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Orientador: Prof. Dr. Daniel Rodrigues Cardoso
So Carlos
2011
So Carlos, 11/03/2011
___________________________
Natlia Ellen Castilho de Almeida
DEDICATRIA
EPGRAFE
AGRADECIMENTOS
Agradecimentos
Agradeo primeiramente a Deus por me acompanhar sempre. O meu Deus
o Deus do impossvel.
Ao Prof. Dr. Daniel R. Cardoso pela orientao e ensinamentos. Ao Prof. Dr.
Douglas W. Franco pela infra-estrutura utilizada.
Aos amigos Clayston e Tatiane (Fefe) por compartilharem momentos bons e
difceis.
A Rafaela e Leandro pelo companheirismo desde 2004 (Turma de
Bacharelado do IQSC-USP).
Aos colegas do Laboratrio da Qumica da Aguardente e Laboratrio de
Qumica Analtica e Inorgnica, IQSC-USP, pela convivncia. Em especial, agradeo
ao Wendel Aquino, Fernanda Seixas, Juliana Grippa e Andr (Barbie) pela ajuda e
amizade.
Ao Sr. Julio Landmann (Hopsteiner) pela gentileza de doar o extrato de lpulo
isomerizado.
Ao Prof. Dr. Antnio Gilberto Ferreira e Eduardo Sanches pela disponibilidade
na realizao dos experimentos de ressonncia magntica nuclear (DQ - UFSCar).
Ao Instituto de Qumica de So Carlos (IQSC), Universidade de So Paulo
(USP) pela oportunidade.
Ao Prof. Dr. Antonio C. Burtoloso e a Viviana pela ajuda nas snteses (IQSC USP).
A FAPESP pelo auxlio financeiro.
SUMRIO
SUMRIO
Lista de Esquemas
Lista de Figuras
Lista de Tabelas
Abreviaturas
Resumo
Abstract
1. INTRODUO
18
2. OBJETIVOS
33
3. MATERIAL E MTODO
34
3.1.
Reagentes
34
3.2.
35
3.3.
36
3.4.
37
3.5.
38
3.6.
39
3.6.1.
40
41
41
43
45
46
4. RESULTADOS E DISCUSSO
47
dos
derivados
47
reduzidos/hidrogenados
das
48
SUMRIO
48
49
Caracterizao
qumica
das
trans-isohumulonas
50
50
isoladas
4.3.2. Caracterizao qumica das cis-isohumulonas isoladas
57
61
65
4.3.5.
70
73
73
79
83
85
93
hidroxietila
4.5. Identificao dos produtos de reao
96
99
5. CONCLUSES
102
REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
105
APNDICES
LISTA DE ESQUEMAS
Lista de Esquemas
Esquema 1. Reao de isomerizao trmica das humulonas cis(2-ac) e trans-isohumulonas (1-ac) durante o cozimento do mosto
fermentado e adicionado de lpulo. A relao trans-/cis-ishumulonas em
condies normais de fabricao da cerveja de 32:68. (a) iso-nhumulona, (b) isocohumulona, (c) isoadhumulona
23
27
30
31
41
44
82
96
LISTA DE FIGURAS
Lista de Figuras
Figura 1. Consumo mdio anual de cerveja per capita por pas e grfico
da distribuio de bebidas alcolicas no mercado brasileiro
18
19
Figura 3. Estrutura qumica dos -cidos (1a-c) e -cidos (2a-c). (1a) nlupulona, (1b) colupulona, (1c) adlupulona, (2a) n-humulona, (2b)
cohumulona, (2c) adhumulona
22
24
Figura 5. Estrutura qumica da dihidro-isohumulonas (1a-c) e tetrahidroisohumulonas (2a-c), derivados reduzidos e hidrogenados dos iso-cidos, respectivamente. (1a) dihidro-iso-n-humulona, (1b) dihidroisocohumulona, (1c) dihidro-isoadhumulona, (2a) tetrahidro-iso-nhumulona, (2b) tetrahidro-isocohumulona, (2c) tetrahidro-isoadhumulona
28
32
48
49
50
51
LISTA DE FIGURAS
52
54
55
56
56
57
58
59
60
61
61
LISTA DE FIGURAS
62
63
65
66
68
69
71
72
LISTA DE FIGURAS
74
77
77
78
80
81
Figura 36. Grfico (F/F-1)*k2*[4-POBN] vs. concentrao de transisohumulonas. Medidas obtidas por espectrometria de massas (ESI-(+)MS/MS e espectroscopia de ressonncia paramagntica de eltrons
(EPR). T = 25 oC; 1 minuto de reao
85
Figura 37. Configurao espacial das cis-isohumulonas (a) e transisohumulonas (b), com os respectivos momentos de dipolo eltrico
90
91
92
LISTA DE FIGURAS
94
95
98
LISTA DE TABELAS
Lista de Tabelas
53
80
86
88
Tabela 5. Propriedades eletrnicas dos diastereismeros cis- e trans-iso-cidos, em sua forma molecular, calculadas usando o mtodo M06/631+G(d)
89
ABREVIATURAS
Abreviaturas
4-POBN
-4-piridil-1-xido-N-tert-butilnitrona
-CD
-ciclodextrina
BDE
CDCl3
Clorofrmio deuterado
CID
ESI-MSn
Espectrmetro de Massas
DFT
IEF-PCM
HER
1-hydroxyethyl radical
HOMO
IAA
Iso--cidos
LC-MSn
MBT
3-metil-but-2-eno-1-tiol
NHE
Rf
RPE
H RMN
RESUMO
RESUMO
Os iso--cidos so os principais constituintes responsveis pelo sabor amargo da
cerveja, sendo estes facilmente degradados durante o seu processo de
envelhecimento ou exposio a radiao luminosa, em particular o diastereoismero
trans-. O radical 1-hidroxietila o radical majoritrio formado na cerveja durante o
processo de envelhecimento. O presente trabalho descreve a reatividade dos iso-cidos frente ao radical 1-hidroxetila atravs do uso da tcnica de spin-trapping com
deteco por espectroscopia de ressonncia paramagntica de eltrons (RPE) e
espectrometria
de
massas
(ESI-(+)-MS/MS).
Observou-se
que
ambos
os
ABSTRACT
ABSTRACT
The iso--acids are the main responsible constituents for the bitter taste of beer, they
are easily degraded during the aging and light exposed process, specially the transdiastereoisomer. The 1-hydroxyethyl radical is the major radical produced during the
beer aging process. The present work describes the reactivity of iso--acids towards
the 1-hydroxyethyl radical as probed by the spin-trapping technique and detected by
electron paramagnetic resonance (EPR) and mass spectrometry (ESI-(+)-MS/MS). It
was observed that both diastereoisomers cis- and trans-iso--acids are degraded in
the presence of 1-hydroxyethyl radical with apparent rate constant of 1.8 108 e 9.2
109 L mol-1 s-1, respectively. The reactivity of dihydro-iso--acids towards the studied
radical was similar to the reactivity of the iso--acids diastereoisomeric mixture,
showing apparent rate Constant of 1.5 109 L mol-1 s-1. The tetrahydro-iso--acids
analogues did not observed reactivity towards the 1-hydroxyethyl radical suggesting
the allilic hydrogens as the reaction sites. In addition, the ab initio DFT calculations
demonstrated that the BDE values for the allilic hydrogens of the prenyl and
isohexenoyl side chains are equivalents and according to that suggesting the higher
reactivity of the trans- diastereoisomer to be accounted to an entropic factor since
both goups are in the same plane of the space. The oxidation products were
determined by LC-ESI-MSn and its was verified the formation of hydroxyl-allo-iso-acids. The data colected allows a mechanism to be proposed for the oxidation
process and loss of bitter acids of beer during the beverage aging.
INTRODUO
1. INTRODUO
Figura 1.. Consumo mdio anual de cerveja per capita por pas e grfico da distribuio de
d bebidas
1
alcolicas no mercado brasileiro .
INTRODUO
malte de cevada
gua
MOAGEM
FILTRAO
FERVURA
FERMENTAO
lpulo
leveduras
MATURAO
FILTRAO
CO2
ENVASE
PASTEURIZAO
INTRODUO
O lpulo pode ser adicionado ao processo cervejeiro atravs da adio direta de flores secas (in
3
natura), pellets ou extratos .
INTRODUO
lpulo
uma
planta
trepadeira
perene,
pertencente
famlia
INTRODUO
1a-c
2a-c
Figura 3. Estrutura qumica dos -cidos (1a-c) e -cidos (2a-c). (1a) n-lupulona, (1b) colupulona,
(1c) adlupulona, (2a) n-humulona, (2b) cohumulona, (2c) adhumulona.
INTRODUO
+
2
+
5
+2
+2
2
+2
+XPXORQDV
S.D
2
+
2
5
2
+ 2
5HDUUDQMR
GH DFLORtQD
2
+2
WUDQVLVRKXPXORQDV
DF
2+
+2
2
5
2+
FLVLVRKXPXORQDV
DF
D 5 &+&+&+
E 5 &+&+
F 5 &+&+&+&+
INTRODUO
(a)
(b)
Figura 4. Estrutura qumica das isohumulonas em sua forma molecular (a) e aninica (b).
INTRODUO
INTRODUO
INTRODUO
11,21
INTRODUO
Verifica-se
uma
crescente
busca
pelas
indstrias
cervejeiras
por
(1a-c)
(2a-c)
Assim, o uso dos derivados reduzidos dos cidos amargos do lpulo vem de
encontro melhoria na qualidade sensorial do produto, uma vez h, em parte, uma
minimizao na formao de aromas indesejveis e perda sensorial de amargor19-22.
Entretanto, na prtica, vrios problemas so detectados, j que os derivados
reduzidos tambm podem sofrer decomposio via radicalide, levando a formao
de produtos de degradao especficos, tais como 4-metil-3-pentenal, o qual lembra
o odor de papelo e assim conferindo um aroma tpico de cerveja velha22. A
exposio das tetrahidro-isohumulonas luz conduz a formao do composto
*
O atributo menos sensvel est relacionado ao menor impacto sensorial dos fotoprodutos de
degradao e no a estabilidade qumica da espcie.
INTRODUO
partir
desses
exemplos
de
alteraes
que
ocorrem
durante
INTRODUO
INTRODUO
25,28
INTRODUO
(a)
(c)
(e)
(b)
(d)
(f)
Figura 6. Estrutura qumica de alguns fenis presentes na cerveja. (a) quercetina, (b) morina, (c)
kaempferol, (d) cido p-cumrico, (e) cido clorognico, (f) cido cafeico.
OBJETIVOS
2. OBJETIVOS
MATERIAL E MTODO
3. MATERIAL E MTODO
3.1.
Reagentes.
MATERIAL E MTODO
3.2.
MATERIAL E MTODO
3.3.
equimolar
de
-ciclodextrina
(1,5
g,
em
12
mL
de
gua)
MATERIAL E MTODO
3.4.
MATERIAL E MTODO
3.5.
MATERIAL E MTODO
3.6.
MATERIAL E MTODO
3.6.1.
as
medidas
foram
efetuadas
em
meio
orgnico
(perclorato
de
tetrabutilamnio em acetonitrila 0,1 mol L-1), a temperatura ambiente (25 oC), sob
atmosfera inerte (N2).
MATERIAL E MTODO
3.7.
MATERIAL E MTODO
MATERIAL E MTODO
3.7.2.
Determinao
das
constantes
de
velocidade
aparentes
MATERIAL E MTODO
nm
nm
= 11.150
MATERIAL E MTODO
sendo
este
monitorado
pelas
tcnicas
RPE
ESI-(+)-MS/MS.
Parmetros instrumentais:
Espectrmetro
de
Ressonncia
Paramagntica
de
Eltrons
(RPE):
3.8.
MATERIAL E MTODO
momento dipolo eltrico e energia dos orbitais de fronteira HOMO foram obtidas
atravs de clculo usando o mtodo DFT utilizando a base M06/6-31+G(d).
3.9.
1-hidroxietila e os iso--cidos.
RESULTADOS E DISCUSSO
4. RESULTADOS E DISCUSSO
RESULTADOS E DISCUSSO
RESULTADOS E DISCUSSO
Z D W
Figura 8. Evoluo dos precursores isohumulonas - e produtos da reao dihidro-isohumulonas no sistema de cromatografia planar utilizando slica gel como fase estacionria e hexano/ter etlico
(1:4 v/v) acidificado com cido actico como fase mvel. (R) reao; (M) mistura; (P) precursores.
horas
de amostragem
todos
precursores foram
RESULTADOS E DISCUSSO
Figura 9. Evoluo dos precursores isohumulonas - e produtos da reao tetrahidroisohumulonas - no sistema de cromatografia planar utilizando slica gel como fase estacionria e
hexano/ter etlico (1:1 v/v) acidificado com cido actico como fase mvel.(R) reao; (M) mistura;
(P) precursores.
RESULTADOS E DISCUSSO
Figura 10. Espectro eletrnico de absoro das trans-isohumulonas isoladas em soluo contendo
-1
10 mL de etanol e 1 mL de soluo aquosa de HCl (2,0 mol L ). Concentrao de trans-isohumulonas
-5
-1
de 3,2 10 mol L .
segunda
tcnica
utilizada
na
caracterizao
qumica
das
trans-
RESULTADOS E DISCUSSO
Intens.
x10 5
(a)
1
4
5
2
0
0
10
Intens.
x104
15
20
25
Time [min]
(b)
[M-H]-
2.0
347.2
+2
2+
2
1.5
WUDQVLVRFRKXPXORQDV
1.0
[M-H-isohexenoila]-
0.5
251.1
[M-H-H2O]
[M-H-prenila]
100
150
Intens.
x10 4
200
369.2
329.2
278.1
0.0
250
300
350
m/z
(c)
[M-H]361.3
+2
3
2+
WUDQVLVRQKXPXORQDV
-
[M-H-isohexenoila]
1
265.2
[M-H-H2O]
283.3
343.2
383.2
0
100
150
200
250
300
350
m/z
Figura 11. (a) Cromatograma de ons total da amostra comercial contendo as isohumulonas, formas
cis- e trans- (em vermelho) e das trans-isohumulonas isoladas (em azul). (b) Espectro de massas
(ESI(-)MS) da espcie trans-coisohumulona referente ao pico 2, tr = 11,4 min. (c) Espectro de massas
(ESI(-)MS) da espcie trans-iso-n-humulona referente ao pico 4, tr = 16,5 min.
RESULTADOS E DISCUSSO
desprotonada [M-H]- = 361 m/z , Figura 11c. interessante ressaltar que a transisoadhumulona, por estar presente inicialmente no extrato de lpulo isomerizado em
pequena quantidade, sua complexao no foi efetiva; consequentemente, no foi
detectada a trans-isoadhumulona na soluo final das trans-isohumulonas isoladas.
Ainda, pela da anlise cromatogrfica do extrato de lpulo pr-isomerizado
(cromatograma em vermelho apresentada na Figura 11a), concedido gentilmente
pela Hopsteiner, constatou-se um excesso de 70% dos ismeros cis- em relao aos
trans-iso--cidos, sendo os percentuais dos compostos apresentados na Tabela 1.
Como um todo, a pureza verificada para a soluo aquosa comercial contendo as
formas cis- e trans-iso--cidos foi de 90%.
cisisocohumulona
transisocohumulona
iso-n-humulona
(cis- e trans-)
isoadhumulona
(cis- e trans-)
25,9%
3,6%
66,0%
4,5%
RESULTADOS E DISCUSSO
Figura 12. Espectro de 1H RMN (200 MHz) das trans-isohumulonas isoladas, em CDCl3. Os sinais
marcados com (*) indicam impurezas presentes na amostra.
RESULTADOS E DISCUSSO
-3
-1
Figura 13. Cromatograma caracterstico das trans-isohumulonas em meio alcolico (5,0 10 mol L )
submetido a separao em uma coluna LUNA C-18 e eluio isocrtica 56% do solvente B. Vazo da
-1
fase mvel 2,5 mL min. Volume de injeo 500 L. Comprimento de onda de monitoramento
= 270 nm.
RESULTADOS E DISCUSSO
[Ma-H]
1.25
347.1
1.00
[Ma-H+O2]-
0.75
[Mb-H]
361.1
0.50
[Mb-H+O2]393.1
0.25
379.1
[Ma-H-isohexenoila]
251.0
0.00
100
150
200
250
300
350
m/z
Figura 14. Espectro de massas (ESI(-)MS) resultante de injeo direta da frao 1 contendo transisohumulona.
[Ma-H]-
0.8
361.1
0.6
[Mb-H+O2]
0.4
[Ma-H+O2]
379.1
0.2
[Mb-H]
-
[Ma-H-isohexenoila]
393.1
347.1
265.0
0.0
100
150
200
250
300
350
m/z
Figura 15. Espectro de massas (ESI(-)MS) resultante de injeo direta da frao 2 contendo transisohumulonas.
RESULTADOS E DISCUSSO
Figura 16. Espectro eletrnico de absoro das cis-isohumulonas isoladas em soluo contendo 10
-1
-5
-1
mL de etanol e 1 mL de soluo aquosa de HCl (2,0 mol L ). Concentrao de 4,6 10 mol L .
RESULTADOS E DISCUSSO
Intens.
x105
(a)
4
2
0
0
10
Intens.
x104
15
20
25
30
Time [min]
(b)
-
[M-H]
347.1
[M-H-isohexenoila]
[M-H-prenilaisohexenoila]
[M-H-isohexenoilaH2O]251.0
182.0
[M-H-H2O]
[M-H-prenila]
329.1
278.1
233.1
0
100
150
200
Intens.
x105
250
300
350
m/z
1.2
(c)
-
[M-H]
1.0
361.1
0.8
0.6
0.4
[M-H-prenilaisohexenoila]-
0.2
[M-H-H2O]
[M-H-isohexenoila]
343.1
265.1
196.0
0.0
100
150
200
250
300
350
m/z
Figura 17. (a) Cromatograma de ons total da amostra comercial contendo as isohumulonas, formas
cis- e trans-, (em vermelho) e das cis-isohumulonas isoladas (em azul). (b) Espectro de massas
(ESI(-)MS) da espcie cis-isocohumulona referente ao pico 1, tr = 10,5 min. (c) Espectro de massas
(ESI(-)MS) das espcies cis-isoadhumulona e cis-iso-n-humulona referente ao pico 3, tr = 14,7 min.
Os sinais marcados com (*) indicam impurezas presentes na amostra.
Pelo espectro de massas do pico 1 contido cromatograma das cisisohumulonas isoladas, nota-se o on [M-H]- 347 m/z respectivo molcula
desprotonada referente forma cis-isocohumulona, Figura 17b. Por outro lado, o
espectro de massas do pico 3, Figura 17c, cujo tempo de reteno 14,7 minutos,
RESULTADOS E DISCUSSO
Figura 18. Espectro de 1H RMN (200 MHz) das cis-isohumulonas isoladas, em CDCl3. Os sinais
marcados com (*) indicam impurezas presentes na amostra.
RESULTADOS E DISCUSSO
-3
-1
Figura 19. Cromatograma caracterstico das cis-isohumulonas em meio alcolico (1,0 10 mol L )
submetido a separao em uma coluna LUNA C-18 e eluio isocrtica 56% do solvente B. Vazo da
-1
fase mvel 2,5 mL min. Volume de injeo 500 L. Comprimento de onda de monitoramento = 270
nm.
compostos
presentes;
portanto,
no
se
obteve
uma
separao
cromatogrfica eficiente.
RESULTADOS E DISCUSSO
Intens.
x105
[Ma-H]
347.1
[Mb-H]
361.1
2
-
[Ma-H-isohexenoila]
[Mb-H-isohexenoila]
[Ma-H-H2O]
329.1
251.1
265.1
0
100
150
200
250
300
350
m/z
Figura 20. Espectro de massas (ESI(-)MS) resultante de injeo direta da frao 1 contendo cisisohumulonas.
No espectro de massas dos picos P.2 e P.3, Figura 21, o on 361 m/z
consiste no on das molculas desprotonadas, o qual referente aos homlogos cisisoadhumulona e cis-iso-n-humulona. De fato, a amostra apresentou uma pureza
estimada em 95%, verificando uma boa separao cromatogrfica.
Intens.
x105
[M-H]-
361.1
2
[M-H-H2O]-
[M-H-isohexenoila]
343.1
265.1
0
100
150
200
250
300
350
m/z
Figura 21. Espectro de massas (ESI(-)MS) resultante de injeo direta da frao 2 contendo cisisohumulonas.
Conforme j exposto, a reduo da funo carbonila do isohexenoila dos iso-cidos conduz a formao dos dihidro-iso--cidos. Logo, verifica-se que estes
RESULTADOS E DISCUSSO
Figura 22. Espectro eletrnico de absoro das dihidro-isohumulonas, formas cis- e trans-, em
-1
soluo contendo 10 mL de etanol e 1 mL de soluo aquosa de HCl (2,0 mol L ). Concentrao de
-5
-1
2,3 10 mol L .
RESULTADOS E DISCUSSO
Intens.
x10 7
(a)
3
2
1
1
0
0
10
20
Intens.
x10 6
30
40
50
T i me [min]
[M-H]-
349.1
(b)
1
[M-H-prenila-HCOH]251.0
381.1
0
50
100
150
Intens.
x10 6
200
1.5
350
m/z
[M-H]
363.1
(c)
+2
+2
300
250
+2
2+
+2
2+
1.0
FLVGLKLGURLVRQKXPXORQDV
5
WUDQVGLKLGURLVRQKXPXORQDV
&+&+&+
0.5
[M-H-prenila-HCOH]
265.0
0.0
50
100
Intens.
x10 5
150
200
250
300
350
m/z
[M-H]
363.1
(d)
[M-H-prenila-HCOH]
265.1
0
50
100
150
200
250
300
350
m/z
Figura 23. (a) Cromatograma de ons total das dihidro-isohumulonas. (b) Espectro de massas
(ESI(-)MS) da espcie trans- e cis-dihidro-isocohumulona referente aos picos 1 e 2, tr = 6,3 e 7,6 min.
(c) Espectro de massas (ESI(-)MS) da espcie trans- e cis-dihidro-iso-n-humulona referente aos picos
3 e 4, tr = 8,2 e 10,0 min. (d) Espectro de massas (ESI(-)MS) da espcie cis- e trans-dihidroisoadhumulona referente aos picos 5 e 6, tr = 11,7 e 15,1 min.
RESULTADOS E DISCUSSO
os
picos
supracitados
apresentaram
mesmo
on
das
molculas
desprotonadas [M-H]- 349 m/z, sendo estes resultantes das eluies das dihidroisocohumulonas, cuja massa molecular igual a 350 g mol-1. Ainda, pela
comparao das reas referentes aos picos, constatou-se que o primeiro pico
remete a trans-dihidro-isocohumulona, pois a rea relativamente menor que a rea
apresentada pelo segundo pico, sendo este decorrente da eluio da espcie cis-.
Os espectros de massas referentes aos demais picos, contidos na Figura
23c-d, apresentaram perfis similares, cujo on das molculas desprotonadas igual
a 363 m/z. Logo, constata-se que os picos 3, 4, 5 e 6 so inerentes aos homlogos
dihidro-iso-n-humulonas e dihidro-isoadhumulonas, os quais possuem massa
molecular igual a 364 g mol-1. Atravs da comparao entre as reas dos picos e
sabendo que os derivados das iso-n-humulonas esto presentes em maior
concentrao, constatou-se que os picos 3 e 4 so referentes aos diastereoismeros
trans-dihidro-iso-n-humulona e cis-dihidro-iso-n-humulona, respectivamente. Por
outro lado, os picos 5 e 6 remetem aos compostos cis-dihidro-isoadhumulona e
trans-dihidro-isoadhumulona.
O espectro de ressonncia magntica nuclear (1H RMN) obtido do produto da
reao decorrente da reduo dos iso--cidos est apresentado na Figura 24.
Apesar da baixa resoluo do espectro, verifica-se uma diferena ntida entre o
presente espectro e o apresentado pelos precursores iso--cidos. Esta diferena
diz respeito a sinal alargado em 6,3 ppm, o qual est diretamente relacionado com a
nova funo hidroxila presente na molcula, uma vez que tomos de hidrognios
ligados alcois so, no geral, facilmente trocveis com tomos de deutrio
presentes no meio (CDCl3). Todavia, outro aspecto que contribui para o alargamento
RESULTADOS E DISCUSSO
Figura 24. Espectro de 1H RMN (200 MHz) das dihidro-isohumulonas, formas cis- e trans-, em
CDCl3. Os sinais marcados com (*) indicam impurezas presentes na amostra.
Como um todo, atravs das anlises dos produtos da reao de reduo dos
iso--cidos, constatou-se que o preparo das dihidro-isohumulonas foi bem
sucedida, obtendo uma pureza estimada de 98%.
RESULTADOS E DISCUSSO
Figura 25. Espectro eletrnico de absoro das tetrahidro-isohumulonas, formas cis- e trans-, em
-5
-1
meio etanol. Concentrao de 2,3 10 mol L .
RESULTADOS E DISCUSSO
que o primeiro pico refere-se aos distereoismeros cis-, ao passo que a transtetradhidro-isocohumulona elue da coluna em 21,5 minutos, pico 2.
Analogamente, os picos 3 e 4 apresentam espectros de massas similares,
Figuras 26c-d, sendo o on 365 m/z o on das molculas desprotonadas [M-H]-.
Estes picos referem-se aos homlogos tetrahidro-iso-n-isohumulonas e tetrahidroisoadhumulonas, os quais apresentam massa molecular igual a 366 g mol-1. Atravs
do clculo das reas, verificou-se que o pico 3 remete mistura das tetrahidro-iso-nhumulonas, cis- e trans-, as quais so majoritrias no extrato de lpulo utilizado. Por
outro lado, o ltimo pico resultado da eluio da mistura cis- e trans-tetrahidroisoadhumulona, minoritrias no extrato de lpulo pr-isomerizado.
RESULTADOS E DISCUSSO
Intens.
x106
(a)
6
2
0
0
10
Intens.
x105
6
20
30
40
50
T ime [min]
[M-H]
(b)
350.7
5
[M-H-CO2]306.8
0
100
150
Intens.
x105
200
250
300
350
m/z
[M-H]
364.8
(c)
2
[M-H-CO2]
320.8
0
100
150
Intens.
x105
200
250
300
350
m/z
[M-H]
364.8
(d)
1.5
1.0
0.5
394.7
0.0
100
150
200
250
300
350
m/z
Figura 26. (a) Cromatograma de ons total das tetrahidro-isohumulonas, formas cis- e trans-. (b)
Espectro de massas (ESI(-)MS) da espcie cis- e trans-tetrahidro-isocohumulona referente aos picos
1 e 2, tr = 19,2 e 21,5 min., respectivamente. (c) Espectro de massas (ESI(-)MS) das espcies cis- e
trans-tetrahidro-iso-n-humulona referente ao pico 3, tr = 26,0 min. (d) Espectro de massas (ESI(-)MS)
das espcies cis- e trans-tetrahidro-isoadhumulona referente ao pico 4, tr = 29,6 min.
RESULTADOS E DISCUSSO
Figura 27. Espectro de 1H RMN (200 MHz) das tetrahidro-isohumulonas, formas cis- e trans-, em
CDCl3. Os sinais marcados com (*) indicam impurezas presentes na amostra.
RESULTADOS E DISCUSSO
4.3.5.
RESULTADOS E DISCUSSO
Figura 28. Voltamograma cclico das trans-isohumulonas em sua forma aninica, em acetonitrila
-1
contendo 0,2 mol L de perclorato de tetrabutilamnio como eletrlito suporte. Eletrodos: diamante
dopado com boro (trabalho), platina (contra-eletrodo), ferroceno (referncia interna). A velocidade de
-1
varredura foi 50 mV s .
RESULTADOS E DISCUSSO
Figura 29. Voltamograma cclico das trans-isohumulonas em sua forma molecular, em acetonitrila
-1
contendo 0,2 mol L de perclorato de tetrabutilamnio como eletrlito suporte. Eletrodos: diamante
dopado com boro (trabalho), platina (contra-eletrodo), ferroceno (referncia interna). As velocidades
-1
-1
-1
-1
de varredura foram: a = 10 mV s ,b = 50 mV s , c = 100 mv s , d = 200 mV s .
RESULTADOS E DISCUSSO
4.4.
radical 1-hidroxietila.
RESULTADOS E DISCUSSO
Intens.
x107
5
P.1
(a)
0
0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
12.5
15.0
17.5
Intens.
x106
20.0
22.5
[M+H-C(CH3)3]
(b)
139.0
Time [min]
[M+H-C(CH3)3-H2O]
[M+H]
2
195.1
[M+H-C(CH3)3+
H2CNO]
95.1
[M+Na]
122.1
217.0
408.2
0
100
200
300
400
500
m/z
Figura 30. (a) Cromatograma de ons total dos produtos decorrentes da reao de formao do aduto
0
radical [4-POBN/CH(CH3)OH] sob atmosfera de O2. T = 25 C; t = 5 minutos. (b) Espectro de massas
(ESI(+)MS) do eluato em tr = 6 min referente espcie 4-POBN.
RESULTADOS E DISCUSSO
RESULTADOS E DISCUSSO
Intens.
x10 7
P.1
(a)
4
P.5
0
0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
12.5
15.0
17.5
20.0
Intens.
x105
22.5
Time [min]
2.0
(b)
[M+H]+
239.1
1.5
1.0
[M+H-C(CH3)3]+
0.5
[M+K]+
[M+H-C(CH3)3-H2O]+
165.0
0.0
[2M+Na-CH3CHOH]+
[M+Na]
183.0
100
[2M+Na]
[2M+H-CH3CHOH]+
261.1277.0
455.2
433.1
200
300
499.1
400
500
Intens.
x105
m/z
1.5
(c)
[M+H-NOC(CH3)3]
153.0
1.0
[M+H]
[2M+Na-CH3CHOH]+
240.1
0.5
[M+H-CH3CHOH+
C(CH3)3]
[4-piridil-1-xido]+
[M+H-CH3CHOH+
H2O]
[M+Na]+
[2M+H-CH3CHOH]
[2M+H]+
479.2
434.2
179.1
[M+K]+
138.0
96.1
456.2
262.0278.0
[2M+Na]
+
501.2
517.1[2M+K]
0.0
100
200
300
400
Intens.
x10 5
500
m/z
(d)
[M+H-2CH3CHOH-H2O]+
179.1
1.5
[M+H-2CH3CHOH-H2O-O]
1.0
[M+H-2CH3CHOH-H2O4-piridil-1-xido]+
[M+H]+
0.5
0.0
285.2
[M+H-2CH3CHOH147.1163.1
H2O-O-C(CH3)3]+
[M+Na]
307.1
[4-piridil-1- 107.1
+
xido] 96.1
100
[2M+Na]+
[2M+H]+ 591.3
[M+K]
323.1
569.3
200
300
400
500
m/z
RESULTADOS E DISCUSSO
(concluso da figura)
Intens.
x10 5
2.0
(e)
[M+H-2CH3CHOH-H2O]+
179.1
1.5
1.0
0.5
[M+H-2CH3CHOH-H2O-O]+
+
[M+H-2CH3CHOH-H2O+
4-piridil-1-xido]
[M+H-2CH3CHOHH2O-O-C(CH3)3]+
[M+H]
285.1
[M+Na]
[2M+Na]+
[M+K]+
147.1
163.1
107.1
591.3
[2M+H]+
323.1
[M+H-CH3CHOH]
307.2
569.3
241.1
501.2
0.0
100
200
300
400
500
m/z
Figura 31. (a) Cromatograma de ons total dos produtos decorrentes da reao de formao do aduto
0
radical [4-POBN/CH(CH3)OH] sob atmosfera de Ar. T = 25 C; t = 5 minutos. (b) Espectro de massas
(ESI(+)MS) com atribuio dos ons do eluato em tr = 7,9 min. (c) Espectro de massas (ESI(+)MS)
com atribuio dos ons do eluato em tr = 8,6 min. (d) Espectro de massas (ESI(+)MS) com atribuio
dos ons do eluato em tr = 9,2 min. (e) Espectro de massas (ESI(+)MS) com atribuio dos ons do
eluato em tr = 12,8 min.
tempos
de
reteno
bem
distintos,
apesar
de
apresentarem
2
+
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
Figura 32. Estruturas qumicas das quatro espcies formadas da reao entre 4-POBN e o radical
1-hidroxietila: (a) aduto oxidado; (b) aduto radical; (c) e (d) 4-POBN ligado a duas molculas do
radical 1-hidroxietil; (e) aduto reduzido.
RESULTADOS E DISCUSSO
(9,521 GHz) do aduto radical [4-POBN/CH(CH3)OH] obtido em soluo aquosa gua/etanol ( 5%) a
0
temperatura de 25 C.
RESULTADOS E DISCUSSO
RESULTADOS E DISCUSSO
Sem Catalase
Com Catalase
kobs (s-1)
1,6 10-3
9,0 10-4
t1/2 (s)
432
774
RESULTADOS E DISCUSSO
Figura 35. rea dos picos cromatogrficos referentes s espcies aduto oxidado, aduto radical
RESULTADOS E DISCUSSO
Esquema 7. Reao de formao das espcies aduto oxidado e 4-POBN ligado a duas molculas de
radical 1-hidroxietila.
RESULTADOS E DISCUSSO
* k2 * [4-POBN] = k2 * [IAA]
(1)
representado
pelos
iso--cidos,
um
grfico
(F/F-1)*k2*[4-POBN]
vs.
RESULTADOS E DISCUSSO
concentrao
do
composto
em
estudo
[IAA]
foi
construdo
obtendo
um
comportamento linear, no qual cada ponto da curva foi obtido a partir da mdia da
anlise em triplicata do aduto radical [4-POBN/CH(CH3)OH] para cada concentrao
do composto adicionado. Consequentemente, sabendo a concentrao da armadilha
qumica [4-POBN] e k2 (3,1 107 L mol-1 s-1)37, calculou-se as constantes de
velocidade aparente de segunda ordem (k2).
Como um todo, os compostos de interesse no estudo da reatividade com o
radical 1-hidroxietila englobaram em primeira instncia os iso--cidos e os
derivados dihidro-iso--cidos e tetrahidro-iso--cidos, dada a importncia na
qualidade sensorial da cerveja destes. Em uma segunda etapa, buscou-se avaliar a
reatividade de alguns fenis presentes tambm na cerveja. Adicionalmente, avaliouse a reatividade de cada diastereismeros cis- e trans-isocohumulonas, bem como
dos anlogos iso-n-humulonas e isocohumulonas, nas formas cis- e trans-, frente ao
radical de interesse, isolando os cidos amargos do lpulo atravs de um sistema
HPLC semi-preparativo.
Um estudo comparativo foi desenvolvido utilizando as tcnicas RPE e
ESI-(+)-MS/MS com o intuito de analisar a reatividade do radical 1-hidroxietila
perante os compostos em estudo. Desta forma, as reaes foram monitoradas por
estas duas tcnicas, sob as mesmas condies reacionais e instrumentais.
Da cintica de competio e pela anlise da Equao 1, sabe-se que o
coeficiente angular da reta fornece a constante de velocidade de interesse. A ttulo
de exemplificao, a Figura 36 apresenta o grfico obtido na cintica da reao
entre as trans-isohumulonas e o radical 1-hidroxietila.
RESULTADOS E DISCUSSO
Figura 36. Grfico (F/F-1)*k2*[4-POBN] vs. concentrao de trans-isohumulonas. Medidas obtidas por
espectrometria de massas (ESI-(+)-MS/MS e espectroscopia de ressonncia paramagntica de
o
eltrons (EPR). T = 25 C; 1 minuto de reao.
Um
estudo
inerente
reatividade
das
formas
naturais
RESULTADOS E DISCUSSO
EPR
(L mol-1 s-1)
ESI-(+)-MS/MS
(L mol-1 s-1)
trans-isohumulonas
9,7 109
8,6 109
cis-isohumulonas
1,8 108
1,7 108
isohumulonas
(cis- e trans-)
1,3 109
1,2 109
dihidro-isohumulonas
(cis- e trans-)
1,5 109
1,4 109
tetrahidro-isohumulonas
(cis- e trans-)
reao no observada
RESULTADOS E DISCUSSO
kobs =
RESULTADOS E DISCUSSO
Paralelamente, a reatividade das fraes 2 isoladas do sistema HPLC semipreparativo contendo os diastereoismeros, cis- e trans-iso--cidos, foi investigada
frente
radical
1-hidroxietila
utilizando-se
espectrmetro
de
massas
(ESI-(+)-MS/MS). Conforme mencionado no texto, estas fraes continham as iso-nhumulonas em considervel grau de pureza (95% para cis-iso--cidos e 85% para
trans-iso--cidos). Entretanto, no se testou a reatividade da frao 1 de cada
configurao devido ao fato destas apresentarem elevado grau de impurezas. Ainda,
interessante salientar que as iso-n-humulonas contidas nas fraes 2 esto
presentes em sua forma molecular, uma vez que os solventes de eluio utilizados
estavam acidificados com cido frmico (1 %), conforme pode ser constatado no
procedimento experimental.
Desta forma, de acordo com a Tabela 4, verifica-se que, de fato, as
constantes de velocidade aparentes obtidas utilizando os iso--cidos protonados
so estatisticamente iguais (p = 0,05) s constantes de velocidade aparentes
verificadas para estes compostos em sua forma desprotonada. Sendo assim, podese inferir que o mecanismo da reao em questo independe dos grupos
substituintes R (isobutila, isopropila, sec-butila).
8,7 109
cis-iso-n-humulonas
1,6 108
RESULTADOS E DISCUSSO
cis-
trans-
2,2
2,4
-0,2453
-0,2394
75,1
75,5
77,6
75,5
Neste contexto, atravs da leitura da Tabela 5, verifica-se que as transisohumulonas apresentam um maior dipolo eltrico que os diastereoismeros cis-,
sugerindo uma maior influncia do solvente nas reaes envolvendo as espcies
trans-. A Figura 37 apresenta as configuraes espaciais mais estveis para as
molculas dos iso--cidos, bem como uma representao vetorial dos momentos
de dipolo eltrico verificados.
RESULTADOS E DISCUSSO
(a)
(b)
Figura 37. Configurao espacial das cis-isohumulonas (a) e trans-isohumulonas (b), com os
respectivos momentos de dipolo eltrico.
Ainda,
constatou-se
que
conformao
cis-
mais
estvel
orbitais
moleculares
HOMO
para
as
estruturas
otimizadas
dos
RESULTADOS E DISCUSSO
(a)
(b)
Figura 38. Ilustrao dos orbitais moleculares ocupados de maior energia (HOMO) calculados para
os diastereoismeros cis- (a) e trans-isohumulonas (b).
RESULTADOS E DISCUSSO
%'(
&E
%'(
&E
2
2+
2+
2+
2+
(a)
(b)
Figura 39. Representao das ligaes C-H envolvidas na abstrao do tomo de hidrognio na
reao. (a) trans-isohumulonas; (b) cis-isohumulonas.
ocorre
no
mesmo
plano
espacial
enquanto
que
para
os
RESULTADOS E DISCUSSO
RESULTADOS E DISCUSSO
21
1
1
0
0
10
Time [min]
Figura 40. Espectro de on isolado 240,1 m/z decorrente da reao do radical 1-hidroxietila e 4-POBN
(pico 1), na presena de cido clorognico (pico 2) ou cido cafeico (pico 3). As injees foram
realizadas em batelada.
RESULTADOS E DISCUSSO
(9,521 GHz) do aduto radical [4-POBN/CH(CH3)OH] decorrente da reao controle (em preto), reao
processada na presena cido clorognico (em vermelho) e reao processada na presena do cido
o
cafeico (em azul). Os espectros foram obtidos a temperatura de 25 C.
RESULTADOS E DISCUSSO
RESULTADOS E DISCUSSO
RESULTADOS E DISCUSSO
Intens.
x10 7
Intens.
x106
1.5
1.50
1.25
1.00
(a)
0.75
0.50
0.25
1.0
17
18
19
20
21
22
T ime [min]
0.5
0.0
0
10
20
Intens.
x10 4
30
40
50
T im e [mi n]
[M-H]
(b)
363.1
5
1
191.0
395.0
0
100
200
300
Intens.
x10 4
8
400
[M-H]
500
600
700
800
m/z
377.1
(c)
-
[M-H-(H3C)2CHCO(H3C)2COHCHCHCO]-
279.0
0
100
200
300
400
500
600
700
800
m/z
Figura 42. (a) Cromatograma de ons total da soluo alcolica contendo as trans-isohumulonas (em
vermelho) e dos produtos decorrentes da reao das trans-isohumulonas e o radical 1-hidroxietila
0
(em azul),sob atmosfera de Ar, T = 25 C, t = 1 minuto de reao. (b) Espectro de massas (ESI(-)MS)
com atribuio do on do eluato em tr = 17,7 min. (c) Espectro de massas (ESI(-)MS) com atribuio
do on do eluato em tr = 21,5 min.
RESULTADOS E DISCUSSO
pelos
espectros
de
massas
referentes
fragmentaes
secundrias dos ons das molculas desprotonadas apresentados, 363 e 377 m/z,
contidos no Apndice C, no foi possvel inferir a estrutura qumica exata dos
compostos. Neste contexto, admissvel tanto a cadeia lateral conectada ao
carbono C4 quanto a cadeia lateral em C5 apresentar o grupo hidroxila adicionado.
Conforme j exposto no texto, constatou-se pelos clculos das entalpias de
dissociao das ligaes C-HCa e C-HCb que ambos os tomos de hidrognios
pertencentes aos grupos isohexenoila e prenila so suscetveis a serem abstrados.
Logo, pode-se inferir que o on 363 m/z referente a dois compostos derivados das
isocohumulonas, os quais um contm um grupo hidroxila adicionado cadeia lateral
em C4 - isohexenoila, sendo o outro composto resultante da adio de um grupo
hidroxila cadeia lateral conectada ao carbono C5 - prenila. O mesmo feito foi
verificado para os compostos decorrentes da degradao dos homlogos iso-nhumulonas e isoadhumulonas, os quais apresentam o on das molculas
desprotonadas [M-H]- 377 m/z.
RESULTADOS E DISCUSSO
14
RESULTADOS E DISCUSSO
CONCLUSES
5. CONCLUSES
de
quatro
produtos
decorrentes
da
reao:
aduto
radical
[4-POBN/CH(CH3)OH], [M+H]+ 240 m/z; aduto oxidado, [M+H]+ 239 m/z; e duas
espcies cujas estruturas so referente molcula do 4-POBN ligada a duas
molculas do radical 1-hidroetila, [M+H]+ 285 m/z. Ainda, constatou-se que as
espcies referentes aos ons 285 e 239 m/z esto provavelmente relacionadas s
reaes subsequentes envolvendo o aduto radical, a partir do consumo deste.
A partir das constantes de velocidade aparentes determinadas, referentes
reao entre o radical de 1-hidroxietila e os iso--cidos, naturais e sintticos,
verificou-se que as tcnicas espectroscopia de ressonncia paramagntica de
eltrons (RPE) e espectrometria de massas (ESI-(+)-MS/MS) foram equivalentes
(p = 0,05) para esta finalidade. Neste contexto, constatou-se uma maior reatividade
por parte dos diastereoismeros trans- (~ 9,2 109 L mol-1 s-1), sendo as espcies cismenos reativas frente ao radical 1-hidroxietila (~ 1,8 108 L mol-1 s-1). Em suma,
verificou-se que a reao entre os iso--cidos e o radical 1-hidroxietila ocorre
preferencialmente via abstrao de tomo de hidrognio allico pertencentes aos
grupos laterais prenila e isohexenoila, em ambos os diastereoismeros cis- e trans
CONCLUSES
reatividade
apresentada
pelos
iso--cidos,
as
dihidro-
proporo
cis-/trans-.
Todavia,
os
derivados
hidrogenados
das
CONCLUSES
REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
20. HUVAERE, K.; OLSEN, K.; ANDERSEN, M. L.; SKIBSTED, L. H.; HEYERICK,
A.; DE KEUKELEIRE, D. Riboflavin-sensitized photooxidation of isohumulones and
derivatives. Photochemical & Photobiological Sciences, v. 3, p. 337-340, 2004.
21. HEYERICK, A.; HUVAERE, K.; DE KEUKELEIRE, D.; FORBES, M. D. E. Fate of
flavins in sensitized photodegradation of isohumulones and reduced derivatives:
studies on formation of radicals via EPR combined with detailed product analyses.
Photochemical & Photobiological Sciences, v. 4, p. 412-419, 2005.
22. HUVAERE, K.; SINNAEVE, B.; BOCXLAER, J. V.; DE KEUKELEIRE, D.
Photooxidative degradation of beer bitterng principles: product analysis with respect
to lightstruck flavour formation. Photochemical & Photobiological Sciences, v. 3,
p. 854-858, 2004.
23. LUSK, L. T.; MURAKAMI, A.; NIEKSEN, L.; KAY, S.; RYDER, D. Beer
Photooxidation creates two compounds with aromas indistinguishable from 3-methyl2-butene-1-thiol. Jorunal of the American Society of Brewing Chemists, v. 67, p.
189-192, 2009.
24. KUNIMUNE, T.; SHELLHAMMER, T. H. Foam-stabilizing affects and cling
formation patterns of iso--acids and reduced iso--acids in lager beer. Journal of
Agricultural and Food Chemistry, v. 56, p. 8629-8634,.2008.
25. ANDERSEN, M. L.; SKIBSTED, L. H. Electron spin resonance spin trapping
identification of radicals formed during aerobic forced aging of beer. Journal of
Agricultural and Food Chemistry, v. 46, p. 1272-1275, 1998.
26. FREDERIKSEN, A. M.; FESTERSEN, R. M.; ANDERSEN, M. L. Oxidative
reactions during early stages of beer brewing studied by electron spin resonance and
spin trapping. Journal of Agricultural and Food Chemistry, v. 56, p. 8514-8520,
2008.
27. ELIAS, R. J.; ANDERSEN, M. L.; SKIBSTED, L. H.; WATERHOUSE, A. L.
Identification of free radical intermediates in oxidized wine using electron
paramagnetic resonance spin-trapping. Journal of Agricultyre and Food
Chemistry, v. 57, p. 4359-4365, 2009.
28. BARREIRO, J. C.; CAPELATO, M. D.; MARTIN-NETO, L.; HANSEN, H. C. B.
Oxidative decomposition of atrazine by a fenton-like reaction in a H2O2/ferrihydrite
system. Water Research, v. 41, p. 55-62, 2007.
REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
APNDICE
APNDICE A
Intens.
x10 5
239 m/z
1.5
CID
183.0
1.0
165.0
0.5
221.0
0.0
100
200
300
400
500
m/z
Figura A1. Espectro de massas por CID do eluato em tr = 7,9 min do cromatograma ilustrado na
Figura 31a.
Intens.
x10 4
240 m/z
CID
179.0
153.0
96.0
138.0
196.0
0
100
200
300
400
500
m/z
Figura A2. Espectro de massas por CID do eluato em tr = 8,6 min do cromatograma ilustrado na
Figura 31b.
Intens.
x10 4
1.2
285 m/z
179.0
1.0
CID
0.8
0.6
0.4
163.0
0.2
107.0
123.0
241.1
147.0
0.0
100
200
300
400
500
m/z
Figura A3. Espectro de massas por CID do eluato em tr = 9,3 min do cromatograma ilustrado na
Figura 31c.
APNDICE
Intens.
x10 5
2.0
285 m/z
179.0
CID
1.5
1.0
241.1
163.1
0.5
107.0123.0
147.0
0.0
100
200
300
400
500
m/z
Figura A4. Espectro de massas por CID dos ons do eluato em tr = 13,0 min do cromatograma
ilustrado na Figura 31d.
APNDICE
APNDICE B
d[H3CHCOH]
= k2 * [4-POBN] * [H3CHCOH]
dt
d[H3CHCOH]
dt
= k2 * [IAA] * [H3CHCOH]
(3)
(4)
APNDICE
* k2 * [4-POBN] = k2 * [IAA]
APNDICE
APNDICE C
Intens.
363 m/z
6000
CID
293.0
275.0
345.0
4000
179.0
205.9
2000
231.0
317.0
0
100
200
300
400
500
600
700
800
m/z
Figura C1. Espectro de massas por CID do on 363 m/z referente ao eluato em tr = 17,8 min do
cromatograma ilustrado na Figura 42a.
Intens.
x10 4
3.0
377 m/z
2.5
CID
293.0
2.0
1.5
275.0
1.0
0.5
179.0
206.0
359.0
231.1
0.0
100
200
300
400
500
600
700
800
m/z
Figura C1. Espectro de massas por CID do on 377 m/z referente ao eluato em tr = 21,5 min do
cromatograma ilustrado na Figura 42b.