CLONAGEM DE UM GENE

O termo clonagem se refere a produo de cpias geneticamente

idnticas de uma molcula de DNA (ou de uma clula, ou de um
organismo). A clonagem de molculas de DNA pode ser divida em
duas grandes etapas:
Na primeira etapa ocorre a ligao entre o fragmento de DNA
que contem o gene de interesse (denominado inserto) com o vetor uma outra molcula de DNA - formando ento, o DNA recombinante
(figura 1).

Na segunda etapa, o DNA recombinante transportado para

dentro de uma clula hospedeira (em geral uma bactria) para que
ocorra o processo de transformao. A clula que recebe o DNA
recombinante sofre vrios ciclos de diviso, produzindo muitas cpias
do DNA recombinante.
PCR
Para obter o DNA de interesse em quantidade suficiente utiliza-se
o mtodo da reao em cadeia da polimerase - PCR. A PCR um
procedimento rpido que possibilita a amplificao in vitro de
fragmentos de DNA especficos, partindo-se de uma quantidade
mnima de DNA.
A PCR se baseia no uso da DNA-polimerase para copiar um molde
de DNA em ciclos repetidos de replicao. A polimerase guiada para
a sequncia a ser copiada por oligonucleotdeos iniciadores de DNA
curtos (primers) que so adicionados reao e hibridizam o DNAmolde no incio e no final da sequencia de DNA desejada. Esses
oligonucletdeos iniciadores fornecem as extremidades 3' para que a
DNA-polimerase inicie a replicao em cada fita de DNA. A PCR s
pode ser utilizada para clonar um DNA cujas sesquncias inicias e
finais sejam conhecidas. Durante cada ciclo de replicao, as duas
fitas do DNA-molde de fita dupla so separadas e copiadas
independentemente.
Cada ciclo da PCR inclui trs etapas:
1. Desnaturao: corresponde a separao da dupla fita de
DNA por elevao da temperatura para 94C durante 2 a 5 minutos.
2. Anelamento: com as fitas de DNA separadas a temperatura
reduzida para valores entre 58 e 66C, favorecendo o pareamento dos
dois oligonucleotdeos nas fitas complementares do DNA, desta forma
delimitando a regio do DNA a ser amplificada.

3. Extenso: a 72C a enzima Taq posiciona-se prximo aos

oligonucleotdeos e recruta os nucleotdeos para a sntese da nova
fita de DNA.
ENZIMAS DE RESTRIO
A tecnologia do DNA recombinante possvel devido a
descoberta de enzimas bacterianas que catalisam reaes especficas
nas molculas de DNA. Essas enzimas de restrio ou nucleases de
restrio, so protenas que reconhecem uma seqncia especifica
dentro da dupla hlice do DNA e clivam em um ponto especifico.
Diferentes espcies de bactrias contem diferentes nucleases de
restrio, cada uma cortando em uma seqncia de nucleotdeos
especfica diferente. As enzimas de restrio clivam seqncias de
DNA especficas em ambas as fitas, chamadas de stios de restrio, e
podem gerar extremidades abruptas ou coesivas (Figura 2).

Figura 2: Tipos de extremidades produzidas no DNA pela ao de

endonucleases do tipo II. (A) Extremidades coesivas geradas pela ao da
endonuclease EcoRI. (B) Extremidades abruptas produzidas aps clivagem
com a endonuclease EcoRV.Em negrito sequncia de reconhecimento das
endonucleases.

As enzimas de restrio so nomeadas conforme o

microrganismo do qual foram isoladas; a primeira letra representa o
gnero, as segunda e terceira letras representam a espcie, as
seguintes, geralmente, representam a linhagem e a ordem da
descoberta.

Tabela 1. Exemplos de endonucleases de restrio com os organismos

de origem
e as seqncias de reconhecimento. As setas indicam os stios de
clivagem.

Uma importante consequncia da ao dessas enzimas que a

clivagem ocorre sempre nos mesmos pontos, gerando, assim, sempre
o mesmo conjunto de fragmentos de DNA, ou seja, ter um padro de
restrio especfico permitindo, desta forma, o isolamento de
fragmentos de DNA de interesse.
Outra consequncia de fundamental importncia, o fato de
aps a clivagem do DNA, este passa a ter extremidades de fita
simples que permitem a ligao de outra molcula de DNA que
possua extremidade de fita simples e complementar. Ou seja, se
houver dois fragmentos de DNA produzidos pela ao da mesma
enzima de restrio, estes fragmentos podem ser unidos gerando
uma molcula de DNA recombinante.
ELETROFORESE
A eletroforese em gel de agarose um mtodo simples e
eficiente que permite separao, identificao e purificao de
molculas de DNA. Depois que a molcula de DNA foi clivada em
pequenos pedaos com uma nuclease de restrio, necessrio
separar os fragmentos de DNA uns dos outros. Para isso, utiliza-se a
tcnica de eletroforese em gel, que separa os fragmentos com base
no seu comprimento. A mistura de fragmentos de DNA aplicada em
uma das extremidades de um bloco de gel de agarose ou de
poliacrilamida, que contm uma rede microscpica de poros. Uma
diferena de potencial eltrico aplicada atravs do bloco de gel.
Como o DNA tem carga negativa, os fragmentos migram em direo
do eletrodo positivo; como fragmentos maiores migram mais
lentamente do que os menores, as bandas mais inferiores formadas
no gel contem os menores fragmentos de DNA. Para visualizar as
bandas de DNA, o gel imerso em um corante, como por exemplo, o
brometo de etdeo, que se liga ao DNA e fluoresce sob luz ultravioleta.
possvel isolar um determinado fragmento de DNA do gel utilizando
uma
lmina
de bisturi. A banda de

DNA

pode

ento

interesse pode ser cortada e o

ser extrado.

FIgura 3: Esquema geral da eletroforese em gel

LIGASES

As enzimas denominadas ligases catalisam a ligao fosfodister

entre os grupos hidroxila 3 de um nucleotdeo e o grupo fosfato do
prximo nucleotdeo, unindo covalentemente molculas de DNA de
fita dupla, resultando em uma molcula de DNA recombinante. Essas
enzimas podem ligar fragmentos de DNA com extremidades coesivas
ou abruptas, porm extremidades abruptas so ligadas com baixa
eficincia.
Os requisitos necessrios para a ao da T4 DNA ligase so:
Hidroxila livre na extremidade 3 de um dos fragmentos do
DNA.
Grupo fosfato livre na extremidade 5 do outro fragmento de
DNA.
Temperatura baixa (16 a 22C) para favorecer o encontro das
molculas de DNA e o pareamento das bases nitrogenadas

complementares.
Figura 4: Reao de ligao promovida pela T4 DNA ligase. Em
negrito, os nucleotdeos que foram unidos por ligao fosfodister
promovida pela ligase.

VETORES
A obteno de vrias cpias idnticas de uma extenso definida
de DNA, pode ser feita de vrias formas. Uma maneira introduzir o
DNA a ser copiado em uma bactria que se divide rapidamente; cada
vez que a bactria replica o seu prprio DNA, ela tambm copia o
DNA introduzido.
Para manter o DNA estranho na clula bacteriana, um plasmdeo
bacteriano utilizado como carreador ou vetor. Os plasmdeos
normalmente utilizados para a clonagem de genes so molculas de
DNA circular que se encontram separadas do DNA cromossmico da
clula. Este DNA circular geralmente ocorre naturalmente em clulas
bacterianas e leveduras. Ele geralmente representa uma pequena
frao do DNA total da clula hospedeira, mas que pode ser
facilmente separado devido seu pequeno tamanho. Como o DNA
cromossomal, o plasmdeo tambm replicado durante a diviso
celular, mas de forma independente do cromossomo, garantindo a
propagao do mesmo atravs das geraes da clula. Alm disso, o
vetor plasmidial tambm possui stios de corte para a ao das

nucleases de restrio, de maneira que o plasmdeo pode ser aberto

convenientemente e um fragmento de DNA estranho pode ser
inserido.
Os plasmdeos variam em estrutura, tamanho, modo de
replicao, nmero de cpias por clula e habilidade para
propagarem-se em diferentes bactrias. Todos contm trs
caractersticas comuns: marca seletiva, origem de replicao e stio
mltiplo de clonagem. A marca seletiva refere-se a genes que
conferem resistncia a antibiticos e que proporcionam a seleo dos
clones transformados daqueles no transformados. Para essa seleo,
adicionado ao meio de cultura o antibitico adequado, em
concentraes que permitam diferenciar a clula no-transformada
(sensvel ao antibitico) da clula transformada (resistente ao
antibitico). Os principais antibiticos utilizados nos meios de cultura
para a seleo de transformantes esto apresentados na Tabela 2.

A
origem 2:
de Principais
replicaoantibiticos
autnoma utilizados
ou ori o
stio agentes
em queseletivos
se iniciae aa
Tabela
como
concentrao
final
utilizada.
replicao do DNA, podendo se replicar independentemente da
replicao bacteriana e produzir milhares de cpias do plasmdeo
dentro da clula hospedeira. A replicao dos plasmdeos pode ser
sincronizada com o ciclo celular, resultando em baixo nmero de
cpias, ou ser independente do ciclo da clula hospedeira, permitindo
a proliferao de centenas de cpias por clula. O stio mltiplo de
clonagem ou polylinker um stio de clivagem de endonucleases de
restrio no qual inserido um fragmento de DNA de interesse sem
interferir na funcionalidade do plasmdeo.
TRANSFORMAO CELULAR
O processo de transformao consiste na introduo de um DNA
exgeno em clulas hospedeiras, que podem ser: bactrias,
leveduras, fungos filamentosos, clulas vegetais e clulas de
mamferos. A clula mais comumente utilizada a clula bacteriana
de Escherichia coli. O processo de transformao bacteriana utilizada
na Biologia Molecular ocorre in vitro, e pode ser afetado pelo tamanho
e conformao da molcula de DNA a ser introduzida na clula.
Plasmdeos pequenos incorporam-se mais facilmente clula
bacteriana competente. A transformao bacteriana utilizada para a
preparao de DNA plasmidial, em larga escala, e para a seleo de
clones recombinantes. A atrao do DNA pelas clulas bacterianas,
em condies naturais, um evento muito raro, devido ocorrncia
da repulso eletrosttica entre as cargas negativas dos fosfolpideos

da membrana e as cargas negativas dos grupamentos fosfatos da

molcula de DNA.
Para a transformao bacteriana, podem-se utilizar dois
diferentes mtodos de transformao:
Choque trmico: Comumente chamado transformao com
cloreto de clcio, um mtodo fcil e relativamente barato de
transformao. Consiste na preparao das clulas, para torn-las
competentes, por tratamento com cloreto de clcio ou outro on
divalente (cloreto de ltio ou magnsio). Os ons atuam neutralizando
as cargas negativas da membrana e do DNA. Aps um choque
trmico na temperatura de 37 a 42C, criam-se poros na membrana e
o DNA pode alcanar o interior da clula.
Eletroporao: o mtodo mais eficiente para transformao
de clulas com DNA plasmidial. Consiste, inicialmente, na preparao
das clulas com uma soluo aquosa para torn-las competentes e
aptas a receber o DNA. As clulas so submetidas a um choque
eltrico que provoca uma desestabilizao da membrana externa e a
formao de poros, possibilitando a entrada do DNA para o interior da
clula. Esse tipo de transformao, que requer um equipamento denominado eletroporador -, pode ser utilizado para a transformao
de bactrias gram positivas e negativas, leveduras, fungos
filamentosos, clulas animais e vegetais. O eletroporador deve ser
ajustado para cada tipo celular, considerando os seguintes
parmetros: capacitncia, intensidade e durao do pulso eltrico.
REFERNCIAS
ALBERTS, B.; BRAY, D.; HOPKIN, K.; JOHNSON, A.; LEWIS, J.; RAFF,
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LIMA, Liziane Maria de. Conceitos Bsicos de Tcnicas em
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Braslia -DF, W Educacional Editora.