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Centrifuga
Eppendorfs (2ml)
Microscopio
Cmara de Newbauer.
Micropipeta
Espectrofotmetro
Balanza
Horno a 100C
Cajas petri estriles.
Tubos de ensayo estriles.
Erlenmeyers 250ml estriles.
Reactivos:
PROCEDIMIENTO:
Con 12h de anticipacin hacer dos preinculos de Bacillus thuringiensis en caldo nutritivo y de
Rhodotorula sp. en Medio Sabouraud.
A
1mL cultivo
9
Dilucin 1/10
B
1mL A
9
1/100
C
1mL B
9
1/1.000
D
1mL C
9
1/10.000
E
1 mL D
9
1/100.000
F
1 mL E
9
1/1.000.000
Peso seco:
Seque en un horno a 60C cuatro eppendorfs marcados (dos para Bacillus thuringiensis y
dos para Rhodotorula sp.) vacos de 2ml por 24h aproximadamente, pselos y gurdelos en
un disecador con anhdrido de calcio (CaSO4).
Agite el erlenmeyer que contiene el preinculo para resuspender el cultivo uniformemente.
Tome 1.5 mL de muestra y virtala en el eppendorf previamente pesado.
Centrifuge las muestras a 14000rpm por 20 minutos. Descarte el sobrenadante
cuidadosamente y coloque los erlenmeyers en el horno a 60C. Pselos peridicamente
hasta lograr peso constante (puede tomar de 2 a 24 horas aproximadamente, dependiendo
del horno y el espesor de la pasta). En algunas ocasiones suele realizarse uno o dos
lavados del pellet con agua destilada para retirar productos (e.g. polmeros etc) formados
por el microorganismo. En este caso obviar este paso por cuestiones de tiempo.
Calcule la diferencia en peso y exprese el peso seco en g/L.
B
2 mL P
8 mL H2O
0.2 g/L
C
3 mL P
7 mL H2O
0.3 g/L
D
5 mL P
5 mL H2O
0.5g /L
E
10 mL P
0 mL H2O
1g/L
F
Blanco
10 mL H2O
Cmara de Neubauer
1. Marco Terico
El crecimiento microbiano, es un incremento en el nmero de clulas o aumento de la biomasa
de un microorganismo. En mltiples situaciones prcticas es necesario el control de la
poblacin celular, dado que el conocimiento de cmo se expande es til para el diseo de
mtodos que permitan su control (UDEA, 2004). Este crecimiento, se ve afectado por mltiples
factores fsicos y qumicos tales como: temperatura, pH, aireacin, fuentes nutricionales y sus
concentraciones, los cuales deben ser adecuados para facilitar el desarrollo del microorganismo
en el medio de cultivo (Pedroza et al, 2007).
La determinacin del crecimiento de una poblacin microbiana puede realizarse a travs de
diversos mtodos, siendo posible cuantificar el nmero de clulas o el aumento de la masa
celular. Tal medicin puede llevarse de manera directa o indirecta. En la medicin directa se
cuenta el nmero total de clulas en un volumen conocido y as se estima el nmero total en la
poblacin. Hacen parte de los mtodos directos el recuento de viables en placa, peso seco,
turbidimetra y conteo en cmara. Los mtodos indirectos son aquellos que utilizan parmetros
distintos del nmero de clulas, pero que pueden relacionarse de forma directa con ste; hacen
parte de estos la determinacin de protenas, polisacridos, DNA, entre otros (Barton, 2005)
El recuento en placa, es quiz el mtodo mas utilizado para determinar el nmero de clulas
viables. Esta tcnica se basa en el principio de que una poblacin de clulas puede extenderse
a travs de un medio slido de tal manera que cada una de ellas puede dar origen a una
colonia. Clulas que formen cadenas, aglomeraciones o hifas, no pueden ser contadas por este
mtodo. El conteo directo en cmara es un mtodo que indica el total de clulas, pero no
cuantifica el nmero de clulas viables a menos que se realice una coloracin. El uso de esta
tcnica requiere de habilidad para distinguir y contar clulas individuales, siendo inaplicable
para microorganismos que formen micelio (Dutta, 2008).
La masa celular puede medirse tambin pticamente mediante la determinacin de la cantidad
de luz dispersada por una suspensin de clulas. La tcnica llamada turbidimetra, se basa en
Especficos
Determinar las ventajas y desventajas del uso de cada mtodo para la medicin de
biomasa de los microorganismos.
3. Resultados
3.1. Recuento de viables en placa: Se prepararon diluciones de 10-1 a 10-6 de un cultivo de 12h
para ambos microorganismos. Posteriormente se sembraron en superficie las diluciones de 10 -4
a 10-6 con rplica. Despus de 24h se realiz la lectura, los resultados se especifican en las
tablas 3.1 y 3.2.
Dilucin
No.
colonias
UFC/ml
10-5 (R1)
186
19x107
10-5 (R2)
209
21x107
10-5 (R3)
157
16x107
10-6 (R1)
27
27x107
10-6 (R2)
37
37x107
Promedio
(UFC/mL)
Error
Estndar
18x107
1.5x107
32x107
5x107
Dilucin
No.
colonias
UFC/ml
Error
Estndar
No Determinado
Tabla 3.2. Recuento en placa de Bacillus thuringiensis
Muestra
No.
Peso
vaco (g)
Peso con
pellet (g)
Peso
pellet (g)
Peso seco
(g/L)
1.1489
1.1569
0.008
5.33 (1)
1.1593
1.1671
0.0078
5.20
Promedio
(g/L)
EE
5.27
0.067
Promedio
(g/L)
EE
1.17
0.1
Muestra
No.
Peso
vaco (g)
Peso con
pellet (g)
Peso
pellet (g)
Peso seco
(g/L)
1.1551
1.157
0.0019
1.27
1.1408
1.1424
0.0016
1.07
(1)
Peso _ sec o g / L
0.008
1000
1 .5
g
L
3.3. Turbidimetra: Se adicionaron 1.5mL de muestra de cada cultivo a 4 eppendorfs para ser
centrifugados. Posteriormente, el pellet fue resuspendido en agua destilada para leer
absorbancia a 640nm. En los casos donde se present absorbancia mayor a 1 se realiz
dilucin hasta obtener valores inferiores a ste. Los resultados se especifican en las tablas 3.5 y
3.6.
Muestra
No.
1
Absorbancia
Promedio
EE
2.247
0.005
2.241
2.252
Dilucin
Absorbancia
1.881
1.883
Muestra
No.
1
Absorbancia
1.52
1.52
Promedio
EE
1.52
Dilucin
Absorbancia
0.759
0.709
3.4. Cmara de Neubauer: Se tomaron 12L de la dilucin 10-2 de ambos microorganismos para
el llenado de cada una de las reas de la cmara. Una vez verificada la ausencia de espacios o
burbujas, se realiz el enfoque de los cuadrantes iniciando en 4X hasta 40X, donde finalmente
se llev a cabo el conteo de las clulas en los 5 cuadrantes internos. Los resultados del conteo
se especifican en las tablas 3.7 y 3.8.
Dilucin
No. clulas
Clulas/ L
10-2
81
405x103 (2)
No. clulas
Clulas/ L
10-2
Promedio
(cl/ L)
EE
335x103
70x103
53
265 x103
Tabla 3.7. Recuento en cmara de Rhodotorula sp
Dilucin
Promedio
(cl/ L)
EE
No Determinado
Tabla 3.8. Recuento en cmara de Bacillus thuringiensis
(2)
Clulas
Clulas
L
Pr ofundidad _(mm) Superficie _ contada _(mm 2 ) Dilucin
Clulas
81
clulas
405 103
1
L
L
0.1mm 5 x0.04mm 2
100
-6
Rhodotorula sp.
4. Anlisis de resultados
Rhodotorula sp. son levaduras que se caracterizan por su morfologa esferoidal y su
incapacidad para formar hifas (Garca et al, 2004). Esta caracterstica le confiere a estos
microorganismos la posibilidad de aplicar tcnicas de medicin de biomasa como recuento en
placa y conteo de clulas en cmara de Neubauer. Tal como lo especifica Dutta (2008), estos
mtodos son tiles siempre y cuando no se presenten aglomeraciones o formacin de micelio
durante el crecimiento. La tabla 3.1 especifica las unidades formadoras de colonia para
Rhodotorula sp. Tal como lo supone la tcnica, es de esperarse que entre diluciones
consecutivas se visualice una disminucin de 10veces en el conteo de las colonias, situacin
que fue posible apreciar de una manera aproximada en el momento de registrar los resultados
de dicho conteo. Para la dilucin 10-5 se obtuvo en promedio un nmero de 184 colonias,
mientras que para la dilucin 10-6 el promedio fue de 32 colonias. Esto da como diferencia
6veces el nmero de colonias, valor relativamente cercano a lo esperado por la tcnica, el cual
pudo verse afectado por el manejo de diluciones, descalibracin de micropipetas o por el error
propio del investigador. La grfica 1, correspondiente a la tcnica de recuento en placa para
Rhodotorula sp., permite visualizar de manera clara el efecto que tiene, en la variabilidad de los
datos, la toma de diversas rplicas para el anlisis de biomasa. En la dilucin 10 -5 fueron
realizadas 3 rplicas, mientras que para la dilucin 10 -6 se realizaron 2 rplicas. Debido a que el
error estndar es inverso al tamao de la muestra, la variabilidad de los datos ser menor para
muestras grandes, lo cual pudo apreciarse en la toma de resultados donde los datos de la
dilucin 10-6 presentaron una variabilidad 3.3veces superior a los datos de la dilucin 10 -5, por
diferencia de una rplica.
Las bacterias del gnero Bacillus, que durante se duplicacin tienen una tendencia baja a
permanecer unidos, pueden presentar un tipo de agrupacin denominada estreptobacilos, esto
es, cadenas de bacilos (Martnez, 2006). Posiblemente esta caracterstica y el tiempo de
incubacin que permanecieron las cajas con Bacillus thuringiensis, dificultaron el recuento de
colonias para la determinacin de biomasa por este mtodo. De acuerdo con un estudio
realizado por Chang et al (2007), el conteo de colonias para dicha cepa puede realizarse en un
tiempo prudencial de 12horas, en donde las colonias se encuentran completamente
desarrolladas. Para la prctica se llev a cabo el recuento despus de 24horas de incubacin,
encontrando el microorganismo extendido en gran parte de la superficie de la caja. Adems de
ello, cabe resaltar que la homogenizacin y el manejo correcto de las diluciones resultan ser
factores determinantes para la obtencin de colonias en la aplicacin del mtodo, pudiendo ser
alguna de ellas la falencia que impidi el correcto desarrollo de las colonias de dicho
microorganismo. La diferencia en el tiempo de duplicacin y desarrollo entre bacterias y
levaduras pudo notarse en la prctica, en donde esta ltima no present inconvenientes para el
conteo de colonias dado que su crecimiento se da en das.
Para algunos autores, la medicin de biomasa por peso seco es probablemente la mas fiable y
reproducible (Barton, 2005). Sin embargo, su insensibilidad a pequeas variaciones de la masa
celular condiciona el mtodo a volmenes elevados, dado que diferencias del orden de
miligramos representan el peso de un gran nmero de clulas. Tal como se especifica en las
tablas 3.3 y 3.4, ambos microorganismos presentaron variabilidad en la medicin de su
biomasa, a saber 0.067 y 0.1 para Rhodotorula sp. y Bacillus thuringiensis, respectivamente.
Aunque dichos valores resultan ser pequeos, pueden traducirse en una cantidad considerable
de biomasa celular, debido al volumen de trabajo utilizado y al tamao de los microorganismos
de estudio. Las levaduras son microorganismos que se caracterizan, entre otras cosas, por ser
de un tamao superior a las bacterias. Mientras una levadura puede medir entre 6 y 12m, una
bacteria tan solo mide de 0.2 a 4m (Martnez, 2006). Esta diferencia puede verse reflejada en
el valor promedio de biomasa seca obtenida para cada microorganismo, siendo 4.5veces
superior la de Rhodotorula sp. en comparacin a Bacillus thuringiensis. La grfica 2 permite
visualizar de manera clara dicha diferencia.
La medicin de biomasa por turbidimetra, resulta ser un mtodo rpido para la determinacin
de la concentracin celular de un cultivo, esto contando con la respectiva curva de calibracin
del microorganismo de estudio. Esta tcnica resulta muy confiable para valores pequeos de
absorbancia, en donde puede presentar proporcionalidad directa con la concentracin de
clulas (Annimo1, 2006). Durante la prctica, la lectura de la absorbancia arroj valores por
encima de la unidad, posiblemente por una elevada densidad celular en las muestras. Para
ajustarla a valores ms pequeos se realizaron diluciones, en donde pudo apreciarse que la
disminucin en los valores de absorbancia no sigue un comportamiento lineal respecto a la
dilucin realizada, tal como lo demuestran los datos registrados en las tablas 3.5 y 3.6, siendo
necesario ajustar experimentalmente los valores de absorbancia en el rango establecido
mediante diluciones seriadas, si es el caso. En la grfica 3 es posible apreciar como para esta
tcnica la variabilidad de los datos fue casi nula para Rhodotorula sp. e igual a cero para
Bacillus thuringiensis, lo que podra traducirse en la toma de muestras significativas y buena
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utilizar esta tcnica, hacer el recuento despus de un periodo de incubacin prudente de tal
manera que sea posible diferenciar fcilmente las colonias. La manipulacin de micropipetas,
las diluciones en serie y el propio investigador, pueden asociar error en la utilizacin de dicha
metodologa.
5. Conclusiones
Las tcnicas de medicin de biomasa que involucran conteo como son UFC y cmara de
Neubauer, no resultan ser apropiadas para Bacillus thuringiensis debido a su forma de
crecimiento y tamao que dificultan la distincin de las clulas.
Para realizar un estudio del crecimiento celular, la toma de varias rplicas tiene un impacto
en la variabilidad de los datos, siendo menor con el aumento del nmero de muestras
tomadas.
6. Bibliografa
ALBELO H., E.; GUTIERREZ B., O.; BOCUORT S., R.; ALBERT R., A.; VERACRUZ, M. 2008. Evaluacin
de la actividad fitasa de un crudo enzimtico a partir de fermentaciones microbianas sobre un sustrato
amilceo. Revista REDVET, volumen IX, nmero 11.
ANNIMO1. 2006. Mtodos pticos basados en la dispersin de la luz. Disponible en Internet:
http://www1.us.es/pautadatos/publico/personal/pdi/1790/14325/11-%20Esp%20Raman%20Turbidimetria
%2006-07.pdf. (Consulta: 13 de Febrero de 2009).
BARTON, L. 2005. Structural and Functional Relationships in Prokaryotes. Captulo 7: Cellular Growth
and Reproduction. Springer.
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