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2010

La Chromatographie
Liquide
haute
Performance (HPLC)
Salle de TP de Gnie Analytique
Prsentation Thorique de la HPLC

TYPE DE
DOCUMENT : DT

N 5

PAGE : 57

IND.REV/DATE :
2 22/08/2010

ETABLI PAR :

VERIFIE PAR :

APPROUVE PAR :

Vronique JACOB

V.JACOB

V. JACOB

DESTINATAIRES : Utilisateurs du laboratoire de Gnie Analytique n 001

V. JACOB
IUT de Chimie de Grenoble
22/08/2010

La Chromatographie Liquide Haute Performance 2010


TABLE DES MATIERES

Gnralits et appareillage..................................................................................................... 1
1.1

La phase mobile ................................................................................................................................ 2

1.2

Le rservoir de solvant .................................................................................................................. 3

1.3

Le systme de pompage ................................................................................................................. 4

1.3.1
1.3.2

Le gradient dlution .............................................................................................................................. 5

1.4

Linjecteur ........................................................................................................................................... 6

1.5

Les colonnes ....................................................................................................................................... 7

1.6

Les dtecteurs ................................................................................................................................... 9

1.6.1

Dtecteurs par absorption dans lultraviolet et le visible .......................................................9

1.6.3

Dtecteurs par rfractomtrie diffrentielle............................................................................. 16

1.6.2
1.6.4

Les pompes.................................................................................................................................................4

1.6.5

Dtecteurs spectrofluorimtriques ............................................................................................... 13


Dtecteurs par conductimtrie ....................................................................................................... 19
Dtecteurs par spectromtrie de masse ..................................................................................... 20

Les principales chromatographies liquides.................................................................... 21


2.1

La chromatographie dadsorption .......................................................................................... 22

2.2

La chromatographie de partage............................................................................................... 22

2.2.1
2.2.2

2.3

les gels de silice greffs ...................................................................................................................... 23


Mcanisme de rtention .................................................................................................................... 23

La chromatographie dchange dions................................................................................... 26

2.3.1

Lchangeur dions ............................................................................................................................... 26

2.3.3

Choix de la phase mobile ................................................................................................................... 29

2.3.2
2.3.4

2.4

Mcanisme de sparation.................................................................................................................. 28
Mise en uvre de la chromatographie ionique........................................................................ 30

La chromatographie de paires dions ou dappariement dions................................... 36

2.4.1
2.4.2

Description du systme chromatographique............................................................................ 37


Mcanisme de rtention .................................................................................................................... 37

2.4.3

Exemples de sparation ..................................................................................................................... 39

La Chromatographie Liquide Haute Performance 2010


1 GENERALITES ET APPAREILLAGE

En raison de sa polyvalence et du vaste domaine de ses applications, la chromatographie liquide


haute performance (CLHP ou HPLC) est actuellement la plus utilise de toutes les techniques de
sparation. Le champ dapplication de ce type de chromatographie recouvre une grande partie
du domaine de la chromatographie en phase gazeuse auquel sajoute lanalyse :

des composs thermosensibles


des composs trs polaires

ainsi que des composs de masses molaires leves.

Un appareil dHPLC comprend diffrents modules : un rservoir solvant contenant la phase


mobile, un systme de pompage permettant deffectuer des lutions gradues, un injecteur, une
colonne, un dtecteur et un systme dacquisition de donnes.

FIGURE 1 : COMPOSITION DUNE CHAINE HPLC

Les diffrents modules sont relis par des canalisations courtes et de trs faible diamtre interne
(0,1 mm).

Les diffrentes parties de lappareillage en contact avec la phase mobile sont gnralement
construites en acier inoxydable type 316 qui prsente lavantage de la tenue la pression et
dune bonne rsistance la corrosion chimique.

Les canalisations sont soit en acier inoxydable soit en polymre de type PEEK (polyetheretherketone) qui est un polymre souple plus conomique que lacier et pouvant rsister aux
solvants sous des pressions leves jusqu 350 bars.

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1.1 LA PHASE MOBILE

Contrairement la chromatographie gazeuse o la nature du gaz est peu importante pour la


sparation des composs (interaction solut-phase stationnaire), en HPLC la sparation des
composs se fait par des interactions avec la phase stationnaire et avec la phase mobile. Ces
interactions sont primordiales

Une bonne sparation dun mlange dpendra donc dune bonne adquation solut-phase
stationnaire-phase mobile.
De nombreux solvants sont disponibles, mais seuls quelques uns pourront tre utiliss car en
chromatographie liquide il existe de nombreuses limitations.

compatibilit avec le systme de dtection : avec des dtecteurs par absorption (les
plus courants) on utilisera des solvants qui absorberont peu aux longueurs donde o les
soluts absorbent. Pour les dtecteurs rfractomtriques, il faudra choisir une phase
luante dont lindice de rfraction est diffrent de ceux des composs de lchantillon
analyser.

miscibilit des solvants et solubilit des soluts : si la phase mobile est constitue par
plusieurs solvants, ceux-ci doivent tre totalement miscibles et les composs analyser
doivent y tre solubles.
viscosit : La viscosit de la phase mobile a une influence :
o

sur la cintique de transfert de masse : une augmentation de la viscosit diminue


les coefficients de diffusion et de transfert de masse des soluts cest--dire
quelle diminue le nombre de plateaux thoriques.
sur la pression en tte de colonne. La pression dentre de colonne augmente
proportionnellement la viscosit de la phase luante.

En gnral, on utilise des solvants dont la viscosit est infrieure 10-3 Pa s.

temprature dbullition : Dans la mesure du possible, on vite des solvants trop


volatils la temprature ambiante car il peut se produire un phnomne de dgazage
au niveau du systme de dtection, ce qui rend la dtection impossible. Le solvant
passe alors dune pression trs leve (100 200 bars) la pression atmosphrique.
puret des solvants : La puret des solvants est indispensable pour la
chromatographie liquide pour amliorer le seuil de dtection. Par exemple :

les alcanes sont transparents jusqu une longueur donde de 190 nm mais il
peuvent contenir des traces dolfines qui limitent la transparence de la phase
luante 250 nm.
loxygne dissous augmente la longueur donde limite de dtection, il devra tre
limin.

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toxicit : de faon gnrale, les solvants utilis sont modrment toxiques. Des
prcautions particulires doivent tre prises avec les solvants chlors et les solvants
aromatiques.

Choix du solvant :

Le choix du solvant se fera en fonction des interactions solutsolvant. En gnral ces


interactions sont dues des forces de Van der Waals (interactions diple-diple ou
lectrostatiques) et aux liaisons hydrogne qui vont dfinir les paramtres de solubilit des
composs dans la phase mobile.

On classe donc les solvants par leur polarit, et la modification de la polarit. Parmi les solvant
utiliss on a lhexane (ou les hycdrocarbures saturs (pentane, cyclohexane) pour les solvants
les moins polaires et leau pour les solvants le plus polaire. Entre les deux, on a toute une srie
de composs qui peuvent tre utiliss.
Pour modifier la polarit de la phase mobile, on peut raliser des mlanges de solvants (
condition que ceux-ci soient miscibles)

1.2 LE RESERVOIR DE SOLVANT

Les appareils sont quips dun ou plusieurs rservoirs en verre ou parfois en acier inoxydable
de contenance denviron 1 litre, ce qui permet de raliser un nombre important danalyses sans
interruption.
Ces rservoirs sont souvent tanches afin dviter lvaporation des solvants (et ainsi la
modification de la composition du mlange) ou leur contamination.

Ils peuvent tre quips de dispositifs de dgazage (barbotage dhlium ou mise sous vide)
permettant dliminer les gaz dissous et en particulier loxygne.
Loxygne est souvent nuisible lanalyse chromatographique :

il augmente le risque de dgradation des chantillons et abrge la dure de vie des


colonnes car les phases stationnaires sont facilement oxydables.
il augmente le risque de formation de bulles gazeuses dans le dtecteur ce qui
conduit un bruit de font important et rend lanalyse impossible.

il diminue le seuil de dtection lors dune analyse par spectroscopie dabsorption


faible longueur donde, par fluorimtrie ou par lectrochimie.

il contribue la corrosion des pices en contact avec la phase mobiles. La corrosion


augmentant avec la pression, les pistons et les joints des pompes sont souvent en
saphir, agate, Tflon ou en alliages spciaux.

Il est donc prfrable de dgazer les solvants soit par ultrasons soit par barbotage dhlium soit
par filtration avant dintroduire les solvants dans leur rservoir.

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1.3 LE SYSTEME DE POMPAGE
1.3.1 LES POMPES

La pompe dun chromatographe a pour rle dassurer lcoulement de la phase mobile dans la
colonne.

Ces pompes doivent tre trs puissantes car la viscosit des solvants et la granulomtrie trs
fine des phases stationnaires entranent des diffrences de pression ou des pertes de charges
entre le sommet et lextrmit des colonnes qui peuvent parfois tre importantes (50 100
bars).
Les plus usuelles permettent dobtenir des pressions de 420 bars (ou 6000 PSI (1 PSI = 0,07
bar)). Les pompes sont trs onreuses et interviennent pour une trs grande part dans le cot
lev des appareils.

Il faut noter que les pressions trs leves engendres par les pompes HPLC ne prsentent
aucun danger dexplosion car les liquides ne sont pas trs compressibles. La rupture dune pice
mcanique nentrane quune fuite de solvant.
La grande majorit des appareils est quip par des pompes pistons alternatifs. Leur avantage
rside principalement dans :

leur petit volume interne,

leur pression de sortie leve (jusqu' 700 bars), leur adaptabilit la technique de
gradient dlution,
la constance de leur dbit qui est pratiquement indpendante de la pression dans la
colonne et de la viscosit du solvant.

Afin dviter lcoulement puls qui est propre au mouvement de va-et-vient du piston
(remplissage-expulsion), les constructeurs ont mis au point des pompes deux pistons qui
fonctionnent soit en mode srie soit en mode parallle.
En mode srie, le piston amont (piston A) refoule une quantit de solvant deux fois plus
importante que le piston aval, soit parce que son diamtre est plus important, soit parce
que sa course est plus grande.

Les deux pistons sont dphass : lorsque lun aspire, lautre refoule. Dans ce systme,
pendant que le piston A aspire une quantit dluant, le piston B refoule la phase mobile
dans la colonne. Ensuite, lorsque le piston A refoule lluant, une partie de ce dernier
vient remplir le cylindre du piston B qui rgle ainsi le dbit nominal et lautre partie est
refoule dans la colonne. Ces montages ncessitent des vannes en amont et en aval de
chaque piston.

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FIGURE 2 : MONTAGE A PISTON DOUBLE

En mode parallle le systme de pompage est constitu de deux ttes de pompe fonctionnant
en opposition permettant dobtenir un dbit de phase liquide sans pulsations.

FIGURE 3 : MONTAGE A DEUX TETES DE POMPE (POMPES BINAIRES HAUTE PRESSION)

1.3.2 LE GRADIENT DELUTION

Llution gradue lors de la sparation de mlanges complexes permet, en modifiant la


composition de lluant, doptimiser les facteurs de capacit et de rduire les temps danalyse.
Les gradients peuvent tre raliss de deux manires diffrentes :

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les solvants sont doss et mlangs en amont de la pompe en programmant le temps


douverture de vannes proportionnelles (systme basse pression). Ce systme ncessite
dintercaler un systme de dgazage en ligne des solvants (souvent effectu par
dpression).
les solvants sont doss et mlangs en aval des pompes (systme haute pression). Dans
ce dispositif, il est ncessaire davoir autant de pompes que de solvants. Le gradient est
obtenu simplement en modifiant, dbit total constant, le rapport des dbits des
pompes.

FIGURE 4 : POMPES BINAIRES (HAUTE PRESSION) ET QUATERNAIRES (BASSE PRESSION)

Parmi les avantages de ces systmes :

le systme haute pression donne la possibilit de transformation en deux


chromatogrammes aprs lajout dun dtecteur et dun injecteur.

dans le systme basse pression, le nombre de pice mobile est moindre. Ce systme
donne la possibilit de raliser des gradients quaternaires. Notons enfin quun prmlange des solvants avant pompage permet de saffranchir des phnomnes de
contraction de volume.

1.4 LINJECTEUR

Linjection doit se faire en un temps trs bref afin de ne pas perturber le rgime dcoulement
dans la colonne et le dtecteur. La difficult consiste introduire en tte de colonne un volume
dchantillon l ou la pression atteint plusieurs dizaines de bars. On utilise pour cela une vanne
haute pression plusieurs voies (vanne boucle dinjection). Ce type de vannes peut tre utilis
soit manuellement soit command par un passeur automatiques dchantillons.

Le principe de fonctionnement de ces vannes est le suivant : lchantillon est introduit avec une
seringue la pression atmosphrique dans la boucle (position chargement ou load), puis il est
mis en communication par rotation de la vanne avec la phase mobile et la colonne (position
inject).

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FIGURE 5 : VANNE DINJECTION HPLC

Ce systme vite les brusques variations de pression dans lappareil et est dune grande
reproductibilit car il y a peu dirrgularit dans les injections tant donn que la quantit
introduite est obligatoirement celle du volume de la boucle.
Les volumes injects sont fixs par la capacit de la boucle qui a des volumes variables allant du
microlitre au millilitre.

1.5 LES COLONNES

Les colonnes dHPLC sont gnralement courtes et droites en acier inoxydable 316 capable de
rsister aux fortes pressions.
La plupart des colonnes ont une longueur de 10 25 cm et un diamtre de 4 5 mm. Ces
colonnes sont remplies de phase stationnaire, maintenue entre deux disques poreux situs aux
extrmits et dont la taille des particules varie de 5 10 m.
Ce type de colonne offre souvent de 40 000 60 000 plateaux par mtre. Le dbit de la phase
mobile ne peut dpasser quelques ml/min.

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La colonne est souvent prcde par une colonne de garde ou prcolonne. Ces colonnes ont pour
rle d'augmenter la dure de vie de la colonne danalyse en retenant tous les composs qui ne
sont pas lus. Elle est plus courte (0,4 1 cm) et est remplie de la mme phase stationnaire.
Cette colonne sera change priodiquement.

FIGURE 6 : COLONNE HPLC

Depuis peu de temps est apparu sur le march des microcolonnes de diamtre intrieur de 0,3
mm et de longueur de 5 cm. La taille des particules varie de 3 5 m et les dbits atteignent
quelques L/min. La colonne et linjecteur doivent tre adapts.
Ces colonnes ont lavantage :

de la rapidit de lanalyse,

de consommer moins de solvant (les solvants de haute puret pour lHPLC sont trs
coteux),
de conduire une meilleure rsolution de lanalyse (par suite dune moindre diffusion),
de permettre de faire du couplage HPLC/MS.

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1.6 LES DETECTEURS

En HPLC, il nexiste pas de dtecteurs universels aussi sensibles que ceux utiliss en
chromatographie gazeuse mais des dtecteurs spcifiques de grande sensibilit. Ds lors, le
dispositif utilis dpend de la nature de lchantillon. le tableau ci-dessous prsente quelques
dtecteurs courants et leurs proprits.

FIGURE 7 : PERFORMANCE DES DETECTEURS POUR HPLC

Les dtecteurs absorptiomtriques dans lultraviolet ou le visible et le rfractomtre diffrentiel


sont les plus utiliss.

1.6.1 DETECTEURS PAR ABSORPTION DANS LULTRAVIOLET ET LE VISIBLE

Ces dtecteurs sont les plus couramment utiliss en HPLC car ils sont peu sensibles aux
fluctuations de dbit et de temprature et un grand nombre de solvants ont une bonne
transparence dans lUV.

FIGURE 8 : LIMITES DUTILISATION DE DIVERS SOLVANTS DANS LULTRAVIOLET

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On mesure en permanence labsorbance de la phase mobile en sortie de la colonne une ou
plusieurs longueurs donde. Le signal donn par ces dtecteurs est proportionnel la
concentration du solut dans leffluent de la colonne chromatographique. En effet, labsorbance
A est lie la concentration par la relation de Beer Lambert :

A = l C

Avec :

: coefficient dabsorption molaire


l : trajet optique

C : concentration du solut dans lffluent

La sensibilit est dautant plus grande que l est grand, mais il faut dans le mme temps que le
volume soit aussi faible que possible pour ne pas affecter lefficacit du systme
chromatographique. Les cellules ont en gnral un volume de quelques microlitres (5 10 L) et
ont un trajet optique de lordre de 1 cm.

FIGURE 9 : CELLULE DUN DETECTEUR UV-VISIBLE

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La limite de dtection dpend :

du coefficient dabsorption du solut,

de sa concentration dans leffluent lors de la traverse dans la cellule de mesure cest-dire de la dilution apporte par la colonne,
du bruit de fond du dtecteur.

Avec un bruit de fond de 10-4 UA, un trajet optique de 1 cm et un coefficient dabsorption de 104 l
mol-1 cm-1, le seuil de dtection est de :

Cmin =

2104
=2.108 moll 1
104*1

Ceci correspond, en prenant un facteur de dilution f lors de lintroduction dans la colonne


chromatographique de 25 et en faisant une injection de 5 l, une quantit minimale dtectable
de 2,5 10-12 mole, soit pour une masse molaire de 300 g mol-1, une quantit dtectable de 0,75
ng.
Il existe trois types de dtecteurs quipant les chromatographes :

Les dtecteurs monochromatiques : ce type de dtecteur est le modle de base, il se compose


dune source au deutrium ou vapeur de mercure, dun monochromateur pour isoler une
bande passante (10 nm) ou une raie (254 nm (vapeur de Hg HP) ou 280 nm (vapeur de Hg MP)),
dune cellule de circulation et dun dtecteur optique :

FIGURE 10 : SCEMA DE PRINCIPE DUN DETECTEUR PHOTOMETRIQUE A UNE SEULE LONGUEUR DONDE

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Ce type de dtecteur est trs limit et est progressivement remplac par des
spectrophotomtres polychromatiques.
Les spectrophotomtres polychromatiques : on peut les classer en trois catgories :

les spectrophotomtres monochromatiques longueur donde variable (190 700 nm)

les spectrophotomtres multi-longueurs donde qui permettent soit de changer de


longueur donde au cours de lanalyse soit denregistrer labsorbance plusieurs
longueurs donde simultanment. Ces dtecteurs permettent non seulement dobtenir un
chromatogramme mais ils fournissent des renseignements spectraux pouvant servir
lidentification des composs.

Les spectrophotomtres barrette de diodes permettant lenregistrement tridimensionnel


absorbance-temps-longueur donde. De ce fait, on dispose tout moment du spectre UV-Visible
de la phase mobile lue, ce qui est une aide lidentification de soluts inconnus par
comparaison des spectres UV des soluts avec ceux des composs purs stocks en bibliothque.
Ce type de dtecteur permet de slectionner la longueur donde optimale de dtection pour
chaque solut.

FIGURE 11 : SCEMA DE PRINCIPE DUN DETECTEUR A BARETTE DE DIODES

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FIGURE 12 : PRESENTATION SOUS FORME TRIDIMENTIONNELLE DU CHROMATOGRAMME

1.6.2 DETECTEURS SPECTROFLUORIMETRIQUES

Ce mode de dtection a une grande slectivit et une grande sensibilit. Il exploite les proprits
quont certaines molcules en solution dabsorber des radiations dans lultraviolet (passage un
tat excit) et de remettre une fraction de la lumire absorbe donc une longueur donde
suprieure, lautre fraction tant convertie en nergie interne
(conversion interne) :

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FIGURE 13 : ABSORPTION ET FLUORESCENCE

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On obtient pour une molcule deux spectres diffrents : un spectre dabsorption (excitation) et
un spectre dmission (dsexcitation radiative) :
La loi fondamentale en fluorimtrie est que lintensit If du rayonnement mis par fluorescence
est proportionnelle pour un volume donn, lintensit lumineuse absorbe :
If = k Iabs = k(Io It)

En remplaant lintensit transmise It par son expression donne par la loi de Beer-Lambert, on
peut calculer If :

If = kIo(1 10-l C)

Si labsorption de la solution est faible (solution dilue) et le trajet optique petit alors

10-l C 1 2,3*l C
If 2,3*l C = a C

et

La rponse de ce type de dtecteur est linaire quaux faibles concentrations, ce qui justifie
lemploi de ce mode de dtection pour lanalyse de traces o la sensibilit est suprieure celle
de labsorption.
En fluorimtrie on effectue une mesure directe de lintensit lumineuse tandis quen absorption
on effectue une mesure relative A = logIo/It.

Ainsi les quantit minimales dtectables des composs prsentant une forte fluorescence
peuvent tre de lordre de quelques femtomoles (10-15 mole) injectes.
Le schma de principe des spectrofluorimtres est le suivant :

FIGURE 14 : SCHEMA DE PRINCIPE DUN SPECTROFLUORIMETRE

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Il existe trois types dappareillage :

les spectrofluorimtres munis dun monochromateur lexcitation et dun filtre


lmission,
les spectrofluorimtres munis de monochromateurs lexcitation et lmission,

les spectrofluorimtres programmables en longueur donde dans le temps. Ceci permet


doptimiser la sensibilit et la slectivit.

Exemple danalyse dun mlange de seize hydrocarbures polyaromatiques avec programmation


des longueurs donde lmission et lexcitation :

FIGURE 15 : SEPARATION PAR CHROMATOGRAPHIE DE PARTAGE A POLARITE DE PHASE INVERSEE


DUN MELANGE DHAP

La fluorimtrie est un mode de dtection trs sensible mais trs slectif car il y a peu de
molecules qui sont naturellement fluorescentes. On peut tendre le domaine dapplication de la
spectrofluorimtie grce aux techniques de drivatisation pr ou post-colonne qui permettent
de modifier les molcules afin de les rendre fluorescentes.

En mode pr-colonne : le solut est modifi avant son injection

En mode post-colonne : le ractif est ajout en continu en sortie de colonne et la raction


se dveloppe dans un racteur

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FIGURE 16 : SCHEMA DE PRINCIPE DUN DISPOSITIF DE DERIVATION POST-COLONNE

1.6.3 DETECTEURS PAR REFRACTOMETRIE DIFFERENTIELLE

Le principe repose sur les lois de Fresnel de transmission de la lumire dans les milieux
transparents dont lindice de rfraction est n.
Schmatiquement, un faisceau lumineux (mono ou polychromatique) passe travers une cellule
comportant deux compartiments dont lun est rempli avec lluant seul et lautre avec la phase
mobile en sortie de colonne. La diffrence de lindice entre les deux liquides, qui apparat
lorsquun compos est mlang lluant se traduit par un dplacement angulaire du rayon
rfract.

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FIGURE 17 : MODELE DE DETECTEUR REFRACTOMETRIQUE

La limite de dtection de la rfractomtrie nest pas trs bonne. Elle dpend la foi de la nature
du solut et de celle de la phase luante. La rponse du rfractomtre est donne par la relation :

R1 = Z(n - no)

Avec

Z : constante caractristique de lappareil


n : indice de rfraction de leffluent

no : indice de rfraction de la phase luante

Lindice de leffluent peut tre calcul en premire approximation par la relation :


Avec

N = nipi + no(1-pi)

ni : indice de rfraction du solut i

pi : fraction massique du solut i dans leffluent

Des deux relations prcdentes, il sen suit que

R1 = Z pi (ni - no)

Supposons un bruit de fond (R1/Z) gal 10-7 et une diffrence dindice de rfraction entre la
phase luante et leffluent gal 0,1 unit, la fraction massique minimale dtectable est de

pmin =

17

2107
=2106 soit 2ppm
0,1

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En considrant un facteur de dilution impos par la colonne de 25, une injection de 5 l et une
masse volumique de la phase luante de 0,7 g cm-3, la quantit dtectable est de :

2 10-6*25*5 10-3 * 0,7 = 175 10-9 g soit 175 ng.

La limite de dtection de la rfractomtrie est environ 100 fois plus grande que celle de
labsorption
Autres inconvnient de cette mthode :

Cette mesure est sensible aux variations de temprature et de pression en raison de la


variation de lindice de rfraction en fonction de la densit des solvants. Le
rfracromtre devra tre thermostat (0,1C) ainsi que la colonne.
Elle conduit des pics soit ngatifs soit positifs, ce qui implique le rglage de la ligne de
base mi-hauteur du graphe.

Les indices de rfraction pouvant varier de plusieurs diximes dunit dun solvant un
autre, on ne peut utiliser le rfractomtre en gradient dlution.

La principale qualit du rfractomtre est son caractre quasi-universel, sauf dans le cas rare o
lindice de rfraction de la phase luante est identique celui du solut.
Ce type de dtecteur sera utilis comme un dtecteur complmentaire au dtecteur absorption
lumineuse lorsque celui-ci ne convient pas. Il est surtout utilis en chromatographie dexclusion
(analyse des distributions de masses molculaires de polymres) et en chromatographie
prparative.

FIGURE 18 : INDICES DE REFRACTION DE QUELQUES SOLVANTS

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1.6.4 DETECTEURS PAR CONDUCTIMETRIE

Ce dtecteur est limit la dtection des espces ionises et est surtout utilis en
chromatographie ionique. Son principe repose sur la mesure, en sortie de colonne, de la
conductance de la phase mobile riche en compos ionique. La difficult dans cette analyse est de
reconnatre dans le signal global la part de conduction due aux ions ou substances ioniques
faiblement charges appartenant lchantillon de celle de llectrolyte contenu dans la phase
mobile.
La conductance dune solution est donne par la relation :

G = i ziCi
i 103 K

Avec :

G : conductance de la solution S

i : conductivit ionique de lion i (S cm2 mol-1)


Ci : concentration de lion i (mol l-1)

zi : valeur absolue de la charge de lion i

K : constante de la cellule conductimtrique (cm-1)

Lors de llution dun solut, la variation de la conductance Sx- sera donne par lexpression :

G =

Avec

x ( S E ) x
[S ]
10 3 K

S : la conductivit ionique de lespce Sx-,

E : la conductivit ionique de la phase mobile.

La rponse du dtecteur est proportionnelle la diffrence des conductivits ioniques des


anions de lchantillon et de lluant. Une bonne dtection implique que :

la diffrence (S - E) soit aussi grande que possible en valeur absolue.

[Sx-] soit le plus grand possible, cest dire que la dilution apporte par lensemble du
systme chromatographique soit faible (ceci est vrai pour tout type de dtection).

la conductance de lluant soit trs stable. Pour cela, il est ncessaire davoir une
thermorgulation de lensemble du systme, la conductivit des ions variant avec la
temprature (les variations de i sont de lordre de 2% par C).
la conductance de lluant soit trs faible pour permettre une forte amplification du
signal au passage du solut.

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Deux voies ont t dveloppes dans la recherche dune bonne dtection :

dans la premire on dispose, entre la colonne de sparation et la cellule de dtection, un


dispositif de neutralisation par lequel on limine les ions de lluant (suppressed ion
chromatography), gnralement par raction acide-base. Si le conducteur ionique du
solvant est acide, on ajoute une base. Si cest une base, on ajoute un acide. La dtection
des ions de lchantillon a lieu dans une phase mobile rendue aussi peu conductrice que
possible.
dans la deuxime mthode dite sans neutralisation, on utilise comme ion luant un ion
organique volumineux donc peu mobile et par consquent de faible E. La dtection
seffectue directement la sortie de la colonne de sparation.

1.6.5 DETECTEURS PAR SPECTROMETRIE DE MASSE

Le couplage HPLC/MS est en plein essor et devient un outil puissant didentification et de


dtection. Cependant deux caractristiques de HPLC rendent le couplage difficile :

1) les mthodes dionisation de la spectrophotomtrie de masse ncessitent que


lchantillon soit vaporis sous un vide pouss do une dcomposition possible du
produit pendant ce processus. En fait lionisation chimique du solut par les molcules
de solvant protge celui-ci de toute dgradation. Des composs de masse molculaire
aussi leve que 1500 ont dj t dtects.
2) la quantit de phase mobile utilise est beaucoup plus grande que celle pouvant tre
raisonnablement introduite dans la chambre du spectromtre.

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2 LES PRINCIPALES CHROMATOGRAPHIES LIQUIDES

Les domaines dapplication de la chromatographie liquide sont reprsents sur le


graphique ci-dessous.

FIGURE 19 : DOMAINES DAPPLICATION DE LA CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE

La connaissance des masses molaires, des polarits et des caractres ioniques des
soluts va orienter le choix de la mthode chromatographique mettre en uvre pour
raliser leur sparation. Suivant la polarit et la masse molaire des composs on utilise
diffrents type de chromatographie:

Pour les molcules de masses molaires leves (> 10 000 g mol-1), on utilise
gnralement une des deux mthodes dexclusion : la permation de gel pour les
espces non polaires et la filtration de gel pour les composs polaires ou
ioniques.
Pour les espces ioniques de faibles masses molaires, on utilisera la
chromatographie par change dions

Pour les petites molcules non ioniques on prfrera les analyser par des
mthodes de partage.
Dans ce cours, nous dvelopperons
dadsorption, de partage et ionique.

21

uniquement

la

chromatographie

La Chromatographie Liquide Haute Performance 2010


2.1 LA CHROMATOGRAPHIE DADSORPTION

La chromatographie dadsorption met en uvre des phases stationnaires ayant des


proprits adsorbantes, principalement les gels de silice poreuse et les gels dalumine.
On parle aussi de chromatographie liquide-solide.

La chromatographie liquide dadsorption sapplique surtout la sparation des


composs organiques relativement non polaires, insolubles dans leau et dont les masses
molaires sont infrieures environ 5000 g mol-1. Sur ces phases, les molcules polaires
sont souvent adsorbes de faon irrversible.
Cette technique est utilise essentiellement pour fractionner les mlanges de composs
prsentant des groupements fonctionnels diffrents et des isomres de position tels que
les drivs du benzne substitus en mta et en para.
tant donne la faible application de cette technique dans le domaine de lanalyse de
leau, cette technique ne sera pas dveloppe dans ce cours.
2.2 LA CHROMATOGRAPHIE DE PARTAGE

Cest la technique chromatographique la plus utilise de toutes les mthodes


chromatographiques en phase liquide. Elle met en uvre des phases stationnaires
greffes ;
La sparation des soluts dpend des diffrences de solubilit des soluts dans la phase
mobile, et des diffrentes interactions des soluts avec la phase stationnaire (force de
Van der Waals, forces lectrostatiques).
La phase stationnaire est un liquide immobilis par greffage sur gel de silice.

La phase mobile est un liquide dont les interactions avec la phase stationnaire doivent
tre faibles, ce qui est obtenu lorsque leurs polarits sont diffrentes. On distinguera
donc deux types de chromatographie de partage :

la chromatographie de partage classique (ou phase normale) dans laquelle la


phase stationnaire est polaire (elle contient par exemple des groupements CN, NH2) et la phase mobile est apolaire ou peu polaire (hexane pur ou en mlange
avec un solvant chlor, ou du mthanol ou de lactonitrile).
la chromatographie de partage polarit de phase inverse dans lequel la phase
stationnaire est apolaire (chane alkyle, polystyrne-divinyl benzne) et la phase
mobile est polaire (mlanges eau-mthanol, eau-actonitrile).

On considre que 80% des sparations chromatographiques en phase liquide sont


effectues sur des colonnes phase inverse.

22

La Chromatographie Liquide Haute Performance 2010


2.2.1 LES GELS DE SILICE GREFFES

Except quelques nouvelles phases constitues par des polymres organiques, le gel de
silice est le matriau de base des phases stationnaires des colonnes HPLC.
Ce matriau doit tre exempt de tout ion mtallique et les grains doivent tre de
dimension rgulire. Ces gels de silices :

sont rsistants la pression (ils rsiste lcrasement sou 1000 bar)


ont des surfaces spcifiques de lordre de 350 m2 g-1

comportent des groupements silanol (groupement Si-OH) leur surface raison


de 5 groupements par m2 environ, ce qui confre au gel de silice ses proprits
polaires.

Lutilisation de la silice est limite par sa solubilit en milieu alcalin (pH > 8). Il faudra
donc respecter la condition dun milieu acide lorsquon utilise des colonnes
chromatographiques avec silice.

La plupart des silices greffes sont prpares par la raction dun organochlorosilane
avec les groupements silanols la surface du gel de silice. Cette raction se fait par
hydrolyse dans lacide chlorhydrique dilu et chaud :
Si(-)2-OH + Cl-Si(CH3)2R Si(-)2-O-Si(CH3) 2R

O R est un groupement n-octyle (-C8H17, ou RP8), un groupement octadcyle (-C18H37,


ou RP18). Dautres groupements fonctionnels peuvent tre greffs (amines aliphatiques,
thers, nitriles, hydrocarbures aromatiques) pour tendre la gamme de polarit des
phases stationnaires.
Ces supports chromatographiques sont stables thermiquement et difficilement
hydrolysables dans le domaine de pH compris entre 2 et 7.
2.2.2 MECANISME DE RETENTION

Chromatographie de partage phase normale (polaire)

Dans ce type de chromatographie, la phase stationnaire est polaire et elle peut tre
schmatise sous la forme :
Si(-)3-CH2-CH2-CH2-NH2

On utilise comme phase mobile :

soit des solvants apolaires : hexane, heptane, cyclohexane, isooctane,

soit des mlanges hexane avec un solvant peu ou polaire (chloroforme,


dichloromthane, ttrahydrofuranne, thanol, mthanol, actonitrile).

23

La Chromatographie Liquide Haute Performance 2010


Sur ce type de phase :

les composs apolaires seront lus avant les composs polaires puisquils sont
plus solubles dans la phase mobile. Si R est un groupement alkyl par exemple :
tR R-CH3 < tR R-Cl < tR R-OH

pour un solut donn, la rtention dun solut (k ou tr) diminuera lorsque la


polarit de la phase mobile augmente.

en prsence dun modificateur dans la phase luante (mlange de solvants), le


facteur de capacit du solut S (ou son temps de rtention) diminue lorsque la
concentration du modificateur polaire P augmente. Cet effet sera dautant plus
important que la force luante du modificateur sera importante :

Le tableau ci-dessous rassemble quelques valeurs de force luante sur silice greffe
aminopropyle :
Solvant

Ttrachlorure de carbone

0,067

Ttrahydrofuranne

0,115

Actate dthyle

Dichloromthane
Chloroforme

0,110
0,124
0,130

TABLEAU 1 : FORCE ELUANTE SUR SILICE GREFFEE AMINOPROPYLE

2.2.2.1 CHROMATOGRAPHIE DE PARTAGE PHASE INVERSE (APOLAIRE)

En chromatographie de partage phase inverse :

la phase stationnaire est apolaire et peut tre schmatise sous la forme : Si(CH3)2-C18H37
la phase mobile est constitue de mlanges eau-mthanol ou eau-actonitile.

Qualitativement, la rtention dun solut en chromatographie polarit inverse est


dautant plus importante que sa solubilit dans la phase mobile est plus faible, il sensuit
que :

les composs polaires seront lus avant les composs apolaires puisquils sont
plus solubles dans la phase mobile,

24

La Chromatographie Liquide Haute Performance 2010

la rtention est dautant plus importante que la polarit de lluant est plus
grande, cest--dire que la proportion en eau sera importante.

Laddition aux mlanges eau-mthanol ou eau-actonitrile dun troisime solvant, dit


solvant secondaire, modifie la force luante et la slectivit de la sparation.

Quand les espces tudies comportent des groupements acide ou basique, il est
ncessaire de contrler le pH de lluant. Plus le solut est ionis, plus son temps de
rtention diminue (forte solubilit en phase aqueuse). Les variations des temps de
rtention sont trs importantes lorsque le pH varie autour du pKa dune espce :

les acides seront chromatographis un pH infrieur dau moins 2 units en se


basant sur le pKa de lespce la plus acide.
les bases seront chromatographies un pH suprieur dau moins 2 units de pH
par rapport au pKa de lespce la plus basique. On ne peut cependant oprer en
milieu trop basique (pH > 7) car alors il y a attaque du rseau de la silice.

Lorsque lchantillon tudi est compos de soluts de polarit trs diffrentes, on


utilisera un gradient dlution eau-mthanol ou eau-actonitrile. On commencera
toujours par une phase mobile trs polaire (trs riche en eau) pour retenir les soluts
sur la phase stationnaire puis on diminuera graduellement la polarit de la phase mobile
(augmentation de la proportion de solvant organique) pour accrotre la force luante.
Les composs polaires sont lus les premiers.
Lorsque les composs sont trs polaires, ils peuvent avoir une rtention insuffisante sur
les silices alkyles. On utilisera alors des silices greffes amino ou cyano.
Dans le cas des soluts ionisables ou ioniss, on prfrera souvent utiliser la
chromatographie ionique.

Remarque sur la puret des solvants : Leau utilise doit tre rigoureusement exempte
de matires organiques. Ces substances peuvent tre retenues par la phase stationnaire
puis tre lues lorsque la teneur en solvant organique augmente, do lapparition de
pics parasites ou de drive de la ligne de base.

Leau simplement dminralise sur rsine changeuse dions contient souvent des
traces de matires organiques provenant du relargage des rsines. Elle devra donc tre
dminralise sur REI puis :

soit tre distille,

soit provenir dappareil de production deau ultra pure (passage sur diverses
rsines et charbons actifs).

Cette eau doit tre stocke exclusivement dans des rcipients en verre.

25

La Chromatographie Liquide Haute Performance 2010


2.3 LA CHROMATOGRAPHIE DECHANGE DIONS

La sparation des ions ou de molcules ionisables prsents dans un chantillon rsulte


de leur interaction avec des sites ioniques de la phase stationnaire.

La phase stationnaire est un changeur dions, cest--dire un solide comportant des


groupements fonctionnels ioniss, fixes, porteurs de charges positives ou ngatives, et
des ions mobiles de signe contraire assurent llectroneutralit. Les ions sont retenus au
voisinage du groupement fonctionnel par des forces lectrostatiques. Lors de lchange,
il se cre des quilibres du type :
(R-X+)S + A+M (R-A+)S + X+M

O S reprsente la phase stationnaire et M la phase mobile.

Selon les proportions de A+ et de X+ lquilibre, on dit que lchangeur a plus daffinit


pour lespce A que pour X ou inversement.

La phase mobile est une solution aqueuse contenant un lectrolyte (gnralement un


tampon de pH) contenant lion prsent dans lchangeur. La sparation rsulte de la
diffrence daffinit des ions de lchangeur et de la phase mobile pour les groupements
fonctionnels.
2.3.1 LECHANGEUR DIONS

Un changeur dion est constitu de deux parties : la matrice (ou support) sur laquelle
seront greffs les groupements fonctionnels, et les groupements fonctionnels.
On distingue :

2.3.1.1 LES GROUPEMENTS FONCTIONNELS

les changeurs de cations pour lesquels les groupements fixes sont chargs
ngativement. Les plus utiliss sont les groupements du type sulfonate RSO3-, qui
agissent comme des acides forts lorsquils sont protons. Lions H3O+ sera lion
changeable contre un autre cation :
2 RSO3H + Ca2+ (RSO3)2Ca + 2 H+

Ces changeurs sont susceptibles de fixer tous les cations et de les changer avec des
protons.

les changeurs danions dont les groupements fixes sont chargs positivement. Ce
sont gnralement des ions ammonium quaternaire du type trimthyl
ammonium : N(CH3)3+ qui agissent comme des bases fortes lorsquils sont sous
forme OH et lion OH- sera lion changeable contre un autre anion :

26

RN(CH3)3OH + Cl- RN(CH3)3Cl + OH-

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Ces changeurs sont susceptibles de fixer tous les anions et de les changer avec des
ions OH-.

Il existe galement des changeurs dions dont les groupements ont le caractre dacides
ou de bases faibles (R-COOH ou R-NR2). La capacit dchange des changeurs dions
faibles dpend du degr dionisation des groupements fonctionnels donc du pH de la
phase luante :

les groupements carboxyliques ne pourront changer que les cations lis aux
anions dacides faibles (HCO3-, SiO3-).
les changeurs faiblement basiques fixent uniquement les anions lis aux anions
dacides forts tels que Cl-, SO42- et NO3-.

FIGURE 20 : CLASSIFICATION DES GROUPEMENTS FONCTIONNELS DES ECHANGEURS DIONS

2.3.1.2 LA MATRICE

La matrice est constitue par un rseau tridimensionnel macromolculaire, le plus


souvent un copolymre styrne-divinylbenzne sur lequel sont greffs les groupements
fonctionnels. Elle se prsente sous forme de petites sphres dun diamtre de quelques
micromtres qui sont gnralement dune trs grande duret pour rsister
lcrasement dans la colonne.

27

La Chromatographie Liquide Haute Performance 2010

FIGURE 21 : PHASE STATIONNAIRE EN CI. SCHEMA DUNE PARTICULE SPHERIQUE DE POLYSTYRENE A


USAGE DECHANGE DE CATIONS

La structure du polymre dtermine les proprits mcaniques du support et la facilit


daccs des diffrentes espces aux sites changeurs. Cette structure conditionne donc
la fois la slectivit de la rsine et la cintique dchange.
La slectivit et la rsistance la pression augmentent avec la rticulation du polymre
mais la cintique diminue du fait de laccroissement de la rsistance au transfert de
masse, diminue. Il faut trouver un compromis entre les deux.
En prsence deau, ces rsines gonflent cest--dire que les molcules deau pntrent
lintrieur des grains et solvatent les groupements fonctionnels provoquant leur
ionisation et leur dissociation en un ion fixe (RSO3- par exemple) et un ion libre
changeable (H3O+ par exemple).
2.3.2 MECANISME DE SEPARATION

Le mcanisme principal observ sur les phases stationnaires est un mcanisme


dchange dions. Dans certains cas, on peut observer un mcanisme de partage
despces non ionises entre la phase stationnaire et la phase mobile (grosses molcules
organiques ionises).
Il stablit sur la colonne une suite dquilibres rversibles rgis par la constante K
dquilibre ionique (loi daction de masse) :
AS- + E-M A-M + E-S

Cet quilibre est caractris par la constante dchange (slectivit)

[ E ]S [ A ] M K E
=
[ E ] M [ A ]S K A

KA et KE sont les coefficients de partage

Dans ce cas, les diffrences daffinit dpendent essentiellement des caractristiques


physiques des ions solvats. En gnral, lchangeur dions marque une prfrence
pour :

28

La Chromatographie Liquide Haute Performance 2010

les ions porteurs de la charge la plus grande (charge),

les ions de plus petites dimensions (ions solvalts) (dimension),


les ions de plus forte polarisabilit (polarisabilit).

Ainsi pour un changeur danions de type ammonium quaternaire, lordre daffinit sera
le suivant :
Citrate > SO42- > oxalate > I- > NO3- > Br- > SCN- > Cl- > formiate > actate > OH- > F-

Pour un changeur de cations de type sulfonate, lodre daffinit est :

Ba2+ > Pb2+ > Sr2+ > Ca2+ > Ni2+ > Cd2+ > Cu2+ > Co2+ > Zn2+ > Mg2+ > Ag+ > Cs+ > Rb+ > K+ >
NH4+ > Na+ > H+ > Li+
Cet ordre est important car il dfinit en partie la force luante des phases mobiles
utilises.

Par exemple, dans le cas dchange danions, lutilisation de lion nitrate dans la
phase luante conduira une lution beaucoup plus rapide que lutilisation de
lion chlorure.
De mme pour un changeur de cations, une solution dun tampon de pH
prpare partir de sel de potassium aura une force luante plus leve que la
mme solution prpare partir de sel de sodium ou a fortiori de lithium.
2.3.3 CHOIX DE LA PHASE MOBILE

On utilise souvent une solution aqueuse en raison du caractre ionisant et dissociant de


leau. Parfois, laddition de solvants organiques tels que lthanol ou le mthanol permet
simultanment daccrotre la solubilit de certains composs et la slectivit de la rsine.
Ce dernier effet est gnralement d a une modification du partage des espces entre les
deux phases.
La rtention des espces est rgie la fois par la concentration des ions dans la solution
(dplacement de lquilibre dchange) et par le pH de celle-ci (ionisation des espces
sparer). On utilise gnralement des solutions tampons de pH.
Trois facteurs dterminent le choix de la phase mobile :

2.3.3.1 LA VALEUR DU PH

Cest le facteur le plus important quil faut optimiser en premier puisquil rgit la
slectivit. En effet un accroissement du taux dionisation conduit une rtention plus
importante des espces. Le degr dionisation sera dfini par la valeur du pKA des
espces acido-basiques.

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La Chromatographie Liquide Haute Performance 2010


Il est difficile dtablir une rgle quant au choix du pH. Souvent on opre un pH voisin
du pKA des espces sparer, lgrement suprieur pour les composs basiques et
lgrement infrieur pour les composs acides.
Certains prconisent un cart de 1 2 units de pH par rapport au pKA, ce qui permet
dobtenir une variation rapide des caractristiques de rtention par changement du pH
dans la mesure o la fraction ionise initiale est faible.
2.3.3.2 LA FORCE IONIQUE

Une augmentation de la force ionique, par accroissement de la concentration en tampon


ou laddition dun lectrolyte est comparable une augmentation de la force luante du
solvan. Eelle entrane une diminution de la rtention.
2.3.3.3 LA NATURE DE LION DEVELOPPEUR

La rtention des espces dpend de la nature de lion dveloppeur. Plus la rsine a


daffinit pour celui-ci plus faible est la rtention.
Les composs les plus souvent utiliss pour prparer les solutions tampons sont :

pour les changeurs de cations : le phosphate, lactate, le borate et le formiate de


sodium, de potassium ou dammonium

pour les changeurs danions : carbonate ou bicarbonate, lammoniaque, la


pyridine.
2.3.4 MISE EN UVRE DE LA CHROMATOGRAPHIE IONIQUE

Par ce terme, on entend une chromatographie qui associe un change dions avec une
dtection conductimtrique.
La dtection des composs ioniques de lchantillon est rendue difficile par suite de leur
faible concentration au sein de la phase mobile aqueuse charge dune grande quantit
dions. Deux voies ont t dveloppes dans la recherche dune bonne dtection la
dtection : conductomtrique avec ou sans neutralisation.

30

La Chromatographie Liquide Haute Performance 2010

2.3.4.1 DETECTION AVEC NEUTRALISATION

Le principe consiste disposer entre la colonne de sparation et la cellule de dtection


un dispositif de neutralisation par lequel on limine les ions de lluant (suppressed ion
chromatography), gnralement par raction acide base. La dtection des ions de
lchantillon a lieu dans une phase mobile rendue aussi peu conductrice que possible.

Par exemple : supposons lanalyse dun mlange de cations Li+, Na+ et K+. la sparation
sobtient aisment sur une colonne avec une rsine changeuse de cations de type
sulfonate comme phase stationnaire et dune solution dacide fort (acide chlorhydrique
par exemple).
Lordre daffinit des ions pour la rsine tant :

K+ > Na+ > H+ > Li+

Lion Li+ ne sera pas retenu et migre la mme vitesse que la phase mobile dans la
colonne tandis que K+ et Na+ migrent plus lentement.

En sortie de colonne chaque ion sera en mlange avec la phase mobile (H+ et Cl-). Pour
liminer lacide chlorhydrique, on fait percoler leffluent de la colonne sur une seconde
colonne place en srie contenant une REI de type anionique forte sous forme OH. On
observe deux ractions :

une raction de permutation des ions Cl- par les ions OH-

une raction de neutralisation des ions H+ de la phase mobile par les ions OH-. En
sortie, ne subsisteront que les espces (Li+ OH-), (Na+ OH-), (K+ OH-).

La neutralisation joue donc un double rle :

liminer les ions de lluant ce qui permet de diminuer la conductivit de


leffluent.

31

La Chromatographie Liquide Haute Performance 2010

augmenter la rponse due aux soluts du fait de la permutation Cl-/OH-. La


conductivit ionique de OH- est en effet 2,6 fois celle de Cl-.

Pour la sparation danions, la colonne de neutralisation est une rsine changeuse de


cations mise sous forme acide et lluant sera une solution de carbonate ou
dhydrognocarbonate de sodium. Lacide carbonique trs peu dissoci ne contribue
pratiquement pas la conductivit de la solution aqueuse.

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La Chromatographie Liquide Haute Performance 2010

Linconvnient de ces colonnes de neutralisation est la ncessit de les rgnrer


priodiquement afin que le support reste soit sous forme acide, soit sous forme basique.

Ces colonnes sont maintenant remplaces par des supresseurs fibres ou


micromembranes de forte capacit ionique. On fait passer leffluent sortant de la colonne
de chromatographie ionique dans une membrane changeuse dions ultramince (volume
mort de lordre de 50 l) qui le spare dune solution rgnrante qui scoule contre
courant.

Par exemple, les ions Na+ de la phase luante sont changs par des ions H+ la surface
interne de la membrane et diffusent ensuite vers lautre surface o il seront changs
avec des ions H+ de la solution acide de rgnration. Les ions H+ de cette solution
migrent dans le sens oppos afin de maintenir llectroneutralit.
Plus rcemment sont apparus des suppresseurs autorgnrs par une raction
dlectrolyse de leau :

33

La Chromatographie Liquide Haute Performance 2010

Les performances de ces systmes sont telles quelles permettent la mise en uvre de
gradient dlution, ce qui nest pas permis en analyse sans neutralisation.
2.3.4.2 DETECTION SANS NEUTRALISATION

Cest une mthode plus simple que la prcdente mais elle impose :

dutiliser un luant peu conducteur (ce qui implique une faible concentration
ionique et, par suite, la mise en uvre dune colonne de faible capacit.
que lion dveloppeur ait une faible conductivit ionique E

On utilise gnralement un ion organique volumineux, donc peu mobile, mais prsentant
une forte affinit pour la phase stationnaire, de faon limiter sa concentration dans
lluant. La dtection seffectue directement la sortie de la colonne de sparation.

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La Chromatographie Liquide Haute Performance 2010

Par exemple : lanalyse des anions organiques peut tre effectue en utilisant lion
benzoate comme ion dveloppeur. Cet ion a une conductivit ionique de 32 S cm2 mol-1
qui est largement infrieure celle des anions organiques courants tels Cl-, NO3-, SO42pour lesquels elle est de lordre de 70 S cm2mol-1. La variation de la conductance sera
suffisante pour pouvoir dtecter ces espces.

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La Chromatographie Liquide Haute Performance 2010


La dtection peut tre amliore en utilisant lacide benzoque qui nest que
partiellement dissoci en solution aqueuse. Une solution dacide benzoque 8,4 10-4
mol l-1 contient 2 10-4 mol l-1 dions benzoate (taux de dissociation est de 24%) et
prsente une force luante trs proche de celle dune solution de benzoate de sodium
la mme concentration. Le remplacement de lion sodium par un proton exalte la
rponse chromatographique par mesure conductimtrique la conductivit ionique de H+
est beaucoup plus leve que celle de Na+).
2.3.4.3 ASPECTS PRATIQUES ET APPLICATIONS

La mise en uvre de phases mobiles soit trs acides soit fortement basiques demande
daccorder une attention particulire la corrosion et aux risques de contamination des
chantillons.
La chromatographie ionique est souvent utilise pour lanalyse de traces dans le
domaine des eaux :

eaux de grande puret

eaux naturelles (surface, souterraine)

eaux de rejets industriels (industrie alimentaire, pharmaceutique, traitements de


surface).

2.4 LA CHROMATOGRAPHIE DE PAIRES DIONS OU DAPPARIEMENT DIONS

On appelle paire dions ou appariement dions, une entit forme par lassociation de
deux ions de charges opposes. Cette association peut tre due :

soit des interactions lectrostatiques : ces paires dions sobservent dans des
solvants de faible constante dilectrique.

Exemple : on peut extraire par un solvant organique de faible constante dilectrique


comme un mlange chlorure de mthylne hexane la paire dions forme par le
mlange en phase aqueuse dune amine protone chane courte RNH3+ avec des
ions perchlorate ClO4- :
RNH3+aq + ClO4-aq [RNH3+, ClO4-]org

soit des effets hydrophobes : les ions organiques de grande taille comportent
une partie apolaire et un groupement ionique sassocient en paire dions en
solution aqueuse.

Exemple : soit en phase aqueuse pH 7-8 un ion carboxylate RCOO- en prsence dun
cation ammonium quaternaire comportant des chanes alkyle hydrophobes, par
exemple lanion ttrabutylammonium Bu4N+. Il y a formation dune paire dions en
phase aqueuse en raison du caractre hydrophobe du cation ammonium quaternaire.

36

La Chromatographie Liquide Haute Performance 2010


Cette paire dions peut tre extraite par un solvant organique de faible constante
dilectrique comme un mlange chlorure de mthylne hexane :
RCOO-aq + Bu4N+aq [RCOO-, Bu4N+]aq [RCOO-, Bu4N+]org

La proprit fondamentale des paires dions est leur aptitude passer des solutions
aqueuses dans les milieux de faible constante dilectrique.

La formation de paires dions peut tre utilise pour effectuer des sparations
chromatographiques de substances ionises ou ionisables. Elle rivalise avec la
chromatographie dchange dions.
Elle met en uvre des phases stationnaires de gel de silice greffe et elle a lavantage
davoir de meilleures proprits mcaniques ainsi qune efficacit suprieure.

Cette technique dappariement dions lavantage sur lchange dions rside dans le fait
que les interactions mises en jeu peuvent tre plus varies par le choix de lion
antagoniste de soluts sparer et par la nature de la phase mobile.
On utilise :

2.4.1 DESCRIPTION DU SYSTEME CHROMATOGRAPHIQUE

Pour la phase stationnaire : soit des silices greffes de chane alkyle (octyle ou
octadcyle), soit un copolymre styrne divinylbenzne.

Pour la phase mobile : cest un mlange binaire eau-actonitrile ou eau-mthanol


contenant un tampon de pH et le contre ion, cest dire lion de charge oppose celle
des soluts sparer et capable de former une paire dion. Ce contre ion doit comporter
une ou plusieurs chanes hydrophobes de manire pouvoir interagir avec la phase
stationnaire apolaire.
Ainsi, il y distribution du contre ion des soluts ioniss et des paires dions entre une
phase mobile hydro-organique et une phase stationnaire apolaire.
2.4.2 MECANISME DE RETENTION

Il sagit dun mcanisme par formation dune double couche lectrique linterface
solide hydrophobe phase mobile. Le contre ion est adsorb par sa partie hydrophobe
par les chanes alkyles de la silice et celleci devient quivalent un changeur dions :

37

La Chromatographie Liquide Haute Performance 2010

Le contre ion fixe le potentiel de surface de la phase stationnaire et le solut ionis se


concentre dans la couche diffuse.

Lefficacit de la sparation des soluts dpendra de diffrents paramtres.


1) La fixation du contre ion sur la phase stationnaire

La fixation du contre ion sur la phase stationnaire sera dfinie par le trac disothermes
dadsorption, cest--dire ltude de la variation de la concentration du contre ion dans la
phase stationnaire en fonction de sa concentration dans la phase mobile pour des phases
mobiles de nature et de composition diffrentes. Ces isothermes montrent que la
fixation du contre ion est dautant plus importante que :

la chane hydrocarbone est plus longue,

la teneur en solvant organique dans la phase mobile est plus faible.

2) Laffinit du solut vis--vis du contre ion


Le facteur de capacit k du solut augmente avec :

38

La Chromatographie Liquide Haute Performance 2010

la concentration du contre ion dans la phase stationnaire,


avec la longueur de la chane carbon du contre ion.

La rtention du solut est dautant plus importante que le solut est ionis. Pour un
acide la rtention maximale sera obtenue pour un pH > pKA +2 et pour une base pour un
pH < pKA 2 (99% de la base sera sous forme protone HB+) ;
Le caractre plus ou moins hydrophobe du solut intervient galement sur la rtention
en fonction du pH.
Exemple : La phnylalanine (PHE) :

-CH2-CH(NH2)COOH

a deux constantes dacidit et peut exister sous les formes suivantes en fonction du pH :
pH < 2,2 :

-CH2-CH(NH3+)COOH

2,2 < pH < 9,2 : :

-CH2-CH(NH3+)COO-

pH > 9,2 :

-CH2-CH(NH2)COO-

Son indice de Rekker est de 2,24. Cest une espce hydrophobe dont sa rtention
augmente fortement au-dessous de pH 3,5 par change dions sur des chanes alkyles
recouvertes de lanion dodcylsulfate et par partage des paires dions hydrophobes.
En rsum, ladsorption de la paire dions solut-contre ions est dautant plus
importante que lassociation contre ion-solut est plus hydrophobe et la phase mobile
plus hydrophile, par exemple lorsquil y a une faible proportion de solvant organique
dans le mlange binaire.
2.4.3 EXEMPLES DE SEPARATION

2.4.3.1 SEPARATION DES ANIONS ORGANIQUES

On forme des paires dions avec le cation ttrabutylammonium (TBA). La phase mobile
est constitue dune solution aqueuse de TBA et dacide salicylique pH 4,62 dont une
partie sous la forme danions salicylates C6H4(OH)COO-.

Le chromatogramme montre quil y a une lution successive des diffrents anions par
lion salicilate comme celui-ci absorbe dans lultraviolet chaque anion donne un pic
ngatif par diminution de labsorbance de leffluent lorsquil passe dans le dtecteur
spectroscopique.

39

La Chromatographie Liquide Haute Performance 2010

2.4.3.2 SEPARATION DACIDES CARBOXYLIQUES SUR SILICE GREFFEE ALKYLE AVEC


UN CONTRE ION CATIONIQUE

Soluts :

Les acides chromatographis sont lists dans le tableau ci-dessous avec leur
valeur de pKA

La phase mobile :

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La Chromatographie Liquide Haute Performance 2010


Le contre ion est cationique : le bromure de ctyltrimthylammonium :
C16H33(CH3)3N+, Br- (ou ctrimide).

Le pKA le plus lev des soluts est celui correspondant la deuxime acidit de
lacide malique (6,26). Nous fixerons donc le pH 7 (pour ces phases il faut
viter les pH > 8).

Le pH sera fix au moyen dune solution dactate dammonium 0,05 mol 1-1 en
phase aqueuse. Le pH aurait pu tre fix avec un tampon phosphate la mme
concentration mais la rtention des anions carboxylate est plus faible ce qui est
en accord avec ce qui a t dit sur le rle des ions secondaires. Sur les rsines
changeuses dions lordre daffinit est CH3COO- < H2PO4- < HPO42-).
La phase mobile sera constitue dun mlange eau-actonitrile (65 :35 v/v)
contenant 0,05 mol l-1 dactate dammonium et 10-2 mol l-1 du ctrimide.

La phase stationnaire :

La phase stationnaire est une silice greffe octyle (Lichrosorb RP 8, 10 m). La


colonne est pralablement quilibre au moyen de la phase mobile.

Chromatogramme :

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