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1nm = 1m = 10 A = 10 m.
-9
Frecuencia (v): es el nmero de oscilaciones (ciclo) que una partcula realiza en una unidad de
tiempo, generalmente un segundo (ciclos por segundo); es la inversa de la longitud de onda.
v = c/
Pero es que adems la luz est formada por fotones, o paquetes discontinuos de
energa; la energa de un fotn depende de su frecuencia y de su longitud de onda:
E = h.v
E = h. c/
Rayos gamma
10 -10
-5
Rayos X
10 -10
-3
Ultravioleta
200-380
Luz Visible
380-780
Infrarrojo
-3
780-50.000
Microondas
10 -10
8
Frecuencias de Radio
>10
El ojo humano responde a la radiacin electromagntica entre los 380 y los 750
aproximadamente, pero actualmente disponemos de instrumentos que suplen nuestra limitacin,
y permiten la medida de radiaciones de longitudes de onda mayores (IR) y menores (UV).
La luz solar, o la luz emitida por un filamento de tungsteno, es una mezcla de radiaciones
de distinta longitud de onda que al ojo humano se reconoce como blanca, es decir, es una
radiacin policromtica.
En la regin visible, la luz se descompone en colores y sus complementarios:
Descomposicin del espectro visible y ultravioleta en colores y sus complementarios
Longitud de onda
(nm)
180-220
220-340
Nombre de la
regin
UV corto
UV
Color
absorbido
Color complementario o de la
solucin
No visible
No visible
---
380-430
Visible
Violeta
430-495
Visible
495-555
Azul
Visible
555-600
Visible
600-650
Visible
650-780
Visible
Amarillo verdoso
Naranja
Rojo
Amarillo
Verde
Rojo
Amarillo
Azul
Azul verdoso
Verde azulado
A*
A + calor
0
1
2
Explicacin:
En los tomos, los electrones ocupan alrededor del ncleo determinados niveles
energticos, que definen orbitales caractersticos para cada tipo de tomo. Un tomo en estas
condiciones, se encuentra en su estado fundamental o de menor energa, su configuracin
electrnica es estable y tiende a mantenerla o a recuperarla si esta ha sido alterada.
En el caso de la radiacin correspondiente a la banda espectral del UV y/o del visible, la
radiacin absorbida tiene la energa suficiente como para producir el desplazamiento de los
electrones de enlace a posiciones ms energticas y por tanto, menos estables, denominados
estados excitados. Los tomos tienden a estar en el estado de mayor estabilidad que coincide
con el estado fundamental o menos energtico, por lo que los electrones al volver total o
parcialmente a este estado en el proceso denominado relajacin, la energa que fue
previamente absorbida, es reemitida en forma de radiacin electromagntica, cuya est
ntimamente ligada a la cantidad de energa incidente.
Este fenmeno es la base de tcnicas espectroscpicas de anlisis como la absorcin,
la absorcin atmica, la emisin, la fotometra de llama (emisin atmica), la fotoluminiscencia
(fluorescencia y fosforescencia), la nefelometra, la turbidimetra, etc.
ESPECTROFOTOMETRA DE ABSORCIN MOLECULAR:
La espectrofotometra de absorcin consiste en la medicin de la radiacin que llega a
un detector tras producirse un fenmeno de absorcin de luz por parte de una sustancia
absorbente.
En qumica clnica, el material en estudio es generalmente una solucin, y las medidas
se hacen ordinariamente dentro del espectro comprendido entre los 220 y 800 nm.
Es aplicable tanto para anlisis cualitativos como cuantitativos.
Leyes de absorcin
Cuando un haz de luz de intensidad I incide sobre una cubeta cuadrada que contiene
una solucin coloreada que absorbe luz a una determinada , se produce en la solucin un
proceso de absorcin, y el haz de luz que sale despus de atravesar la cubeta tiene una
intensidad menor, I
0
Para evitar interacciones por parte del solvente o de la cubeta y considerar as slo la
absorcin del compuesto de inters, hay que hacer una primera medida con una solucin de
referencia o blanco, que contiene todos los posibles compuestos que participan en la lectura,
menos el compuesto a medir. Todas las medidas que se hagan a continuacin sern referidas a
esta medida inicial.
Se define transmitancia a la relacin entre la luz incidente y la luz transmitida:
T = I /I
s
Y el porcentaje de transmitancia:
%T = I /I . 100
s
C =C .A /A
problema
C = concentracin de la solucin estndar
C =
problema
Conocemos el valor de C y por la analtica los valores de A y A ; con estos datos
calculamos el cociente C /A estableciendo as el valor de un factor, que es constante, y que
multiplicado por las absorbancias de sucesivos problemas que se ensayen en la misma serie,
nos dar el valor de las concentraciones de estas soluciones problema.
s
C =C /A .A =F.A
p
b) Curva de calibracin:
Es la representacin grfica en un eje de coordenadas de absorbancia (ordenadas) frente a
concentracin (abscisas).
El mtodo de trabajo con curva de calibracin consiste en ensayar varias soluciones de
concentraciones conocidas, determinar sus absorbancias y a continuacin construir la curva
de calibracin (que debe ser una recta), representando las concentraciones frente a
absorbancias grficamente; en la construccin de la curva se emplean un mnimo de 3 puntos y
a continuacin se traza una lnea recta que se aproxime a ellos lo ms posible.
Una vez ensayadas las soluciones problema, su concentracin se averigua por
interpolacin de las absorbancias de las soluciones problema en la recta de calibracin.
Estas 2 formas de trabajo slo son vlidas si el cromgeno obedece la Ley de Beer, y tanto
las soluciones estndar como los problemas son ledas en idnticas condiciones.
A estndar
C estndar
A problema
C problema
Producto coloreado
Concentracin
lectura Absorbancia
(Espectrofotmetro)
patrn
problema
patrn
ya que suelen ser, por lo general, reacciones colorimtricas a punto final, pero
tambin pueden ser colorimtricas y cinticas, por lo que se empleara la siguiente
expresin:
problema
= C
patrn
. DO
DO
problema
patrn
https://docs.google.com/document/d/1IStRYXgU2LMyemg7GI0enZuSYGqecjBfocWL_LfYeI/edit?pli=1
Curso 2012-13. Ciclo Superior de Laboratorio de Diagnstico Clnico. Fundamentos y tcnicas de anlisis bioqumico.
Tema 2. Tcnicas espectromtricas