FACULTAD DE CIENCIAS

FARMACUTICAS Y BIOQUMICA
MICROBIOLOGIA
PRCTICA N4
TEMA:
MTODOS DE COLORACIN.

INTEGRANTE:

BENAVIDES BERMUDEZ, JESSICA

FORONDA BURGOS, ANGELICA
MORENO LOARTE ,MARIBEL
NUEZ GABRIEL,GUISSELA
PEREZ HUAMAN,VANESSA
YNOFUENTE,MARLENE

DOCENTE:
Q.F PEDRO JACINTO HERVIAS

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INTRODUCCION

Los microorganismos, concretamente las bacterias, pueden observarse

directamente al microscopio de campo claro. Sin embargo, debido al bajo
contraste entre las clulas y su entorno, estos procedimientos se utilizan en
ocasiones muy limitadas, como por ejemplo para la observacin de la movilidad
bacteriana. Los microscopios de contraste de fases, interferencia diferencial (DIC
o la microscopa de Nomarski) y campo oscuro permiten aumentar el contraste,
emplendose para la observacin de vainas, filamentos u otras estructuras
bacterianas. La tincin es un mtodo sencillo para incrementar el contraste entre
la clula y su entorno y por lo tanto contribuye a mejorar la imagen observada. Las
tcnicas de tincin con diversos colorantes facilitan la observacin al aumentar
notablemente el contraste. En Microbiologa todas las tinciones se realizan a partir
de suspensiones de microorganismos extendidas en un portaobjetos (frotis),
secadas y fijadas. La fijacin, procedimiento que permite preservar estructuras
celulares, se puede llevar a cabo con diferentes tratamientos: fijacin por calor o
fijacin qumica. La fijacin por calor es la ms utilizada para la observacin de
bacterias. Este procedimiento consiste en pasar el portaobjetos, con la suspensin
bacteriana extendida y seca, a travs de una llama de un mechero. La fijacin por
calor preserva la morfologa externa de los microorganismos pero no las
estructuras internas. La fijacin qumica con agentes como etanol, folmaldehido y
cido actico entre otros muchos, se utiliza para preservar las estructuras
celulares. Se pueden utilizar dos tipos de procedimientos, la tincin positiva es la
ms frecuente, en ella un colorante se une a ciertas estructuras microbianas.
Todos los colorantes utilizados en microbiologa tienen en comn la presencia de
grupos cromforos, grupos con dobles enlaces conjugados que son los
responsables del color mediante la unin a estructuras celulares por enlaces
inicos, covalentes o hidrfobos, los que establecen enlaces inicos son los ms
frecuentes. Por otra parte, en la tincin negativa se utilizan compuestos que no
penetran en las clulas sino que impregnan el medio circundante. Los
microorganismos aparecen refringentes sobre un fondo negro.

COMPETENCIAS:

Capacitar y adiestrar al estudiante para realizar manualmente los diferentes

mtodos de tincin

Aprender a realizar frotis y preparaciones fijas de bacterias.

Conocer los mtodos de tinciones, aprender a realizar la tcnica de tincin
simple usada en bacteriologa.
Conocer y distinguir que es tincin diferencial as como aplicar la tcnica de
Tincin de Gram.

MARCO TEORICO

MEDIOS DE CULTIVO

La mayor parte de los colorantes usados en Microbiologa son de tres tipos: A)

Aquellos en los cuales el ion portador del color (cromforo) es el anin llamados
colorantes cidos Ej. Eosinato de sodio Eosina. B) Aquellos cuyo cromforo es el
catin llamados colorantes bsicos Ej. Cloruro azul de metileno. C) Los colorantes
neutros, compuestos por bsicos y cidos Ej. Hematoxilina (bsico) Eosina
(cido). En los trabajos bacteriolgicos generalmente se usan colorantes bsicos
como el azul de metileno, cristal de violeta, fucsina bsica, safranina, todos ellos
pertenecen al grupo de los colorantes derivados de la anilina. Las coloraciones
pueden ser segn el nmero de colorantes que utilizan: A) Simples: cuando se
utiliza un solo colorante como el Azul de metileno, Tinta China, Azul de lactofenol
B) Diferenciales: cuando utilizan ms de un colorante como la coloracin de Gram,
y Ziehl - Neelsen. C) Especiales: cuando se usan colorantes que permiten
reconocer ciertas estructuras celulares como la coloracin de Leishman, Vago,
Hiss (para capsula), Wirtz conklin (para espora) etc
Clasificacin de los medios de cultivo
En los laboratorios de microbiologa se utilizan diferentes tipos de medios de
cultivo que pueden ser preparados en forma lquida o en forma slida. Usualmente
para preparar un medio slido se parte de un medio lquido al que se le aade un
agente solidificante como el agar, la gelatina o la slicagel.
Los medios de cultivo se pueden clasificar de acuerdo a la naturaleza de sus
constituyentes en:
Medios naturales o complejos:
Constituidos por sustancias complejas de origen animal o vegetal, las que son
usualmente complementadas por la adicin de minerales y otras sustancias. En
ellos no se conocen todos los componentes ni las cantidades exactas presentes
de cada uno de ellos.
Medios definidos o sintticos: son los medios que tienen una composicin
qumica definida cualitativa y cuantitativamente. Generalmente se usan en trabajos
de investigacin.
(Para bacterias como: Echerichia coli y Leuconostoc citrovorum)

De acuerdo al uso del medio de cultivo, stos se clasifican en:

Medios de enriquecimiento: Son medios lquidos que

de un tipo de microorganismo en particular. Permiten
microorganismos de ese tipo. Usualmente contienen
inhibidoras del crecimiento de los microorganismos con
quieren cultivar.

favorecen el crecimiento
aumentar el nmero de
una o ms sustancias
excepcin de los que se

Medios selectivos: Son parecidos a los de enriquecimiento, se diferencian por

ser medios slidos y estn diseados para el aislamiento de microorganismos
especficos.
(Para bacterias como Salmonella typhi y Clostridium botulinum)
Medios diferenciales: son medios que contienen indicadores de productos
derivados de la actividad microbiana de los microorganismos. No contienen ningn
tipo de sustancia con actividad antimicrobiana. Permiten revelar caractersticas
fisiolgicas de los microorganismos.
(Para bacterias como: Streptococcus pyogenes y Escherichia coli)
Por su composicin los medios de cultivo se clasifican en:
Lquidos: conocidos como caldos, estos son especialmente tiles para hacer
diluciones, para homogenizar mezclas de microorganismos, para enriquecer
cultivos y para rehidratar cepas liofilizadas.
Slidos: Para separar microorganismos y favorecer el desarrollo de las colonias
aisladas en las que es posible observar las caractersticas tpicas de un solo tipo
de microorganismo.
Semislidos: Son aquellos medios lquidos a los que se adiciona agar en
concentraciones de 0.4 a0.8%. Estos se emplean para determinar la movilidad de
los microorganismos microaeroflicos.Los medios de cultivo se pueden preparar en
el laboratorio a partir de cada uno de sus constituyentes bsicos o por simple
rehidratacin de productos asequibles comercialmente (medios de cultivo
deshidratados). Generalmente se prefiere el uso de los medios de cultivo
deshidratados porque, adems de simplificar el trabajo, con ellos se tiene mayor
probabilidad de obtener resultados reproducibles. Para su preparacin se deben
tener en cuenta los siguientes aspectos:
Prepararlos slo a partir de productos que provengan de fabricantes o
proveedores que suministren productos de calidad.

 Utilizar agua destilada o desmineralizada con una calidad microbiolgica y

fisicoqumica adecuada.
Utilizar materiales de vidrio bien lavado y enjuagado con agua destilada o
desmineralizada.
Controlar el tiempo y la temperatura recomendada durante su esterilizacin.
Nunca se deben exceder las condiciones sealadas por el fabricante.

Almacenamiento de los medios de cultivo:

Los medios de cultivo deshidratados se deben almacenar en envases sellados
bajo las condiciones que seale el fabricante. Generalmente se almacenan en un
lugar fresco (entre 15 y 25_), con poca humedad y protegidos de la luz solar di
recta. Nunca se deben almacenar cerca de autoclaves, hornos, ni otra fuente de
calor o vapor; Los medios de cultivo deshidratados se deben descartar cuando se
hidraten o decoloren. Una vez que el medio de cultivo ha sido preparado y
esterilizado se debe almacenar entre 2 y 8_C, a menos que el medio requiera
alguna condicin diferente. Se deben mantener en recipientes bien cerrados para
evitar su deshidratacin. Cuando se usa tapn de algodn se debe colocar por
encima una envolturade papel (Craft).
ESTERILIZACIN
Es un procedimiento que engloba un trmino absoluto que significa la total
destruccin o remocin de toda forma de vida. Para medios de cultivo se usan
altas temperaturas, vapor saturado a presin, algunos agentes qumicos (muy
pocos) y ciertos filtros y radiaciones U.V.Se dividen en mtodos
1) Fsicos
2) Qumicos.

CICLO DE ESTERILIZACIN:
1.- Tiempo de calentamiento (en autoclave) de aproximadamente 20 desde 20C
(temperatura ambiente) a 121C.
2.- Tiempo de penetracin: tiempo que tarda el calor en llegar a todo el objeto
(121C)
3.- Tiempo de alojamiento: es el tiempo en que va a estar el objeto a esa
Temperatura 121C
4.- Tiempo de enfriamiento: de 121C a 60C

AGAR TRIPTICASA DE SOYA

Principio del mtodo:
El agar tripticase de soya garantiza el crecimiento de todos los microorganismos
de importancia microbiolgica tanto grampositivos como gramnegativos, hongos y
levaduras, este medio tiene mltiples usos puede ser utilizado para el monitoreo
microbiolgico de reas y superficies, para el mantenimiento de cepas ATCC y
para el anlisis de aguas y alimentos. El agar tripticase de soya contiene casena
digerida con enzimas pancreticas 5.0 g. casena digerida con papana 5.0 g.
Cloruro de Na 5.0 g Agar 15.0 g pH final (7.3 +/- 0.2).

CRITERIOS DE DESEMPEO Y LIMITACIONES DEL MTODO

El agar Tripticase de Soya debe permitir el crecimiento abundante de todos los
microorganismos en estudio despus de 18 horas de incubacin en atmsfera de
aerobios.

COMPETENCIA:
Realizar un listado de los principales medios de cultivo y su aplicacin, as como
los indicadores mas usados

AGUA PEPTONADA: mtodo usado como diluyente y para enriquecimiento

bacteriano de productos alimenticio y otros materiales de inters sanitario.
UREA AGAR BASE: recomendado para la deteccin de la produccin de
ureasa , en particular por proteusvulgaris , micrococos y organismos paracolon
AGAR XLD:agar xilosa tisina desoxicolato para microbiologa
BLOOD AGAR BASE BBL: (base para agar sangre)(agar infusin)Base para
el aislamiento y cultivo de estreptococos y otros microorganismos ms
delicados.
SABOURAUD DEXTROSE AGAR: Base para el cultivo de hongos y
microrganismos aciduricos.

 AGAR TRIPLE AZUCAR HIERRO: base para diferenciacin de bacilos tnicos

gramnegativos.
PEPTONA, CALDO: incluye contenido trytophan alta utilizado como ingrediente
en medios de cultivo til para la produccin comercial de mes Enzy, vacunas,
antibiticos y otros productos.
VIOLETA ROJO Y BILIS AGAR: medio selectivo para la investigacin
presuntiva de coliformes, en alimentos y productos lcteos.
AGAR SS: para aislamiento de Salmonella y Shigella
PAPA GLUCOSADO AGAR: adecuado para el cultivo, aislamiento y recuento
de hongos y levaduras en alimentos y otros materiales
AGAR NUTRIENTE: base para el cultivo de una amplia variedad de
microrganismos.
AGAR MC CONKEY: base para el aislamiento y la diferenciacin de
microorganismos entricos

MATERIALES Y EQUIPO:

Probetas
Solucin de NaOH
Tripones con rejilla metlica
Tubos estriles y placas, baguetas, beakers
Papel indicador de pH
Agar tripticase de soja (TSA)
Autoclave

AGAR DE SOJA TRIPTICASE

PROCEDIMIENTO:

SEMBRADO

Pesar 2.4 gr de tripticase de soya:

40gr agar .1000 Ml
X60Ml H20 dest
x= 2, 4 gr de agar

Medir en una probeta 60 ML de agua

destilada

Agregar el agua dest 60 Ml y el agar

de soya 2.4 gr

Luego se agit para que se disolviera

completamente el agar

Se mide el PH con la cinta indicadora, y como

resultado se obtuvo 6.5 y se agreg NaOH para
ajustar el PH.

ESTERILIZACION

Se puso el envase, rotulado en

autoclave para ser esterilizar durante
30 minutos a 100c se cierra la espita
para que suba a 125c, se apaga en 3
tiempos

Se separa en 2 placas Petri y tambin en 2 tubos de

ensayo y esperar a que se solidifique ya que es un
agar.

INCUBACION:

Luego son llevados a la incubadora por

24 h

RESULTADO:
Como resultado se obtuvo:
En el medio de cultivo no se observ ningn defecto alguno.
CONCLUSION
El resultado indica que el procedimiento se realiz perfectamente

CUESTIONARIO:
1. Qu importancia tiene el uso de los medios solidos?
El agar puede utilizarse para diferentes fines, aunque los ms importantes son:
agar comercial para la industria alimenticia, agar bacteriolgico, agares
purificados y agarosa, utilizada para electroforesis en gel. Aproximadamente la

mitad de todo el agar que se produce, se utiliza en trabajo microbiolgico, por lo

que es importante la ausencia de metales txicos.
Se utilizan con frecuencia en el aislamiento y mantenimiento de los
microorganismos en el laboratorio. Ej. Agar nutritivo.

2. Qu sustancia es la encargada de solidificar los medios de cultivo?

De dnde se extraen?
Agentes solidificantes
El agar es un polmero de la galactosa que es esterificado con cido sulfrico y se
extrae de ciertas algas marinas rojas, las Rhodophyceae, debe estar limpio y libre
de desechos. Se agrega a la solucin acuosa del 1,5 al 2%.El medio agarizado
comienza a fundir a los 100C, si bien se mantiene lquido hasta los 45C, en
donde se comienza a solidificar.
La gelatina Es poco usada ya que a temperaturas altas se disuelve y por otra
parte numerosos microorganismos lo digieren, se usa principalmente en
microbiologa de suelos.
La Agarosa es un polisacrido neutro que junto con la agaro pectina es un
producto de disociacin del agar. Se usa en pruebas de difusin inmuno
electrofortica, donde la claridad es especialmente importante

BIBLIOGRAFIA:

http://marisol-marysebastian.blogspot.com/2012/04/preparacion-y-esterilizacionde.html
http://aline-m-e-p.blogspot.com/2012/04/practica-2-preparacion-yesterilizacion.html
http://www.ms.gba.gov.ar/sitios/laboratorio/files/2012/08/ESTERILIZACI
%C3%93N-DE-MEDIOS-DE-CULTIVO.pdf
https://www.bd.com/europe/regulatory/Assets/IFU/US/8808511(0703)ES.pdf
http://www.ucv.ve/fileadmin/user_upload/facultad_farmacia/catedraMicro/10_Pre
paraci%C3%B3n_de_medios_de_cultivo.pdf