sistema de Lodos Ativados

O sistema de lodos ativados amplamente utilizado, a nvel mundial, para o
tratamento de despejos domsticos e industriais, em situaes em que uma elevada
qualidade do efluente e reduzidos requisitos de rea so necessrios. No entanto, inclui

16
um elevado ndice de mecanizao, implicando em alto consumo de energia eltrica.
Basicamente, compreende um tanque de aerao, tanque de decantao e recirculao
de lodo. A biomassa consegue ser facilmente separada no decantador devido formao
de floco, no qual esto presentes bactrias heterotrficas aerbias, autotrficas
nitrificantes, heterotrficas desnitrificantes, filamentosas e protozorios, envolvidos em
uma matriz de polissacardeos (VON SPERLING, 2002).
A medida do dimetro do floco, realizada atravs da anlise microscpica, informa
a respeito das condies gerais do lodo e pode ser correlacionada com a eficincia do
processo. De modo geral, um floco que apresente um pequeno dimetro (<50m)
caracteriza um lodo disperso e de difcil sedimentao; um dimetro de floco mdio a
grande

(>100

300m)

encontrado

em

lodos

com

boas

condies

de

sedimentabilidade (VAZOLLER, 1988).

No tanque aerado ocorre a nitrificao, converso de amnio a nitrato, mas no
h remoo de nitrognio. A desnitrificao alcanada em ausncia de oxignio, pela
respirao bacteriana do nitrato para oxidao da matria orgnica, formando nitrognio
gasoso que liberado para atmosfera (VON SPERLING, 2002). O esquema da Figura
3.4 mostra um sistema de lodos ativados modificado, comumente empregado para
nitrificao-desnitrificao. Primeiramente, tem-se uma fase anxica onde a matria
orgnica (DQO) presente no efluente bruto removida juntamente com o nitrato, pelo
processo de desnitrificao; a amnia presente no efluente bruto levada a nitrato na
fase aerada, atravs da nitrificao; o nitrato formado recircula para o primeiro tanque,
bem como parte da biomassa separada no decantador secundrio.
Recirculao interna (NO3)
1
5

2
Anxico

Aerado
4

Figura 3.4: Remoo de nitrognio pelo sistema de lodos ativados

1-Efluente bruto (NH4, DQO); 2 - Suspenso de lodo; 3 Efluente tratado;
4 Excesso de lodo; 5 Recirculao de lodo. (Fonte: VON SPERLING, 2002)

17
Em um sistema de lodos ativados como o apresentado anteriormente, mesmo
considerando 100% de converso nas etapas de nitrificao e desnitrificao, a eficincia
de remoo de nitrognio depende fortemente da razo de reciclo, sendo este um
limitante do processo (TEIXEIRA et al., 2002). Para melhorar esta eficincia, algumas
variaes do sistema so propostas, como o processo Bardenpho, que emprega dois
tanques anxicos, para uma pr e ps desnitrificao, e dois tanques aerados, conforme
descrito por ILIES & MAVINIC (2001).
As espcies microbianas presentes no floco reagem aos fatores de seleo do
meio (trficos ou fsico-qumicos), individualmente, segundo as suas caractersticas
prprias. A microfauna indicadora, portanto, do conjunto de parmetros de
funcionamento do processo de lodos ativados, uma vez que sua natureza varia com o
nvel de depurao, com a concentrao de oxignio dissolvido e com a presena de
substncias txicas dentro do tanque (VAZOLLER, 1988).

3.4 Novos Processos de Remoo Biolgica de Nitrognio

Recentemente, novos processos relacionados com a eliminao biolgica de

nitrognio que podem ocorrer em plantas de tratamento de efluentes, tais como a
desnitrificao aerbia, a oxidao anaerbia do amnio e a desnitrificao por bactrias
nitrificantes litoautotrficas, tm sido descritos como alternativas promissoras frente as
tecnologias usuais, tendo em vista o aumento da eficincia e reduo de custos.

3.4.1 Desnitrificao Aerbia

A remoo de nitrognio e fosfato de efluentes tem se tornado um problema
municipal e industrial, frente aos padres de qualidade exigidos. Na Europa, uma diretiva
de 21 de maio de 1991 definiu como mximo para concentrao de nitrognio e fsforo
no efluente final de 10-15 e 1-2mg.L-1, respectivamente, o que implica uma eficincia de
remoo de 70 a 80% para o caso do tratamento de esgoto domstico. No entanto, a
mdia atual dos tratamentos utilizados para remoo de nitrognio e fsforo deste
resduo est ao redor de 40% (PATUREAU et al., 2001).

18
At pouco tempo, para estabelecer um balano de nitrognio em plantas de
tratamento de efluentes, eram considerados apenas os processos de nitrificao e
desnitrificao, sem atentar para a existncia atpica de bactrias fixadoras de nitrognio,
nitrificantes heterotrficas, amonificantes e desnitrificantes aerbias. A atividade
inesperada destas bactrias explicaria a dificuldade em fechar os balanos de massa em
muitas plantas de tratamento e em solos (PATUREAU et al., 2000).
Estas reaes tm possibilitado o desenvolvimento de novos sistemas, frente s
plantas convencionais que utilizam a combinao de nitrificao e desnitrificao em
duas fases separadas. KSHIRSAGAR et al.*, apud PATUREAU et al. (2000), demonstrou
a viabilidade de combinar nitrificao e desnitrificao em um nico reator aerbio,
inoculando lodo ativado nitrificante com Thiosphaera pantotropha, de conhecida atividade
desnitrificante aerbia.
ROBERTSON

&

KUENEN**,

apud

GUPTA

(1997),

isolaram

bactria

Thiosphaera pantotropha, anaerbia e autotrfica facultativa, capaz de crescer em

ambiente mixotrfico e heterotrfico, podendo oxidar compostos de enxofre (como fonte
de energia para o crescimento), nitrificar amnio a nitrito heterotroficamente e reduzir
nitrato ou nitrito a N2 independente da concentrao de oxignio dissolvido. Devido ao
seu peculiar sistema enzimtico, permite uma grande aplicabilidade em relao a
estratgias de tratamento convencionais, seja para tratar efluentes ricos em matria
orgnica ou em nitrognio.
T. pantotropha tem um metabolismo respiratrio capaz de utilizar O2, NO2, NO3 ou
NO como aceptor final de eltrons. Pode usar hidroxilamina oxiredutase para formar NO2,
bem como para combinar NO2 e hidroxilamina a N2O, como reportado para bactrias
autotrficas amnio-oxidantes. Para algumas bactrias, como o Paracoccus denitrificans,
que utilizam NO3 como aceptor final de eltrons, a atividade desnitrificante inibida pela
presena de O2. No entanto, a T. Pantotropha possui um sistema de nitrato redutase que
a torna apta a desnitrificar tanto em condies anaerbias quanto aerbias (GUPTA,
1997).

**

KSHIRSAGAR, M.; GUPTA, A.B.; GUPTA, S.K.. Aerobic denitrification studies on activated
sludge mixed whith Thiosphaera pantotropha. Environmental Technology. 16:35-43. 1995.

ROBERTSON, L. A.; KUENEN, J. G.. Thiosphaera pantotropha, a facultatively anaerobic,

facultatively autyotrophic sulphur bacterium. Archives in Microbiology. 129, 2847-2855. 1983.

19
PATUREAU et al. (2000) compuseram um mix com amostras de ecossistema
natural e de lodo ativado, o qual foi progressivamente adaptado alternando fases
aerbia/anxica na presena de NO3, visando enriquecer a microflora de desnitrificantes
aerbias. A influncia do oxignio dissolvido (OD) e da carga C/N na cintica de reduo
aerbia do NO3 foi estudada em cultura contnua. Um ensaio foi conduzido em paralelo,
nas mesmas condies, contendo, porm, cultura de Microvirgula aerodenitrificans. Os
resultados mostraram no haver influncia do OD na performance desnitrificante aerbia,
acima de um valor mnimo de 0,35mg/L para o consrcio e 4,5mg/L para M.
aerodenitrificans. A uma carga de 160mg NO3.m-3.d-1, a velocidade de desnitrificao do
consrcio e da cultura de M. aerodenitrificans foi de 122 e 66mgNO3.m-3.d-1,
respectivamente. O aumento da carga aumentou a atividade de M. aerodenitrificans em
maior proporo, comparada ao consrcio.
Segundo PATUREAU et al. (2000), isto mostra que o sistema enzimtico
desnitrificante e sistema de respirao de oxignio funcionam em paralelo, ou seja, o
oxignio no inibidor direto da atividade e sntese de enzimas desnitrificantes. No
entanto, ao diminuir a concentrao de oxignio, alm do valor mnimo, as enzimas
desnitrificantes tm sua atividade aumentada.

3.4.2 Anammox
At a dcada de 90, apenas processos aerbios vinham sendo discutidos para
oxidao do amnio. No entanto, MULDER et al. (1995) observaram uma perda de
amnio em um reator desnitrificante de leito fluidizado, aplicado ao tratamento de efluente
de um reator metanognico que foi operado para degradao de resduos de uma planta
de produo de fermento, em Delft (Holanda). Neste mesmo reator foi verificado um
elevado consumo de amnio e nitrato com concomitante produo de gs. Experimentos
em fluxo contnuo demonstraram a estequiometria do processo como sendo de 5mol de
NH4+ para cada 3mol de NO3-, resultando em 4mol de N2. Ficou, ento, comprovada a
descoberta de um novo processo de oxidao anaerbia do amnio, em que amnio era
oxidado a nitrognio gasoso sob condies anxicas, com nitrato servindo como aceptor
de eltrons. Este processo foi denominado Anaerobic ammonium oxidation Anammox.
Em teoria, j se sabia que amnio poderia ser usado como um doador inorgnico
de eltrons para a desnitrificao conforme a equao a seguir.

20
3NO3- + 5NH4+ 4N2 + 9H2O + 2H+ (G0 = -297 kJ.mol-1)
A energia livre (G0) para esta reao est na mesma ordem de grandeza que a
energia livre do processo de nitrificao aerbia (para o qual G0 = -362kJ.mol-1),
demonstrando que o processo de oxidao anaerbia do amnio quase to favorvel
quanto o processo de nitrificao aerbia. Em 1977, BRODA,

baseado em clculos

termodinmicos, j previa a existncia de bactrias quimiolitotrficas capazes de oxidar

amnio a nitrognio gasoso com NO3-, CO2 ou O2 como oxidante (MULDER et al., 1995).
Alguns anos mais tarde, foi verificado que nitrito tambm poderia servir como
aceptor de eltrons, tendo, inclusive, G0 mais favorvel de acordo com a reao:
NH4+ + NO2- N2 + H2O (G0 = -358kJ.mol-1)
Para uma melhor compreenso do processo, a biomassa proveniente do reator
descrito por MULDER et al. (1995) foi enriquecida em um meio mineral autotrfico para o
desenvolvimento de microrganismos anaerbios amnio-oxidantes. O meio continha
amnio e nitrito como nico doador e aceptor de eltrons, respectivamente, e carbonato
como nica fonte de carbono. A concentrao de oxignio foi mantida abaixo dos nveis
de deteco (<1M) para prevenir efeitos inibitrios. Aps enriquecimento da cultura com
meio sinttico, em reator de leito fluidizado, a velocidade de remoo de nitrognio
aumentou de 0,4kgN.m-3.d-1 no lodo original para 2,4kgN. m-3.d-1 (van de GRAAF et al.
1996).
O tipo de microrganismo dominante na cultura de enriquecimento foram clulas
Gram-negativas com uma morfologia no usual apresentando uma colorao
avermelhada. O mtodo de NMP mostrou que nitrificantes aerbias estiveram presentes
no lodo, mas o nmero permaneceu constante e em torno de (95) x103 clulas.(mgSV)-1
de amnio oxidantes e (10,9) x103 clulas.(mgSV)-1 de nitrito oxidantes. Comparado a
uma cultura pura de Nitrosomonas europaea com 9x109 clulas.(mgSV)-1, o nmero de
nitrificantes foi considerado muito pequeno para ter alguma influncia representativa no
processo (van de GRAAF et al., 1996).
Buscando esclarecer o metabolismo do processo, van de GRAAF et al. (1997)
procederam um estudo da oxidao anerbica do amnio utilizando

15

N radioativamente

marcado. Partindo da cultura anteriormente citada, as etapas do processo foram

21
definidas e hidroxilamina e hidrazina foram identificados como importantes compostos
intermedirios. A rota metablica apresentada na Figura 3.5 indica que em uma primeira
etapa amnio oxidado pela hidroxilamina para formar hidrazina. Ento, os equivalentes
de reduo derivados de N2H4 reduzem o nitrito para regenerar a hidroxilamina e formar
N2. Parte do NO2 levado a NO3-, o que geraria equivalentes de reduo para fixao do
CO2 e conseqente crescimento da biomassa.
NH4+

NH2OH

NO2

NO3

N2H4
2[H]+
N2H2
2[H]+
N2
Figura 3.5: Possvel rota metablica para oxidao anaerbia do amnio
(Fonte: van de GRAAF et al., 1997)

A partir da rota metablica proposta para a oxidao anaerbica do on amnio,

alguns estudos com esta biomassa foram realizados, visando a determinao de
parmetros estequiomtricos da reao. Neste sentido, um reator RBS com uma eficiente
reteno da biomassa (>90%) foi otimizado para o estudo da comunidade anammox.
Importantes parmetros tais como rendimento da biomassa (0,066 0,01 molC.(mol
NH4+)-1), mxima velocidade especfica de consumo de amnio (45 5 nmol.min-1.(mg
protena)-1) e a mxima velocidade especfica de crescimento (0,0027h-1, tempo de
duplicao de 11dias), puderam ser determinados (STROUS et al., 1998). Com base
nestes dados e de estudos anteriores (van de GRAAF et al., 1996) foi proposta a
estequiometria da oxidao anaerbia do amnio, conforme a reao:
NH4+ + 1,32 NO2- + 0,066 HCO3- + 0,13 H+ 1,02 N2 + 0,26 NO3- +
0,066 CH2O0,5N0,15 + 2,03 H2O
As condies ambientais para o anammox foram temperatura entre 20 e 43C
(com timo a 40C) e pH de 6,7-8,3 (com timo a pH 8). O processo foi inibido por

22
concentraes de nitrito acima de 20mM, embora concentraes maiores que 10mM j
foram desfavorveis. Quando a concentrao de nitrito permaneceu acima de 5mM
(70mgN-NO2-.m-3) por um longo perodo (12h), atividade anammox foi completamente
inibida, sendo recuperada pela adio de quantidades trao de intermedirios do
processo (hidrazina e hidroxilamina). A constante de afinidade pelo substrato amnio e
nitrito foi bastante elevada (KS 5M) e a biomassa revelou-se estritamente anxica,
evidenciando perda completa de atividade, mas de forma reversvel, mesmo em
concentraes muito baixas de oxignio, menores que 2M (STROUS et al., 1999).
A comunidade na biomassa foi dominada por mais de 70% de um tipo morfolgico
de microrganismo, o qual foi fisicamente purificado da cultura de enriquecimento por
gradiente de densidade (centrifugao). O extrato de DNA das clulas purificadas foi
usado como molde para amplificao por PCR com um primer 16SrDNA, obtendo-se uma
seqncia dominante de Planctomyces. O microrganismo anaerbio amnio-oxidante da
ordem Planctomyces foi denominado Candidatus Brocadia anammoxidans (STROUS et
al., 1999).
Mais recentemente foi identificado um novo gnero de bactria com atividade
Anammox, encontrado no biofilme formado em reatores tipo biodiscos rotatrios, em
Stuttgart (Alemanha), tendo sido denominado Candidatus Kuenenia stuttgartiensis
(SCHMID et al., 2000). A aplicao da tcnica de biologia molecular FISH demonstrou a
predominncia desta bactria em ecossistemas com altas perdas de nitrognio
(SCHMIDT et al., 2002).
A Figura 3.6 mostra uma representao esquemtica da oxidao anaerbia do
amnio por Planctomyces, a nvel celular. A seqncia de reaes e o sistema
enzimtico envolvido ainda no esto totalmente elucidados. O mecanismo para
formao de hidroxilamina inclui a incompleta reduo de nitrito a hidroxilamina por uma
citocromo-c nitrito redutase (de todos os compostos de nitrognio, a hidroxilamina o
mais rapidamente metabolizado pelo Anammox). Amnia e hidroxilamina so convertidos
a hidrazina por uma enzima encontrada na membrana celular. A hidrazina , ento,
oxidada a N2 no periplasma. O mecanismo de transferncia de eltrons para a reduo
do nitrito no totalmente conhecido, indicando a presena de um novo tipo de enzima
capaz de combinar dois tomos de nitrognio, originando N2. Foram propostos dois
possveis sistemas: primeiro, uma nica enzima seria responsvel pela oxidao da
hidrazina e reduo do NO2; segundo, uma enzima nitrito-redutora mediaria a formao

23
de hidroxilamina enquanto enzimas de uma cadeia de transporte se encarregaria dos
eltrons (van de GRAAF et al., 1997; JETTEN et al., 1999 ; YE & THOMAS, 2001).

Figura 3.6: Oxidao anaerbia do amnio por Planctomyces a nvel celular

(Fonte: YE & THOMAS, 2001)

Na literatura especializada atual crescente o nmero de publicaes revelando

elevadas perdas de nitrognio em plantas de tratamento de efluentes, indicando que a
oxidao anaerbia do amnio pode ser mais freqente do que previamente assumido.
Para compreender o processo e sua importncia, seja em ambientes naturais ou em
plantas de tratamento, desejvel identificar outras bactrias com esta capacidade, uma
vez que os organismos anammox j conhecidos tm sido extremamente difceis de
cultivar em cultura pura (EGLI et al., 2001).
As vantagens do processo Anammox sobre a tradicional combinao de
nitrificao e desnitrificao para tratamento de efluentes so a menor demanda de
oxignio, utilizada pelas nitrificantes para oxidao parcial do amnio a nitrito, e nenhum
requerimento de fonte externa de carbono, pois o processo autotrfico. A desvantagem
estaria relacionada a baixa velocidade de crescimento das bactrias anammox, o que
prolongaria o start-up do processo (EGLI et al., 2001). Por outro lado, esta mesma
caracterstica seria responsvel pela pequena produo de lodo, uma vez que o tempo
estimado de duplicao de 11dias (JETTEN et al., 2001). Tendo em vista que o
aumento do nmero de bactrias muito lento, a utilizao de reatores com um sistema
de reteno de biomassa eficiente necessria para o enriquecimento (SCHMIDT et al.,
2002).

24
A implementao do processo Anammox como uma tecnologia vivel de
tratamento de efluentes manusevel, requer uma melhor compreenso das faixas de
permissibilidade para nitrito e amnio, das cargas de carbono orgnico e nveis de
oxignio admissveis e do pH do meio (EGLI et al., 2001).
Diferentes configuraes de reatores tm sido aplicadas na converso de amnio
no processo Anammox. A utilizao de reatores de leito fluidizado, permite a aplicao de
elevadas cargas de nitrognio. No entanto, reatores do tipo RBS (Reator Sequencial em
Batelada) so mais simples e podem ser operados de maneira estvel por um longo
perodo de tempo, alm de que altas velocidades de converso de nitrognio podem ser
alcanadas (JETTEN et al., 2001).
Um enriquecimento em microrganismos Anammox foi obtido por EGLI et al. (2001)
a partir de uma biomassa retirada de um biodisco rotatrio de contato, usado para o
tratamento de efluente rico em amnio e com baixo contedo de carbono orgnico. O
enriquecimento levou a uma populao de 88% de bactrias Anammox, as quais foram
identificadas por uma anlise da seqncia 16S rDNA e por FISH. A percentagem de
identidade entre a bactria estudada e organismos Anammox anteriormente identificados,
foi de 90,9% para Brocadia anammoxidans e entre 98,5 e 98,9% para Kuenenia
stuttgartiensis.

3.4.3 Processos Envolvendo Nitrificao Parcial e Oxidao Anaerbia do Amnio

Novos sistemas de nitrificao onde on amnio parcialmente convertido a nitrito

(prevenindo a formao de nitrato), tais como OLAND, SHARON e CANON, os quais
sero descritos nos itens seguintes, tm surgido como possibilidade de associao
desnitrificao autotrfica por oxidao anaerbia do amnio. Desta maneira, o processo
torna-se auto-sustentvel, uma vez que no h necessidade de adio de nitrito ou fonte
externa de carbono, e possibilita uma economia significativa de oxignio (energia) com a
nitrificao parcial em relao ao processo tradicional (FUX et al., 2002).
Acmulo de nitrito freqentemente observado em plantas de tratamento de
efluentes devido incompleta nitrificao. STEIN & ARP (1998), sugeriram uma
inativao irreversvel de bactrias amnio-oxidantes por nitrito a uma concentrao de
420mgN-NO2.L-1. MULLER et al. (1995) reportaram que a velocidade de oxidao de

25
amnio foi reduzida pela metade quando em contato com 42-70mgN-NO2-.L-1 quando
comparada a 0-14mgN-NO2-.L-1. Devido aos riscos inerentes ao acmulo de nitrito, como
a toxidade, precaues especiais devem ser tomadas na utilizao de novos processos
de remoo de nitrognio que utilizam este on como substrato (PHILIPS &
VERSTRAETE, 2001).

3.4.3.1 SHARON

O processo Sharon (Single reactor system for High Ammonium Removal Over
Nitrite) uma tcnica empregada para tratamento biolgico de efluentes com altas
cargas de nitrognio. Neste processo, o amnio parcialmente convertido a nitrito sob
condies aerbias por bactrias amnio-oxidantes (Nitrosomonas), de acordo com a
reao:
NH4+ + 1,5O2 NO2- + H2O + 2H+
Devido ao curto TRH (aproximadamente 1 dia) e alta temperatura (35C), as
bactrias nitrito-oxidantes (Nitrobacter) so lavadas do reator. A temperatura, associada
ao curto TRH, torna-se um fator de seletividade, pois, como mostra a Figura 3.7, a 35C a
mxima

velocidade

aproximadamente

de

crescimento

metade

do

que

(mx)
a

das

de

bactrias

nitrito-oxidantes

amnio-oxidantes

(0,5

-1

1dia ,

respectivamente) (VERSTRAETE & PHILIPS, 1998; JETTEN et al., 2001; van KEMPEN
et al., 2001).

Figura 3.7: Efeito da temperatura na mxima velocidade de crescimento de

bactrias amnio e nitrito oxidantes (Fonte: JETTEN et al., 2001)

26
A nitrificao parcial a nitrito tambm foi reportada por POLLICE et al., (2002)
como sendo tecnicamente vivel e economicamente favorvel, especialmente para o
tratamento de efluentes com altas concentraes de amnio e baixa relao C/N. A
nitritao pode ser obtida pela regulao apropriada do pH, temperatura e tempo de
reteno do lodo do sistema. Associados a estes mtodos j conhecidos, o sistema de
aerao intermitente, pode ter um importante papel na inibio de nitrito oxidantes. Estes
autores demonstraram pela realizao de testes de nitrificao utilizando dois reatores,
operados sob aerao contnua e intermitente, que a nitrificao parcial a nitrito foi
regularmente obtida sob limitao de oxignio, independente do tempo de reteno de
lodo. Dessa forma, o sistema de aerao foi proposto como um parmetro alternativo ao
TRH para o controle da oxidao de amnio a nitrito.
JETTEN et al. (2001) estudaram a combinao dos processos SHARON e
Anammox para a remoo de nitrognio. O reator utilizado para o processo SHARON foi
alimentado com efluente de digesto de lodo com elevada concentrao de amnio,
operado a 35C e com um TRH (Tempo de Reteno Hidrulico) inicial de 2dias, para
converso de 50% do amnio a nitrito. Quando o processo de nitrificao foi
estabelecido, o TRH diminuiu para 1dia para favorecer as bactrias amnio-oxidantes,
devido a sua maior velocidade de crescimento nesta condio. Para o processo
Anammox, foi escolhido um reator RBS, o qual recebeu como inculo um lodo
enriquecido em biomassa Anammox. Aps um perodo de adaptao da biomassa, o
reator RBS passou a receber o efluente do reator SHARON contendo amnio e nitrito na
proporo molar de aproximadamente 1:1 (ideal 1:1,32). Os substratos amnio e nitrito
foram convertidos a nitrognio gasoso no reator Anammox, demonstrando que o sistema
combinado pde ser operado com sucesso.

3.4.3.2 OLAND

No processo OLAND (Oxygen Limited Autotrophic Nitrification Denitrification), o

oxignio fornecido em quantidade estequiomtrica para que a nitrificao proceda
apenas at nitrito e, subseqentemente, devido escassez de aceptores de eltrons, o
nitrito formado consumido para oxidar o restante do amnio (VERSTRAETE & PHILIPS,
1998).
O potencial de um sistema OLAND com lodo nitrificante como biocatalisador foi
investigado por KUAI & VERSTRAETE (1998), em escala laboratorial. Um reator RBS foi

27
inoculado com 3gSSV.L-1, alimentado com efluente sinttico contendo 1gN-NH4.L-1 e
operado a 33C. A uma carga de 0,13gN-NH4.L-1.d-1 a velocidade de remoo de
nitrognio foi da ordem de 50mgN. L-1.d-1, correspondente a uma velocidade de remoo
especfica de 16mgN.(gSSV)-1.d-1. Os microrganismos que catalisaram o processo
OLAND foram assumidos ser nitrificantes, dominadas por amnio oxidantes do gnero
Nitrosomonas.
As reaes sumarizadas a seguir demonstram que espcies de Nitrosomonas
presentes no lodo nitrificante obtm energia suficiente para manuteno celular, a partir
desta ao combinada de nitrificao e desnitrificao (VERSTRAETE & PHILIPS, 1998):
0,5NH4+ + 0,75O2 0,5NO2- + 0,5H2O + H+
0,5NH4+ + 0,5NO2- 0,5N2 + H2O
O processo OLAND, comparado ao processo de nitrificao e desnitrificao
convencional, permite uma economia de 62,5% de oxignio (energia) e 100% de agente
redutor (fonte de carbono orgnico). Alm de que, a oxidao direta de amnio a
nitrognio gasoso pode ser alcanada em uma nica fase (VERSTRAETE & PHILIPS,
1998).
O processo OLAND no requer condies anxicas, mas pode ocorrer em
condies microaeradas. A hiptese formulada por PHILIPS et al. (2002) para reaes do
tipo OLAND que sob condies de limitao de oxignio, as nitrificantes podem passar
a oxidao de amnio com nitrito para nitrognio gasoso e utilizar este gs como um
meio de transporte. Dessa forma, as nitrificantes poderiam se mover para fora do
sedimento de lodo e ascender ao longo de uma coluna de gua. Tal movimento, baseado
nas bolhas de gs, propiciaria s bactrias a oportunidade de migrar para a superfcie e
captar oxignio para recomear a nitrificao aerbia, levando a formao de nitrito. Uma
vez que o nitrognio fosse liberado para a atmosfera, os microrganismos retornariam
para o sedimento por gravidade. No interior do sedimento, devido a zonas de limitao de
oxignio, o nitrito formado reagiria com amnio liberando novamente nitrognio gasoso.

3.4.3.3 CANON

Substanciais perdas de nitrognio tm sido reportadas em reatores com baixa

concentrao de oxignio dissolvido e com baixa quantidade de DQO presente no

28
efluente. provvel que nestes sistemas, um processo de desnitrificao autotrfica seja
promovido por bactrias tipo Anammox (SLIEKERS et al., 2002). Bactrias que oxidam
amnio a nitrito necessitam de oxignio, enquanto bactrias que convertem nitrito a
nitrognio gasoso so anaerbias. Recentemente tem sido mostrado que ambas
bactrias podem co-existir em um nico reator desde que o sistema seja mantido em
condies de oxignio limitado (JETTEN et al., 2002).
No processo CANON (Completely Autotrophic Nitrogen removal Over Nitrito),
amnio parcialmente convertido a nitrito por amnio oxidantes aerbias sob oxignio
limitado e, subseqentemente, bactrias Anammox convertem o nitrito produzido junto
com parte do amnio remanescente a nitrognio gasoso e pequena quantidade de nitrato
formada conforme as reaes (SLIEKERS et al., 2002; JETTEN et al., 2002):
NH4+ + 1,5O2 NO2- + H2O + H+
NH4+ + 1,32NO2- + H+ 1,02N2 + 0,26NO3- + 2H2O
Considerando que bactrias Anammox so reversivelmente inibidas por baixas
concentraes de oxignio (0,5% da saturao do ar), para que o processo CANON
possa ocorrer em um nico reator, a oxidao aerbia do amnio deve remover todo o
oxignio do lquido (SLIEKERS et al., 2002). Para tanto, o fluxo de entrada de amnio no
reator deve ser mantido acima do fluxo de entrada de oxignio (JETTEN et al., 2002).
HAO et al. (2002) desenvolveram um modelo matemtico para o processo
CANON em biofilme e avaliaram os parmetros relevantes envolvidos no processo. O
nvel timo de oxignio dissolvido no qual ocorreu a mxima remoo de nitrognio
relatada para uma determinada carga superficial no biofilme. Uma carga superficial de
2gN.m-2.d-1, associada com uma concentrao de oxignio dissolvido de 1,3mgO2.L-1 no
lquido, com um mnimo de 1mm de profundidade do biofilme pareceram ser as
condies apropriadas para um processo de remoo de amnio em um nico estgio.
Sob estas condies e a temperatura de 30C, a eficincia de remoo de amnio foi de
94% (82% de eficincia de remoo de nitrognio total). Melhor eficincia de remoo de
amnio poderia ser alcanada com um aumento da concentrao de oxignio dissolvido,
mas isto poderia limitar fortemente o processo Anammox, diminuindo o total de nitrognio
removido.

29
3.4.3.4 Desamonificao em Sistemas de Biofilmes

Nitrificao e desnitrificao simultnea pode ocorrer em plantas de tratamento de

efluentes com sistema de lodos ativados ou biofilmes, devido a microzonas anxicas no
centro do floco ou nas camadas internas do biofilme. Nas camadas superficiais, os
microrganismos em contato com oxignio levam a nitritao, oxidao parcial de amnio
a nitrito e, internamente, na ausncia de oxignio ocorre o processo de desamonificao,
atravs do qual nitrito e amnio so levados a nitrognio gasoso (HELMER e KUNST,
1998). A Figura 3.8 apresenta as diferentes fases envolvendo o biofilme, bem como as
reaes que se processam em seu interior.

NH4+

N2

NH4+
Nitritao

II

NH4+

N2

NO2Oxidao anaerbia do amnio

III

Desnitrific ao

N2

NO2- + NH4+

N2

IV
Reao
Difuso

Figura 3.8: Processos de nitrificao parcial e desamonificao em biofilme

I Fase lquida; II Fase aerbia; III Fase anxica (Biofilme); IV Suporte
(Fonte: HELMER & KUNST, 1998)

Em biofilmes, diferentes grupos microbiolgicos podem estar mais ou menos

segregados. Organismos com baixa velocidade de crescimento do tipo nitrificantes
competem pelo oxignio em regies superficiais com organismos de crescimento rpido
como as heterotrficas. Isto significa que as nitrificantes esto sujeitas a limitao de
oxignio, pois, uma vez que sua constante de afinidade pelo oxignio relativamente
alta, estaro em desvantagem (JETTEN et al., 1997).
Os reatores com biomassa aderida diferem dos reatores com biomassa em
suspenso por apresentarem distintas fases: uma lquida contnua e outra slida formada

30
por microrganismos aderidos a suportes. Os substratos tm que atravessar a interface
lquido-biofilme e, por difuso, serem transportados ao longo do filme, podendo resultar,
assim, condies no homogneas no reator. Desta forma, os microrganismos no
biofilme podem estar sujeitos a diferentes microambientes (van LOOSDRECHT &
HEIJNEN, 1994, apud BRANDO, 2002).
HELMER & KUNST (1998) observaram perdas de nitrognio da ordem de 90%
em um RBC (Rotating Biological Contactor) utilizado para fase de nitrificao do prtratamento de chorume. Considerando a baixa remoo de DQO, a possibilidade de
desnitrificao convencional foi descartada. Devido existncia de microzonas anxicas
no biofilme, uma converso autotrfica de amnia a nitrognio gasoso poderia ser
assumida.

3.4.4 Desnitrificao por Bactrias Nitrificantes

Por um longo tempo, bactrias amnio oxidantes do gnero Nitrosomonas foram
consideradas ser obrigatoriamente litoautotrficas e aerbias. Recentemente tem sido
demonstrado que Nitrosomonas tambm podem ser organismos desnitrificantes, pois
dispe de enzimas do tipo nitrito-redutase e xido redutase para formar xido nitroso
(N2O) e dinitrognio (N2). Em condies de limitao de oxignio, as clulas utilizam NO2
como aceptor de eltrons e economizam oxignio para a reao da monoxigenase, que
catalisa a oxidao do amnio a hidroxilamina (ZART & BOCK, 1997; SHRESTHA et al.,
2000).
A oxidao anaerbia de amnio por Nitrosomonas indica um complexo papel dos
xidos de nitrognio (NO e NO2) no metabolismo aerbio de amnio oxidantes. Uma das
espcies de Nitrosomonas descritas, capaz de realizar este metabolismo a N. eutropha,
a qual pode oxidar amnio na ausncia de oxignio dissolvido, substituindo o oxignio
molecular por NO2 ou N2O4. Como nitrito no est disponvel em ambientes naturais sob
condies anxicas, uma oxidao anaerbia do amnio dependente do transporte de
NO2 de camadas xicas (SCHMIDT et al., 2002).
ZART & BOCK (1997) estudaram a habilidade de bactrias litotrficas amnio
oxidantes N. eutropha para nitrificao e simultnea desnitrificao sob condies xicas,
suplementando o ar usado na aerao com dixido de nitrognio (NO2) ou xido ntrico
(NO). Na presena de NO2 gasoso, aproximadamente 50% do nitrito produzido foi

31
reduzido a nitrognio gasoso, revelando altas perdas de nitrognio. Neste caso, produo
biolgica de NO foi tambm observada e sua permanncia constante na atmosfera do
fermentador, segundo os autores, pode ser responsvel por uma induo cumulativa das
enzimas de desnitrificao, NO2 redutase e NO redutase, levando ao aumento da
velocidade de desnitrificao. Quando NO foi suprido na atmosfera do fermentador, as
clulas morreram em poucos dias, o que indicou uma maior toxicidade do NO em relao
ao NO2.
Buscando esclarecer a rota metablica que as Nitrosomonas seguem para
permanecer viveis e crescer sob condies anaerbias, ABELIOVICH & VONSHAK
(1992) procuraram pelos doadores e aceptores de eltrons destas reaes. Para tanto,
Nitrosomonas europaea ATCC 19718 foi cultivada em meio contendo nitrito, amnia e/ou
piruvato, mantido em ambiente absolutamente anaerbio. As clulas incubadas na
presena de amnio e piruvato consumiram o nitrito do meio, enquanto que na presena
de um ou outro a concentrao de nitrito foi pouco afetada, indicando uma necessidade
especfica por ambos reagentes para manter uma constante reduo de nitrito.
Neste mesmo trabalho, ABELIOVICH & VONSHAK (1992) demonstraram que no
houve incorporao do piruvato pelas clulas, indicando que ele no participa do
metabolismo intracelular. Segundo estes autores, o piruvato prov a energia requerida
para a assimilao do CO2, por uma reao que produz acetilfosfato e CO2 na superfcie
da membrana celular ou por criar diretamente uma diferena de potencial na membrana,
gerando, assim, ATP.
O efeito do oxignio no processo de desnitrificao por N. europaea foi
investigado por SHRESTHA et al. (2000). Os autores observaram que em condies
aerbias, amnio foi convertido a nitrito, enquanto que sob condies de oxignio
limitante (0,6mgO2/L) ou de anaerobiose estrita, o nitrito formado na oxidao da amnia
pelas clulas de N. europaea foi reduzido a N2O e N2 com um mximo de 22% de
converso. Foi demonstrado que tanto a baixas presses parciais de oxignio quanto em
condies de ausncia de oxignio, N. europaea so hbeis a desnitrificar.
As pesquisas apresentadas pelos autores acima mencionados (ABELIOVICH &
VONSHAK, 1992; ZART & BOCK, 1997; SHRESTHA et al., 2000) demonstraram um
potencial para assimilao de carbono inorgnico pelas Nitrosomonas, particularmente
pertencentes s espcies de N. eutropha e N. europaea utilizando outros aceptores de
eltrons em substituio ao oxignio, o que sugere que estes microrganismos so

32
capazes de seguir uma rota metablica alternativa, sem envolver nitrificao, em
ausncia de oxignio.

3.5 Tcnicas Empregadas para o Estudo de Populaes Microbianas

3.5.1 Nmero Mais Provvel

O mtodo do Nmero Mais Provvel (NMP) permite estimar a densidade da
populao microbiana sem uma contagem individual das clulas ou colnias.
Microbiologistas freqentemente estimam o tamanho de populaes com base na maior
diluio na qual o crescimento pode ser obtido. Ento, se o crescimento foi observado na
diluio 10-4, mas no na 10-5, o nmero de clulas viveis estimado estar entre 104 e
105. O teste de vrias alquotas de uma srie de diluies sucessivas, junto com clculos
estatsticos e interpolaes, fornece estimativas muito mais precisas (ALEXANDER,
1982).
O princpio do mtodo proposto por ALEXANDER & KLARK (1982) para anlise
de solos foi adaptado para anlise de lodos. Para enumerar Nitrosomonas, bactria
oxidante do amnio, as diluies da amostra devem ser inoculadas em meio inorgnico
contendo o on amnio como fonte de nitrognio. No caso de ter Nitrosomonas na forma
vivel no inculo, haver crescimento e nitrito ser produzido, porm, necessrio no
ter produo de nitrito nos tubos no inoculados (controle). Mesmo que nitrito no seja
encontrado, antes de afirmar que o teste negativo, necessrio fazer o teste para
nitrato, porque as bactrias oxidantes de nitrito convertem o nitrito produzido pelas
Nitrosomonas em nitrato. Portanto, no caso de nitrato ser encontrado, indica tambm a
presena de Nitrobacter, bactria nitrito-oxidante, mas, novamente, os testes nos tubos
controle devem ser negativos. Na enumerao de Nitrobacter, o meio empregado deve
ser livre de matria orgnica e como fonte de energia utilizado nitrito. A presena de
Nitrobacter dada pelo teste negativo de nitrito e teste positivo nos tubos no inoculados.
Inmeros autores tm utilizado a tcnica de NMP em suas pesquisas para
quantificao de populaes, tais como PHILIPS et al. (2002), MUXI et al. ( 2002) e van
de GRAAF et al. (1996). A contagem por NMP um mtodo comumente utilizado para
avaliar a proporo de grupos fisiolgicos de microrganismos em um ecossistema
particular (ETCHEBEHERE et al., 2001). A microbiota desnitrificante presente no lodo de

33
diferentes reatores foi avaliada por contagem NMP de desnitrificantes, associada a
medidas de atividade especfica (ETCHEBEHERE et al., 2001).

3.5.2 Fluorescent In Situ Hybridisation

O mtodo FISH (Fluorescent In Situ Hybridisation) baseado na hibridizao de
sondas marcadas com um radioistopo como 32P para uma parte especfica do 16S rRNA
de uma bactria. Uma sonda consiste de 15 a 30 nucleotdeos (bases), complementares
ao DNA de interesse, denominado DNA-alvo, e marcada com um agente corante
fluorescente que permite a visualizao microscpica das clulas de um dado tipo de
bactria. As sondas so empregadas para identificar qual dos clones de uma biblioteca
ou qual banda de um gel contm o DNA-alvo (PASSAGLIA & ZAHA, 1996). A tcnica
empregada para a realizao da anlise FISH apresentada de forma esquematizada na
Figura 3.9. A grande vantagem oferecida por esta anlise que no h necessidade de
purificao prvia da amostra de lodo a ser investigada (JETTEN et al., 2001).

Fixao das clulas

em PFA

Hibridizao com
sondas fluorescentes

Incubao a 46C

Anlise microscpica

Contagem das clulas com

DAPI e CY3 UV
Clulas
Totais
(DAPI)

Clulas
Hibridizadas
(CY3 UV)

Figura 3.9: Representao esquemtica da tcnica empregada para anlise FISH

34
Durante a hibridizao, uma sequncia de fita simples de um DNA-alvo liga-se a
uma sonda contendo uma sequncia complementar de nucleotdios. O DNA de fita
simples, produzido por desnaturao alcalina do DNA de dupla fita, primeiramente
ligado a um suporte slido, como uma membrana de nitrocelulose. As fitas de DNA
imobilizadas no podem ligar-se umas s outras, mas esto disponveis para hibridizao
a uma sonda de DNA exgeno de fita simples. A extenso da hibridizao medida pela
reteno de radioatividade na membrana utilizando uma sonda marcada radioativamente.
As molculas de sonda em excesso que no hibridizam so removidas por lavagem do
filtro e, assim, no interferem na anlise (PASSAGLIA & ZAHA, 1996).
Utilizando anlise FISH, tipos especficos ou grupos de bactrias podem ser
observados sob uma microscopia fluorescente e neste sentido a presena bem como a
quantidade de dada bactria na amostra de lodo pode ser investigada (JETTEN et al.,
2001). Inmeros autores tm utilizado tcnicas de biologia molecular em seus trabalhos
e, dentre elas, a anlise FISH consiste em uma importante ferramenta para acompanhar
o desenvolvimento de populaes microbianas nos bioreatores estudados (PERSSON et
al.,2002; TOH et al., 2002; EGLI et al., 2001; JETTEN et al., 2001).

35
4. METODOLOGIA

4.1 Caracterizao do Inculo

Os reatores estudados no decorrer deste trabalho foram inoculados com um lodo
nitrificante proveniente de um sistema de lodos ativados para tratamento de esgoto
sanitrio, da Companhia de Saneamento do Estado de Santa Catarina (CASAN). Este
lodo coletado na unidade insular da CASAN, foi adaptado por 130dias em meio
nitrificante autotrfico, de acordo com a composio proposta por CAMPOS et al. (1999)
apresentada nas Tabelas 4.1 e 4.2, mantido a temperatura ambiente e sob aerao,
sendo alimentado diariamente aplicando-se uma carga da ordem de 90mgN-NH4+. L-1.d-1,
a qual foi aumentada progressivamente.
Tabela 4.1: Composio do meio nitrificante
Componentes

Concentrao (mg.L-1)

(NH4)2SO4

1047

NH4Cl

850

KH2PO4

222

MgSO4

53

NaCl

889

NaHCO3

4444

Soluo de micronutrientes

0,5mL.L-1

Fonte: CAMPOS et al. (1999)

Tabela 4.2: Composio da soluo de micronutrientes *

Componentes

Concentrao (mg.L-1)

EDTA

50000

FeSO4

2728

ZnSO4

12354

CaCl2

5540

MnCl2

3220

CuSO4

1004

(NH4)6Mo7O24

1036

CoCl2

880

Fonte: CAMPOS et al. (1999); *O pH foi ajustado em 6,0 com KOH

36
4.1.1 Determinao dos Slidos Suspensos Totais
Para estimar a concentrao celular do lodo, foi determinada a massa de slidos
suspensos totais (gSST) presente em determinado volume de amostra (L), seguindo a
metodologia indicada por Andreas Karoli Gombert Depto Eng. Qumica da Escola
Politcnica/USP. Primeiramente, foram recortados papis de filtro comum de forma
circular com aproximadamente 5cm de dimetro, enumerados e secos em microondas
por 15 minutos, a 20% da potncia. Terminado este tempo, os papis foram
imediatamente pesados sendo o peso correspondente anotado.
A seguir, foram filtrados 20mL de suspenso de lodo em filtro a vcuo, efetuando
a amostragem em triplicata. Os papis contendo o lodo foram novamente levados ao
aparelho de microondas, permanecendo por 15 minutos a 20% da potncia para retirada
da umidade. Aps nova pesagem foi obtida a massa de slidos, por diferena de peso,
presente nos 20mL de amostra. Atravs de uma simples relao para 1000mL, foi obtida
a concentrao de slidos do lodo em gSST.L-1.

4.1.2 Determinao da Atividade Nitrificante

Para verificar a atividade nitrificante do lodo, foi realizado um ensaio de
respirometria no qual se determina a cintica de consumo de oxignio relacionada ao
consumo de substrato. Inicialmente, um determinado volume de lodo nitrificante com
aproximadamente 2gSST.L-1 foi retirado do reator nitrificante e lavado por vrias vezes
com gua destilada, o suficiente para remover as formas nitrogenadas dissolvidas (NH4+,
NO2- e NO3-). Terminada a lavagem, o lodo foi ressuspendido em soluo de macro e
micronutrientes conforme a composio proposta por Campos et al. (1999) apresentada
nas Tabelas 4.1 e 4.2 (porm livre de amnio), completando um volume final de 1L. Foi
determinada a concentrao de slidos da suspenso final atravs da anlise descrita no
item 4.1.1.
A suspenso de lodo foi colocada em um erlenmeyer, ao qual acoplou-se um
eletrodo de pH, devidamente calibrado com solues padro de pH 7,0 e 14,0 e um
eletrodo galvnico (Oxi 340/SET WTW Germany), calibrado com gua destilada e
ajustado para medir a concentrao de oxignio dissolvido em mgO2.L-1, com relao a
saturao (CS = 7mgO2.L-1 a 1atm e 35C). A temperatura foi mantida em 35C e a
agitao em 300rpm atravs do uso de um agitador magntico provido de aquecimento.

37
O pH foi mantido em 7,5, sendo utilizada soluo de HCL 10% (v/v) ou NaOH 5% (p/v)
para corrigir o mesmo, conforme necessrio. A aerao do meio era feita atravs de um
dispersor acoplado a um sistema de compresso de ar.
Inicialmente foi determinada a respirao endgena dos microrganismos. Para
tanto, o meio foi aerado at atingir aproximadamente a concentrao de saturao de
oxignio, ento a aerao foi suspensa e, imediatamente aps, foi procedida a leitura do
consumo de oxignio (mgO2.L-1) em funo do tempo (s), na ausncia de substrato.
Subseqentemente, foram dados pulsos de amnio, inicialmente de 1-2mgN-NH4.L-1 e
depois de 10-20mgN-NH4.L-1, at verificar alguma inibio pelo substrato, evidenciada por
uma diminuio no consumo de oxignio.
Aps ser dado o pulso, o meio era homogenizado antes de retirar a amostra para
determinao da concentrao de amnio. Logo aps retirar a amostra era suspendida a
aerao, iniciando imediatamente a leitura da concentrao de oxignio dissolvido a cada
intervalo de tempo, de acordo com a atividade das clulas. Quando a concentrao de
oxignio atingia aproximadamente 30% da CS, era novamente retornada a aerao,
evitando que a concentrao de oxignio casse alm do valor crtico que de
aproximadamente 0,1CS para a maioria dos microrganismos. Os volumes do pulso e da
amostra retirada eram os mesmos, aproximadamente 10mL, de modo a manter o volume
no erlenmeyer praticamente constante ao longo do experimento.
A partir da inclinao da reta da variao da concentrao de oxignio dissolvido
(mgO2.L-1) em funo do tempo (s), foi possvel obter a velocidade de consumo de
oxignio (QO2X) a cada pulso de amnio, conforme a Equao 4.3, sendo esta corrigida
descontando-se o valor correspondente a respirao endgena. Conhecendo-se o valor
da concentrao celular (que considerada constante ao longo do experimento), foi
determinado o valor de QO2 (mgO2.gcel-1.s-1), o qual pde ser expresso como velocidade
especfica de consumo de substrato considerando um fator estequiomtrico de converso
entre oxignio e amnio (4,25gO2 / gN-NH4+). A partir da velocidade especfica (mgN-NH4.
gSST-1.s-1) obtida em funo da concentrao de substrato (mgN-NH4.L-1) e aplicando
uma regresso no linear no programa Statistica, para ajuste dos dados ao modelo
cintico proposto por ANDREWS (1968) (Equao 4.4), o qual considera o termo de
inibio pelo substrato, puderam ser determinados os parmetros de atividade max ,KS e
KI .
A seguir so apresentadas as equaes utilizadas para a determinao cintica.

38
De acordo com SCHMIDELL (2001), em um biorreator descontnuo aerado e
agitado, o balano de massa para o oxignio pode ser escrito:

dC
K L a (CS C ) QO2 X =

dt

(4.1)

onde: C = concentrao de oxignio dissolvido (mg.L-1)

CS = concentrao de oxignio dissolvido na saturao (mg.L-1)
KLa = coeficiente volumtrico de transferncia de oxignio (h-1)
QO2X = velocidade de consumo de oxignio (mgO2.L-1.min-1)
QO2 = velocidade especfica de respirao (mgO2.gcel-1.d-1)
X = concentrao celular (g.L-1)
t = tempo (h)
Considerando que ao interromper a aerao a transferncia de oxignio para o
lquido seja praticamente nula (KLa = 0), desta forma:
(4.2)

dC
QO2 X =

dt

A integrao da equao anterior fornece a equao de uma reta, na qual os

valores prticos de C em funo do tempo permitem o clculo de QO2X (coeficiente
angular da reta), conforme a seguir:

C = C0 QO 2 X t

(4.3)

onde: C0 = concentrao de oxignio dissolvido no instante t=0

A determinao dos parmetros de atividade est baseada no modelo cintico
proposto por ANDREWS (1968), de maneira que:

= max

(4.4)

S
KS + S +

S
KI

4.1.3 Determinao do Nmero Mais Provvel

A metodologia empregada na determinao do nmero mais provvel foi
adaptada do mtodo proposto por ALEXANDER & CLARK (1982), uma vez que este
baseado em anlise de solos. Os meios de cultura utilizados nesta anlise so
especficos para oxidadoras de amnio e oxidadoras de nitrito, possibilitando o
desenvolvimento dos diversos gneros bacterianos envolvidos em cada um destes

39
grupos. No entanto, levando-se em conta que as bactrias Nitrosomonas e Nitrobacter
so as principais representantes do grupo de oxidadoras de amnio e de oxidadoras de
nitrito, respectivamente, ser feita referncia apenas a estes dois gneros, sem descartar
a possibilidade de que outras bactrias podem tambm estar sendo quantificadas.

4.1.3.1. Nmero mais Provvel de Nitrosomonas

Preparo do material:
1. Meio Amnia-carbonato de clcio para Nitrosomonas
Para 1000mL de gua, foram adicionados 0.302g de (NH4)2SO4; 1,0g de K2HPO4;
0,03g de FeSO4.7H2O; 0,3 de NaCl; 0,3g de MgSO4.7H2O; 3,33 g de CaCO3. Desta
soluo foram transferidos 3 mL para tubos de ensaio e esterilizados em autoclave.
2. Reagente de Griess-Ilosvay
Foram dissolvidos 0,6g de cido sulfanlico em 70mL de gua destilada quente.
Aps resfriar a soluo, foram adicionados 20mL de HCl concentrado, diluindo a seguir a
mistura para 100mL com gua destilada e misturando bem. Foram dissolvidos 0,6g de
alfa-naftalamina em 10 a 20mL de gua contendo 1mL de HCl concentrado, diluindo em
seguida para 100mL com gua. Foram dissolvidos 16,4g de CH3COONa.3H2O em gua e
completado o volume da soluo para 100mL com gua. As solues foram
acondicionadas em vidros escuros, separadamente, e estocadas sob refrigerao.
3. Reagente de nitrato: Foram dissolvidos 50mg de difenilamina em 25mL de
H2SO4 concentrado, sendo guardado em frascos protegidos da luz por no mximo 14dias.
4. Foram feitos brancos com gua destilada.
Procedimento analtico:
A amostra do lodo nitrificante adaptado (a ser utilizado como inculo) foi
submetida a uma agitao com prolas de vidro, de modo a desagregar os flocos de lodo
tanto quanto possvel. Foram preparadas as diluies em srie transferindo alquotas de
1mL para cada um dos cinco tubos contendo meio estril, a partir da mais alta diluio

40
preparada. Esse mesmo procedimento foi repetido para as outras quatro mais baixas
diluies. Os tubos inoculados foram incubados por 3 semanas a 28 C, juntamente com
uma seqncia de tubos no inoculados (brancos), utilizados como controle.
Aps o perodo de incubao, foi realizado o teste para nitrito, em cada tubo,
usando o reagente de Griess-Ilosvay. Primeiramente, foram misturaradas partes iguais
dos trs reagentes e, ento, adicionadas trs gotas da mistura na cultura a ser testada.
Se ocorresse, em poucos minutos, o aparecimento de uma cor vermelho-prpura,
indicava a presena de nitrito, sendo o teste, portanto, positivo. Para os tubos que no
apresentaram resultado positivo, era feito o teste para nitrato, adicionando uma gota do
reagente de difenilamina. Se ocorresse desenvolvimento de uma cor azul o teste era
considerado positivo para Nitrosomonas, significando que o nitrito produzido pelas
Nitrosomonas tinha sido convertido pelas Nitrobacter em nitrato. Caso ocorresse teste
positivo para nitrito ou nitrato nos tubos controle (brancos), significaria a ocorrncia de
alguma contaminao e o resultado obtido deveria ser desprezado.
O NMP para Nitrosomonas foi determinado utilizando a tabela proposta por
ALEXANDER & CLARK (1982), a qual consta em Anexo neste trabalho.

4.1.3.2. Nmero Mais Provvel de Nitrobacter

Preparo do material:
1. Meio Nitrito-carbonato de clcio para Nitrobacter
Para 1000 ml de gua destilada, foram adicionados 0,006g de KNO2, 1,0g de
K2HPO4, 0,3g de NaCl, 0,1g de MgSO4.7H2O, 0,03g de FeSO4.7H2O, 1,0g de CaCO3 e
0,3g de CaCl2. A seguir, foram transferidos 3mL do meio para tubos de ensaio e
esterilizados em autoclave por 15 minutos.
2. Reagente Griess-Ilosvay (conforme descrito no item 4.1.3.1).
3. Foram feitos brancos com gua destilada.
Procedimento analtico:

41
A amostra de lodo adaptado foi coletada do reator nitrificante e preparada para a
determinao atravs de agitao com bolinhas de vidro, de modo a desagregar os flocos
tanto quanto possvel. Foram preparadas as diluies em srie transferindo alquotas de
1mL para cada um dos cinco tubos contendo meio estril, a partir da mais alta diluio
preparada. Este mesmo procedimento foi repetido para as outras quatro diluies mais
baixas. Os tubos inoculados foram incubados por 3 semanas a 28C, juntamente com
uma seqncia de tubos no inoculados (brancos), utilizados como controle.
No final do perodo de incubao, foi testado apenas nitrito usando o reagente de
Griess Ilosvay. O teste era considerado positivo para Nitrobacter se o meio no
desenvolvesse colorao avermelhada (colorao caracterstica de nitrito) e negativo se
apresentasse colorao.
O NMP para Nitrobacter foi determinado utilizando a tabela proposta por
ALEXANDER & CLARK (1982), a qual consta em Anexo.

4.1.4 Anlise FISH

As amostras de lodo retiradas para a anlise FISH foram previamente fixadas com
paraformaldedo, conforme descrito no item abaixo, guardadas a 20C e posteriormente
enviadas para a Faculdade de Cincias do Uruguai.

4.1.4.1 Fixao com paraformaldedo

Preparo dos reagentes:

1. Tampo PBS 3X (390mM NaCl, tampo fosfato 30mM pH 7,2-7,4)
Foram preparadas as solues de NaH2PO4 0,5M (60g em 1000mL de gua
destilada) e Na2HPO4 0,5M (71g em 1000mL de gua destilada). Para preparar 1000mL
de tampo fosfato de sdio 0,5M pH 7,2-7,4 foram misturados 280mL de NaH2PO4 0,5M
com 720mL de Na2HPO4 0,5M. Para preparar 300mL de tampo PBS 3X foram
misturados 23,4mL de NaCl 5M, 18,0mL de tampo fosfato de sdio 0,5M e 258,6mL de
gua.

42
2. Tampo PBS 1X: foi diluda uma parte de PBS 3X para duas de gua.
3. Soluo 4% PFA-PBS (100mL)
Foram aquecidos 66mL de gua destilada a 60C. A seguir, foram agregados 4g
de paraformaldedo (PFA) e gotas de NaOH 10N para a dissoluo do PFA
(aproximadamente 100L), em frasco com tampa devido a formao de vapores txicos,
deixando no banho-maria a 60C at completa dissoluo (no mais que 10 minutos).
Foram, ento, agregados 33mL de PBS 3X. Aps esfriar a 20C o pH foi ajustado a 7,27,4 com gotas de HCl concentrado e, caso houvesse formao de precipitado, poderia
ser filtrado em papel de 0,45m. A soluo foi armazenada a 4C at o momento do uso
(no devendo permanecer estocada por mais de duas semanas).
Procedimento analtico:
Primeiramente, um volume de suspenso de lodo de aproximadamente 300L foi
colocado em tubo ependorf e centrifugado a 5000rpm por 10 minutos. Aps descartar o
sobrenadante, o pellet foi lavado com PBS 1X agitando vigorosamente e centrifugado
novamente. O sobrenadante foi novamente descartado e o precipitado foi ressuspendido
em 300L de PBS 1X. Foram agregados 900L de soluo 4% PFA-PBS e incubado por
3 a 4h a 4C (tempo de incubao nunca superior a 18h).
A amostra foi centrifugada a 5000rpm por 10 minutos, foi descartado o
sobrenadante e o pellet foi lavado com PBS 1X, agitando vigorosamente. Novamente foi
centrifugado a 5000rpm por 10 minutos e ressuspendido em 300L de PBS 1X. Foram
agregados 300L de etanol absoluto, misturando bem. Aps este procedimento, a
amostra pode ser guardada por vrios meses a 20C.

43
4.2 Montagem e Operao dos Reatores
Foram construdos dois reatores de mistura completa, utilizando cilindros de
acrlico concntricos, tendo uma diferena de 4cm no dimetro de modo que o cilindro de
menor dimetro (interno) constitusse um reator com um volume til de 2,5L, restando
ainda um pequeno volume vazio no topo. A base e a tampa eram constitudas de chapas
planas recortadas de forma circular, sendo que a tampa possua perfuraes onde foram
acopladas 3 tubulaes: entrada da alimentao, sada do efluente tratado e sada de
gs. A tubulao de sada de gs era acoplada a um sistema de medida de gs,
constitudo de frasco invertido do tipo mariote, contendo soluo de soda a 5%, e proveta
para medida do volume de soda a ser deslocado pelo gs produzido. A diferena entre os
dimetros dos cilindros externo e interno constituiu uma camisa de troca trmica,
permitindo a circulao da gua de aquecimento.
Foi tambm especialmente adequado um frasco para alimentao, sendo este
vedado com uma rolha de borracha perfurada por onde passava a tubulao a ser
conectada na bomba peristltica. Era borbulhado diariamente gs inerte (He ou Ar), de
modo que o meio sinttico a ser alimentado aos reatores permanecesse em ausncia de
oxignio.
O lodo nitrificante adaptado foi lavado com gua destilada, de modo a remover
todas as formas nitrogenadas (NH4+, NO2- e NO3-) e ressuspendido em meio mineral
sinttico contendo nitrito e amnio como fonte de nitrognio, outros sais, alm da soluo
de nutrientes I e II (1mL por litro de meio), conforme a composio proposta por van de
GRAAF (1996) que consta nas Tabelas 4.3 e 4.4.
A suspenso de lodo foi, ento, inoculada nos reatores I e II, completando um
volume de 2,5L. A concentrao celular em gSST.L-1 foi determinada pelo mtodo
descrito no item 4.1.4, para cada um dos reatores. Para eliminar o oxignio dissolvido, foi
borbulhado gs argnio no meio (utilizando um dispersor acoplado a um cilindro de gs),
por um perodo de 15 minutos. Este tempo foi determinado previamente, acoplando um
oxmetro a um bquer contendo gua destilada a temperatura ambiente, enquanto era
borbulhado o gs, de modo que transcorridos 15 minutos foi atingida a concentrao
mnima de 0,55mg O2.L-1 (a qual no sofria mais reduo ao longo do tempo).
Imediatamente aps retirar o dispersor de gs, foi colocada a tampa no reator, vedando
apropriadamente com cola de silicone.

44

Tabela 4.3: Composio do meio anammox

Componentes

Concentrao (mg.L-1)

(NH4)2SO4

330

NaNO2

345

KHCO3

500

MgSO4.7H2O

300

CaCl2.2H2O

180

Soluo de micronutrientes I e II

1mL.L-1

Fonte: van de GRAAF (1996)

Tabela 4.4: Composio das solues de micronutrientes

Componentes

Concentrao (mg.L-1) Concentrao (mg.L-1)

para soluo I

para soluo II

EDTA

5000

15000

FeSO4

5000

ZnSO4.7H2O

430

CoCl2. 6H2O

240

MnCl2.4H2O

990

CuSO4.5H2O

250

NaMoO4.2H2O

220

NiCl2.6H2O

190

NaSeO4.10H2O

210

H3BO4

14

Fonte: van de GRAAF (1996)

Foram considerados os seguintes dados operacionais:

VR = 2,5L
TRH = 5 dias
Considerando:

TRH =

VR
VR '

onde: TRH = tempo de reteno hidrulico (d)

VR = volume utilizado do reator (L)
VR = volume retirado por dia (L.d-1)

(4.5)

45
Utilizando a equao 4.5 e os dados operacionais (TRH = 5 dias e VR = 2,5L), foi
calculado o volume a ser retirado por dia (VR ), sendo este de 0,5L.
Os reatores foram operados como RBS (Reator Sequencial em Batelada), o qual
compreende ciclos de alimentao, sedimentao e retirada de sobrenadante. Assim, o
volume retirado deveria ser reposto diariamente, o que era realizado por uma mesma
bomba peristltica para ambos os reatores (RI e RII). Para tanto, primeiramente era
desligada a agitao e aguardado um tempo para ocorrer a sedimentao do lodo
(aproximadamente 40 minutos).
A seguir, era retirado 0,5L do sobrenadante dos reatores. Antes de iniciar a
alimentao, era borbulhado gs nos reatores por 15 minutos, conectando a tubulao de
alimentao ao cilindro de argnio. Terminado este tempo, a tubulao de entrada era
novamente conectada a uma das extremidades da bomba peristltica, para a
alimentao.
Inicialmente a alimentao era realizada de forma ininterrupta, regulando a
rotao da bomba peristltica no valor mnimo tolerado (10rpm). Mas, desta forma, a
alimentao era realizada em apenas 3h. A partir do 150 dia de operao, foi acoplado
um temporizador bomba peristltica de modo que a alimentao pudesse ser melhor
distribuda ao longo do dia, permanecendo 15 minutos ligada e 45 minutos em repouso,
por 7h, at completar a alimentao.
Nos primeiros 9 dias de funcionamento do sistema em estudo, o reator RI foi
operado de forma diferenciada, tendo sido submetido a uma lavagem inicial de clulas.
Para tanto, o meio era mantido homogneo (a agitao permanecia ligada) durante a
retirada dos 0,5L de meio, de modo que parte do lodo era removida. A anlise de SST
era efetuada diariamente, para acompanhar a diminuio da concentrao celular ao
longo do tempo. Uma vez que a concentrao celular atingiu um valor limite previamente
estipulado, o qual foi alcanado em 9 dias, o procedimento de lavagem foi encerrado e os
reatores passaram a ser operacionalizados da mesma maneira, conforme descrito no
pargrafo anterior.
O meio utilizado para a alimentao dos reatores foi proposto por van de GRAAF
(1996) e est descrito nas Tabelas 4.3 e 4.4. A preparao do meio era feita
semanalmente, ficando armazenado a temperatura ambiente. A caracterizao fsicoqumica de cada novo meio preparado era realizada atravs das anlises de NH4+, NO2-,

46
NO3-, pH, DQO e Alcalinidade, de acordo com as metodologias descritas no item 4.3,
sendo os dados computados como valores de entrada dos reatores (Apndice 2).
O pH do meio de cultivo dos reatores era mantido em torno de 7,5 atravs do
ajuste do valor de pH do meio de alimentao com soluo de NaOH ou HCl. A
temperatura do meio de cultivo era mantida em 35C atravs da circulao de gua
aquecida ( 37C) na camisa do reator, sendo esta monitorada diariamente por leitura em
termmetro.
A Figura 4.1 mostra o esquema prtico montado para o funcionamento e operao
dos reatores.

Figura 4.1: Sistema operacional para o estudo da remoo biolgica de nitrognio

Problemas com a montagem dos reatores, tais como freqente descolamento da
tampa e da base, levaram a substituio dos cilindros de acrlico por vidros providos de
tampa com rosca. A troca permitiu um melhor controle da vedao dos reatores, alm de
prevenir a perda de clulas que poderia ocorrer devido a rompimentos.

47
4.3 Anlises para o Acompanhamento dos Reatores
O monitoramento analtico dos reatores envolveu anlises fisico-qumicas para
verificao das condies de entrada (meio de alimentao) e sada dos reatores (NH4+,
NO2-, NO3-, pH, DQO e Alcalinidade), bem como quantificao celular pela determinao
de slidos (SST) e anlises para acompanhamento das populaes microbianas (NMP e
FISH). Tambm foi realizada uma anlise do lodo em microscpio tico. As anlises
foram efetuadas conforme a frequncia apresentada na Tabela 4.5.
Tabela 4.5: Freqncia analtica para acompanhamento dos reatores RI e RII
Anlise
Reator
Frequncia
pH

I e II

diariamente

I e II

2 vezes por semana

DQO e Alcalinidade

I e II

1 vez por semana

SST

diariamente durante lavagem

I e II

0, 75, 150 e 225 dias

final da lavagem

I e II

0, 75, 150 e 225 dias

FISH (Fixao)

I e II

0, 75, 150 e 225 dias

Microscopia

I e II

200dias

Ensaio cintico

Nitrificante

inculo

I e II

225dias

NH4+,

NO2-,

NO3-

NMP

As amostras para as anlises fsico-qumicas foram obtidas a partir da filtrao do

sobrenadante retirado dos reatores, sendo estes dados computados como valores de
sada dos reatores (Apndice 2). Com os dados obtidos a partir das anlises das formas
nitrogenadas, foi possvel determinar a eficincia de remoo (em %) para cada reator e
calcular a carga de nitrognio de entrada e sada dos reatores, considerando as
equaes 4.6 e 4.7.

Eficincia =

onde:

(CN)

(C N ) E (C N ) S
(C N ) E

(4.6)

= concentrao de nitrognio na forma de amnio, nitrito e nitrato na

entrada do reator (mgN.L-1);

(CN)

= concentrao de nitrognio na forma de amnio, nitrito e nitrato na

sada do reator (mgN.L-1).

48

CN
ou q = C N D
TRH
Q 0,5L / d
D= =
= 0,2d 1
V
2,5L

q=

(4.7)

onde: q = carga (mgN.L-1.d-1)

CN = concentrao de nitrognio [N-NH4+ + N-NO2- + N-NO3-] (mgN.L-1)
D = vazo especfica de alimentao (d-1)
Q = vazo (L.d-1)
V = volume do reator (L)
Para as anlises de SST, NMP, FISH e microscopia, foi retirado um volume de
aproximadamente 30mL de cada reator, sendo o meio de cultivo completamente
homogenizado antes de efetuar a amostragem.

4.3.1 Determinao de Amnio

A determinao de amnio foi realizada segundo o mtodo de Nessler, descrito
por VOGUEL (1981). Inicialmente foi preparado o reagente de Nessler dissolvendo 100g
de iodeto de mercrio (II) e 70g de iodeto de potssio em 100mL de gua, adicionando a
seguir uma soluo fria de 160g de NaOH em 700mL de gua destilada, completando o
volume final da soluo para 1L. O precipitado foi deixado decantar por alguns dias antes
de utilizar o reagente, o qual deve ser submetido a uma padronizao, utilizando uma
soluo de cloreto de amnio.
Para determinao da concentrao de amnio, foram adicionados 100L do
reagente de Nessler para 5mL de amostra e, aps aguardar 10 minutos de reao, foi
efetuada a leitura da absorbncia em espectrofotmetro (Hach DR/2010) a 525nm. Com
o valor da absorbncia, foi obtida a concentrao de amnio a partir da curva padro.

4.3.2 Determinao de Nitrito

Foi empregado o kit analtico NitriVer 2 Hach Company, que abrange a faixa de
concentrao de 0 a 150mgNO2-.L-1, baseado em uma curva padro obtida com nitrito de
sdio. Este mtodo est baseado na reduo do nitrito para xido nitroso na presena de
sulfato ferroso e em meio cido. O xido , ento, convertido em um cromgeno pela

49
reao com o cdmio permitindo a leitura em espectrofotmetro. Para a anlise foram
utilizados 10 mL de amostra e um envelope do reagente NitriVer 2, sendo agitado por 2
minutos e aguardados 10 minutos de reao. Ento, foi realizada a leitura da absorbncia
em espectrofotmetro 585nm, sendo obtido o valor da concentrao atravs da curva
padro.

4.3.3 Determinao de Nitrato

A determinao de nitrato foi realizada pelo mtodo do cido saliclico, de acordo
com o procedimento descrito por CATALDO et al. (1975). Para a anlise da concentrao
de nitrato, foram utilizados 200L da amostra ao qual foram adicionados 0,8mL do
reagente AS-H2SO4. Aguardados 20minutos para a reao, foram adicionados 19mL de
soluo de NaOH 2N e efetuada a leitura da absorbncia em espectrofotmetro a 410nm.
Para a determinao da concentrao de nitrato foi utilizada uma curva de calibrao
preparada com KNO3.
O reagente AS-H2SO4 foi preparado dissolvendo 50g de cido saliclico com
H2SO4 concentrado, completando a soluo para 1L. A soluo de NaOH foi obtida
dissolvendo 80g de NaOH em gua destilada, completando o volume para 1L.

4.3.4 Determinao de DQO

A anlise de DQO foi realizada segundo procedimento do Standard methods for
the examination of water and wastewater (APHA, AWWA, WEF, 1995). O procedimento
baseado no refluxo fechado por digesto cida na presena de dicromato de potssio
com 2,5 mL de amostra filtrada, realizada em um digestor a 150C por duas horas. A
quantificao alcanada por mtodo colorimtrico em funo do dicromato consumido
pela oxidao da matria orgnica. Para determinao foram colocados em uma cubeta
apropriada 2,5mL de amostra, 3,5mL de soluo de H2SO4 e 1,5mL de soluo digestora,
permanecendo por 2h a 150C, sendo efetuada a leitura da absorbncia em
espectrofotmetro (Hach DR/2010) a 600nm aps resfriamento. A concentrao de DQO
foi determinada a partir de uma curva padro obtida com soluo de biftalato de potssio.
A soluo de cido foi obtida adicionando a um frasco de 1L de H2SO4
concentrado 5,5g de AgSO4, deixando em repouso por 1 a 2 dias para dissolver. Para

50
obter a soluo digestora foram adicionados a 500mL de gua destilada 167mL de H2SO4
concentrado, 10,21g de dicromato de potssio seco e 33,3g de AgSO4, diluindo aps
resfriar para 1L.

4.3.5 Determinao da alcalinidade

A determinao da alcalinidade foi realizada pelo mtodo da titulao, de acordo
com o Standard Methods. Foram utilizados 20mL de amostra, completando o volume
para 40mL com gua destilada, os quais foram titulados com soluo de H2SO4 0,027N
at pH 4,7, sendo lido o volume gasto na titulao. A alcalinidade foi determinada em
mgCaCO3.L-1, de acordo com a equao:

Alcalinidade =

A N 50000
V

onde: A = volume de H2SO4 gasto na titulao (mL)

N = normalidade da soluo de H2SO4 (N)
V = volume de amostra (mL)

4.3.6 Determinao dos Slidos em Suspenso Totais e Volteis

A determinao da concentrao celular presente nos reatores foi determinada
atravs da anlise de SST pela metodologia indicada por Andreas Karoli Gombert
Depto Eng. Qumica da Escola Politcnica/USP, conforme descrito no item 4.1.1.
No perodo final de acompanhamento dos reatores (225dias), foi conduzida
paralelamente uma determinao de SST conforme metodologia do Standard Methods.
Inicialmente, os cadinhos de porcelana foram identificados e tarados na mufla a 600C
por 30 minutos para cada cadinho. A seguir, uma amostra de 10mL de suspenso de
lodo foi filtrada em papel de filtro a vcuo, sendo o papel contendo o lodo colocado dentro
do cadinho, repetindo em triplicata. Foi feito tambm um branco colocando apenas papel
de filtro no cadinho, sem amostra. Os cadinhos foram levados a estufa a 105C por 24h,
sendo resfriados e pesados. Ento, os cadinhos foram levados a mufla a 600C por 11,5h por cadinho, resfriados e pesados.

51
Por diferena de peso entre a amostra depois da calcinagem e depois da
secagem, tendo sido descontado o valor do branco, foi obtido o SSV, ou seja, a massa de
matria orgnica transformada em CO2 e gua, presente em 10mL de amostra. O SST,
ou massa de slidos suspensos totais, em 10mL de amostra tambm foi obtido nesta
determinao atravs da diferena de peso entre a amostra depois da estufa e o peso
inicial do cadinho, j descontado o valor do branco. Fazendo uma simples relao para
1000mL, os slidos foram expressos em gSSV.L-1 e gSST.L-1. Pela diferena entre o
peso da amostra aps calcinagem e o peso inicial do cadinho, foi estimada a
percentagem de matria inorgnica presente no lodo.

4.3.7 Nmero Mais Provvel

A quantificao das populaes bacterianas de Nitrosomonas e Nitrobacter pelo
NMP foi realizada ao longo do perodo de acompanhamento dos reatores, de acordo com
a metodologia previamente descrita no item 4.1.3.

4.3.8 Fluorescent In Situ Hybridisation

Foi realizada a fixao com paraformaldedo, a cada perodo de amostragem, de
acordo com a metodologia explicitada no item 4.1.4.1. Todas as amostras fixadas foram
mantidas congeladas e enviadas para a Faculdade de Cincias, Uruguai, no final do
perodo de acompanhamento dos reatores (225dias), no entanto, devido a no haver
possibilidade de analisar todas as amostras, optou-se por excluir a amostra
correspondente a 150dias. Foram ento analisadados por FISH o inculo, 75 e 225dias
de RI e RII.

4.4 Microscopia
Foi realizada uma anlise de microscopia do lodo de cada reator, buscando
avaliar o tamanho e grau de disperso dos flocos. Para tanto, foi colocada uma gota da
amostra de lodo em lmina apropriada e visualizado em microscpio tico, num aumento
de 100 e 400X. O aparelho conectado a um computador, permitiu que as imagens fossem
digitalizadas e armazenadas. Utilizando uma escala, foi possvel estimar o dimetro dos
flocos.

52
4.5 Cintica de Consumo de Substrato
Para verificar a atividade do lodo, foi realizado um ensaio cintico de consumo dos
substratos amnio e nitrito no final do perodo de acompanhamento dos reatores, tendo
em vista que o processo demonstrou uma estabilidade aps 150dias de operao. O
ensaio foi conduzido nos prprios reatores, alimentando 0,5L de meio em uma nica
etapa (sem distribuir a alimentao), sendo mantidas as condies anxicas borbulhando
gs argnio por um perodo de 15minutos. Logo aps foram retiradas amostras do tempo
zero, a cada 1h e 30minutos nas primeiras 7,5h e, posteriormente, de forma mais
espaada at completar 48h.
As amostras foram filtradas e analisadas com relao a concentrao de NH4+,
NO2- e NO3-, de acordo com as metodologias anteriormente descritas. O volume de
amostra retirado (10mL) era reposto utilizando um meio contendo apenas as solues de
micronutrientes I e II, no qual eram ressuspendidas as clulas filtradas de modo que
pudessem ser retornadas para o reator. Desta forma, pde ser evitado que o volume
reacional e a concentrao celular sofressem variao ao longo do experimento. Atravs
da variao na concentrao de NH4+, NO2-, foi determinada a cintica de consumo de
substrato para cada reator.

53
5. RESULTADOS E DISCUSSO

5.1 Caracterizao do Inculo

Aps um perodo de adaptao de 130dias, o lodo nitrificante apresentou uma
concentrao celular de 1,6g.L-1. O lodo original coletado de um sistema de lodos
ativados da CASAN (Companhia de Abastecimento de gua e Saneamento do Estado de
Santa Catarina), antes do perodo de adaptao, possua uma concentrao celular de
5,96g.L-1. Esta diminuio na concentrao celular pode ter ocorrido devido a morte de
heterotrficos, causada pelas condies seletivas do meio de cultivo, as quais
favoreceram o enriquecimento do lodo em microrganismos autotrficos, bem como pela
retirada de clulas pela prpria alimentao do reator.

5.1.1 Determinao da Atividade Nitrificante

O grfico da Figura 5.1 foi construdo a partir dos dados obtidos durante o ensaio
de respirometria para o lodo nitrificante adaptado (Apndice 1), considerando uma
concentrao celular (X) de 1,6gSST.L-1. Neste grfico esto apresentados a velocidade
especfica de consumo de amnio obtida experimentalmente, bem como os valores
fornecidos pelo modelo cintico de ANDREWS (1968).

Figura 5.1: Velocidade especfica de consumo de substrato em funo da

concentrao de amnio e ajuste pelo modelo de Andrews

54
Como pode ser observado na Figura 5.1, o modelo cintico de ANDREWS (1968)
se ajustou muito bem aos dados experimentais, indicando a existncia de uma efetiva
inibio causada pelo substrato. O valor encontrado para m de 358mgN-NH4.(gSST)-1.d-1
demonstra que o lodo estava com uma atividade nitrificante bastante elevada, indicando
que houve uma boa adaptao da biomassa s condies autotrficas no reator
nitrificante.

5.1.2 NMP e FISH

A Tabela 5.1 expressa os valores encontrados para a quantificao das
populaes, a partir das determinaes de NMP e FISH efetuadas para o lodo nitrificante
adaptado.
Analisando os resultados desta tabela, verifica-se que o nmero de clulas de
Nitrosomonas determinado por NMP est prximo do nmero de oxidadoras de amnio
determinado por FISH (mesma ordem de grandeza). Este resultado parece bastante
razovel, uma vez que, segundo GRAY (1992), a reao de oxidao do amnio
geralmente considerada ser catalisada pelo gnero Nitrosomonas. No entanto, o nmero
de Nitrobacter encontrado por FISH foi superior ao NMP e, inclusive, maior que o nmero
de Nitrosomonas. Considerando que a mxima velocidade de crescimento (mx) de
nitrito-oxidantes menor que de amnio-oxidantes, a 35C e TRH de 1dia (JETTEN et
al., 2001), e que a oxidao de amnio a nitrito a etapa limitante da reao de
nitrificao (GRAY, 1992), esperava-se encontrar uma populao mais abundante de
Nitrosomonas do que de Nitrobacter em um lodo nitrificante.
Tabela 5.1: Resultados de NMP e FISH para o lodo nitrificante adaptado
FISH

cel.mL-1

NMP

cel.mL-1

DAPI

6,0 x 107

Nso1225

6,0 x 105

Nitrosomonas

2,1x105

Nit3

2,0 x 106

Nitrobacter

5,1x103

Amx820

< 103 *

* O limite de deteco do mtodo 103cl.mL-1

55
A anlise FISH, realizada pela Ctedra de Microbiologia da Universidade de la
Repblica - Uruguai, foi baseada no emprego de sondas especficas. O tingimento com
DAPI detecta todas as clulas bacterianas (cora clulas vivas e mortas porque
conservam o DNA), no sendo considerado hibridizao por FISH. A determinao dos
demais gneros de bactrias foi feita com relao ao total de clulas coradas por DAPI. A
sonda Nso1225 detecta todas as bactrias oxidadoras de amnio do grupo beta
Proteobacteria

(gneros

Nitrosomonas,

Nitrosospira,

Nitrosococcus,

Nitrosovibrio,

Nitrosolobus). A sonda Nit3 apenas detecta o gnero Nitrobacter, que em geral o

gnero mais abundante de oxidadoras de nitrito neste tipo de reator (no detecta outros
gneros, como Nitrospira, que em alguns casos pode ser importante). A sonda Amx820
detecta as bactrias anammox descritas at o momento (Candidatus Kuenenia
stuttgartiensis e Brocadia anammoxidans, que ainda no foram isoladas em cultivo puro),
sendo o limite de deteco de 103cl.mL-1.

5.2 Acompanhamento dos Reatores

5.2.1 Concentrao Celular e Microscopia
Ao longo do perodo de lavagem celular do reator RI (9dias), foi feito um
acompanhamento dirio da concentrao celular atravs da determinao dos slidos em
suspenso no lodo, cujos resultados so representados graficamente na Figura 5.2.

3,5
3

SST (g/L)

2,5
2

X = 2,947 e

1,5

-0,1724 t

1
0,5
0
0

10

Tempo (dias)
Figura 5.2: Variao da concentrao de SST durante a lavagem do reator RI

56
SCHMIDELL (2001) descreveu o balano de massa para as clulas em um reator
contnuo homogneo sem reciclo de clulas. Embora os reaotes utilizados sejam do tipo
RBS, ser aplicado o mesmo equacionamento por razo de simplificao, conforme
apresentado a seguir:

dX
= X DX
dt
Essa equao integrada fornece:

X = Xi . e

( -D) t

Onde: Xi = concentrao celular inicial

X= concentrao celular no instante t
Ento, a partir da equao exponencial obtida com o ajuste dos dados
experimentais, pde ser calculado o valor de :

X = 2,947e

-0,1724 t

( - D) = -0,1724
D = Q / V = 0,5L.d-1/ 2,5L = 0,2d-1
= 0,0276d-1

O valor da vazo especfica de alimentao maior do que a velocidade de

crescimento (D>) ocasiona a lavagem, o que fica evidenciado pela intensa reduo da
concentrao celular observada na Figura 5.2. O valor de de 0,0276 equivale a um
tempo de duplicao de 25 dias, superior ao tempo de duplicao de 11 dias das
bactrias anammox que so citadas pela literatura como bactrias de crescimento muito
lento (STROUS et al., 1998). Deve-se considerar que a lavagem celular no uma
condio favorvel ao desenvolvimento das populaes microbianas, o que explica o
crescimento celular extremamente lento neste perodo.
Na Tabela 5.2 so apresentados os valores de SST encontrados desde a partida
at o perodo de 225dias de acompanhamento dos reatores RI e RII. Fica evidente uma
perda de clulas, em ambos os reatores, no entanto mais acentuada no reator RI mesmo
aps o trmino do perodo de lavagem. Embora o tempo de duplicao celular em

57
condies anxicas seja bastante lento, esperava-se verificar algum aumento na
concentrao celular, tendo em vista o longo perodo de incubao.
Tabela 5.2: Resultados da determinao de SST durante o
acompanhamento dos reatores.
SST (g.L-1)
Perodo

RI

RII

2,91

1,86

Aps lavagem

0,65

75

0,44

1,46

150

0,41

1,11

225

0,28

1,43

A anlise microscpica do lodo revelou flocos pequenos e bastante dispersos,

conforme pode ser verificado nas Figuras 5.3 e 5.5, com dimetros variando de 50 a
90m, tanto para o reator RI quanto para o reator RII. De acordo com VAZOLLER (1988),
um floco que apresente um pequeno dimetro caracteriza um lodo disperso e de difcil
sedimentao; um dimetro de floco mdio a grande (100 a 300m) encontrado em
lodos com boas condies de sedimentabilidade. Isto explica a dificuldade de
enriquecimento da biomassa, pois devido a sedimentabilidade inadequada do lodo,
muitas clulas permaneciam em suspenso no meio de cultivo no perodo sem agitao e
acabavam sendo removidas com o sobrenadante durante a retirada do efluente dos
reatores.
Somado a isto est o fato de que bactrias em condies anxicas, de um modo
geral, apresentam um crescimento muito lento; mais especificamente, bactrias
anammox apresentam um tempo de duplicao de 11dias. Nestes casos, segundo
SCHMIDT et al. (2002), reatores com um sistema de reteno de biomassa muito
eficiente so necessrios para o enriquecimento. Sistemas como discos rotatrios ou
reatores com material suporte, parecem ser uma boa alternativa, uma vez que a
biomassa permanece fortemente aderida, evitando que as clulas sejam carregadas com
a vazo de alimentao e favorecendo, assim, o enriquecimento da cultura.
As Figuras 5.4 e 5.6, fornecem uma imagem ampliada de flocos individuais
(aumento de 400X), permitindo uma melhor visualizao do tipo de estrutura formada.

58

(a)

(b)

Figura 5.3: Microscopia tica mostrando a estrutura dos flocos do reator RI com
aumento de 100X (medida estimada do dimetro do floco maior em (a): 51x57m e em
(b): 80x88m)

Figura 5.4: Microscopia tica mostrando a estrutura do floco

do reator RI com aumento de 400X

59

(a)

(b)

Figura 5.5: Microscopia tica mostrando a estrutura dos flocos do reator RII com
aumento de 100X (medida estimada do floco maior em (a): 76x37m e em (b):
50x51m)

Figura 5.6: Microscopia tica mostrando a estrutura do floco

do reator RII com aumento de 400X

60
Os dados obtidos para a anlise de slidos suspensos totais por diferentes
metodologias, para a amostragem realizada no perodo de 225d de monitoramento dos
reatores, bem como a determinao de slidos suspensos volteis, so apresentados na
Tabela 5.3. Pode ser observado que para ambos os reatores h grande proximidade
entre os resultados de SST, demonstrando que a tcnica utilizando microondas (proposta
por A. K. Gombert), alm de muito mais prtica e rpida que a determinao em estufa
(conforme proposto pelo S. Methods), apresenta boa confiabilidade, conforme j havia
sido verificado em outros testes comparativos realizados no LTE Laboratrio de
Tratamento de Efluentes do Depto de Engenharia Qumica e de Alimentos da UFSC.
Tabela 5.3: Dados comparativos das anlises de slidos em suspenso
Amostra

SST (g.L-1)
(Microondas)*

SST (g.L-1)

SSV (g.L-1)

Standard Methods Standard Methods

RI 225d

0,28

0,30

0,26

RII 225d

1,43

1,47

0,63

* indicao de Andreas Karoli Gombert Depto Eng. Qumica da Escola Politcnica/USP

Considerando que o SSV representa a massa de matria orgnica presente na

amostra (transformada em CO2 e gua), e que o nico carbono orgnico presente
aquele incorporado na biomassa, esta anlise quantifica indiretamente o material celular.
Para o reator RI, o valor de SSV est bastante prximo do SST, indicando que a maior
parte do material em suspenso no lodo constituda de clulas. No entanto, para o
reator RII, o valor encontrado para o SSV representa menos de 50% dos slidos
suspensos totais, o que indica uma considervel proporo de material inorgnico em
suspenso no lodo.

5.2.2 Acompanhamento das Formas Nitrogenadas

As Figuras 5.7 e 5.8 apresentam graficamente os resultados obtidos para os

reatores RI e RII, respectivamente, durante o acompanhamento analtico das formas
nitrogenadas amnio, nitrito e nitrato, a partir das anlises de entrada (meio de
alimentao) e sada (sobrenadante).

61

Concentrao (mg/L)

140

N-NH4 E

N-NO2 E

120

N-NO3 E
N-NH4 S

100

N-NO2 S
N-NO3 S

80
60
40
20
0
0

25

50

75

100

125

150

175

200

225

Tempo de Operao (dias)

Figura 5.7: Concentrao das formas nitrogenadas na entrada (E)

e sada (S) do reator RI

140

N-NH4 E

N-NO2 E

120

N-NO3 E

Concentrao (mg/L)

N-NH4 S

100

N-NO2 S
N-NO3 S

80
60
40
20
0
0

25

50

75

100

125

150

175

200

Tempo de Operao (dias)

Figura 5.8: Concentrao das formas nitrogenadas na entrada (E)

e sada (S) do reator RII

225

62
A fase 1 representada nas Figuras 5.7 e 5.8 para o reator RI e RII,
respectivamente, foi caracterizada por uma grande oscilao do sistema, tendo em vista
a variao das concentraes de sada das formas nitrogenadas de amnio, nitrito e
nitrato (N-NH4+, N-NO2- e N-NO3-). Isto justificado pelo fato de as populaes
microbianas estarem em um perodo de adaptao e seleo, uma vez que o inculo
partiu de um lodo nitrificante, ou seja, os microrganismos estavam sob aerao e
recebendo um meio contendo amnio como nico substrato. Ento, o lodo nitrificante foi
colocado em reatores anxicos e passou a ser alimentado com um meio contendo
amnio e nitrito, constituindo uma condio totalmente adversa devido ao estresse da
ausncia de oxignio e presena de nitrito no meio de cultivo.
Considerando que a rota metablica dos microrganismos est na dependncia de
seu sistema enzimtico (YE & THOMAS, 2001), parece razovel que neste perodo inicial
tenha sido necessria uma readequao do metabolismo microbiano s novas condies
impostas. Aqueles cujo sistema enzimtico no apresenta flexibilidade, tambm no
apresentaro capacidade de adaptao, sendo levados morte ou permanecendo num
estado de inrcia at encontrar alguma condio favorvel, como a entrada de oxignio
no reator.
A lavagem inicial de clulas aplicada em RI parece ter acelerado e/ou acentuado a
seleo de microrganismos, originando uma biomassa muito mais especializada no
processo de interesse: oxidao anaerbia do amnio via nitrito, sob condies anxicas,
tendo em vista que houve um concomitante consumo destes substratos durante todo o
perodo de monitoramento do reator (Figura 5.7). Provavelmente, as clulas que no se
adaptaram nos primeiros dias ou morreram, foram sendo removidas do reator RI durante
o perodo de lavagem. J no reator RII no foi realizada lavagem e todas as clulas
permaneceram retidas, podendo ter sido prejudicando o desenvolvimento de bactrias
anaerbias capazes de oxidar concomitantemente amnio e nitrito. Conforme pode ser
observado na Figura 5.8, o consumo de N-NH4+ (diferena entre entrada e sada) em RII
foi sempre muito superior ao de N-NO2-.
A fase 2 marcada por uma sobrecarga de nitrito no sistema, devido a uma
concentrao de N-NO2- no meio de alimentao acima de 100mg.L-1. Alm disso, nesta
mesma fase pode-se observar um aumento crescente do nitrato na sada de RI e RII (a
concentrao de N-NO3 aumentou cerca de trs vezes neste perodo, em ambos os
reatores). Parece razovel considerar que a elevao da concentrao de nitrito tenha
afetado o sistema enzimtico, causando uma mudana no metabolismo microbiano. O

63
aumento na concentrao de nitrato pode ter sido favorecido por uma entrada de ar nos
reatores, levando a um nitratao pelas bactrias oxidadoras de nitrito.
Inmeras pesquisas tm demonstrado a toxicidade do nitrito em relao aos
microrganismos. STEIN & ARP (1998), sugeriram uma inativao irreversvel de amniooxidantes por nitrito a uma concentrao de 420mg.L-1 (equivalente a 128mgN-NO2-1.L-1).
MULLER et al. (1995) reportaram uma reduo metade da velocidade de oxidao de
amnio na faixa de 42-70 mgN-NO2-.L-1 quando comparada com 0-14 mgN-NO2-.L-1.
Durante o estudo da fisiologia microbiana da comunidade anammox, STROUS et al.
(1998) verificaram uma inibio da oxidao anaerbia do amnio (via nitrito) por
concentraes de nitrito acima de 20mM, embora quando a concentrao permaneceu
acima de 5mM (70mgN-NO2-.L-1) por um longo perodo (12h), a atividade foi
completamente perdida. Considerando que a concentrao de nitrito no meio de
alimentao estava em torno de 110mgN-NO2-.L-1 no perodo de sobrecarga, este fato
pode ter afetado as populaes microbianas presentes, porm de forma reversvel, uma
vez que a atividade foi recuperada posteriormente.
Segundo TIEDJE (1988), apud PRATES (1997) a reduo desassimilatria do
nitrato a amnio seria benfica para a clula bacteriana, pois constituiria um mecanismo
de retirada do nitrito acumulado no meio. No entanto, caso estivesse ocorrendo a RDNA,
resultaria em um consumo de nitrato ou nitrito e concomitante aumento na concentrao
de amnio. No entanto, neste perodo de desequilbrio (fase 2, Figura 5.8) foi verificado
um aumento na concentrao de nitrato, no parecendo ter havido remoo do mesmo.
Alm disso, um aumento na concentrao de amnio foi verificado apenas no perodo
entre 74 e 107dias, o qual parece acompanhar o aumento da entrada de amnio no
reator.
Por razo da toxicidade do nitrito, talvez tenha sido acionado um sistema
enzimtico para oxidao do nitrito a nitrato, como um mecanismo de defesa microbiano,
de forma a diminuir a condio de inibio imposta ao meio de crescimento. Assim, a
oxidao do amnio via nitrito, seja ela realizada por amnio-oxidantes do gnero
Nitrosomonas, bactrias anammox ou outra cultura, provavelmente tenha sido
minimizada ou ficado temporariamente inibida.
Na fase 3, como pode ser observado nas Figuras 5.7 e 5.8, os reatores
demonstraram um perfil de relativa estabilidade, podendo ser observado algumas
diferenas peculiares entre RI e RII. A partir de 125dias de operao do reator RI, passou

64
a haver um consumo de amnio e nitrito quase na mesma proporo (ao redor de
30mgN.L-1) e a concentrao de nitrato na sada esteve ao redor de 25mgN.L-1,
resultando em uma remoo da ordem de 35mgN.L-1 . J no reator RII, a partir do incio
da terceira fase (correspondente a 105dias), embora tenha sido verificado um consumo
de amnio de cerca de 30mgN.L-1, como em RI, houve um baixo consumo de nitrito e a
concentrao de nitrato na sada permaneceu abaixo de 10mgN.L-1.
Foram, ento, calculadas as relaes molares entre nitrito consumido e nitrato
formado por mol de amnio, para tentar delinear o processo de remoo de nitrognio
desenvolvido nos reatores. Nas Figuras 5.9 e 5.10 so apresentados os resultados
obtidos a partir dos dados experimentais, para os reatores RI e RII, respectivamente,
comparativamente as relaes estequiomtricas definidas para o processo anammox
(van de GRAAF et al., 1996; STROUS et al., 1998):
1 NH4+ + 1,32 NO2- + 0,066 HCO3- + 0,13 H+ 1,02 N2 + 0,26 NO3- + 0,066
CH2O0,5N0,15 + 2,03 H2O

2,50

2,00

NO2/NH4 C
NO3/NH4 F

NO2/NH4 T
NO3/NH4 T

Relao molar

1,50
1,00
0,50
0,00
-0,50

25

50

75

100

125

150

175

200

225

-1,00
-1,50
-2,00
-2,50

Tempo de operao (dias)

Figura 5.9: Relaes molares de consumo de substrato e formao de produto

no reator RI em comparao a estequiometria do processo anammox
(C = consumido; F = formado; T = terico)

65

1,50

NO2/NH4 C

NO3/NH4 F

Relao molar

1,00

NO2/NH4 T
NO3/NH4 T

0,50
0,00
0

25

50

75

100

125

150

175

200

225

-0,50
-1,00
-1,50

Tempo de operao (dias)

Figura 5.10: Relaes molares de consumo de substrato e formao de

produto no reator RII em comparao a estequiometria do processo anammox.
(C = consumido; F = formado; T = terico)

Observando o grfico da Figura 5.9, verifica-se que, ao longo de quase todo o

perodo de acompanhamento, a relao molar de nitrito consumido por mol de amnio
permaneceu abaixo do valor terico que de 1,32 mol de NO2 por mol de NH4, de acordo
com a estequiometria do processo anammox. Por outro lado, a relao molar de nitrato
formado por mol de amnio, principalmente nas fases 1 e 2, esteve sempre acima do
valor terico de 0,26 mol de NO3 por mol de amnio. Isto pode indicar que nestas fases
parte do nitrito e amnio estavam sendo oxidados a nitrato, enquanto outra parte poderia
estar sendo oxidada a nitrognio gasoso, evidenciando a possibilidade dos dois
processos estarem se desenvolvendo simultaneamente: nitrificao e oxidao anaerbia
do amnio. Entretanto, na fase 3, a mdia de consumo de nitrito por mol de amnio foi ao
redor de 1, muito prxima do valor terico que de 1,32. Da mesma forma, a produo
de nitrato foi de 0,5 em relao ao consumo de amnio, enquanto a terica de 0,26,
indicando que algum processo aerbio poderia estar ocorrendo.
A nitrificao poderia estar ocorrendo durante a decantao do reator, uma vez
que esta operao era realizada mantendo uma abertura para a atmosfera, de modo que
o ar pudesse equilibrar a presso negativa causada pelo bombeamento do sobrenadante.
Caso no fosse tomada esta medida, a diferena de presso entre o meio interno e
externo poderia ocasionar a ruptura do reator. Neste momento, as bactrias nitritooxidantes, provavelmente, encontravam um meio favorvel para que seu sistema

66
enzimtico pudesse ser ativado. Logo aps a decantao, o gs argnio borbulhado no
meio restabelecia as condies anxicas, induzindo a utilizao do nitrito como aceptor
de eltrons pela cultura nitrificante ou tornando o meio favorvel para atividade da
populao de anaerbias amnio-oxidantes.
Conforme j discutido anteriormente, o consumo de nitrito no reator RII foi muito
baixo ao longo de praticamente todo o perodo de acompanhamento, embora tenha
havido um considervel consumo de amnio. Portanto, uma relao molar de nitrito
consumido por mol de amnio muito aqum do valor terico de 1,32 mol de NO2 por mol
de NH4, de acordo com a estequiometria do processo anammox, j era esperada, o que
pode ser observado no grfico da Figura 5.10. Em contraste com o RI, a relao molar de
nitrato formado por mol de amnio de 0,15 obtida em RII , esteve abaixo do valor terico
de 0,26 mol de NO3 por mol de amnio, com exceo ao perodo de desequilbrio do
sistema (39 a 92dias).
Tendo em vista a concentrao celular mais elevada, assim como uma maior
variedade de populaes microbianas no reator RII em relao ao RI, provvel que
tenha havido uma maior competio pelo oxignio que viesse a entrar no reator. Dessa
forma, poderia estar ocorrendo uma nitrificao parcial de amnio a nitrito, a qual
consumiria todo o oxignio disponvel, impossibilitando a formao de nitrato pela ao
de nitrito-oxidantes. Embora parte do nitrito e amnio estivesse sendo oxidada a
nitrognio gasoso quando as condies anxicas eram restabelecidas, ainda permanecia
um residual de nitrito relativamente elevado, aparentando ter havido um consumo mnimo
do mesmo. Esta hiptese explicaria os baixos nveis de nitrato formado, bem como o
consumo de amnio (aparentemente) muito superior ao de nitrito.
A biomassa anammox considerada estritamente anxica, tendo sido
evidenciado por STROUS et al. (1999) uma perda completa de atividade, mas de forma
reversvel, mesmo em concentraes muito baixas de oxignio. Uma vez que o sistema
operacional utilizado neste trabalho no possibilitava a ausncia permanente de oxignio,
a presena deste, mesmo que em baixas concentraes, pode ter inibido a oxidao
anaerbia do amnio nos reatores. Em decorrncia disso, talvez a atividade das bactrias
anammox esteja associada a outros grupos microbianos, cuja atividade consome o
oxignio do ambiente em que elas se encontram, propiciando condies anxicas no
sistema. Possivelmente, por esta razo as bactrias anammox no tenham sido isoladas
em culturas puras at o momento.

67
POLANCO et al. (2001) descrevem a reduo desassimilatria do sulfato (RDS)
como uma alternativa para remoo simultnea de nitrognio e enxofre, sob condies
anaerbias. Os mesmos autores apontam a vantagem energtica do processo em
relao a outros processos anxicos. Considerando que neste trabalho o meio de cultivo
possui sulfato de amnio na sua composio, bactrias redutoras de sulfato poderiam
estar utilizando o hidrognio como doador e sulfato como aceptor final de eltrons para
obteno de energia. Ainda, sulfito poderia ser doador de eltrons, sendo reoxidado a S0
ou sulfato por bactrias como o Thiobacillus denitrificans usando nitrato como aceptor de
eltrons. A RDS seria uma rota de desnitrificao alternativa, entretanto, nitrato estaria
sendo convertido a amnio.
Embora tenha sido observado aumento na concentrao de amnio em alguns
pontos isolados durante o monitoramento de RII, este parece acompanhar a oscilao da
concentrao de entrada. No entanto, quando se tem a possibilidade de mais de um
processo estar ocorrendo num mesmo reator, fica difcil monitorar a formao e consumo
de todos os compostos envolvidos, uma vez que h uma dinmica de reaes e
interconverso entre os componentes presentes no meio. Considerando que o inculo
utilizado partiu de uma estao de tratamento de esgoto domstico, mesmo aps o
perodo de adaptao do lodo nitrificante, este deveria conter inmeros gneros
microbianos, de forma que no seria surpreendente a presena de bactrias do tipo
Thiobacillus denitrificans nos reatores, principalmente em RII, o qual no sofreu uma prseleo com lavagem de clulas.
A seguir, nas Figuras 5.11 e 5.12, so apresentados os grficos de eficincia de
remoo de nitrognio durante o monitoramento dos reatores, com relao s cargas de
entrada e sada de RI e RII, respectivamente.

68

Sada

45

90

% Remoo

40

Carga (mgN/L.d)

100

Entrada

80

35

70

30

60

25

50

20

40

15

30

10

20

10

0
1

10 14 21 36 44 64 71 78 84 100 114 127 134 141 148 155 161 170 178 189 197 203 210 217 225

Tempo de Operao (dias)

Figura
ra 5.11: Eficincia de remoo de nitrognio com relao a carga de entrada e
sada do reator RI

Entrada

100

45

Sada

90

40

% Remoo

80

35

70

30

60

25

50

20

40

15

30

10

20

10

Eficincia (%)

Carga (mgN/L.d)

50

0
1

16

24

39 46

53

60

72

80 107 114 121 128 135 141 149 157 162 171 179 186 193 200 211 225

Tempo de Operao (dias)

Figura 5.12: Eficincia de remoo de nitrognio com relao a carga de entrada e

sada do reator RII

Eficincia (%)

50

69
Analisando-se a Figura 5.11, possvel observar um perodo de oscilao do
sistema at o 134 dia de operacionalizao do reator RI. A partir da at o final do
perodo de acompanhamento (225dias), a remoo de nitrognio foi da ordem de
10mgN.L-1.d-1, correspondente a uma eficincia de remoo entre 30 e 40%,
caracterizando um perfil estvel do processo.
Comparando os resultados apresentados pela Figura 5.12 para o RII com a Figura
5.11, referente ao RI, verifica-se que inicialmente o reator RII apresentou uma maior
eficincia de remoo, o que provavelmente se deve a maior concentrao celular e
variedade microbiana presente, uma vez que este no foi submetido a lavagem inicial.
Nos ltimos 75dias de acompanhamento, entre os dias 150 e 225, o RII apresentou uma
remoo em torno de 5mgN.L-1.d-1, correspondente a uma eficincia de remoo
aproximadamente constante e em torno de 20%. Resultado similar foi reportado por
SHRESTHA et al. (2000), que obtiveram um mximo de 22% de remoo de nitrognio
empregando cultura pura de Nitrosomonas europaea sob condies de oxignio limitante
(0,6mgO2/L).
Tendo em vista os resultados anteriormente apresentados com relao a
determinao de SST, verifica-se que embora o reator RI tenha demonstrado uma
diminuio acentuada da concentrao celular, pode ser observado na Figura 5.13 um
aumento da remoo de nitrognio especfica, em intervalos de 75dias. Em RII, a
remoo especfica mdia ficou em torno de 5mgN.gSST-1.d-1 ao longo de todo o perodo
de acompanhamento e em RI, a remoo especfica mdia que inicialmente estava em
torno de 10 passou para 25mgN.gSST-1.d-1 no intervalo de 150 a 225dias de
monitoramento. Estes resultados indicam fortemente o enriquecimento da biomassa
presente no reator RI em microrganismos especializados na oxidao anaerbia do
amnio.

70

Remoo Especfica (mgN/gSST.d)

30

RI
25

225d

RII

20

150d

15

75d

10
5

80
10
0
12
0
13
4
14
3
15
5
16
3
17
8
19
1
20
3
21
3
22
5

71

59

36

15

10

Tempo de operao (dias)

Figura 5.13: Valores mdios da remoo especfica de nitrognio a cada

intervalo de 75dias

5.2.3 Acompanhamento da DQO

A Figura 5.14 expressa os valores de DQO determinados para o reator RI (a) e RII
(b), no perodo de 225dias de acompanhamento. O objetivo desta determinao era
monitorar a morte celular, a qual seria evidenciada por um aumento na DQO de sada
devido liberao do carbono que faz parte da composio qumica da biomassa.
Reator RI
150

150

DQO E

125
100
75
50
25
0

(b)
DQO E
DQO S

125

DQO S
DQO (mgDQO/L)

DQO (mgDQO/L)

Reator RII

(a)

100
75
50
25
0

25

50

75 100 125 150 175 200 225

Tempo de Operao (dias)

25 50

75 100 125 150 175 200 225

Tempo de Operao (dias)

Figura 5.14: Valores de DQO em RI (a) e RII (b) durante o perodo de companhamento.

71
Levando-se em considerao que no h fonte de carbono orgnico, os valores
de DQO do meio de alimentao se devem basicamente ao nitrito, o qual sabido
expressar alguma DQO. Os valores de entrada para RI e RII esto na mesma faixa
(80mgO2.L-1), o que era esperado devido a se tratar do mesmo meio de alimentao.
Com relao sada, podem ser verificados alguns pontos em que os valores de DQO
so maiores que a entrada, como nos primeiros dias de operao de RI e RII, em que as
clulas ainda estavam se adaptando ao meio e no apresentavam um consumo efetivo
do substrato, e entre 50 e 75dias para RII, provavelmente por apresentar nveis mais
elevados de nitrito, o qual acumulou no reator neste perodo devido a um desequilbrio do
sistema (nitrito na sada maior do que na entrada), conforme visto anteriormente no
grfico de acompanhamento das formas nitrogenadas (Figura 5.8).
Considerando que o maior aumento observado (Figura 5.14 b) foi da ordem de
50mgDQO, possvel constatar que isto se deva muito mais ao nitrito presente no meio
do que a morte celular. Esta constatao est de acordo com a justificativa apresentada
no item 5.2.1, para a diminuio da concentrao celular. Conforme discorrido
anteriormente, a perda de clulas se deveria a inadequada sedimentabilidade do lodo.
Uma vez que os reatores foram inoculados com lodo j adaptado a condies
autotrficas, era esperada uma inibio microbiana devido ausncia de oxignio e
presena de nitrito, mas considervel morte apenas seria observada caso as condies
se tornassem extremamente desfavorveis, como excesso de temperatura e quedas ou
elevaes bruscas de pH. Neste caso, a determinao da DQO tambm serviria como
um indicativo de descontrole do sistema.

5.2.4 Acompanhamento da Alcalinidade

Nas Figuras 5.15 e 5.16 so apresentados os valores encontrados pela
determinao da alcalinidade dos reatores RI e RII, respectivamente.
A alcalinidade de entrada mdia foi de 230mgCaCO3.L-1, a qual provm do
bicarbonato de potssio presente no meio de alimentao. Considerando que o
bicarbonato constitui-se na nica fonte de carbono para incorporao celular, o consumo
de alcalinidade indica o consumo de carbono inorgnico, o qual est diretamente
relacionado com o crescimento da biomassa.

72
Para o reator RI, o consumo de alcalinidade ao longo do perodo de
acompanhamento foi de aproximadamente 50mgCaCO3.

350

E RI
S RI

Alcalinidade (mgCaCO3/L)

300
250
200
150
100
50
0
0

50

100

150

200

250

Tempo de Operao (dias)

Figura 5.15: Valores de alcalinidade de entrada (E) e sada (S) do reator RI

350

E RII
S RII

Alcalinidade (mgCaCO3/L)

300
250
200
150
100
50
0
0

50

100

150

200

250

Tempo de Operao (dias)

Figura 5.16: Valores de alcalinidade de entrada (E) e sada (S) do reator RII

73
Em RII, h um perodo inicial e final de maior consumo de alcalinidade, que
coincide

com

as

maiores

concentraes

celulares,

conforme

observado

pela

determinao de SST (Tabela 5.2). O menor consumo de alcalinidade foi observado no

perodo entre 125 e 175dias, o qual coincide com uma elevao da concentrao de
amnio na sada do RII (Figura 5.8) e com a menor concentrao celular determinada
(Tabela 5.2, 150dias). Isto parece indicar um perodo de estagnao da biomassa, ou
seja, talvez o metabolismo tenha sido inibido ou retardado neste perodo, devido
diminuio no consumo de amnio e baixo crescimento. No h evidncia das possveis
causas desta inibio. De forma geral, comparando os dois reatores, o consumo de
alcalinidade no reator RII foi superior ao verificado em RI.
Durante o estudo ecofisiolgico da comunidade anammox em um reator SBR,
STROUS et al. (1998) determinaram os parmetros de rendimento da biomassa como
sendo de 0,066 0,01 molC.(mol NH4+)-1. Buscando comparar os dados experimentais
com este valor terico, calculou-se o consumo molar de carbono a partir do consumo de
alcalinidade em mgCaCO3 e relacionou-se com o consumo molar de amnio, para ambos
os reatores. Os resultados obtidos para RI e RII so apresentados graficamente na
Figura 5.17.

12
RI

mol C / mol NH4

10

RII

8
6
4
2
0
0

50

100

150

200

250

Tempo de Operao (dias)

Figura 5.17: Relao molar de consumo de carbono e amnio

74
Analisando-se o grfico da Figura 5.17, observa-se uma certa disperso dos
dados em ambos os reatores. De forma geral, a relao molar de consumo de mol de C
por mol de NH4+ esteve muito acima da relao proposta por STROUS et al. (1998) para
cultura anammox. Este resultado indica que o lodo dos dois reatores composto por uma
populao mista, na qual os microrganismos em maior proporo apresentam velocidade
de crescimento muito superior ao de bactrias anammox, o que explicaria o elevado
consumo de carbono inorgnico calculado a partir do consumo de alcalinidade. Mesmo
no reator RI, que sofreu uma lavagem inicial de clulas, visando a seleo, o lodo est
longe de poder ser comparado com uma cultura pura.
Conforme representado na Figura anterior, at cerca de 50dias, a relao molar
de consumo foi baixa, provavelmente devido a adaptao da biomassa. No perodo de 50
a 200dias, a relao oscilou entre 2 e 6 molC.molNH4+, indicando uma certa instabilidade.
Nos ltimos 25dias de acompanhamento dos reatores percebe-se uma elevao
acentuada no consumo de carbono em relao ao amnio para RII (Figura 5.17), o que
est relacionado com o aumento da concentrao celular verificada neste mesmo perodo
pela determinao de SST (Tabela 5.2, 225dias). Isto parece indicar um enriquecimento
da biomassa o qual deve ter ocorrido em ambos reatores, embora no tenha sido
verificado aumento da concentrao celular em RI, que pode ser explicado por uma maior
perda de clulas devido inadequada sedimentao do lodo ou pela menor preciso do
mtodo a baixas concentraes de slidos.

5.2.3 Quantificao e Caracterizao das Populaes

As Tabelas 5.4 e 5.5 apresentam os resultados da determinao do nmero mais

provvel de bactrias oxidadoras de amnio e nitrito, aqui denominadas como
Nitrosomonas e Nitrobacter, para os reatores RI e RII, respectivamente. A partir dos
resultados de NMP.mL-1 e dos dados de SST disponveis na Tabela 5.2, calculou-se o
NMP.gSST-1 e o log do NMP.gSST-1, cujos valores obtidos constam nas Tabelas a seguir.

75
Tabela 5.4: Nmero mais provvel de Nitrosomonas e Nitrobacter em RI
Dias

Nitrosomonas
NMP.mL-1

NMP.gSST-1

Nitrobacter
NMP.mL-1

log
NMP.gSST

NMP.gSST-1

-1

log
NMP.gSST-1

0*

2,1x105

1,3x108

8,11

5,1x103

3,5x106

6,54

9**

1,4x105

2,1x108

8,32

1,8x103

2,7x106

6,43

75

9,2x105

2,1x109

9,32

1,1x103

2,5x106

6,40

2,2x10

5,4x10

10

3,2x10

7,8x10

7,89

1,7x10

6,8x10

10

4,0x10

1,6x10

7,20

150
225

10,70
10,80

* Inculo (lodo nitrificante adaptado); ** Final do perodo de lavagem

Tabela 5.5: Nmero mais provvel de Nitrosomonas e Nitrobacter em RII

Dias

Nitrosomonas
NMP.mL-1

NMP.gSST-1

Nitrobacter
NMP.mL-1

log
NMP.gSST

NMP.gSST-1

-1

log
NMP.gSST-1

0*

2,1x105

1,3x108

8,11

5,1x103

3,5x106

6,54

75

2,2x106

1,5x109

9,18

3,1x102

2,1x105

5,32

9,2x10

9,92

1,9x10

1,7x10

4,23

1,4x10

3,2x10

2,2x10

5,34

150
225

8,3x10
9,8x10

10

11,00

* Inculo (lodo nitrificante adaptado)

A partir dos valores de NMP.gSST-1 do reator RI, percebe-se que a lavagem

celular realizada por um perodo de 9dias propiciou um aumento do NMP de
Nitrosomonas em cerca de 1,6 vezes em relao ao inculo, enquanto o NMP de
Nitrobacter sofreu uma reduo da ordem de 1,3 vezes. O objetivo da lavagem era de
fazer prevalecer o nmero de oxidadoras de amnio em relao as nitrito oxidantes, de
modo que o nitrito no fosse levado a nitrato e ficasse disponvel para oxidao
anaerbia do amnio. Alm disso, tambm se desejava alcanar uma pr-seleo
microbiana, de modo a reduzir a competio pelo substrato e tornar as clulas mais
especficas para a oxidao anaerbia do on amnio.

76
A lavagem parcial de nitrito oxidantes do reator RI foi favorecida pela temperatura,
pois, segundo JETTEN et al. (2001) a 35C e um curto TRH, a mxima velocidade de
crescimento (mx) de bactrias nitrito-oxidantes aproximadamente duas vezes menor
que de amnio-oxidantes (0,5 e 1dia-1, respectivamente). Ento, a reduo no nmero de
Nitrobacter s no foi maior devido ao tempo de reteno hidrulico de 5dias, pois os
autores citados consideram um TRH de aproximadamente 1dia. Dessa forma, uma
lavagem mais efetiva de nitrito-oxidantes poderia ser alcanada utilizando um TRH mais
baixo, de forma a minimizar a formao de nitrato no reator a qual se manteve acima do
esperado, conforme discutido anteriormente.
Aps enriquecimento de uma cultura de microrganismos anaerbios amniooxidantes em reator de leito fluidizado, o mtodo de NMP mostrou que bactrias
nitrificantes aerbias estiveram presentes no lodo, mas o nmero permaneceu constante
e em torno de 9 5 x103 clulas.(mgSV)-1 de amnio oxidantes e 1 0,9 x103
clulas.(mgSV)-1 de nitrito oxidantes (van de GRAAF et al., 1996). Calculando-se os
valores de NMP.(mgSV)-1 para RI e RII 225dias, a partir dos valores de NMP.mL-1 das
Tabelas 5.4 e 5.5 e dos valores de SSV da Tabela 5.3 (convertidos para mg.L-1),
encontrou-se 6x104 clulas.(mgSV)-1

de Nitrosomonas e 1x101clulas.(mgSV)-1 de

Nitrobacter para RI e 2x105 clulas.(mgSV)-1 de Nitrosomonas e 5x10-1clulas.(mgSV)-1

de Nitrobacter para RII.
Pode-se perceber que o nmero de amnio oxidantes presente nos reatores SBR
em estudo mais elevado do que o encontrado por van de GRAAF et al. (1996), por
outro lado o nmero de nitrito oxidantes bem menor. Esta diferena pode ser devido ao
tipo de inculo utilizado e condies de seletividade empregadas. Neste estudo o inculo
adaptado partiu de um reator nitrificante (sob aerao), que j apresentava inicialmente
um nmero de Nitrosomonas em maior proporo do que de Nitrobacter. Enquanto os
autores citados utilizaram um inculo de um reator desnitrificante (anaerbio), sendo a
quantificao celular por NMP realizada aps enriquecimento da cultura em
microrganismos anaerbios amnio-oxidantes.
A partir dos valores de log do NMP.gSST-1 (Tabelas 5.4 e 5.5) foram construdos
os grficos das Figuras 5.18 e 5.19, os quais permitem uma melhor visualizao do
desenvolvimento das populaes durante o acompanhamento dos reatores RI e RII.

77

12

Nitrosomonas
11

Nitrobacter

log do NMP/gSST

10
9
8
7
6
5
4
0

75

150

225

Amostragem (dias)

Figura 5.18: Desenvolvimento das populaes de Nitrosomonas e

Nitrobacter durante o acompanhamento do reator RI

12
11

Nitrosomonas
Nitrobacter

log do NMP/gSST

10
9
8
7
6
5
4
0

75

150

225

Amostragem (dias)

Figura 5.19: Desenvolvimento das populaes de Nitrosomonas e

Nitrobacter durante o acompanhamento do reator RII

78
Analisando-se a Figura 5.18, pode-se observar um enriquecimento da populao
de Nitrosomonas ao longo dos 225dias de acompanhamento do reator RI. Com relao a
populao de Nitrobacter, houve alguma diminuio at os 75dias iniciais, mas aos
150dias parecem ter se desenvolvido novamente e aumentado em nmero. Mesmo tendo
ainda sofrido alguma diminuio, no final do perodo de acompanhamento o nmero
estava acima do inicial.
LAANBROEK & GERARDS afirmam que as bactrias nitrito-oxidantes so mais
afetadas que as amnio-oxidantes pelas baixas concentraes de oxignio no meio,
devido a apresentarem maiores valores de constante de afinidade pelo oxignio (Km).
Considerando que o Km representa o inverso da afinidade, quanto maior o Km maior a
dificuldade da clula se ligar ao oxignio para processar a reao. Ento, em baixas
concentraes de oxignio, as bactrias nitrito-oxidantes no conseguem competir pelo
oxignio com amnio-oxidantes, sendo esperado um maior desenvolvimento das clulas
de Nitrosomonas em relao as Nitrobacter, conforme verificado pelo NMP.
Estudando uma cultura mista de Nitrosomonas europaea e Nitrobacter
winogradskyi sob diferentes concentraes de oxignio, LAANBROEK & GERARDS
(1992) encontraram um nmero de Nitrosomonas de aproximadamente 7,5x107NMP.mL-1
a 0kPa e 1,8x108 NMP.mL-1 a 2kPa (0,7mgO2.L-1), utilizando um TRH de 3dias. Estes
valores so prximos aos resultados apresentados pelos reatores RI e RII para o
NMP.mL-1 de Nitrosomonas, na amostra de 225dias (Tabela 5.4 e 5.5). Com relao a
Nitrobacter, os autores citados verificaram uma maior reduo do nmero em funo da
diminuio da concentrao de oxignio, tendo sido encontrado 3,2x106 NMP.mL-1 a
0kPa e 1,6x108 NMP.mL-1 a 2kPa, com o mesmo TRH. Apesar do menor TRH utilizado,
os valores de NMP.mL-1 de Nitrobacter segundo LAANBROEK & GERARDS (1992) esto
bem acima do determinado para RI e RII a cada 75dias de amostragem. O mximo valor
encontrado foi de 3,2x104 NMP.mL-1 de Nitrobacter para RI 150dias.
A partir da Figura 5.19, tambm verifica-se um aumento crescente da populao
de Nitrosomonas no reator RII ao longo do perodo de 225dias de acompanhamento.
Com relao a populao de Nitrobacter, percebe-se uma efetiva diminuio da
populao at 150dias, ocorrendo um desenvolvimento e aumento do nmero nos
ltimos 75dias de operao do reator RII.

79
O nmero mais provvel de Nitrobacter em 75dias foi maior em RI, apesar da
lavagem. Talvez em RII, devido a maior variedade de populaes e mais elevada
concentrao celular, possa ter ocorrido uma maior competio pelo oxignio que poderia
ter entrado no reator, evitando o desenvolvimento das Nitrobacter. J em RI, embora a
lavagem tenha efetuado uma seleo prvia, o que favorvel pela diminuio da
competio pelo substrato, beneficiando o desenvolvimento de microrganismos
especficos, restou uma quantidade de clulas bastante reduzida. Ento, parte do
oxignio que possa ter entrado no reator devido a provveis vazamentos, mesmo que em
baixa

concentrao,

ficou

disponvel

para

as

Nitrobacter

possibilitando

seu

desenvolvimento.
As Tabelas 5.6 e 5.7 apresentam os resultados comparativos entre NMP e FISH,
para as amostras equivalentes a 0 (inculo), 75 e 225dias de operao de RI e RII.
Tabela 5.6: Dados comparativos entre NMP e FISH obtidos para RI

Amostra

NMP.mL-1

FISH

NMP.mL-1

FISH

FISH

Nitrosomonas

Nso1225

Nitrobacter

Nit3

Amx820

(n.mL-1)

(n.mL-1)

(n.mL-1)
0*

2,1x105

6,0x105

5,1x103

2,0x106

< 103

75

9,2x105

6,0x106

1,1x103

8,0x106

< 103

225

1,7x107

2,0x106

4,0x103

6,0x105

6,0x105

* Inculo (lodo nitrificante adaptado)

Tabela 5.7: Dados comparativos entre NMP e FISH obtidos para RII

Amostra

NMP.mL-1

FISH

NMP.mL-1

FISH

FISH

Nitrosomonas

Nso1225

Nitrobacter

Nit3

Amx820

-1

-1

(n.mL )

(n.mL )

(n.mL-1)

0*

2,1x105

6,0x105

5,1x103

2,0x106

< 103

75

2,2x106

<103

3,1x102

<103

< 103

225

1,4x108

5,0x104

3,2x102

< 103

< 103

* Inculo (lodo nitrificante adaptado)

80
Analisando-se os resultados apresentados nas Tabelas 5.6 e 5.7, percebe-se
alguma distino entre os valores determinados por FISH e NMP na maioria das
amostras, mas h que se considerar que cada mtodo tem suas limitaes e erros. De
forma geral as duas tcnicas de quantificao revelaram um enriquecimento na
populao de bactrias amnio-oxidantes em relao a nitrito-oxidantes em ambos os
reatores. Vrios pesquisadores (ABELIOVICH & VONSHAK, 1992; ZART & BOCK, 1997;
SHRESTHA et al., 2000) tm demonstrado um potencial para assimilao de carbono
inorgnico pelas Nitrosomonas, utilizando outros aceptores de eltrons em substituio
ao oxignio, o que lhes possibilita permanecer viveis e crescer sob condies anxicas.
Nos resultados das amostras onde o valor <103 (Tabelas 5.6 e 5.7), significa que
no foram detectadas clulas com a sonda empregada, devido a ser este o limite de
deteco do mtodo. Portanto, o fato de determinadas bactrias no terem sido
identificadas por FISH, no significa que estejam ausentes, mas que a concentrao
inferior a 1000 clulas.mL-1.
Deve-se destacar que no reator RI, na amostra correspondente a 225dias de
operao foi verificada a presena de bactrias anaerbias amnio-oxidantes
(anammox), por hibridizao com a sonda Amx820 que detecta as espcies descritas at
o momento (Candidatus Kuenenia stuttgartiensis e Brocadia anammoxidans). A
identificao deste grupo de bactrias no reator RI indica fortemente que o consumo
concomitante de amnio e nitrito, bem como uma maior remoo especfica de
nitrognio, deve ter ocorrido pelo processo anammox.
As condies que podem ter levado ao desenvolvimento de bactrias anammox
em RI e as razes para o mesmo no ter ocorrido em RII, parecem estar relacionadas
com a partida diferenciada do reator. Os resultados apresentados revelam que a lavagem
celular inicial a que foi submetido o reator RI beneficiou de alguma forma, ou acelerou, o
desenvolvimento de uma populao mais especializada na oxidao anerbica do
amnio, neste caso, as bactrias anammox.
Tanto a determinao por FISH quanto por NMP revelaram uma populao
dominante de Nitrosomonas em relao as Nitrobacter nos reatores. Uma vez que
bactrias anammox e nitrificantes esto presentes no reator RI, no h como identificar a
parcela de contribuio de cada cultura na remoo biolgica de nitrognio que foi
verificada. No caso do reator RII, a remoo parece estar sendo proporcionada pelas
Nitrosomonas, tendo em vista os resultados obtidos.

81
Segundo SCHIMIDT et al. (2002), Nitrosomonas podem oxidar amnio na
ausncia de oxignio dissolvido, substituindo o O2 por NO2. Assim, economizam oxignio
para a reao da monoxigenase, que catalisa a oxidao do amnio a hidroxilamina
(ZART & BOCK, 1997). Em ausncia de oxignio, ocorre a induo das enzimas de
desnitrificao nitrito redutase, levando o nitrito presente no meio a N2O e N2
(SHRESTHA et al., 2000). Considerando que hidroxilamina foi identificada como um
importante intermedirio na reao anammox (van de GRAAF et al., 1996) e que
bactrias nitrificantes sempre estiveram presentes nos reatores anaerbios amniooxidantes estudados at o momento, parece bastante razovel que bactrias anammox e
Nitrosomonas possam agir em simbiose para efetivar a remoo de nitrognio em
ausncia ou limitao de oxignio.

82
5.2.4 Cintica de Consumo do Substrato
As Figuras 5.20 e 5.21 expressam graficamente os resultados do ensaio cintico
de consumo de substrato conduzido para os reatores RI e RII, aps 225dias de operao.

55
N-NO2
N-NH4
N-NO3

50

Concentrao (mgN/L)

45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
0

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Tempo (h)

Figura 5.20: Resultados experimentais do ensaio cintico para o reator RI

55

N-NH4

50

N-NO2

45

N-NO3

Concentrao (mgN/L)

40
35
30
25
20
15
10
5
0
0

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Tempo (h)

Figura 5.21: Resultados experimentais do ensaio cintico para o reator RII

83
Analisando-se o grfico da Figura 5.20, observa-se que o consumo mais
acentuado de amnio e nitrito ocorreu no perodo inicial de 10h, sendo este praticamente
equimolar.

Neste

mesmo

perodo,

concentrao

de

nitrato

permaneceu

aproximadamente estvel e ao redor de 15mgN-NO3.L-1. A partir deste instante foi

observado um maior consumo de amnio em relao ao nitrito e um progressivo aumento
da formao de nitrato. Tendo em vista que a anlise por FISH identificou a presena de
bactrias anammox em RI 225dias, talvez inicialmente se tenha uma ausncia de
oxignio mais efetiva devido ao gs hlio borbulhado no reator, favorecendo a ao desta
populao e ocasionando, assim, maior o consumo de amnio e nitrito.
Aps determinado tempo de reao, pode ter ocorrido alguma penetrao de
oxignio no reator, devido a algum microvazamento ou devido a prpria permeabilidade
do sistema, tornando as condies propcias para a oxidao de amnio a nitrito e de
nitrito a nitrato, uma vez que foi verificado um aumento acentuado de nitrato aps 10h e a
anlise FISH identificou o mesmo nmero de Nitrobacter em RI 225dias que de
anammox. Esta mesma dificuldade, de manter o sistema permanentemente em
condies anxicas, foi encontrada durante todo o perodo de operao dos reatores,
conforme previamente discutido.
Com relao ao reator RII, observa-se um consumo de amnio e nitrito apenas no
perodo inicial de 10h, conforme apresentado no grfico da Figura 5.21, no qual a
concentrao de nitrato permaneceu aproximadamente estvel e em torno de 5mgNNO3.L-1. Devido ao limite de deteco da sonda, no foi identificada a presena de
bactrias anammox em RII 225dias pela anlise FISH, o que no significa que no
estejam presentes, mas no atingiram ainda um suficiente nvel de enriquecimento.
A partir do perodo inicial do ensaio cintico de 10h, passou a haver um maior
consumo de amnio em relao ao nitrito. Devido a alguma presena de oxignio, cujas
causas foram anteriormente exemplificadas, pode ter passado a ocorrer uma converso
parcial de amnio a nitrito e, devido a oxidao anaerbia no ocorrer na mesma
proporo de RI, o reator RII apresenta consumo de nitrito quase nulo. Este mesmo
comportamento tambm foi verificado durante a operao do RII, uma vez que os
grficos de acompanhamento mostraram um consumo muito baixo de nitrito. Aps 28h,
h novamente evidncia de consumo de nitrito, com algum aumento na formao de
nitrato, embora a nveis muito abaixo do encontrado em RI ao longo de todo o perodo do
ensaio.

84
As velocidades de consumo de substrato foram determinadas a partir dos valores
de inclinao das tangentes das respectivas curvas de concentrao de nitrito e amnio,
apresentadas nas figuras anteriores. Considerando que h uma variao na inclinao
das tangentes em determinados perodos de tempo, calculou-se as velocidades (rS) e
velocidades especficas (S) para 7,5, 24 e 36h, de acordo com as seguintes equaes:

dS
dt

rS =

S=

1 dS

X dt

Sendo: X = 0,28gSST.L-1 para RI e X = 1,43gSST.L-1 para RII.

Os valores encontrados para as velocidades e velocidades especficas,
correspondente aos reatores RI e RII, constam nas Tabelas 5.8 e 5.9, respectivamente.
Tabela 5.8: Valores de velocidades de consumo de amnio e nitrito para RI
Tempo

NH4

rNO2

rNH4
-1

-1

-1

-1

NO2
-1

-1

(mgN-NH4.gSST . h ) (mgN-NH4.gSST-1. h-1)

(h)

(mgN-NH4.L .h )

(mgN-NO2.L .h )

7,5

1,23

1,07

4,39

3,82

24

0,81

0,50

2,89

1,79

36

0,32

0,24

1,14

0,86

Tabela 5.9: Valores de velocidades de consumo de amnio e nitrito para RII

Tempo

rNH4

rNO2
-1

-1

-1

-1

NH4

NO2

(h)

(mgN-NH4.L .h )

(mgN-NO2.L .h )

(mgN-NH4.gSST-1. h-1)

(mgN-NH4.gSST-1. h-1)

7,5

0,64

0,53

0,45

0,37

24

0,64

0,063

0,45

0,044

36

0,64

0,26

0,45

0,18

85
STROUS et al. (1997), estudando os efeitos das condies aerbias e
microaerbias na oxidao anaerbia do amnio, determinaram uma atividade anammox
constante no perodo anaerbio equivalente a 2mol de NH4.(gSSV)-1.min-1. Calculando o
valor da velocidade de consumo de amnio do reator RI, no tempo de 7,5h (maior valor
de velocidade encontrado a partir dos dados experimentais), nas mesmas unidades
utilizadas pelos autores, determinou-se uma atividade de 4mol de NH4.(gSSV)-1.min-1, o
dobro da referncia citada.
A velocidade de consumo de amnio foi constante para RII, conforme pode ser
verificado na Tabela 5.9. As velocidades de consumo de substrato, tanto para amnio
quanto para nitrito, de RII so bem menores do que de RI para t = 7,5h. No entanto, a
partir de 24h, os valores de velocidade de RI e RII so bastante prximos. Com relao a
velocidade especfica, esta se manteve inferior em RII em todos os intervalos estudados,
atingindo o valor mais elevado no perodo inicial (t = 7,5h) em RI . Este resultado est de
acordo com a argumentao efetuada anteriormente, baseada na remoo especfica, de
que em RI teria se desenvolvido uma populao mais especializada na oxidao
anaerbia do amnio, o que torna-se evidente devido as maiores velocidades especficas
de consumo de amnio e nitrito apresentadas.

86
6. CONCLUSES

A adaptao de um lodo proveniente de um sistema de Lodos Ativados propiciou

a seleo de microrganismos autotrficos com elevada atividade nitrificante.
A lavagem de clulas nas condies de temperatura de 35C e TRH de 5dias
aplicados a um reator RBS, promoveu uma seleo de microrganismos levando a uma
reduo parcial de oxidadoras de nitrito do gnero Nitrobacter e um aumento no nmero
de oxidadoras de amnio do gnero Nitrosomonas.
As estratgias diferenciadas de partida dos reatores, RI com lavagem celular
inicial e RII sem lavagem inicial, ambos operados com reteno de clulas, aps 225dias
de operao, levaram ao desenvolvimento de floras bacterianas em diferentes
propores e a um desempenho diferenciado em termos de remoo de nitrognio
amoniacal e nitrito, inclusive das possveis rotas metablicas seguidas pelos mesmos.
No perodo de estabilidade, o reator RI apresentou maior eficincia de remoo e
maior remoo especfica de nitrognio em relao ao RII e, consequentemente, maiores
velocidades de consumo de amnio e nitrito. A porcentagem de remoo em RI foi de 30
a 40% e a mxima remoo especfica foi de 25mgN.(gSST)-1.d-1, enquanto em RII foi
obtido 20% de remoo e uma mxima remoo especfica 5mgN.(gSST)-1.d-1,
demonstrando que a estratgia de lavagem celular inicial uma alternativa eficiente
quanto ao desenvolvimento de uma populao microbiana especializada na oxidao
anaerbia do amnio em um menor tempo de operao.
No reator submetido a lavagem celular inicial foi verificada a presena de
bactrias anammox dentre as espcies descritas at o momento, evidenciando um
enriquecimento do lodo em biomassa anaerbia amnio-oxidante e comprovando que
possvel alcanar o desenvolvimento de bactrias anammox a partir de um lodo de um
sistema de lodos ativados.

87
7. SUGESTES PARA TRABALHOS FUTUROS

Otimizar o sistema operacional dos reatores para assegurar condies anxicas

constantes, de modo a beneficiar a oxidao anaerbia do amnio e atingir nveis
mais elevados de remoo biolgica de nitrognio.

Buscar uma metodologia para determinao de intermedirios da reao de

oxidao do amnio em condies anxicas, especficos para determinada via
metablica, para que se possa avaliar a parcela de contribuio de cada
populao, Nitrosomonas e bactrias anammox.

Testar a agregao da biomassa em material suporte, como estratgia para uma

maior reteno celular, de modo que seja alcanado um enriquecimento mais
efetivo e num tempo reduzido.

88
8. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

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95

ANEXOS E APNDICES

96
ANEXO
Tabela de NMP e limites a 95% de confiana para vrias combinaes de resultados positivos
quando vrios nmeros de tubos so usados para diluio (10mL; 1,0mL e 0,1mL)
Tubos por diluio
3
Combinaes

Limites 95% Confiana

de positivos

NMP/100mL

0-0-0

<3

0-0-1

< 0,5

0-1-0

< 0,5

13

0-2-0

1-0-0

< 0,5

1-0-1

1-1-0

Limites 95% Confiana

NMP/100mL

Inferior

Superior

< 0,5

< 0,5

< 0,5

11

20

< 0,5

21

< 0,5

11

23

< 0,5

11

1-1-1

11

36

< 0,5

15

1-2-0

11

36

< 0,5

15

2-0-0

36

< 0,5

13

2-0-1

14

37

17

2-1-0

15

44

17

2-1-1

20

89

21

2-2-0

21

47

21

2-2-1

28

10

150

2-3-0

12

28

3-0-0

23

120

19

3-0-1

39

130

11

25

3-0-2

64

15

380

3-1-0

43

210

11

25

3-1-1

75

14

230

14

34

3-1-2

120

30

380

3-2-0

93

15

380

14

34

3-2-1

150

30

440

17

46

3-2-2

210

35

470

3-3-0

240

36

1300

3-3-1

460

71

2400

3-3-2

1100

150

4800

3-3-3

2400

4-0-0

13

31

4-0-1

17

46

Inferior

Superior

<2

97
Tabela de NMP (continuao)
Tubos por diluio
3
Combinaes

Limites 95% Confiana

de positivos

NMP/100mL

4-1-0

Limites 95% Confiana

NMP/100mL

Inferior

Superior

17

46

4-1-1

21

63

4-1-2

26

78

4-2-0

22

67

4-2-1

26

78

4-3-0

27

80

4-3-1

33

11

93

5-0-0

23

70

5-0-1

31

11

89

5-0-2

43

15

110

5-1-0

33

11

93

5-1-1

46

16

120

5-1-2

63

21

150

5-2-0

49

17

130

5-2-1

70

23

170

5-2-2

94

28

220

5-3-0

79

25

190

5-3-1

110

31

250

5-3-2

140

37

340

5-3-3

180

44

500

5-4-0

130

35

300

5-4-1

170

43

490

5-4-2

220

57

700

5-4-3

280

90

850

5-4-4

350

120

1000

5-5-0

240

68

750

5-5-1

350

120

1000

5-5-2

540

180

1400

5-5-3

920

300

3200

5-5-4

1600

640

5800

5-5-5

2400

Inferior

Fonte: ALEXANDER & CLARK (1982)

Superior

98
APNDICE 1
Dados correspondentes a determinao da atividade nitrificante por Respirometria
S

Qo2
O2x

QO2

exp

Andrews

Andrews

(mg N-NH4/L)

mgO2/L.min

(mgO2/gSST.min)

(mgN-NH4/gSST.d)

(mgO2/gSST.min)

(mgN-NH4/gSST.d)

0,00
2,04
10,05
12,17
15,31
16,14
18,32
25,50
43,05
35,33
26,51
24,59
27,79
41,38
47,89
53,02
58,92
74,82
62,26
167,90
108,67
144,31

0,00
0,16
0,49
0,78
0,84
1,00
1,15
1,26
1,37
1,44
1,44
1,23
1,34
1,51
1,57
1,56
1,52
1,58
1,60
1,35
1,46
1,40

0,00
0,10
0,31
0,49
0,52
0,62
0,72
0,79
0,85
0,90
0,90
0,77
0,84
0,95
0,98
0,98
0,95
0,99
1,00
0,84
0,91
0,87

0,00
24,77
76,86
122,33
132,24
157,40
181,12
197,98
215,29
227,50
227,06
194,30
211,50
238,28
247,89
245,93
239,83
249,08
251,67
212,25
230,24
220,13

0,00
0,12
0,44
0,50
0,57
0,59
0,63
0,74
0,88
0,83
0,75
0,73
0,76
0,87
0,90
0,92
0,93
0,96
0,94
0,91
0,96
0,94

0,00
30,33
111,33
126,07
144,54
148,86
159,23
185,67
220,89
209,00
188,64
182,86
192,18
218,67
226,39
230,99
235,03
241,22
236,83
229,96
242,18
235,76

APNDICE 2
Acompanhamento analtico dos reatores durante o perodo de operao
Acompanhamento do reator RI - Dados de entrada

Dias
1
2
3
6
7
8
10
11
14
15
21
35
36
42
44
59
64
66
71
73
78
80
84
92
100
112
114

Meio
i
1
1
3
3
4
4
4
5
5
6
8
8
8
9
11
12
12
13
13
14
14
15
15
17
17
18

pH
7,56
7,65
7,65
7,53
7,53
7,55
7,55
7,55
7,63
7,63
7,57
7,85
7,85
7,85
7,90
7,80
7,80
7,80
7,35
7,35
7,80
7,80
7,50
7,50
7,60
7,60
7,80

Abs
NH4
0,263
0,333
0,333
0,314
0,314
0,269
0,269
0,269
0,307
0,307
0,344
0,321
0,321
0,321
0,258
0,342
0,323
0,323
0,311
0,311
0,276
0,276
0,337
0,337
0,366
0,366
0,245

diluio
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20

Abs
NO2
0,258
0,253
0,253
0,116
0,116
0,1215
0,1215
0,1215
0,121
0,121
0,122
0,112
0,112
0,112
0,117
0,186
0,193
0,193
0,128
0,128
0,124
0,124
0,131
0,131
0,121
0,121
0,121

diluio
5
5
5
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10

Abs
NO3
0,040
0,033
0,033
0,014
0,014
0,000
0,000
0,000
0,023
0,023
0,013
0,030
0,030
0,030
0,016
0,017
0,018
0,018
0,017
0,017
0,026
0,026
0,049
0,049
0,024
0,024
0,027

diluio
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1

Abs
DQO
0,052

Alcalinidade
diluio (mL H2SO4)
1
2,25

0,045

3,00

0,044
0,045
0,045
0,045
0,045
0,043
0,045
0,050
0,050
0,040
0,040
0,046
0,046

1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1

3,00
3,70
3,20
3,20
3,20
4,80
4,60
4,10
4,10
4,70
4,70
4,50
4,50

0,046
0,046
0,044

1
1
1

4,80
4,80
4,60

Concentrao (mg/L)
N-NH4
N-NO2
N-NO3
80,80
74,52
4,43
111,50
73,13
3,53
111,50
73,13
3,53
103,17
69,69
1,07
103,17
69,69
1,07
83,43
72,76
0,00
83,43
72,76
0,00
83,43
72,76
0,00
99,88
72,48
2,26
99,88
72,48
2,26
116,32
73,04
0,58
106,24
67,46
3,44
106,24
67,46
3,44
106,24
67,46
3,44
78,61
70,25
1,09
115,44
108,81
1,26
107,11
112,72
1,42
107,11
112,72
1,42
101,85
76,40
1,26
101,85
76,40
1,26
86,50
74,16
2,77
86,50
74,16
2,77
113,25
78,07
6,63
113,25
78,07
6,63
125,97
72,48
2,79
125,97
72,48
2,79
72,91
72,48
3,28

DQO

Alcalinidade

(mg DQO/L) (mg CaCO3/L)

94,93

151,88

75,61

202,50

72,85
75,61
75,61
75,61
75,61
70,09
75,61
89,41
89,41
61,81
61,81
78,37
78,37

202,50
194,25
168,00
168,00
168,00
252,00
241,50
215,25
215,25
246,75
246,75
236,25
236,25

75,06
75,06
69,60

252,00
252,00
241,50

Carga
(mg N/L.d)

31,95
37,63
37,63
34,79
34,79
31,24
31,24
31,24
34,92
34,92
37,99
35,43
35,43
35,43
29,99
45,10
44,25
44,25
35,90
35,90
32,69
32,69
39,59
39,59
40,25
40,25
29,73

99

Acompanhamento do reator RI - Dados de entrada (Continuao)

Dias
120
127
129
134
136
141
143
148
150
155
156
161
163
170
177
178
182
189
191
197
199
203
206
210
213
217
220
225

Meio
19
20
20
21
21
22
22
23
23
24
24
25
25
26
27
27
28
29
29
30
31
31
32
32
33
33
34
34

pH
7,99
7,90
7,90
7,83
7,83
7,84
7,84
7,70
7,70
7,62
7,62
7,65
7,65
7,42
7,44
7,44
7,65
7,45
7,45
7,55
7,45
7,45
7,56
7,56
7,47
7,47
7,50
7,50

Abs
NH4
0,265
0,303
0,303
0,266
0,266
0,240
0,240
0,419
0,419
0,418
0,418
0,440
0,440
0,501
0,490
0,490
0,434
0,416
0,416
0,419
0,413
0,413
0,416
0,416
0,423
0,423
0,411
0,411

diluio
20
20
20
20
20
20
20
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10

Abs
NO2
0,123
0,123
0,123
0,115
0,115
0,121
0,121
0,244
0,244
0,249
0,249
0,248
0,248
0,256
0,258
0,258
0,267
0,268
0,268
0,269
0,263
0,263
0,266
0,266
0,268
0,268
0,264
0,264

diluio
10
10
10
10
10
10
10
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5

Abs
NO3
0,024
0,034
0,034
0,075
0,075
0,031
0,031
0,045
0,045
0,030
0,030
0,036
0,036
0,019
0,031
0,031
0,032
0,029
0,029
0,028
0,017
0,017
0,025
0,025
0,015
0,015
0,012
0,012

diluio
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1

Abs
DQO
0,045
0,051
0,051
0,049
0,049
0,054
0,054

Alcalinidade
diluio (mL H2SO4)
1
4,2
1
4,4
1
4,4
1
4,6
1
4,6
1
4,5
1
4,5

0,043
0,043
0,048
0,048

1
1
1
1

4,0
4,0
4,4
4,4

0,049

4,0

0,046
0,046
0,055
0,055

1
1
1
1

3,8
3,8
4,4
4,4

0,045
0,045

1
1

4,3
4,3

Concentrao (mg/L)
N-NH4
N-NO2
N-NO3
81,68
73,60
2,79
98,34
73,60
4,42
98,34
73,60
4,42
82,12
69,13
7,69
82,12
69,13
7,69
70,71
72,48
3,24
70,71
72,48
3,24
74,61
70,61
4,66
74,61
70,61
4,66
74,39
72,01
3,14
74,39
72,01
3,14
79,21
71,73
3,75
79,21
71,73
3,75
92,59
68,87
2,03
90,17
69,42
3,24
90,17
69,42
3,24
77,90
71,85
3,34
73,95
72,12
3,04
73,95
72,12
3,04
74,61
72,39
4,62
73,29
70,77
2,70
73,29
70,77
2,70
73,95
71,58
4,09
73,95
71,58
4,09
75,48
72,12
2,36
75,48
72,12
2,36
72,85
71,04
1,83
72,85
71,04
1,83

DQO

Alcalinidade

(mg DQO/L) (mg CaCO3/L)

72,33
88,72
88,72
83,26
83,26
96,92
96,92

220,50
231,00
231,00
241,50
241,50
236,25
236,25

66,87
66,87
80,53
80,53

210,00
210,00
231,00
231,00

83,26

210,00

75,06
75,06
99,65
99,65

199,50
199,50
231,00
231,00

88,95
88,95

225,75
225,75

Carga
(mg N/L.d)

31,61
35,27
35,27
31,79
31,79
29,29
29,29
29,98
29,98
29,91
29,91
30,94
30,94
32,70
32,57
32,57
30,62
29,82
29,82
30,32
29,35
29,35
29,92
29,92
29,99
29,99
29,14
29,14

100

Acompanhamento do reator RI - Dados de sada

Dias
1
2
3
6
7
8
10
11
14
15
21
35
36
42
44
59
64
66
71
73
78
80
84
92
100
112
114

pH
7,42
7,55
7,24
8,00

8,05
7,58
7,79
7,00
7,33
7,50
6,74
7,62
7,05
6,89
7,02
7,69
7,67
7,18
7,57
7,08
8,25
8,12
7,90

Abs
NH4
0,486
0,237
0,235
0,236
0,207
0,246
0,196
0,229
0,270
0,268
0,261
0,248
0,230
0,208
0,157
0,258
0,195
0,209
0,202
0,191
0,185
0,190
0,229
0,206
0,266
0,299
0,193

diluio
10
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20

Abs
NO2
0,355
0,088
0,073
0,049
0,047
0,045
0,060
0,066
0,035
0,035
0,055
0,154
0,085
0,148
0,155
0,198
0,129
0,149
0,119
0,125
0,100
0,104
0,053
0,047
0,072
0,042
0,074

diluio
5
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
5
10
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5

Abs
NO3
0,034
0,080
0,127
0,152
0,163
0,187
0,167
0,169
0,275
0,266
0,155
0,136
0,120
0,122
0,125
0,254
0,292
0,294
0,343
0,329
0,366
0,335
0,452
0,422
0,441
0,394
0,308

diluio
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1

Abs
DQO
0,059

diluio
1

Alcalinidade
(mL H2SO4)

0,055

3,30

0,036
0,035
0,040
0,044

1
1
1
1

5,70
3,80
2,90
3,10

0,036

2,8

0,045

2,8

0,050

3,2

0,031
0,030

1
1

2,6
3,2

3,00

Concentrao (mg/L)
N-NH4
N-NO2
N-NO3
89,30
101,63
3,59
69,18
53,76
9,58
68,52
45,66
15,63
68,96
32,25
18,85
56,02
31,13
25,78
73,13
29,73
29,81
51,20
38,12
26,45
65,89
41,75
26,79
83,87
24,14
44,59
82,99
24,14
43,08
79,92
35,60
24,44
74,22
45,46
21,25
66,33
52,37
18,56
56,68
43,79
18,89
34,31
45,74
19,40
78,61
57,76
41,07
50,98
38,48
47,45
57,12
44,07
47,79
54,05
35,68
56,02
49,22
37,36
53,67
46,59
30,37
59,88
48,79
31,49
54,67
65,89
17,24
74,33
55,80
15,56
69,29
82,12
22,55
70,70
96,59
14,17
63,04
50,10
23,11
49,04

DQO
Alcalinidade
Carga
Eficincia
(mgDQO/L) (mg CaCO3/L) (mg N/L.d) Remoo (%)
114,25
202,50
38,90
-21,76
26,50
29,57
25,96
31,01
24,01
30,98
103,21
222,75
22,59
35,07
26,53
15,06
23,15
25,88
26,89
13,94
30,52
12,61
50,77
384,75
30,04
13,98
48,00
199,50
27,99
26,32
28,19
20,44
27,45
22,51
23,87
32,61
19,89
33,67
35,49
21,32
27,38
38,12
50,77
147,00
29,79
32,67
29,15
18,80
75,61
147,00
28,05
21,87
27,37
16,26
89,41
168,00
26,99
17,43
31,49
20,46
28,13
28,95
34,08
136,50
35,07
12,86
31,35
168,00
34,76
13,64
24,45
17,77

101

Acompanhamento do reator RI - Dados de sada (Continuao)

Dias
120
127
129
134
136
141
143
148
150
155
156
161
163
170
177
178
182
189
191
197
199
203
206
210
213
217
220
225

pH
7,86
7,89
8,14
7,96
7,45
7,99
7,66
7,65
7,61
7,75
7,74
7,61
7,95
7,92
8,02
7,62
7,93
7,38
7,68
7,92
8,16
7,70
7,82
7,88
7,97
7,88
7,47
7,65

Abs
NH4
0,232
0,265
0,236
0,196
0,166
0,417
0,411
0,233
0,260
0,222
0,240
0,240
0,236
0,318
0,296
0,265
0,246
0,208
0,218
0,215
0,228
0,221
0,212
0,235
0,238
0,231
0,219
0,216

diluio
20
20
20
20
20
5
5
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10

Abs
NO2
0,104
0,133
0,153
0,136
0,129
0,134
0,128
0,139
0,144
0,128
0,125
0,107
0,126
0,146
0,073
0,095
0,108
0,126
0,167
0,155
0,167
0,155
0,165
0,145
0,150
0,144
0,153
0,157

diluio
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5

Abs
NO3
0,244
0,193
0,283
0,276
0,248
0,289
0,252
0,264
0,226
0,219
0,220
0,296
0,249
0,182
0,363
0,328
0,286
0,243
0,152
0,170
0,147
0,175
0,161
0,177
0,183
0,180
0,178
0,168

diluio
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1

Abs
DQO
0,037
0,039

diluio
1
1

Alcalinidade
(mL H2SO4)

0,038

3,6

0,040

3,2

0,038

2,9

0,040

3,2

0,037

3,0

0,042

3,8

0,048

3,5

0,038

2,0

3,5
3,9

Concentrao (mg/L)
N-NH4
N-NO2
N-NO3
67,21
31,49
38,62
81,68
39,60
30,31
68,96
45,18
28,71
51,42
40,43
28,01
38,26
38,48
25,18
37,08
39,87
29,32
36,43
38,20
25,58
33,82
41,27
26,79
39,74
42,67
22,95
31,41
38,20
22,24
35,36
37,36
22,35
35,36
32,33
30,03
34,48
33,77
25,28
52,46
39,17
18,51
47,64
19,46
36,80
40,84
25,40
33,26
36,67
28,91
29,02
28,34
33,77
24,67
30,53
44,84
15,47
29,87
41,60
29,31
32,73
44,84
25,31
31,19
41,60
30,18
29,22
44,30
27,75
34,26
38,90
30,53
34,92
40,25
31,57
33,38
38,63
31,05
30,75
41,06
30,70
30,09
42,14
28,96

DQO
Alcalinidade
Carga
Eficincia
(mgDQO/L) (mg CaCO3/L) (mg N/L.d) Remoo (%)
50,48
183,75
27,46
13,13
55,94
204,75
30,32
14,05
28,57
19,00
53,21
189,00
23,97
24,59
20,38
35,88
21,26
27,43
58,67
168,00
20,04
31,57
20,38
32,02
21,07
29,70
53,21
152,25
18,37
38,58
19,01
36,43
19,54
36,83
58,67
168,00
18,71
39,54
22,03
32,64
20,78
36,20
19,90
38,90
18,92
38,21
17,36
41,80
18,17
39,07
20,16
33,52
64,14
199,50
20,58
29,90
20,59
29,84
80,53
183,75
20,25
32,32
20,74
30,70
21,35
28,82
20,61
31,27
20,50
29,65
68,64
105,00
20,24
30,55

102

Acompanhamento do reator RII - Dados de entrada

Dias
1
2
3
15
16
22
24
29
39
44
46
51
53
58
60
64
72
74
80
92
107
109
114
116
121
123
128

Meio
i
6
6
8
8
8
9
9
11
12
12
13
13
14
14
15
15
16
17
17
20
20
21
21
22
22
23

pH
7,65
7,57
7,57
7,85
7,85
7,85
7,90
7,90
7,80
7,80
7,80
7,35
7,35
7,80
7,80
7,50
7,50
7,86
7,60
7,60
7,90
7,90
7,83
7,83
7,84
7,84
7,70

Abs
NH4
0,180
0,344
0,344
0,321
0,321
0,321
0,258
0,258
0,342
0,323
0,323
0,311
0,311
0,276
0,276
0,337
0,337
0,315
0,366
0,366
0,303
0,303
0,266
0,266
0,240
0,240
0,419

diluio
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
10

Abs
NO2
0,101
0,122
0,122
0,112
0,112
0,112
0,117
0,117
0,186
0,193
0,193
0,128
0,128
0,124
0,124
0,131
0,131
0,173
0,121
0,121
0,123
0,123
0,115
0,115
0,121
0,121
0,244

diluio
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
5

Abs
NO3
0,019
0,013
0,013
0,030
0,030
0,030
0,016
0,016
0,017
0,018
0,018
0,017
0,017
0,026
0,026
0,049
0,049
0,028
0,024
0,024
0,034
0,034
0,075
0,075
0,031
0,031
0,045

diluio
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1

Abs
DQO
0,052
0,045
0,045
0,045
0,045
0,045
0,043
0,043
0,045
0,050
0,050
0,040
0,040
0,046
0,046

0,050
0,046
0,046
0,051
0,051
0,049
0,049
0,054
0,054

Alcalinidade
diluio (mL H2SO4)
1
2,2
1
3,7
1
3,7
1
3,2
1
3,2
1
3,2
1
4,8
1
4,8
1
4,6
1
4,1
1
4,1
1
4,7
1
4,7
1
4,5
1
4,5

1
1
1
1
1
1
1
1
1

4,6
4,8
4,8
4,4
4,4
4,6
4,6
4,5
4,5

Concentrao (mg/L)
N-NH4
N-NO2
N-NO3
44,40
61,31
1,59
116,32
73,04
0,58
116,32
73,04
0,58
106,24
67,46
3,44
106,24
67,46
3,44
106,24
67,46
3,44
78,61
70,25
1,09
78,61
70,25
1,09
115,44
108,81
1,26
107,11
112,72
1,42
107,11
112,72
1,42
101,85
76,40
1,26
101,85
76,40
1,26
86,50
74,16
2,77
86,50
74,16
2,77
113,25
78,07
6,63
113,25
78,07
6,63
103,60
101,55
3,10
125,97
72,48
2,79
125,97
72,48
2,79
98,34
73,60
4,42
98,34
73,60
4,42
82,12
69,13
7,69
82,12
69,13
7,69
70,71
72,48
3,24
70,71
72,48
3,24
74,61
70,61
4,66

DQO

Alcalinidade

(mg DQO/L) (mg CaCO3/L)

94,93
75,61
75,61
75,61
75,61
75,61
70,09
70,09
75,61
89,41
89,41
61,81
61,81
78,37
78,37

115,50
194,25
194,25
168,00
168,00
168,00
252,00
252,00
241,50
215,25
215,25
246,75
246,75
236,25
236,25

89,41
75,06
75,06
88,72
88,72
83,26
83,26
96,92
96,92

241,50
252,00
252,00
231,00
231,00
241,50
241,50
236,25
236,25

Carga
(mg N/L.d)

19,47
37,99
37,99
35,43
35,43
35,43
29,99
29,99
45,10
44,25
44,25
35,90
35,90
32,69
32,69
39,59
39,59
41,65
40,25
40,25
35,27
35,27
31,79
31,79
29,29
29,29
29,98

103

Acompanhamento do reator RII - Dados de entrada (Continuao)

Dias
130
135
136
141
143
149
150
157
158
162
169
171
177
179
183
186
190
193
197
200
206
211
219
225

Meio
23
24
24
25
25
26
26
27
27
28
29
29
30
31
31
32
32
33
33
34
34
35
36
37

pH
7,70
7,62
7,62
7,65
7,65
7,42
7,42
7,44
7,44
7,65
7,45
7,45
7,55
7,45
7,45
7,56
7,56
7,47
7,47
7,50
7,50
7,60
7,25
7,30

Abs
NH4
0,419
0,418
0,418
0,440
0,440
0,501
0,501
0,490
0,490
0,434
0,416
0,416
0,419
0,413
0,413
0,416
0,416
0,423
0,423
0,411
0,411
0,414
0,412
0,415

diluio
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10

Abs
NO2
0,244
0,249
0,249
0,248
0,248
0,256
0,256
0,258
0,258
0,267
0,268
0,268
0,269
0,263
0,263
0,266
0,266
0,268
0,268
0,264
0,264
0,266
0,263
0,264

diluio
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5

Abs
NO3
0,045
0,030
0,030
0,036
0,036
0,019
0,019
0,031
0,031
0,032
0,029
0,029
0,028
0,017
0,017
0,025
0,025
0,015
0,015
0,012
0,012
0,014
0,023
0,021

diluio
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1

Abs
DQO

diluio

Alcalinidade
(mL H2SO4)

0,043
0,043
0,048
0,048

1
1
1
1

4,0
4,0
4,4
4,4

0,049

4,0

0,046
0,046
0,055
0,055

1
1
1
1

3,8
3,8
4,4
4,4

0,045
0,045

1
1

4,3
4,3

0,046

4,2

Concentrao (mg/L)
N-NH4
N-NO2
N-NO3
74,61
70,61
4,66
74,39
72,01
3,14
74,39
72,01
3,14
79,21
71,73
3,75
79,21
71,73
3,75
92,59
68,87
2,03
92,59
68,87
2,03
90,17
69,42
3,24
90,17
69,42
3,24
77,90
71,85
3,34
73,95
72,12
3,04
73,95
72,12
3,04
74,61
72,39
4,62
73,29
70,77
2,70
73,29
70,77
2,70
73,95
71,58
4,09
73,95
71,58
4,09
75,48
72,12
2,36
75,48
72,12
2,36
72,85
71,04
1,83
72,85
71,04
1,83
73,51
71,58
2,18
73,07
70,77
3,75
73,73
71,04
3,40

DQO

Alcalinidade

(mg DQO/L) (mg CaCO3/L)

66,87
66,87
80,53
80,53

210,00
210,00
231,00
231,00

83,26

210,00

75,06
75,06
99,65
99,65

199,50
199,50
231,00
231,00

88,95
88,95

225,75
225,75

91,85

220,50

Carga
(mg N/L.d)

29,98
29,91
29,91
30,94
30,94
32,70
32,70
32,57
32,57
30,62
29,82
29,82
30,32
29,35
29,35
29,92
29,92
29,99
29,99
29,14
29,14
29,45
29,52
29,63

104

Acompanhamento do reator RII - Dados de sada

Dias
1
2
3
15
16
22
24
29
39
44
46
51
53
58
60
64
72
74
80
92
107
109
114
116
121
123
128

pH
7,58
7,65
7,63
7,03
7,28
7,83
6,78
6,83
7,04
6,98
6,66
6,85
7,48
7,20
7,23
7,05
7,70
7,15
7,47
8,20
7,87
8,08
7,86
7,72
7,70
8,09
7,75

Abs
NH4
0,165
0,176
0,175
0,217
0,201
0,198
0,200
0,204
0,190
0,139
0,167
0,151
0,164
0,155
0,162
0,122
0,167
0,200
0,209
0,241
0,278
0,208
0,199
0,187
0,438
0,451
0,311

diluio
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
20
5
5
10

Abs
NO2
0,105
0,202
0,188
0,195
0,090
0,086
0,119
0,150
0,315
0,295
0,301
0,313
0,300
0,296
0,276
0,312
0,273
0,260
0,265
0,199
0,221
0,222
0,218
0,209
0,224
0,225
0,232

diluio
10
5
5
5
10
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5

Abs
NO3
0,012
0,018
0,016
0,036
0,037
0,003
0,039
0,049
0,054
0,048
0,059
0,065
0,069
0,130
0,099
0,144
0,278
0,211
0,212
0,209
0,059
0,107
0,072
0,055
0,063
0,057
0,051

diluio
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1

Abs
DQO
0,059

diluio
1

Alcalinidade
(mL H2SO4)

0,050
0,053

1
1

2,8
3,8

0,052

4,9

0,051

1,7

0,065

2,0

0,066

2,9

0,055
0,055
0,048
0,046

1
1
1
1

1,8
1,5
2,4
3,9

0,049

3,9

0,040

3,3

2,2

Concentrao (mg/L)
N-NH4
N-NO2
N-NO3
37,82
63,54
0,42
42,65
58,88
1,42
43,96
54,96
1,09
62,38
56,92
4,45
55,36
55,16
4,62
54,05
26,46
0,00
54,93
35,68
4,95
56,68
44,35
6,63
50,54
90,45
7,47
28,18
84,86
6,46
40,45
86,54
8,31
33,44
89,89
9,32
39,14
86,26
9,99
35,19
85,14
20,24
38,26
79,55
15,03
20,72
89,61
22,59
40,45
78,72
45,10
54,93
75,08
33,84
58,87
76,48
33,41
72,91
58,04
32,92
89,13
64,18
8,49
58,43
64,46
10,92
54,49
63,35
7,39
49,22
60,83
5,67
39,82
65,02
6,48
41,25
65,30
5,87
51,80
67,26
5,27

DQO
Alcalinidade
Carga
Eficincia
(mgDQO/L) (mg CaCO3/L) (mg N/L.d) Remoo (%)
114,25
115,50
20,36
-4,55
20,59
45,80
20,00
47,35
89,41
147,00
24,75
30,14
97,69
199,50
23,03
35,00
16,10
54,55
19,11
36,27
94,93
257,25
21,53
28,20
29,69
34,17
23,90
45,99
92,17
89,25
27,06
38,85
26,53
26,10
130,81
105,00
27,08
24,58
28,11
13,99
133,57
152,25
26,57
18,71
26,58
32,85
32,85
17,02
103,21
94,50
32,77
21,32
99,65
78,75
33,75
16,14
80,53
126,00
32,77
18,58
75,06
204,75
32,36
8,25
26,76
24,12
83,26
204,75
25,04
21,21
23,15
27,19
22,27
23,98
58,67
173,25
22,48
23,23
24,87
17,05

105

Acompanhamento do reator RII - Dados de sada (Continuao)

Dias
130
135
136
141
143
149
150
157
158
162
169
171
177
179
183
186
190
193
197
200
206
211
219
225

pH
7,80
7,70
7,61
7,52
8,06
8,17
7,51
7,81
7,30
7,72
7,50
7,82
7,87
8,15
7,89
7,58
7,92
7,90
7,48
7,37
7,56
7,65
7,83
7,59

Abs
NH4
0,316
0,356
0,347
0,356
0,342
0,413
0,410
0,369
0,295
0,319
0,308
0,293
0,282
0,282
0,255
0,254
0,270
0,278
0,276
0,278
0,277
0,275
0,283
0,285

diluio
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10

Abs
NO2
0,220
0,240
0,235
0,235
0,224
0,239
0,224
0,257
0,289
0,258
0,234
0,236
0,251
0,238
0,243
0,249
0,242
0,244
0,252
0,245
0,253
0,248
0,247
0,246

diluio
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5
5

Abs
NO3
0,045
0,047
0,052
0,037
0,034
0,043
0,049
0,080
0,067
0,042
0,057
0,053
0,049
0,044
0,040
0,044
0,034
0,049
0,046
0,040
0,031
0,036
0,040
0,040

diluio
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1

Abs
DQO

diluio

Alcalinidade
(mL H2SO4)

0,047

3,2

0,048

3,5

0,045

3,1

0,042

3,9

0,049

3,6

0,045

2,1

0,046

2,0

Concentrao (mg/L)
N-NH4
N-NO2
N-NO3
52,90
63,91
4,66
61,67
69,49
4,86
59,70
68,10
5,37
61,67
68,10
3,85
58,60
60,23
3,55
74,17
64,28
4,46
73,51
60,23
5,06
64,52
69,15
8,20
48,29
77,79
6,88
53,56
69,42
4,36
51,14
62,93
5,87
47,86
63,47
5,47
45,44
67,52
8,09
45,44
64,01
7,23
39,52
65,36
6,53
39,30
66,98
7,23
42,81
65,09
5,49
44,57
65,63
8,09
44,13
67,79
7,57
44,57
65,90
6,53
44,35
68,06
4,96
43,91
66,71
5,83
45,66
66,44
6,53
46,10
66,17
6,53

DQO
Alcalinidade
Carga
Eficincia
(mgDQO/L) (mg CaCO3/L) (mg N/L.d) Remoo (%)
24,29
18,96
77,80
168,00
27,20
9,04
26,63
10,95
26,72
13,62
80,53
183,75
24,48
20,89
28,58
12,59
27,76
15,10
28,37
12,88
26,59
18,34
72,33
162,75
25,47
16,83
23,99
19,55
23,36
21,67
24,21
20,15
64,14
204,75
23,34
20,49
22,28
24,08
83,26
189,00
22,70
24,13
22,68
24,21
23,66
21,11
23,90
20,31
23,40
19,71
88,95
110,25
23,48
19,45
23,29
20,92
23,73
19,61
91,85
105,00
23,76
19,81

106