DRX

II.2.2. Difraccin de rayos X (RX).
Cristalografa
II.2.2.1. Introduccin.
II.2.2.2. Dispersin de RX por un electrn.
II.2.2.3. Dispersin de RX por un tomo.
II.2.2.4. Dispersin de RX por un cristal monodimensional.
II.2.2.5. Dispersin de RX por un cristal bidimensional.
II.2.2.6. Dispersin de RX por un cristal tridimensional.
II.2.2.7. Ley de Bragg.
II.2.2.8. El problema de la fase.
II.2.2.9. Mtodos para obtener difractogrmas de RX
Mtodo de Laue
Mtodo de Weissenberg
Mtodo de precesin
Mtodo de oscilacin
II.2.2.10. Etapas para determinar la estructura de una macromolcula.
Estructura de Macromolculas
Departamento de Qumica-Fsica, Universidad de Granada. OLM
II.2.2. Difraccin de rayos X (RX). Cristalografa

II.2.2.1. Introduccin
Si una imagen vale ms que 1000 palabras la estructura

macromolecular no tiene precio para un bioqumico-fsico.
La difraccin de RX es la tcnica ms poderosa actualmente disponible para estudiar
la estructura de grandes molculas. En muchos casos los estudios de difraccin de RX sobre
cristales de protenas o cidos nucleicos han resuelto completamente sus estructuras terciarias
a un nivel de resolucin de 2 o mejor.
Como es de esperar una tcnica que puede proporcionar tantos detalles estructurales
debe ser intrnsecamente bastante compleja. Vamos a omitir cuantos aspectos complicados
sea posible y tratar de enfocar nuestra atencin sobre los hechos esenciales del mtodo. As
los tomos sern tratados como estticos, es decir sin movimiento, aunque en los cristales
haya un movimiento apreciable a temperaturas finitas. Los cristales son tratados como
ordenamientos perfectos, incluso sabiendo que el orden slo alcanza dominios locales; la
radiacin X es tratada como monocromtica, aunque en la prctica se use una distribucin de
longitudes de onda; finalmente consideraremos que los datos de difraccin son muy precisos,
aunque los errores experimentales a menudo son problemas importantes en la prctica.
Para comprender la difraccin de RX se debe conocer cmo es la interaccin entre esta
radiacin electromagntica y los tomos, as como la manera en que los tomos estn
organizadas en los cristales.
La mayora de las descripciones y tradicionales de esta tcnica comienza con el
estudio de la simetra y estructura de los cristales y se describe la difraccin de RX en
trminos de reflexiones sobre planos del cristal. No obstante nosotros vamos a usar un
enfoque diferente.
Explicaremos la infraccin la dispersin de RX producida por un simple tomo;
entonces creciendo en complejidad describiremos la dispersin que produce un hipottico
cristal monodimensional, continuando con un cristal bidimensional y finalmente con el
ordenamiento tridimensional propio de los cristales reales. Aunque este tratamiento requiere
mayor soporte fsico-matemtico nos permite profundizar y comprender mejor esta compleja
tcnica experimental.
132
II.2.2.2. Dispersin de RX por un electrn.

La interaccin entre los RX y la materia consiste en la dispersin que los electrones de
los tomos producen sobre esta radiacin. Los RX dispersados por los electrones de los
tomos de una muestra cristalina sufren fenmenos de interferencias dando lugar a procesos
de difraccin y la informacin estructural subyace en los patrones de difraccin.
Comenzamos por considerar un electrn en el origen de coordenadas, sobre el cual
incide la radiacin que proviene de una fuente de RX en la direccin del eje x, y un detector
en una direccin de observacin que forma un ngulo con el eje x al que por conveniencia
consideremos 2 ( ser el ngulo mitad del considerado), figura II.2.2.1.A. A las direcciones
de incidencia y de observacin le corresponden los vectores unitarios s0 y s .
La dispersin, como ya sabemos, es una funcin del ngulo de observacin, pero
tambin depende de la posicin relativa del centro porque la fase depende del camino ptico.
As, si suponemos que el electrn est en una posicin diferente a la del origen de
r
coordenadas, dada por el vector de posicin r , figura II.2.2.1.B. Si la fuente y el detector
estn suficientemente alejados del electrn, el ngulo de observacin es prcticamente el
mismo para las diferentes posiciones que podamos considerar en la proximidad del origen de
coordenadas. La nica diferencia entre la dispersin producida en el origen y otra posicin es
la diferencia de camino ptico. En la figura II.2.2.1.C se indica como esta diferencia es debida
a los segmentos no comunes a las dos posiciones consideradas que corresponden a los
r r
r r
productos escalares r s0 y r s0 , respectivamente. La diferencia de camino ptico ser
r
entonces (s s0 ). r .
Es conveniente, matemticamente y conceptualmente, introducir un vector de
dispersin, figura II.2.2.2 definido por la diferencia:
r s s
s= 0
[II.2.2.1]
La longitud de este vector (su mdulo) se deduce a partir del producto escalar del
vector por si mismo:
2
r r s 2 + s0 2 s s0 2(1 cos 2 ) 4 sen 2
s s =
=
=
2
2
2
r 2 sen
s =
133
[II.2.2.2]
Detector
F
U
E
N
T
E
s0
Detector
s0
F
U
E
N
T
E
r
r
x
Detector
C
Y
F
U
E
N
T
E
s0
s0
r
r s0
s
r
r
r
r s
Figura II.2.2.1. A: Dispersin elstica de rayos por un electrn en el origen de

coordenadas. B: Dispersin elstica de rayos por un electrn en la posicin determinada
r
por el vector de posicin r . C: Diferencia de caminos opticos entre la dispersin desde el
r
origen y la posicin determinada por el vector de posicin r .
134
r
s
s0
s0
r
s
r
s
1 r
s
r r
r s s
s
(0,0)
s0
r
s r r
s s
Figura II.2.2.2. Izquierda: Definicin del vector dispersin, s . Derecha: Para la

direccin de incidencia de los RX fija en el eje x, los posibles vectores de dispersin segn la
direccin de observacin, describen una esfera a la que llamaremos de esfera de reflexin o
esfera de Ewald.
Este vector de dispersin es funcin del ngulo observacin y tiene dimensiones de
longitud inversa; su valor nos da el nmero de ciclos de radiacin por unidad de longitud.
Para fijar este vector en el espacio necesitamos unas coordenadas en las que los ejes tengan
dimensiones de longitud inversa, es decir un espacio reciproco. Posteriormente
relacionaremos este vector con los parmetros que definen las redes cristalinas.
Volviendo al caso planteado anteriormente y representado en la figura II.2.2.1.B la
diferencia de camino ptico puede expresarse como:
(s s0 ). rr = sr rr
[II.2.2.3]
r
Si llamamos E (s ) a la intensidad de campo elctrico de la radiacin dispersada por el
electrn en el origen de coordenadas y en el espacio reciproco, el campo de la radiacin
dispersada por el electrn en el punto determinado por el vector de posicin

Apendice I: Repaso de las matemticas de las ondas peridicas):
r
r
ser (ver
r 2 i sr rr
E ( s )e
r
Introducimos ahora la idea de factor de estructura, F (s ) , como la razn entre la

radiacin dispersada por cualquier muestra real y la dispersada por un simple electrn en el
origen de coordenadas.
As para el caso del electrn en el punto determinado por el vector de posicin
factor de estructura ser:
rr
r
rr
r E ( s )e 2 i s r
F (s ) =
= e 2 i s r
r
E (s )
r
r el
[II.2.2.4]
Los electrones no son cargas puntuales localizadas en un determinado punto del

r
espacio, es mas adecuado tratarlos como una densidad electrnica continua (r ) . En
135
cualquier punto del espacio en el que consideremos un elemento de volumen dV = dx dy dz

solo tendremos una fraccin del electrn
reescribirse como:
(r )dV por lo que el factor de estructura podr
rr
r
r
F ( s ) = (r ) e 2 i s r dV
[II.2.2.5]
Para una muestra con muchos centros dispersantes discretos el factor de estructura ser
la suma de muchos trminos como el de la ecuacin II.2.2.5. Para una distribucin continua
de electrones, la suma se convierte en la integral extendida a toda la muestra:
r
r 2 i srrr
F ( s ) = (r ) e
dV
[II.2.2.6]
Esta es la ecuacin bsica que gobierna la dispersin y la consecuente difraccin de

los RX. Si la distribucin de la densidad electrnica se conoce es posible calcular el factor de
estructura, y a partir de ste calcular la dispersin para cualquier forma de la densidad
electrnica.
La forma matemtica de la ecuacin II.2.2.6 corresponde a una transformacin integral
r
de Fourier; podemos entonces decir que el factor de estructura, F (s ) , es la transformada de
Fourier de la densidad electrnica de la muestra. Una consecuencia inmediata es que la
densidad electrnica es la transformada inversa de Fourier del factor de estructura:
rr
(r ) = e 2 i s r F ( s )ds
[II.2.2.7]
La utilidad de esta ecuacin radica, como se indica en la figura II.2.2.3, en que

establece la conexin entre los datos experimentales y la estructura de las molculas de la
muestra, a travs de la densidad electrnica. La conexin es la transformada rpida de Fourier,
FFT (Fast Fourier Transform), un algoritmo que nos permite pasar, en este caso particular,
del dominio del espacio reciproco (el difractograma) al dominio de la distribucin espacial de
la densidad electrnica. Finalmente se optimizan las coordenadas de todos los tomos para el
mejor ajuste a la densidad electrnica.
No obstante, el proceso aparentemente sencillo est complicado por el llamado
problema de la fase. El factor de estructura es un nmero complejo y como consecuencia
para especificarlo es preciso una parte real y una parte compleja, o bien, segn la
representacin vectorial de un nmero complejo, se precisa un mdulo y un ngulo de fase,
figura II.2.2.4. El mdulo se obtiene experimentalmente de la intensidad de la radiacin
dispersada, que est dada por el cuadrado del factor de estructura:
r
r
r
2
I (s ) = F (s ) F * (s ) = F
[II.2.2.8]
sin embargo la fase queda indeterminada y sin conocer su valor no es posible usar las
ecuaciones II.2.2.6 o II.2.2.7. Esto ha conducido al desarrollo de mtodos para determinar la
fase que estudiaremos posteriormente.
136
Cristales de
protena.
Difractometro
de Rayos X
El difractograma
Transformada
rpida de Fourier
Factor de estructura
r
F (s )
FFT
Espacio reciproco
Optimizacin
algoritmica de
la estructura
molecular
Mapa de densidad
electrnica de una
hlice
Modelo molecular
Figura II.2.2.3. Ilustracin del mtodo de determinacin de la estructura

tridimensional de biopolmeros por difraccin de rayos X.
Eje imaginario
r
F = F e i
r
F = Fr + iFi
= arctag
Fase,
Eje real
F cos
Figura II.2.2.4. Representacin vectorial del factor de estructura.
137
Fi
Fr
II.2.2.3. Dispersin de RX por un tomo.
El siguiente paso en la descripcin del fenmeno de difraccin de RX es considerar la

dispersin de esta radiacin por un tomo. Como en el caso del electrn consideraremos en
primer lugar al tomo en el origen de coordenadas, y en segundo lugar en un punto fuera del
origen.
La resolucin en los experimentos de difraccin de RX no es lo suficientemente
elevada para poder distinguir la forma detallada de la distribucin de electrones en el tomo,
en diferentes orbitales atmicos y moleculares. As es una aproximacin aceptable considerar
que los electrones de un tomo forman una distribucin esfrica alrededor del ncleo. Una
consecuencia inmediata de esta aproximacin es, como se ilustra en la figura II.2.2.5., que la
densidad electrnica por simetra es independiente de la direccin considerada, y solo es
funcin de la distancia al ncleo.
Figura II.2.2.5. Distribucin esfrica de la densidad electrnica. Por razn de

simetra la funcin de distribucin espacial dependiente del vector de posicin del punto
r
considerado (izquierda), (r ) , se reduce a una funcin en el plano del mdulo del vector de
posicin, es decir, de la distancia al origen de coordenadas, (r ) .
r
El factor de estructura, funcin del vector de dispersin, s , por la razones de simetra
que acabamos de considerar, se convierte en una funcin del mdulo del vector de
r
r
dispersin, s = S , pasando a llamarse factor de dispersin atmica: F ( s ) f ( S ) .
Utilizando las coordenadas polares indicadas en la figura II.2.2.6 se deduce, a partir de la

ecuacin II.2.2.6, la siguiente expresin de f (S ) :
sen 2 S r
dr
f ( S ) = 4 (r )r 2
0
2 S r
138
[II.2.2.9]
r
s
Figura II.2.2.6. Coordenadas polares

para deducir la ecuacin II.2.2.9.
Para tomos reales la densidad electrnica puede considerarse aproximadamente como

, donde z es el
una distribucin Gausiana de la distancia al ncleo: ( r ) = zPe
nmero de electrones, P es una constante de normalizacin y k est relacionada con la
anchura de la Gausiana. Con esta densidad electrnica podemos integrar la ecuacin II.2.2.9
para, teniendo en cuenta la ecuacin II.2.2.2, obtener:
kr 2
f ( S ) = ze
S 2 k
= ze 4
( sen )2
[II.2.2.10]
Esta ecuacin nos muestra que el mximo de la intensidad de la radiacin dispersada,

I ( S ) = f ( S ) 2 , corresponde a un ngulo entre direccin de incidencia y observacin es nulo,
es decir, dispersin en la misma direccin de incidencia. Y que el factor de dispersin cae
rpidamente al aumentar el ngulo. En la figura II.2.2.7 se representa la I (S ) en funcin de
sen para un tomo de Helio en el origen, con una longitud de onda de 12 .
Figura II.2.2.7. Factor de dispersin atmica para un tomo de He y una longitud de

onda de los RX de 12 , segn la ecuacin II.2.2.10.
139
Consideremos ahora al tomo fuera de origen de coordenadas, como se representa en

la figura II.2.2.8. De forma anloga al caso de un simple electrn puede demostrarse que:
r r
r
F ( s ) = f ( S ) e 2 i s rn
[II.2.2.11]
r r
donde es el vector de posicin del tomo y el producto escalar s rn en el exponente

representa la diferencia de camino ptico entre la dispersin desde el origen y la dispersin
desde la posicin indicada por
r
rn .
Figura II.2.2.8. tomo, representado por una distribucin esfrica de la densidad

electrnica, fuera del origen.
Para un juego de N tomos, cada uno localizado en una posicin
dispersin atomica f n (S ) , el factor de de estructura total ser:
r
rn , con factores de
N
rr
r
F ( s ) = f n ( S ) e 2 i s rn
[II.2.2.12]
n =1
Si todos los tomos pertenecen a la misma molculas el factor de estructura dado por
r
la anterior ecuacin ser el factor de estructura molecular, Fm (s ) .
II.2.2.4. Dispersin de RX por un cristal monodimensional.
Un hipottico cristal monodimensional consiste en una fila de 2N +1 tomos idnticos.

La posicin de cada tomo en el cristal se obtiene desde el tomo vecino por la traslacin
r
determinada por un vector a , cuyo mdulo corresponde al espaciado del cristal:
r
a
-5a
-4a
-3a
-2a
-a
2a
3a
4a
5a
Figura II.2.2.9. Cristal mono dimensional de espaciado a.
140
As la posicin del ensimo tomo en el cristal ser na y el factor de estructura de este

tomo ser:
r r
r
2 i n s a
Fn ( s ) = f ( S ) e
[II.2.2.13]
De esta forma la dispersin de cualquier tomo en el cristal monodimensional puede

expresarse en trminos del factor de dispersin atmica para un tomo en el origen. El factor
de estructura para el cristal completo puede escribirse como:
N
r r
r
2 i n s a
FTotal ( s ) = f ( S ) e
[II.2.2.14]
n= N
De forma anloga podemos tratar cualquier cristal monodimensional de molculas

generado por simple traslacin (sin rotacin), y la ecuacin anterior ser vlida sustituyendo
r
el factor de dispersin atmica por el factor de dispersin molecular Fm (s ) .
La intensidad de dispersin total, [FTotal (s )] , es entonces el producto de la intensidad
de
la dispersin producida por un simple tomo en el origen,
[ f (S )] 2 ,
y el trmino
N 2 in srar
e
. ste ltimo es una funcin peridica que recibe el nombre de Funcin
n= N
Franja.
Veamos algunos ejemplos sencillos para consolidar estas ideas.
Caso de dos tomos en las posiciones n= 0 y n=+1. Figura 2,2,10, panel superior.
rr
rr
r
F (s ) = f ( S ) e 0 + f ( S ) e 2 is a = f ( S ) 1 + e 2 is a
La intensidad de dispersin ser el cuadrado de este factor de estructura (y recordando que

ei.x = cos x i. sen x):
)(
rr
rr
r
r 2
r r
2
2
I (s ) = [F (s )] = [ f ( S )] 1 + e 2 is a 1 + e 2 is a = 2[ f ( S )] [1 + cos 2 s a ]
Caso de tres tomos en las posiciones n=-1, n=0 y n=+1. Figura II.2.2.10, panel central.
rr
rr
r
r r
F (s ) = f ( S ) 1 + e 2 is a + e 2 is a = f ( S )(1 + 2 cos 2 s a )
r
r r
I (s ) = f 2 ( S )(1 + 2 cos 2 s a ) 2
141
Caso de cuatro tomos en las posiciones n=-1, n=0, n=+1 y n =+2. Figura II.2.2.10, panel
inferior.
rr
rr
rr
r
F (s ) = f ( S ) 1 + e 2 is a + e 2 is a + e 4 is a
r
r r
r r
r r
F (s ) = f ( S )((1 + 2 cos 2 s a + cos 4 s a ) + i (sen 4 s a ))
Parte real
Parte imaginaria
r
r r
r r
r r
I (s ) = f 2 ( S ) (1 + 2 cos 2 s a + cos 4 s a ) 2 + sen 2 4 s a
Caso de cinco tomos en las posiciones n=-2, n=-1, n=0, n=+1 y n=+2 Figura II.2.2.11,
panel superior.
r
F (s ) = f ( S )(1 + e 2 is a + e 2 is a + e 4 is a + e 4 is a ) =
r r
r r
f ( S )(1 + 2 cos 2 s a + 2 cos 4 s a )
rr
rr
rr
rr
r
r r
r r
I (s ) = f 2 ( S )(1 + 2 cos 2 s a + 2 cos 4 s a ) 2
Caso de nueve tomos en las posiciones n=-4, , n=0, , n=+4 Figura II.2.2.11, panel
inferior.
rr
rr
rr
rr
rr
rr
rr
rr
r
F (s ) = f ( S ) 1 + e 2 is a + e 2 is a + e 4 is a + e 4 is a + e 6 is a + e 6 is a + e8 is a + e 8 is a
r
r r
r r
r r
r r
F (s ) = f ( S )(1 + 2 cos 2 s a + 2 cos 4 s a + 2 cos 6 s a + 2 cos 8 s a )
r
r r
r r
r r
r r2
I (s ) = f 2 ( S )(1 + 2 cos 2 s a + 2 cos 4 s a + 2 cos 6 s a + 2 cos 8 s a )
Como puede observarse en la figura II.2.2.11 con solo nueve tomos la dispersin de
r r
la radiacin en valores no enteros de s a es ya muy pequea. Si consideramos un cristal
monodimensional de longitud usual en los cristales reales, el nmero de tomos sera del
r r
orden de 106, en cuyo caso la radiacin dispersada para valores enteros de s a sera muy
intensa, mientras que para valores no enteros sera prcticamente nula. El significado fsico de
este resultado es que solo para ciertas orientaciones de la muestra y de la direccin del
detector se observar radiacin dispersada. Este resultado se conoce como condicin de von
Laue, y la expresamos as:
r r
s a = h;
donde h = 0, 1, 2, 3, ...
r
Si fijamos la orientacin del cristal, es decir fijamos el vector a , la condicin de von

Laue para un cristal monodimensional puede representarse por un juego de planos paralelos,
r
perpendiculares a la direccin del vector a , el plano central en el origen y los restantes en las
posiciones 1/a, 2/a, 3/a, . Estos planos son los lugares geomtricos de los extremos de
r
r
los vectores s cuyas proyecciones sobre la direccin del vector a valen 1/a, 2/a, 3/a, .
Ver figura II.2.2.12.
142
-4a
-5a
-3a -2a
-a
2a
4a
3a
5a
I
n
t
e
n
s
i
d
a
d
r r
s a
-4a
-5a
-3a -2a
-a
2a
5a
4a
3a
I
n
t
e
n
s
i
d
a
d
r r
s a
-5a
-4a
-3a -2a
-a
2a
3a
4a
5a
I
n
t
e
n
s
i
d
a
d
r r
s a
Figura II.2.2.10. Dispersin de RX por un hipottico cristal monodimensional de dos, tres y
cuatro tomos, con las posiciones indicadas en el dibujo. Izquierda: Intensidad resultante,
r
r r
I (s ) , frente al producto s a . Derecha: Mapas bidimensionales de la Intensidad dispersada
en funcin de los ndices h y k.
143
-5a
I
n
t
e
n
s
i
d
a
d
-4a
-3a
-2a
-a
2a
3a
4a
5a
r r
s a
r r
s a
r r
s a
-5a
-4a
-3a
-2a
-a
2a
3a
4a
5a
I
n
t
e
n
s
i
d
a
d
r r
s a
Figura II.2.2.11. Dispersin de RX por un hipottico cristal monodimensional de cinco y

nueve tomos, con las posiciones indicadas en el dibujo. Izquierda: Intensidad resultante,
r
r r
I (s ) , frente al producto s a . Derecha: Mapas bidimensionales de la Intensidad dispersada
en funcin de los ndices h y k.
Conforme a lo que hemos descrito anteriormente, para observar dispersin de la
r
radiacin los vectores de dispersin s deben cumplir dos condiciones, por un lado sus
extremos deben pertenecer a la la superficie de la esfera de reflexin, figura II.2.2.2, y por
otro lado deben pertenecer a los planos de la condicin de von Laue. Como consecuencia solo
se observar radiacin dispersada en las orientaciones del detector (relativas a la direccin de
r
incidencia de los RX) que correspondan a los vectores s cuyos extremos caigan sobre los
crculos que resultan de la interseccin de los citados planos y la esfera de reflexin, como se
indica en la figura II.2.2.13.
144
Figura II.2.2.12. Conjunto de planos paralelos representando las condiciones de von

Laue para un cristal monodimensional de espaciado a. La parte inferior de la figura es una
vista lateral o corte transversal de los planos y algunos vectores de dispersin que cumplen
la condicin de von Laue.
Aunque s es muy til para describir el fenmeno de difraccin de RX, como hemos
podido comprobar en lo expuesto hasta ahora, la direccin de este vector de dispersin no es
la direccin en la que el detector observar radiacin dispersada. No obstante, es muy fcil
obtener esta ltima direccin a partir de los vectores de dispersin y de la direccin de
incidencia de RX; para ello es suficiente considerar la composicin vectorial de la definicin
r
de s dada en la figura II.2.2.2.
Veamos a continuacin la dispersin por un cristal monodimensional, tal como se
vera en el laboratorio si el experimento fuera factible. Comencemos por analizar la dispersin
por un tomo en el origen de coordenadas con la configuracin planteada en la figura
II.2.2.14. En este hipottico experimento los RX inciden a lo largo del eje x y la deteccin se
hace con una pelcula fotosensible cilndrica con eje z. El desarrollo de esta pelcula revela un
patrn de dispersin acorde con el factor de dispersin atmica anteriormente estudiado,
obtenindose la mxima intensidad de radiacin dispersada en la direccin de incidencia. La
forma elipsoidal del patrn obtenido es consecuencia de la geometra cilndrica de la pelcula,
si hubiramos usado una pelcula plana habramos obtenido un patrn circular.
145
+4/a
+3/a
r
s0 a
r
a
+2/a
+1/a
0
s0
-1/a
-2/a
-3/a
-4/a
-8/a -7/a -6/a -5/a -4/a -3/a -2/a -1/a 0
Figura II.2.2.13. Interseccin de los planos paralelos, que representan la condicin de

von Laue, con la esfera de reflexin de Ewald (crculo de trazo discontinuo). Todo vector de
dispersin cuyo extremo sea un punto de cualquiera de los crculos resultantes nos dar una
direccin de observacin en la que habr radiacin dispersada.
Figura II.2.2.14. Izquierda: Un tomo en el origen de coordenadas; los RX inciden a

lo largo del eje x y la radiacin dispersada se detecta con una pelcula fotosesnsible
cilndrica con eje z. Derecha: Desarrollo de la pelcula resultante apareciendo un patrn
elptico de dispersin.
146
Consideremos ahora el experimento representado en el esquema de la figura II.2.2.15.

A. Como en el caso del simple tomo en el origen los RX inciden a lo largo del eje x y la
deteccin se hace con una pelcula fotosensible cilndrica con eje z. Ahora el cristal
monodimensional se centra en el origen de coordenadas y se orienta en la direccin del eje z.
En la figura II.2.2.15.B se representa la construccin geomtrica de uno de los conos
de radiacin dispersada a partir de los vectores de dispersin para la condicin de von Laue h
= 3. En este esquema podemos observar los crculos paralelos sobre la superficie de la esfera
de reflexin de Ewald, que representan el lugar geomtrico de los posibles extremos de los
vectores de dispersin para que haya radiacin dispersada, y se muestran dos vectores de
dispersin en puntos diametralmente opuestos del circulo que corresponde a la condicin h =
3. Es evidente que al mover el extremo de uno de estos vectores por todo el crculo se genera
el cono de radiacin indicado en la figura con color azul.
De la misma forma se generan otros conos para los restantes valores de h,
representndose el conjunto de todos ellos en la figura II.2.2.15.C. La interseccin de estos
conos de radiacin con la pelcula cilndrica producir un patrn de bandas paralelas, con
separacin creciente en la direccin vertical y que se atenan horizontalmente como
consecuencia del efecto introducido por el factor de dispersin atmica.
II.2.2.5. Dispersin de RX por un cristal bidimensional.
Obviamente el cristal monodimensional es un modelo terico que no tiene utilidad

prctica, pero es la base sobre la que vamos a construir el anlisis del sistema real, es decir un
cristal tridimensional. Todava es conveniente extender las ideas desarrolladas en el cristal
monodimensional a un modelo de cristal bidimensional.
ste es un ordenamiento cuya periodicidad se define por dos vectores a y b , y se

puede considerar compuesto por un conjunto de cristales monodimensionales de espaciado
r
r
r
a ordenados con una separacin b , o viceversa. La periodicidad en la direccin de a
r
r r
producir franjas de difraccin de separacin 1 a tal que s a = h (siendo h = 1, 2, 3, ),
r
r
y la periodicidad en la direccin b otro juego de franjas de separacin 1 b tal que
r r
s b = k (siendo k = 1, 2, 3, ).
147
Figura II.2.2.15. A: Hipottico experimento de difraccin de RX por un cristal

monodimensional en la direccin del eje z (Los tamaos del cristal y la pelcula estn
totalmente desproporcionadas). Los RX inciden sobre el cristal en la direccin del eje x y la
deteccin se hace con una pelcula cilndrica. B: Construccin geomtrica de uno de los
conos de radiacin dispersada a partir de los vectores de dispersin para la condicin de von
Laue h = 3. C: Conjunto de conos de radiacin dispersada por el cristal y su interseccin con
la pelcula cilndrica. D: Desarrollo de la pelcula en la que la atenuacin horizontal del
patrn obtenido es consecuencia del factor de dispersin atmica.
148
As en la figura II.2.2.16 se muestra un esquema de cristal bidimensional y los planos

que representan las condiciones de von Laue para cada uno de las dos dimensiones. La
condicin de von Laue para el cristal completo implica satisfacer simultneamente las dos
r r
r r
condiciones anteriores, s a = h y s b = k , y esto lo cumple el conjunto de lneas de
r
r
1
b
1 ay
,
interseccin de los dos juegos de planos paralelos de separacin

respectivamente, y que en la figura II.2.2.16 se indican con lneas de trazos.
r
b
r
1 b
r
a
r
1 a
r
Figura II.2.2.16. Izquierda: Cristal bidimensional definido por los vectores a y b . Derecha:
Planos paralelos correspondientes a las condiciones de von Laue para cada una de los dos
conjuntos de cristales monodimensionales que podemos considerar forman el cristal, de
r
r
separacin 1 a y 1 b , respectivamente. Las lneas de trazo discontinuo, resultado de la
interseccin de los dos conjuntos de planos representan la condicin de von Laue para todo
el cristal.
El patrn de dispersin que producira un cristal bidimensional en un experimento tal

como se representa en el esquema de la figura II.2.2.17.A se muestra en la figura II.2.2.17.C.,
como resultado de la interseccin de los patrones de dispersin que produciran cristales
monodimensionales con la periodicidades generadas por los vectores a y b . El efecto del

factor de dispersin atmica se refleja en la atenuacin de la intensidad de la radiacin
dispersada al alejarnos del centro del patrn.
149
Figura II.2.2.17. A: Hipottico experimento de difraccin de RX por un cristal bidimensional

ortogonal orientado en el plano yz (Los tamaos del cristal y la pelcula estn totalmente
desproporcionadas). Los RX inciden sobre el cristal en la direccin del eje x y la deteccin se
hace con una pelcula cilndrica. B: Patrn de dispersin producido por los cristales
r
monodimensionales de direccin a sobre la pelcula cilndrica sin incluir el efecto del factor
de estructura atmica. C: Patrn
de dispersin producido por los cristales
r
monodimensionales de direccin b sobre la pelcula cilndrica sin incluir el efecto del factor
de estructura atmica. D: Patrn de dispersin producido por el cristal bidimensional
completo sobre la pelcula cilndrica incluyendo el efecto del factor de dispersin atmica.
150
II.2.2.6. Dispersin de RX por un cristal tridimensional.
En un cristal tridimensional hay una tercera dimensin en la que la periodicidad est

r
establecida por un vector c , figura II.2.2.18, lo que conduce a un tercer juego de franjas de
r r
dispersin planas dadas por la condicin s c = l , donde l = 0, 1, 2, 3, ... ,
r
r
r r r
perpendiculares a c y de separacin 1 c . Los tres vectores a , b y c definen la unidad que se
repite, conocida como celdilla unidad, de forma que el cristal tridimensional puede
considerarse generado por la traslacin de esta unidad en las tres direcciones de estos
vectores.
La condicin de von Laue es ahora triple:
r r
s a = h , h = 0, 1, 2, 3, ...
r r
s b = k , k = 0, 1, 2, 3, ...
r r
s c = l , l = 0, 1, 2, 3, ...
h, k y l reciben el
nombre de ndices
de Miller.
Satisfacen esta triple condicin la red tridimensional de puntos que resultan de la interseccin
r
r
r
de los tres juegos de planos de dispersin, separados por los espaciados 1 a , 1 b y 1 c ,
respectivamente, como se muestra en los esquemas rde la figura II.2.2.18. Esta red de puntos
r
r
puede considerarse generada por tres vectores a, b y c que son los vectores inversos de
r r r
a , b y c , respectivamente, por lo que a esta red se le denomina red reciproca definida en el
espacio reciproco x, y y z .
En la red cristalina la posicin de cualquier tomo se puede expresar en trminos de
r r r
las coordenadas del sistema definido por los vectores a , b y c , as un vector con origen en el
origen del sistema de coordenadas y el extremo en la posicin del tomo o molcula, es decir
el vector de posicin, sera:
r
r
r
r
r = x a + y b + z c
Donde x, y y z son nmeros enteros porque los tomos o molculas caen en los nudos de la
red. Este vector de posicin puede utilizarse para calcular la dispersin producida por la red
tridimensional; as, usando la ecuacin II.2.2.12, el factor de estructura ser una suma
extendida a todas las posiciones de los tomos o molculas:
r r r r
r
2 i s (xa + yb + zc )
FTotal ( s ) = f ( S ) e
x
151
[II.2.2-.15]
Figura
II.2.2.18. A: Red ortogonal cristalina en el espacio en el espacio de los vectores
r r r
a , b y c .B C y D: Planos de dispersin que representan la condicin de von Laue para las
r r r
periodicidades especificadas por los vectores a , b y c .E: Red reciproca generada por los
r r
r
vectores a, b y c , inversos de los anteriores.
152
Introduciendo en la ecuacin anterior las condiciones de von Laue:
FTotal (h, k , l ) = f ( S ) e 2 i (hx + ky + lz )

x
[II.2.2--.16]
Con la ecuacin II.2.2.16 cualquier patrn de dispersin se puede calcular, es decir,

cada rayo difractado se puede calcular escogiendo el correspondiente juego de valores enteros
para h, k y l, y sumando para todo el cristal. Adems, la ecuacin II.2.2.16 es una serie de
Fourier, la versin discreta de la Transformada de Fourier, y es consecuencia de la naturaleza
discreta de los patrones de difraccin. De la misma manera que la transformada de Fourier es
un par de transformaciones autoimplicadas (una transformada implica la existencia de la
transformada inversa) una serie de Fourier implica la serie inversa, as la ecuacin II.2.2.16
implica la distribucin de densidad electrnica de la red cristalina:
1
( x, y , z ) =
NV h =
k = l =
Total
(h, k , l )e 2 i (hx + ky + lz )
[II.2.2-.17]
Donde V es el volumen de la celdilla unidad y N el nmero de tomos en el cristal. Para un

cristal con un tomo por celdilla, como el dibujado en la figura II.2.2.18, NV es el volumen
total del cristal. Esta ltima ecuacin nos dice que es posible calcular la densidad electrnica
del cristal a partir del patrn de difraccin, si, y solo si de alguna manera conocemos la fase
del nmero complejo en la sumatoria.
II.2.2.7. Ley de Bragg.
El tratamiento ms simple, aunque incompleto y limitado, del fenmeno de la

difraccin de RX es la interpretacin que hizo Bragg W.L. (Premio Nobel de Fsica en 1915).
Por su sencillez suele utilizarse en muchos textos para describir la difraccin de RX por lo
que merece la pena revisarlo y demostrar que el tratamiento hecho aqu conduce fcilmente a
la ley de Bragg.
Comencemos por considerar lo que se entiende como planos cristalinos. stos son un
juego de planos equidistantes y paralelos construidos de forma que todos los puntos de la red
(vrtices de la celdilla unidad) caen en alguno de los planos del juego. Estos planos pueden
especificarse mediante los ndices de Millar; as en la figura II.2.2.19 se representan algunos
casos de estos planos para diferentes pares de ndices de Millar.
La descripcin de Bragg del fenmeno de difraccin de RX considera que la radiacin
incidente se refleja en los planos cristalinos de ndices h k l y espaciado d. La condicin de
Bragg para que haya radiacin dispersada es que la diferencia de camino ptico entre los
rayos reflejados por dos planos cristalinos adyacentes sea un mltiplo entero de la longitud
de onda. De acuerdo con el esquema de la figura II.2.2.20 esta condicin puede expresarse
mediante la ecuacin:
2 d sen = n
153
[II.2.2-18]
(h = 1, k = 1)
(h = 3, k = 1)
(h = 1, k = 2 )
r
a
r
b
Figura II.2.2.19. Tres juegos de planos cristalinos en una representacin bidimensional. La
red cristalina est representada por la malla de color negro y los planos cristalinos por las
lneas paralelas de color azul.
Rayo
incidente
Rayo
dispersado
Planos
cristalinos
d sen
Figura II.2.2.20 Difraccin de RX interpretada como una reflexin de la

radiacin desde planos cristalinos adyacentes separados por un espaciado d.
La ley de Bragg es un resultado que se predice fcilmente desde el enfoque ms

riguroso que hemos adoptado para explicar el fenmeno de la difraccin de RX. Para deducir
esta ley consideremos un plano cristalino que corte a los tres ejes de la celdilla unidad en
r
r
r
r
a h, b k y c l , figura II.2.2.21. Para que haya dispersin el vector s debe cumplir la
condicin de von Laue, que podemos expresar como:
r
r
r
r a r b r c
s = s = s =1
l
k
h
Es decir que el plano considerado es perpendicular al vector s . Cualquier vector r trazado

r r
desde el origen hasta un punto cualquiera del plano cumplir la condicin s r = 1 y su
154
proyeccin sobre la direccin de
r
r
s valdr 1 s
. Un plano cristalino adyacente al plano
propuesto pasar por el origen, y el espaciado entre estos dos planos, d, ser el mdulo del
r
vector r0 trazado desde el origen perpendicularmente al plano, tal y como se representa en el
esquema de la figura II.2.2.21. Este vector es la proyeccin de cualquier vector con extremo
en el plano sobre la direccin del vector
r
r
1
s , es decir: d = r0 = r ; pero de acuerdo con la
s
1 2 sen
, o bien: 2 d sen = , que es la ley de Bragg para n=1. Si
=
d
r r
consideramos un plano definido por s r = n podemos de forma anloga obtener la
ecuacin II.2.2.18.
ecuacin II.2.2.2 ,
r
a
h
r
s
r
r0
r
s
r
r
r
b
k
r
c
l
r
a r
h r0 rr
r
b
k
c
r r
Figura II.2.2.21 Un plano cristalino definido por el producto escalar s r = 1 que corta a los
tres ejes de la celdilla unidad en a h, b k y c l . A la derecha una vista lateral a lo largo
del eje c .
II.2.2.8. El problema de la fase.
El problema central en cristalografa de RX es determinar la distribucin de la

densidad electrnica y para ello disponemos de la ecuacin II.2.2.17, que repetimos aqu:
1
( x, y , z ) =
NV h =
k = l =
Total
(h, k , l )e 2 i (hx + ky + lz )
No obstante, tropezamos con un problema prctico de mucha importancia. Como se

mencion anteriormente el factor de estructura es un nmero complejo que requiere para
quedar completamente determinado una amplitud y una fase; pero solo el cuadrado de la
amplitud puede determinarse experimentalmente y las fases, que puede demostrarse ser el
parmetro mas til, no pueden medirse. Es necesario entonces utilizar algn mtodo que nos
155
permita estimar con suficiente exactitud la fase del factor de estructura para poder calcular la
densidad electrnica. Es necesario tener presente que la estimacin de la fase no es exacta y
ocasionalmente podemos obtener estructuras incorrectas.
Antes de estudiar los mtodos de estimacin de la fase vamos a introducir una funcin
que no presenta el problema de la fase, porque se define a partir de las intensidades de
radiacin dispersada medidas experimentalmente, y que es til para pequeas molculas y
juega un papel importante en los mtodos de estimacin de la fase en grandes molculas. Esta
funcin es conocida como funcin de Patterson y es la transformada de Fourier inversa de la
intensidad:
+
rr r
r
P = I ( s )e 2 i s r ds =
r r 2 i srrr r
F
(
s
) F (s )e ds
[II.2.2-.19]
Dado el carcter discreto de los datos de intensidad la integral de la ecuacin anterior puede
reemplazarse por una suma:
P ( x, y , z ) =
F (h, k , l )
2 2 i ( hx+ ky +lz )
h= k = l =
[II.2.2-.20]
r
Como ya hemos estudiado la transformada de Fourier de F (s ) es la distribucin de
r
r
densidad electrnica (r ) ; tambin podemos demostrar que la transformada de F (s ) es la
r
densidad electrnica invertida a travs del origen de coordenadas (r ) ; por ello la funcin
de Patterson puede reescribirse como:
N
P ( x, y , z ) =
j =1 k =1
j (r j ) k (rk )
[II.2.2-.21]
donde los ndices j y k se extiende a todos los tomos de la celdilla unidad.

As la funcin de Patterson es el juego de todos los vectores diferencia de los vectores
de posicin de pares de tomos en la estructura; en un mapa de contorno aparecern picos en
las posiciones marcadas por estos vectores diferencia. La figura II.2.2.22 ilustra dos casos
sencillos para dos y tres tomos en la celdilla unidad.
El mapa de Patterson contiene informacin ms que suficiente para determinar la
estructura. Resuelve esto el problema y hace innecesario el uso de los factores de estructura?
Una molcula que contenga n tomos en la celdilla unidad, el mapa de Patterson
mostrar N2 picos correspondientes a los posibles vectores interatmicos entre cada uno de
ellos. De esos, N picos estarn en el origen donde se concentran los vectores interatmicos
nulos procedentes de la relacin de un tomo consigo mismo. Los restantes N2- N picos se
distribuyen por la celdilla unidad, que mantiene las dimensiones de la original por lo que los
picos estn ms densamente repartidos que los mximos de la densidad electrnica. Si N =
1000, como puede ser el caso de una protena, apareceran 999000 picos fuera del origen en el
mapa de Patterson y asignar cada pico al par de tomos que corresponde se hace imposible.
No obstante, la funcin de Patterson es de gran utilidad en los mtodos de estimacin de la
fase en grandes molculas.
156
r
rA
r r
rA rB
r
rB
B
r r
rA rB
r r
rB rA
B
Y
Y
A
r
rA
r
rB
r r
rA rC
r
rC
X
r r
rA rB
r r
rC rB
r r
rB rC
r r
rB rA
r r
rC rA
Figura II.2.2.22. En la parte superior: A la izquierda, celdilla unidad con dos tomos
y los vectores de posicin correspondientes, as como el vector diferencia de estos vectores. A
la derecha, mapa de Patterson correspondiente. En la parte inferior: Lo mismo que en la
parte superior pero para una celdilla unidad con tres tomos.
Para resolver el problema de la fase existen diferentes mtodos. Unos implican

perturbar el sistema introduciendo en la red cristalina algn tomo pesado (muchos
electrones) que produce intensidades de radiacin dispersa mucho ms grande que los tomos
ligeros;como los mtodos de Remplazamiento isomorfo mltiple y Dispersin anmala
de mltiple longitud de ondas. Otros, calculan la fase a partir de un modelo que se acepta
como una buena aproximacin, como el mtodo Remplazamiento molcular. El modelo se
extrae de otra molcula similar de estructura conocida, por ejemplo de una protena
relacionada con la protena de estructura a resolver, o de la misma protena en diferente forma
cristalina, etc.
Nosotros vamos a describir aqu el mtodo de Remplazamiento isomorfo mltiple,
por ser uno de los ms ampliamente utilizados, especialmente en la resolucin de las
estructuras de protenas y cidos nucleicos. Este mtodo requiere un juego de tres o mas
cristales de la muestra: el cristal padre (cristal del biopolmero puro sin perturbar) y al
menos otros dos cristales de idntico grupo espacial y estructura molecular, excepto la
157
presencia de uno o mas tomos pesados que pueden remplazar tomos presentes en el cristal
padre o aadirse a la estructura.
Para preparar derivados isomorfos se puede unir covalentemente el/los metal/es
pesado/s a la macromolculas en disolucin y entonces cristalizar la muestra. Este
procedimiento en muchos casos no es eficaz porque la presencia del metal pesado bloquea la
cristalizacin o conduce a cristales no isomorfos respecto al cristal padre. Por ello el
procedimiento al que casi siempre se recurre es partir de un cristal preformado de la
macromolcula no modificada y aadir reactivos conteniendo el tomo pesado que difunde en
el cristal. Los mtales que se usan con mayor frecuencia son mercurio, uranio, platino, plomo
y oro.
r
La distribucin de densidad electrnica, (r ) , para un derivado isomorfo es la suma
r
de la (r ) del cristal padre y de los tomos pesados, as se habr de cumplir que:
FPH (h, k , l ) = FP (h, k , l ) + FH (h, k , l )
[II.2.2-.22]
donde FP (h, k , l ) es el factor de estructura del cristal padre, FPH (h, k , l ) el factor de estructura
del cristal con el metal pesado y FH (h, k , l ) el factor de estructura del tomo pesado. Las tres
cantidades en la ecuacin anterior son nmeros complejos y sern vectores en el plano
complejo.
La funcin de Patterson para el tomo pesado ser:
PH =
Pero FH (h, k , l )
h= k = l =
2 i ( hx+ ky +lz )
H ( h, k , l ) e
2
[II.2.2-.23]
no es un dato experimental medible; no obstante FH se puede aproximar
bastante bien por FH FPH FP .
i
FPH
FH
FH FPH FP
FP
R
Figura II.2.2.23. Factores de estructura en el plano complejo del cristal padre, FP, de
un cristal con una adicin isomorfa de un tomo pesado, FPH, y del tomo pesado mismo, FH.
158
Con esta aproximacin podemos estimar FH a partir de las amplitudes medidas del
cristal padre y el cristal con la adicin isomorfa de un tomo pesado; entonces se puede
calcular una funcin de Patterson de diferencia segn la siguiente ecuacin:
PH =
h= k = l =
FPH FP e 2 i (hx+ky+lz )
2
[II.2.2-.24]
De los vectores entre tomos pesados del mapa de Patterson correspondiente

calculamos las posiciones de los tomos pesados. Con las coordenadas de cada atomo pesado
identificado se puede calcular el factor de estructura FH (h, k , l ) usando la ecuacin II.2.2.16.
Pero del cristal padre y del cristal isomorfo con el tomo pesado solo se conoce
experimentalmente el mdulo del factor de estructura FP y FPH , respectivamente. Los
posibles valores para el factor de estructura FP estn representados por la circunferencia de
radio FP centrada en el origen, diagrama de Harker figura II.2.2.24 izquierda; los posibles
valores para el factor de estructura FPH
estn representados en esta figura por la
circunferencia de radio FPH , pero centrada en el extremo del vector FH para cumplir la
ecuacin II.2.2.22. A cada uno de los dos puntos de interseccin de ambas circunferencias, A
y B en la figura II.2.2.24 izquierda, le corresponde un factor de estructura que satisface la
ecuacin II.2.2.22. Hemos restringido as los posibles valores de la fase a los dos valores A
y B , siendo todava necesario resolver esta ambigedad. Para resolver esta ambigedad la
solucin adoptada con ms frecuencia es usar un segundo derivado isomorfo de un metal
pesado H. Para el segundo derivado se debe cumplir que:
FPH (h, k , l ) = FP (h, k , l ) + FH (h, k , l ) .
La verdadera fase del cristal padre la define el punto comn a los tres cristales, B en la
figura II.2.2.22 derecha.
II.2.2.9. Mtodos para obtener difractogrmas de RX
Las tcnicas usadas para medir los ngulos y la intensidad de los haces de difraccin
han evolucionado a lo largo del tiempo. En el primer experimento de difraccin, Friedrich y
Knipping (1912) usaron una pelcula sensible a los rayos X, pero incluso en el mismo ao,
Bragg us una cmara de ionizacin montada sobre un brazo rotatorio que, en general,
determinaba con ms precisin los ngulos y las intensidades de difraccin. Sin embargo, la
pelcula presenta la ventaja de poder impresionar muchos haces difractados a la vez. Durante
los primeros aos de la Cristalografa estructural (desde 1920 hasta 1970) se hizo uso
extensivo de los mtodos fotogrficos, y entre ellos se deben destacar los mtodos de Laue,
Weissenberg, precesin, y oscilacin.
159
i
A
A
FP
FPH
FH
FP
FPH
A
B
FP
FH
FH
FPH
FPH
Figura II.2.2.24. Construccin de Harker para la determinacin de la fase por el

mtodo de remplazamiento isomorfo,. FP: factor de estructura del cristal padre. FH y FH:
factores de estructura de los tomos pesados H y H (calculadas a partir de las posiciones
determinadas con una sntesis de Patterson de diferencias). FPH y FPH: factores de
estructura del cristal con los metales pesados H y H . Las circunferencias representan el
lugar geomtrico de todas las posiciones posibles del extremo de los vectores FP, FPH y FPH.
Izquierda: Con el cristal padre y un solo cristal con metal pesado H se determinan dos
posibles valores para la fase del cristal padre, ngulos A y B, en los puntos de interseccin
de las dos circunferencias correspondientes a FP y FPH. Derecha: Con el cristal padre y dos
derivados H y H se determinan sin ambigedad el valorde la fase del cristal padre.
Mtodo de Laue
En sus primeros experimentos, Max von Laue (Premio Nobel de Fsica en 1914) us
radiacin contnua (con todas las longitudes de onda posibles) incidiendo sobre un cristal
estacionario. De este modo, el cristal generaba un conjunto de haces que representan la
simetra interna del cristal. En estas condiciones, y teniendo en cuenta la ley de Bragg,
ecuacin II.2.2.18, las constantes del experimento son los espaciados d y la posicin del
cristal respecto al haz incidente, y las variables son la longitud de onda y el entero n. As
que cada haz difractado corresponder al primer orden de difraccin (n=1) de una cierta
longitud de onda, al segundo orden (n=2) de la longitud de onda mitad /2, al tercer orden
n=3 de la longitud de onda /3, etc. Por lo tanto, el diagrama de Laue es simplemente una
proyeccin estereogrfica de los planos del cristal.
Hay dos geometras diferentes, dependiendo de la posicin del cristal respecto de la placa
fotogrfica, transmisin o reflexin, figura II.2.2.25.
Figura II.2.2.25 Izquierda: Mtodo de Laue en modo transmisin. Derecha: Mtodo de Laue
en modo reflexin.
160
Mtodo de Weissenberg
El mtodo de Weissenberg est basado en la cmara del mismo nombre, desarrollada

por K. Weissenberg (1924). Consta de un cilindro metlico que contiene en su interior una
pelcula fotogrfica sensible a los rayos X. El cristal se monta sobre un eje coaxial con dicho
cilindro y se hace girar de tal modo que los puntos recprocos que intersectan la superficie de
la esfera de Ewald son los responsables de los haces de difraccin, figura II.2.2.26.
Figura II.2.2.26. Izquierda: Esquema de una cmara tipo Weissenberg, usada en los
laboratorios de Cristalografa hasta aproximadamente 1970. Cmara desarrollada por K.
Weissenberg en 1924.
Estos haces generan un ennegrecimiento (mancha) sobre la pelcula fotogrfica que
cuando se extrae del cilindro metlico tiene la apariencia que se muestra en la figura II.2.2.27.
Figura II.2.2.27. Esquema que explica la produccin de un diagrama de Weissenberg del

tipo rotacin-oscilacin.
161
El tipo de diagramas Weissenberg que se obtienen del modo descrito se denominan de

rotacin o de oscilacin, dependiendo de que el giro del cristal sea de 360 o parcial (aprox.
20), respectivamente. El montaje del cristal debe ser tal que su eje de giro coincida con un eje
directo de la celdilla elemental. De ese modo, por definicin de la red recproca, existirn
planos recprocos perpendiculares a dicho eje.
Es indudable que mediante este tipo de diagramas se consigue informacin sobre los
perodos de repeticin de la red directa, ya que la separacin entre las lneas que contienen las
manchas de difraccin es proporcional a la distancia entre planos recprocos. Sin embargo,
cada plano recproco (dos dimensiones) queda sobre una lnea (una dimensin) de manchas de
la pelcula, dando lugar a solapamiento entre manchas.
Este problema qued resuelto cuando a las cmaras se les aadi la libertad de
traslacin del cilindro, en la direccin paralela a su eje, acoplada al giro del cristal y
seleccionando mediante dos cilindros internos el cono de difraccin que origina uno solo de
los planos recprocos. De este modo, un plano recproco (dos dimensiones) quedara
impresionado en toda la superficie de la placa fotogrfica (dos dimensiones), evitando con
ello el posible solapamiento entre manchas.
El aspecto de un diagrama de este tipo, con la deformacin geomtrica que se
produce del plano recproco, se muestra en la figura II.2.2.28. En estas condiciones, y
teniendo en cuenta dicha deformacin, es posible medir aisladamente cada haz de difraccin,
y seleccionando adecuadamente la rendija se pueden recoger todos los planos recprocos del
cristal.
Figura II.2.2.28. Izquierda: Detalle de la cmara de Weissenberg para separar un cono de

haces difractados mediante dos cilindros internos que dejan una rendija. El cilindro exterior
se traslada al mismo tiempo que el cristal gira, distribuyndose las manchas de difraccin,
que antes estaban en una lnea, sobre toda la placa fotogrfica. Derecha: Diagrama de
Weissenberg del plano recproco hk2 del metaborato de cobre.
162
Mtodo de precesin
El mtodo de precesin fue desarrollado por Martin J. Buerger, a principios de la

dcada de 1940, como alternativa muy ingeniosa para poder impresionar placas fotogrficas
de planos recprocos sin distorsionar. Al igual que el mtodo de Weissenberg, se trata de un
mtodo en el que cristal se mueve, pero el movimiento del cristal (y como consecuencia el de
los planos recprocos solidarios) es como el de precesin de los planetas, de ah su nombre. La
pelcula fotogrfica se coloca sobre un soporte plano y se mueve solidariamente con el cristal,
figura II.2.2.29. La cmara diseada para tal efecto se muestra en la parte inferior de esta
figura. El cristal debe orientarse de tal modo que el plano recproco que se desee recoger sea
perpendicular al haz directo de los rayos X, es decir, que un eje directo coincida con la
direccin de los rayos X incidentes.
Figura II.2.2.29. En la parte superior: Dos visiones esquemticas del principio en el que se
basa la cmara de precesin. El ngulo m es el ngulo de precesin del plano recproco
seleccionado del cristal y de la pelcula fotogrfica, que se mantiene paralela al plano
recproco y solidaria en movimientos al cristal. En la parte inferior: Esquema y aspecto de
una cmara de precesin.
Los difractogramas que se obtienen con este mtodo son mucho ms simples de
interpretar que los de Weissenberg, ya que muestran el aspecto de un plano recproco sin
distorsin. La separacin de un plano recproco determinado se consigue mediante el uso de
pantallas (figura de arriba) que seleccionan los haces difractados de dicho plano. Del mismo
modo a como ocurre en el caso de Weissenberg, se pueden medir las distancias recprocas y
las intensidades de difraccin. Sin embargo, aqu es mucho ms facil observar los elementos
163
de simetra del espacio recproco. La desventaja del mtodo de precesin es consecuencia de

que la pelcula es plana en lugar de cilndrica, y el ngulo slido explorado es menor.
Este mtodo se ha usado con xito durante muchos aos, incluyendo la resolucin de
las estructuras de de las protenas. As en la figura II.2.2.30 se muestra un difractograma de
precesin de un cristal tetragonal de Lisozima que visualiza un plano completo de la red
recproca sin distorsin.
Figura II.2.2.30. Diagrama de precesin de un cristal tetragonal de Lisozima en el

que fcilmente se distingue un eje de simetra cuaternario perpendicular al diagrama y varios
planos de simetra especular. Debido a que los ejes de la celdilla elemental son grandes, la
separacin entre los puntos recprocos es pequea.
Mtodo de oscilacin
Originalmente, los mtodos de monocristal, con giro amplio de la muestra, como los
mencionados anteriormente, se impusieron por su facilidad de interpretacin. Sin embargo,
cuando se lleg a experimentar con redes directas grandes, es decir, recprocas pequeas, los
tiempos de recogida se disparaban y por lo tanto se recurri al mtodo de oscilacin con
ngulos pequeos, que permita recoger varios niveles recprocos a la vez sobre cada posicin
del cristal. Repitiendo estos diagramas, a distintas posiciones de partida del cristal, se
conseguan obtener suficientes datos en un tiempo razonable. La geometra de recogida est
descrita en la figura II.2.2.31.
164
Hoy en da, con generadores de nodo rotatorio o sincrotrones, y detectores de rea,

que aumentan la intensidad de los mximos de difraccin y reducen los tiempos de recogida
con gran fiabilidad, se ha impuesto este mtodo para los estudios de macromolculas, en
particular de protenas.
Figura II.2.2.31. En la parte superior: Esquema de la geometra de las condiciones de

mximo de difraccin en el mtodo de oscilacin. El cristal, y por tanto la red recproca,
estn oscilando un pequeo ngulo alrededor de un eje perpendicular al plano de la figura y
que pasa por el centro. En la figura de la derecha, el rea que pasa por condicin de mximo
de difraccin est denotada por el rea amarillenta, delimitada por la esfera de Ewald (de
radio 2 sen 90 ) en los dos extremos de oscilacin de la red, y la esfera de resolucin
mxima (de radio 2sen max ) que se puede alcanzar con la radiacin empleada y con el
detector que se haya usado.En la parte inferior: Cuando la red recproca oscila un pequeo
ngulo, alrededor del eje de giro, pequeas zonas de los diferentes niveles de la red
recproca entran en contacto con la esfera de Ewald, alcanzando las condiciones de mximo
de difraccin. De este modo, sobre la pantalla del detector, la geometra de oscilacin
produce mximos de difraccin procedentes de diferentes niveles de la red recproca y
formando lnulas sobre el diagrama (figura de la derecha).
165
Actualmente estos mtodos estn siendo sustituidos por difractmetros goniomtricos

altamente automatizados. La introduccin de los computadores digitales a finales de la dcada
de 1970, permiti el diseo de los llamados difractmetros automticos de cuatro crculos.
Estos equipos, disponen de un sistema goniomtrico, con una mecnica muy precisa, que
mediante tres giros permite colocar el cristal en cualquier orientacin del espacio, provocando
as que se cumplan los requerimientos de la construccin de Ewald para que se produzca la
difraccin. En estas condiciones, un cuarto eje de giro, que sustenta el detector electrnico se
coloca en condiciones de recoger el haz difractado. Todos estos movimientos se pueden
programar para que se realicen de un modo automtico, con una mnima intervencin del
operador.
La descripcin de estos equipos queda fuera del alcance y propsito del curso; no
obstante, puede encontrar informacin al respecto en la pgina Web del Departamento de
Cristalografa del CSIC: www.xtal.iqfr.csic.es.
II.2.2.10 Etapas para determinar la estructura de una macromolcula.
El estudio cristalogrfico de protenas o cidos nucleicos presenta notables diferencias

con el procedimiento usual para pequeas molculas. Las etapas de una determinacin de la
estructura de una macromolcula son:
1. Preparacin de cristales adecuados de la macromolcula pura.
Obtener un cristal con una elevada perfeccin es el requisito imprescindible para

determinar la estructura de un biopolmero, es pues uno de los pasos ms importante.
La cristalizacin se logra llevando la disolucin de protena al punto de saturacin.
Para muchas protenas la saturacin ocurre entre 10 y 100 mg/ml, consecuentemente es
deseable bajar la concentracin de saturacin aadiendo un agente precipitante tal como
NaCl, (NH4)2SO4, polietilen-glicol, o el disolvente metilpentandiol (MPD), que generalmente
actan reduciendo la solubilidad. Estos precipitantes deben introducirse gradualmente,
manteniendo la protena en el umbral de la saturacin. Los cristales para los experimentos de
difraccin han de ser de un tamao de 0.1 a 1.0 mm; esto se logra por un crecimiento lento
durante un periodo de 1 a 6 semanas.
Las tcnicas mas frecuentemente usadas para la introduccin gradual del agente
precipitante son las de dilisis y difusin de vapor.
En las tcnicas de la dilisis, la protena concentrada es colocada en la cmara superior
de una unidad del microdilisis, posiblemente como una gota sobre la superficie de la
membrana, figura II.2.2.32 izquierda. El agente de precipitacin est presente en la cmara
inferior a una concentracin calculada para que la disolucin de protena quede finalmente de
5 a un 30% de sobresaturacin. El agente precipitando difunde despacio en la disolucin de la
protena a travs de la membrana de dilisis.
En la difusin del vapor o la tcnica de la gota colgante, aproximadamente 10 L de la
disolucin de protena se deposita sobre un cubreobjetos de vidrio con la cantidad de agente
precipitante necesaria para llevar la disolucin hasta un 75% de la concentracin de
saturacin. El cubre objeto se sella con vaselina sobre un vasito("pozillo") con la gota hacia
dentro quedando adherida o "colgada". El vasito contiene el agente precipitante al
concentracin conveniente para saturar la disolucin de protena. Con el tiempo el vapor de
agua difunde despacio desde la gota colgante a la solucin ms concentrada debajo, hasta que
ambas soluciones estn a la misma concentracin de agente precipitante, figura II.2.2.32
derecha.
166
Disolucin de protena.
Disolucin de protena.
Membrana de dilisis.
Disolucin con el agente

precipitante.
Disolucin con el agente

precipitante.
Figura II.2.2.32. Mtodos de cristalizacin de biopolmeros. Izquierda: Configuracin de una

unidad de microdilisis para la lenta difusin del agente precipitante en la cristalizacin de
una protena. Derecha: Configuracin para la cristalizacin por difusin del vapor o mtodo
de la gota colgante.
Un ensayo completo de cristalizacin explorar diversas variables, tales como la

concentracin de protena, la concentracin de agente precipitante, PH, concentracin de
ligandos, etc. Con cuatro o cinco variables se deben hacer cientos de ensayos, para lo cual las
cajas de vasitos mltiples, como la mostrada en la figura II.2.2.33, son muy tiles. Una vez
que se han acotado las condiciones ptimas de cristalizacin, se puede intentar obtener
cristales de mayor tamao, para lo que los microcristales obtenidos en los ensayos previos
puede usarse como semillas para inducir la cristalizacin.
Figura II.2.2.33. Caja de mltiples vasitos (24) para realizar los ensayos de cristalizacin
(screening). Por ejemplo, en las columnas de cuatro vasitos podran ponerse cuatro
concentraciones diferentes de protena, y en las filas seis pHs diferentes.
Al cristal obtenido de la disolucin de protena pura le llamaremos cristal padre, para

distinguirlo de aquellos otros que contengan metales pesados.
167
2. Caracterizacin del cristal y obtencin de los difractogramas.
Una vez que se tiene el cristal padre se determina el sistema cristalino al que pertenece
(triclinio, ortorombico, cbico, etc.) y se obtienen un juego de datos de intensidad de
radiacin dispersada, es decir se obtienen los difractogramas necesarios usando alguno de los
mtodos explicados anteriormente.
3. Preparacin de varios derivados isomorfos del cristal padre con metales pesados.
Se preparan varios derivados isomorfos con tomos pesados, es decir, cristales con la
misma celdilla unidad, el mismo sistema cristalino y la misma estructura que el cristal padre
pero donde uno o ms tomos pesados se han introducido en sitios especficos de la red. Este
paso es ineludible para determinar las fases del cristal padre por alguno de los dos mtodos
que requieren la obtencin de estos cristales derivados, a saber, el mtodo de remplazamiento
isomorfo mltiple (explicado anteriormente) y el mtodo de dispersin anmala de mltiple
longitud de ondas.
Con los cristales derivados isomorfos se obtiene un nuevo conjunto de difractogramas.
4. Se determinan la posicin de los tomos pesados en los cristales isomorfos derivados.
Para ello se usa una sntesis de Patterson de diferencias, tal como se ha explicado
anteriormente, usando la funcin:
PH =
h= k = l =
PH
FP e 2 i (hx+ky+lz )
2
Con la primera estimacin de las coordenadas atomicas de los metales pesados se

intenta refinar la posicin de stos usando la sntesis de de Fourier:
r 2 i (hx j + ky j +lz j )
FH (h, k , l ) = f j ( s ) e
j
5. Estimacin de la fase del factor de estructura del cristal padre.
Mediante los diagramas de Harker se compara el factor de estructura del cristal padre
con los factores de estructura de los derivados isomorfos de tomos pesados. Se estima la fase
de los cristales, tal como se ha explicado anteriormente. Cuanto ms derivados isomorfos se
usen ms precisa ser la fase obtenida.
Con la fases estimadas para el cristal padre es posible refinar ms la posicin de los
tomos pesados utilizando un mtodo de mnimos cuadrados o con tcnicas de Fourier. De
forma iterativa se estima mejor las fases para el cristal.
168
6. Obtencin del mapa de densidad electrnica y construccin de un modelo.

Refinamiento de la estructura y Resolucin.
Con la fase refinada y las amplitudes para cada factor de estructura se calcula un mapa
de densidad electrnica.
Una vez que se dispone de este mapa se intenta construir un modelo, entendiendo por
tal el juego de coordenadas atmicas que ajuste mejor el mapa de densidad electrnica.
Usualmente en la primera determinacin del modelo se utiliza una resolucin no muy
alta, de 55 a 7 . Se repite entonces los pasos anteriores (del 4 al 6) a ms alta resolucin,
de 2 a 3 , mientras sea posible construir un modelo molecular optimizado. La figura
II.2.2.34 ilustra este procedimiento.
Figura II.2.2.34. Izquierda: Mapa de densidad electrnica de partida a baja resolucin, de

55 a 7 . Centro: Modelo molecular que ajusta mejor el mapa de densidad electrnica.
Derecha: Despus del refinamiento de las fases y los factores de estructura se obtiene
finalmente un mapa de densidad a mas alta resolucin y el correspondiente modelo.
En el proceso de refinamiento las intensidades calculadas se comparan con las

intensidades experimentales y para comprobar la calidad del modelo se usa el llamado factor
cristalogrfico R. Este factor se define como el cociente entre la diferencia total entre
intensidades medidas y calculadas y la intensidad total observada:
R=
r
r
Fobs Fcalc
r
F
obs
Idealmente R debera tender a cero. Un valor R = 04 es un buen punto de partida para

resolver la estructura de una protena, y un valor final de R =01 es un valor final de
optimizacin suficientemente bueno para una macromolcula. Valores de 001 son frecuentes
para pequeas molculas.
Los factores de estructura calculados del modelo inicial incluye fases que pueden ser
de mayor calidad que los determinados experimentalmente. En este caso es posible generar
un nuevo mapa de densidad electrnica usando las intensidades experimentales y las fases
calculadas. El proceso se reitera cclicamente hasta que el valor del factor cristalogrfico R
no disminuya ms; ver diagrama de flujo en la figura II.2.2.35.
169
Patrn de
difraccin
Derivado isomorfo
de metal pesado
Intensidades de RX
dispersados
Fases del factor de

estructura
Si
Disminuye R?
Mapa de densidad
electrnica
Modelo estructural
xi, yi, zi
No
Fin del proceso de

refinamiento
Clculo de fases a
partir del modelo
Figura II.2.2.35. Diagrama de flujo del procedimiento de refinamiento de la estructura

de una macromolcula.
Otra forma de medir la calidad del modelo es la resolucin. sta nos da el tamao de la
molcula mas pequea que podemos ver o resolver.
La resolucin depende de varios factores:
Radiacin de Rayos X utilizada. Con anodo de Cu el espaciado mnimo que se
puede medir es de 0,7709 .
Caractersticas del cristal, perfeccin, pureza, estabilidad, etc.
Cantidad de datos finales de los mdulos de los factores de estructura y sus fases.
Temperatura.
Figura II.2.2.36. Mapas de densidad

electrnica de la misma regin de una protena a
las resoluciones de 3, 2 y 1.2 . La regin mostrada
corresponde a una fenilalanina y es evidente que
del mapa a la ms alta resolucin se podr ajustar
un modelo molecular con mas exactitud en las
coordenadas atmicas.
170
Como ya hemos indicado la temperatura es una variable de la que depende fuertemente

la definicin de la estructura y su resolucin; especialmente las regiones con mayor
movilidad. La influencia es tan marcada que podemos decir que el modo ms eficaz de
aumentar la resolucin es crioenfriar los cristales cerca de la temperatura del nitrgeno
lquido. La parte izquierda y derecha de la figura II.2.2.37 corresponden a la misma regin de
una molcula y obtenidas las densidades electrnicas a la misma resolucin; la diferencia
consiste en las temperaturas de trabajo, 20 C el mapa de la derecha, -148 C el mapa de la
izquierda. La notable diferencia en la estructura, pobremente definida a la temperatura
ambiente y muy bien definida a la temperatura de una corriente de nitrogeno enfriado, es
debido a la disminucin de las fluctuaciones trmicas, es decir a la disminucin de la
movilidad de esa regin de la estructura. Este es un claro ejemplo de las mejoras que pueden
alcanzarse usando crio-tcnicas.
Figura II.2.2.37. Izquierda: Mapa de densidad electrnica, obtenida a 125 K (-149

C) de una regin de una protena, que corresponde a una glicina y una alanita. Derecha:
Mapa de densidad, obtenida a 293 K, de exactamente la misma regin anterior, con la misma
resolucin.
Refinamientos adicionales incluye:
- La revisin de las longitudes y los ngulos de enlaces, que deben caer en un
intervalo aceptable.
- La revisin de las distancias interatmicas de pares de tomos no enlazados
covalentemente, que no deben ser menores que ciertos valores umbrales.
- La compatiilidad de la estructura con los impedimentos estericos, es decir, la
conformidad con los mapas de Ramachandran.
- Depuracin final por medio de clculos de Dinmica molecular usando campos de
fuerzas adecuados.
171

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II.2.2. Difraccin de rayos X (RX).

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II.2.2. Difraccin de rayos X (RX). Cristalografa

Si una imagen vale ms que 1000 palabras la estructura

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II.2.2.2. Dispersin de RX por un electrn.

Departamento de Qumica-Fsica, Universidad de Granada. OLM

Figura II.2.2.1. A: Dispersin elstica de rayos por un electrn en el origen de

Departamento de Qumica-Fsica, Universidad de Granada. OLM

Figura II.2.2.2. Izquierda: Definicin del vector dispersin, s . Derecha: Para la

dispersada por el electrn en el punto determinado por el vector de posicin

Introducimos ahora la idea de factor de estructura, F (s ) , como la razn entre la

Los electrones no son cargas puntuales localizadas en un determinado punto del

Departamento de Qumica-Fsica, Universidad de Granada. OLM

cualquier punto del espacio en el que consideremos un elemento de volumen dV = dx dy dz

(r )dV por lo que el factor de estructura podr

Esta es la ecuacin bsica que gobierna la dispersin y la consecuente difraccin de

La utilidad de esta ecuacin radica, como se indica en la figura II.2.2.3, en que

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Figura II.2.2.3. Ilustracin del mtodo de determinacin de la estructura

Figura II.2.2.4. Representacin vectorial del factor de estructura.

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II.2.2.3. Dispersin de RX por un tomo.

El siguiente paso en la descripcin del fenmeno de difraccin de RX es considerar la

Figura II.2.2.5. Distribucin esfrica de la densidad electrnica. Por razn de

Utilizando las coordenadas polares indicadas en la figura II.2.2.6 se deduce, a partir de la

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Figura II.2.2.6. Coordenadas polares

Para tomos reales la densidad electrnica puede considerarse aproximadamente como

Esta ecuacin nos muestra que el mximo de la intensidad de la radiacin dispersada,

Figura II.2.2.7. Factor de dispersin atmica para un tomo de He y una longitud de

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Consideremos ahora al tomo fuera de origen de coordenadas, como se representa en

donde es el vector de posicin del tomo y el producto escalar s rn en el exponente

Figura II.2.2.8. tomo, representado por una distribucin esfrica de la densidad

Un hipottico cristal monodimensional consiste en una fila de 2N +1 tomos idnticos.

Figura II.2.2.9. Cristal mono dimensional de espaciado a.

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As la posicin del ensimo tomo en el cristal ser na y el factor de estructura de este

De esta forma la dispersin de cualquier tomo en el cristal monodimensional puede

De forma anloga podemos tratar cualquier cristal monodimensional de molculas

La intensidad de dispersin total, [FTotal (s )] , es entonces el producto de la intensidad

la dispersin producida por un simple tomo en el origen,

Veamos algunos ejemplos sencillos para consolidar estas ideas.

La intensidad de dispersin ser el cuadrado de este factor de estructura (y recordando que

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Si fijamos la orientacin del cristal, es decir fijamos el vector a , la condicin de von

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Figura II.2.2.11. Dispersin de RX por un hipottico cristal monodimensional de cinco y

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Figura II.2.2.12. Conjunto de planos paralelos representando las condiciones de von

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-8/a -7/a -6/a -5/a -4/a -3/a -2/a -1/a 0

Figura II.2.2.13. Interseccin de los planos paralelos, que representan la condicin de

Figura II.2.2.14. Izquierda: Un tomo en el origen de coordenadas; los RX inciden a

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Consideremos ahora el experimento representado en el esquema de la figura II.2.2.15.

II.2.2.5. Dispersin de RX por un cristal bidimensional.

Obviamente el cristal monodimensional es un modelo terico que no tiene utilidad

ste es un ordenamiento cuya periodicidad se define por dos vectores a y b , y se

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Figura II.2.2.15. A: Hipottico experimento de difraccin de RX por un cristal

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