LA BIOLOGA MOLECULAR Y EL ADN

MOLECULAR BIOLOGY AND THE DNA

REINALDO VELASCO MOSQUERA1

PALABRAS CLAVE:

RESUMEN

ADN, enzimas de restriccin, marcadores moleculares, PCR, diversidad gentica.

El presente Artculo es una descripcin de los aspectos ms importantes

que se conocen del ADN desde que Watson y Crick presentaron su modelo
estructural y de la simultnea evolucion de la biologa molecular, aspectos
que han permitido conocer el comportamiento de esta molcula tan esencial para la vida y cmo ella ha servido para resolver problemas en diferentes
campos como el de la crimi-nalistica y en estudios de diversidad gentica
especialmente a partir del decubrimiento de las enzimas de restriccin y los
denominados marcadores moleculares, la PCR (Reaccin en Cadena de la
Polimerasa) y otras tcnicas basadas en ella, las cuales emplean el concepto
de ADN polimorfico.

KEY WORDS:
DNA, restriction enzymes, molecular markers, PCR, genetic
diversity.

ABSTRACT
This article is a description of the most important aspects that are known of
the DNA since Watson and Crick presented its structural model and of the
simultaneously evolution of the molecular biology, aspects that have allowed
to know the behavior of this molecule so essential for the life and how she
has been good to solve problems in different fields like that of the judicial
camp and in studies of genetic diversity especially since the discovery of
the restriction enzymes and the denominated molecular markers, the PCR
(Polimerase Chain Reaction) and other techniques based on her, which use
the concept of polimorphic DNA.

____________
Recibido para evaluacin: Diciembre 1 de 2003. Aprobado para publicacin: 27 de febrero de 2004.
1

MSc., Especialista en Biotecnologa, Profesor Asociado Departamento de Agroindustria,

Grupo de Investigacin ASUBAGROIN FCA Unicauca

Correspondencia: Reinaldo Velasco Mosquera. , e_mail: rvelasco@unicauca.edu.co

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INTRODUCCION
La Biologa molecular es la ciencia que se ocupa del
estudio de las bases moleculares de la vida; es decir,
relaciona las estructuras de las biomolculas con las
funciones especficas que desempean en la clula y
en el organismo. Por tanto su objetivo fundamental es la
comprensin de todos aquellos procesos celulares que
contribuyen a que la informacin gentica se transmita
eficientemente de unos seres a otros y se exprese en los
nuevos individuos. Para ello requiere de la secuenciacin
de los cidos nucleicos, del diagnstico molecular, de la
produccin de fragmentos de cidos nucleicos a gran
escala, entre otras disciplinas (1).

EL ADN
La presentacin del modelo estructural del cido
desoxirribonucleico (ADN) por Francis Harry Comton
Crick y James Dewey Watson en 1953, fue el verdadero inicio de la biologa molecular. La importancia de
este hecho se debe, por un lado a que es la molcula
que transmite la informacin hereditaria de generacin
en generacin, y por otro a que la propia estructura
muestra cmo lo logra.
La qumica de la molcula de ADN tiende a ser ms
bien simple, considerando la enorme cantidad de informacin almacenada y su misin trascendental en la
clula. Es una molcula de doble cadena de nucletidos, arreglados en forma antiparalela y complementaria, unidas entre s por puentes de hidrgeno
entre los nucletidos: adenina (A), guanina (G), citosina
(C) y timina (T). La A de una cadena se aparea siempre
con la T de la cadena complementaria mediante dos enlaces de hidrgeno, y la G con la C mediante tres enlaces de
hidrgeno. Los puentes de hidrgeno ocurren entre un
tomo de hidrgeno enlazado con un tomo
electronegativo (O, C, N) y un segundo tomo
electronegativo. Los puentes de hidrgeno tienen una
energa de estabilizacin de 10-30 kJ/mol (2).
Durante la replicacin o duplicacin, las dos hebras
simples se separan y cada una de ellas forma una nueva hebra complementaria, incorporando bases, la A se
unir a la T de la hebra molde, la G lo har con la C y as
sucesivamente. De esta manera se obtiene otra molcula de ADN, idntica a la original y por tanto, el mate-

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rial gentico se ha duplicado. Este material incluye toda

la informacin necesaria para el control de las funciones vitales de las clulas y del organismo.
Durante la divisin celular, las dos clulas hijas reciben igual dotacin gentica; de este mismo modo se
reparte el material hereditario a la descendencia, cuando
se reproduce un organismo.
Cada nucletido est formado por una molcula de
azcar desoxirribosa (no posee O en el sitio 2, nicamente un H), una base orgnica nitrogenada
(pirimidinas, como en el caso de la citosina y la timina,
o purinas, como en el caso de la adenina y la guanina)
y un grupo fosfato.
Los nucletidos se enlazan entre s por enlaces
covalentes fosfodiester entre el grupo fosfato ubicado
en el sitio 5 con el grupo OH ubicado en el sitio 3 del
nucletido anterior. El enlace covalente es una unin
en la cual dos electrones son compartidos por dos
tomos. En este tipo de enlace, cada electrn del par
compartido es atrado por los ncleos involucrados
en el enlace, lo cual hace que sea un enlace muy fuerte, que dependiendo del tipo de tomos involucrados
puede tener una energa desde los 263 kJ/mol para un
enlace C-P hasta 460 kJ/mol para un enlace O-H (2).
Esto hace que la molcula de ADN sea particularmente
estable en condiciones tanto intra como extracelulares.
Los enlaces covalentes que unen a cada subunidad de
nucletido son qumicamente estables y no son susceptibles de experimentar ruptura hidroltica en el medio acuoso de la clula. Esto establece una forma segura y duradera de almacenamiento de la informacin
gentica, que no debe alterarse ni daarse de generacin en generacin. Es por esta razn que se ha extrado ADN de especimenes de museo y muestras arqueolgicas de varios millones de aos (3).
La cadena orientada en el sentido 5 3 recibe el nombre de codificante porque es la que tiene la informacin y la cadena antiparalela que va en el sentido 3
5 el de cadena molde, porque es en esta cadena en la
que se hibridiza el ARN. Una vez terminada una cadena, en el extremo 5 queda un grupo fosfato y en el
extremo 3 un grupo OH.
Esta disposicin lleva las bases orgnicas al interior
de la doble hlice. Las bases adyacentes de la misma

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hebra se apilan unas sobre otras (como peldaos de

una escalera en espiral), esto permite la formacin de
interacciones hidrofbicas, en las que la presencia de
agua obliga a los grupos no polares a distribuirse ordenadamente para evitarla, las cuales tienen una energa de estabilizacin de 5-30 kJ/mol, e interacciones
de van der Waals, formadas entre molculas con
dipolos transitorios inducidos por fluctuacin de electrones, ocurriendo entre cualquier par de tomos que
esten muy cercanos, estas ultimas tienen una energa
de stabilizacin de 1-5 kJ/mol (2).
El lenguaje empleado para almacenar la informacin en
el ADN consiste en el alfabeto de las cuatro letras: A, T,
G y C. El formato para almacenarla es una secuencia
lineal de los nucletidos en ADN que vara en tamao y
secuencia con cada especie. Por ejemplo, el genoma
humano completo tiene 1 metro de longitud y contiene
un nmero estimado de 3 mil millones de pares de
nucletidos. Una molcula de ADN de E. Coli mide cerca de 2 cm de largo y contiene alrededor de 4 millones
de pares de nucletidos.

LA BIOLOGIA MOLECULAR
Podra parecer que purificar molculas de ADN es tarea
fcil, sin embargo en la prctica es bien difcil conseguir una molcula bien definida de ADN natural de cualquier organismo, excepto los virus ms simples. Esto
se debe a la gran complejidad que presenta esta molcula, la cual como ya se dijo es una cadena compuesta
de desoxinucletidos normalmente apareada con otra
cadena con secuencias complementarias formando hlices dobles, las cuales a su vez estn enrolladas y rodeadas de protenas diversas (4).
Cuando los bilogos moleculares intentan aislar una
cadena de ADN desnuda, esta es tan larga y delgada
que se rompe aleatoriamente en mltiples pedazos hasta con el tratamiento ms suave. Por esta razn la extraccin de ADN que se haga de mltiples clulas idnticas,
as mismo producir mltiples copias de cualquiera de
los genes de dicho ADN, pero cada copia se hallar en
un fragmento de distinta longitud.
Durante muchos aos este problema fue un obstculo para el estudio de los genes. En los aos sesenta
se descubrieron las restrictasas (endonucleasas de
restriccin), enzimas que cortan las cadenas de ADN

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en sitios especficos, permitiendo cortar el ADN en

fragmentos menores, ms consistentes e identificables, por lo cual es ms fcil aislar los fragmentos
que por tan el gen que interesa a los bilogos
moleculares (4).
Aunque la Ciencia posea las herramientas necesarias
para el estudio del ADN, su aplicacin en la resolucin
de casos judiciales solo se produjo hasta 1985, cuando
el Ministerio del Interior Britnico solicit la ayuda de
Alec J. Jeffreys, profesor de Gentica de la Universidad
de Leicester. Los primeros casos de Criminalstica fueron resueltos gracias a la tcnica de los RFLPs
(Polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restriccin). Jeffreys descubri la existencia de unas regiones minisatlites hipervariables dispersas por el
genoma humano que al ser tratadas con enzimas de
restriccin generaban fragmentos de longitud variable.
Estudios posteriores realizados por el mismo Jeffreys
demostraron que las diferencias en el tamao de estos
fragmentos se deban a que estas regiones consistan
en un determinado nmero de repeticiones en tndem
de una secuencia central, la cual variaba de unos individuos a otros (1).
El primer locus de ADN polimrfico fue descubierto por
Wyman y White en 1980 usando una sonda de ADN
arbitraria. De esta manera observaron fragmentos de
ms de 15 longitudes diferentes en una pequea muestra de individuos. Posteriormente se encontraron otros
loci hipervariables como en la secuencia del gen de la
insulina humana, en el oncogen ras, en el pseudo
gen de la zeta-globina y en el gen de la mioglobina.
Estos loci hipervariables constaban de repeticiones en
tndem de una secuencia de oligonucletidos (11 a 60
pb), de manera que las diferentes longitudes de los fragmentos originados dependan del nmero de dichas
repeticiones y se les denomin VNTR (Variable Number
of Tandem Repeat).
Tras el descubrimiento de los primeros VNTRs se observ que stos podan ser aplicados a la medicina
forense y sustituir a los marcadores clsicos, que consistan en el estudio de antgenos eritrocitarios (sistema
ABO, Rh, MN), protenas sricas, enzimas eritrocitarias
y sistema HLA. Con el estudio de dichos marcadores
poda incluirse o excluirse una persona como posible
sospechoso por poseer una combinacin gentica igual
o diferente a la del vestigio biolgico hallado en el lugar
de los hechos.

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En un principio la manera de estudiar los marcadores

VNTRs se hizo por medio de la tcnica llamada hibridacin con sondas o Southern blot. Esta tcnica consta
bsicamente de las siguientes etapas (1):
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.

8.

Digestin del ADN con enzimas de restriccin tras

conseguir extraer un ADN de alta molecularidad.
Separacin de los fragmentos obtenidos por medio de una electroforesis en gel de agarosa.
Desnaturalizacin de los fragmentos separados y
cortados.
Transferencia de las cadenas simples a una membrana de nitrocelulosa o nylon y fijacin de las
mismas por medio de calor (80C).
Prehibridacin con sondas de ADN inespecfico
para bloquear los lugares de unin inespecficos
que pudiera haber en la membrana.
Marcaje de la sonda con nucletidos radioactivos
(32P normalmente).
Hibridacin de la sonda marcada y desnaturalizada con los fragmentos de ADN fijados a la membrana, y lavado de la membrana para eliminar el
exceso de sonda o aquellas que hayan hibridado
mal.
Revelado en placa radiogrfica e interpretacin de
los resultados.

Informacin aportada: las sondas multi-locus tienen una

mayor capacidad discriminativa al aparecer mltiples
bandas. No obstante, las mono-locus son ms especficas ya que el fragmento de ADN con el que hibridan es
de mayor tamao.
Cantidad y calidad del ADN: cuando se usan sondas
multi-locus se requiere aproximadamente un
microgramo de ADN sin degradar mientras que en el
caso de las mono-locus se necesita menos de 100 ng y
este ADN no necesariamente debe estar en perfecto estado, siempre y cuando el fragmento complementario a
la sonda est intacto.
Especificidad entre especies: las sondas multi-locus
permiten su uso sobre el ADN humano y de cientos de
animales superiores, mientras que las mono-locus son
exclusivas de una especie, se ha utilizado con frecuencia en humano.
A pesar de que el anlisis SLP ha sido y es bastante
til en estudios de paternidad no puede decirse lo mismo de su aplicacin a la Criminalstica ya que presenta
una serie de inconvenientes como son:

Las sondas utilizadas pueden ser de dos tipos:

Sondas Mono-locus (SLP): son especficas para

una regin de un determinado cromosoma. Se
unen a secuencias largas de nucletidos y presentan mayor variabilidad que las sondas multilocus. Como resultado se observan una o dos
bandas por individuo, segn sea homocigoto o
heterocigoto. El patrn de bandas obtenido con
estas sondas se denomina perfil unilocus de ADN
o DNA profiling
Sondas Multi-locus (MLP): hibridan con secuencias minisatlites presentes en varios loci de diferentes cromosomas. Son sondas de 10 a 15
nucletidos que se repiten mltiples veces y tras el
revelado se observan de 10 a 20 bandas por
persona. Este patrn de mltiples bandas se conoce como huella gentica multilocus o DNA
fingerprint.

Las sondas multi y mono-locus presentan una serie de

ventajas e inconvenientes con respecto a una serie de
parmetros como son:

La cantidad de ADN que se necesita est entre 20 y

100 ng, cantidad difcil de conseguir en casos de
criminalstica en los que los indicios biolgicos
encontrados son mnimos.
En cuanto a la calidad del ADN, en la prctica
forense es muy difcil encontrar en estado no degradado toda la cantidad de ADN que se necesita
para un anlisis con sondas mono-locus.
El tiempo requerido para este tipo de anlisis es de
dos o tres das.
El hecho de que se requieran cantidades elevadas
de ADN hace que normalmente, con el primer anlisis se consuma la totalidad de la muestra, con lo
que se dificultan contra pericias y una posterior
revisin del caso.

LA PCR
Kary B. Mullis, quien trabajaba desde 1979 en Cetus
Corporation, de Emeryville, California, dice que: saba que una tcnica que permitiese fcilmente identificar el nucletido presente en una posicin determinada de una molcula de ADN sera muy til, sobre todo
en los casos de gran complejidad del ADN y con pe-

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quea cantidad disponible de esta molcula. No vea

por qu no se poda utilizar la enzima polimerasa de
ADN en una variante del mtodo de secuenciacin con
ddNTPs y dise un cndido experimento para someter esa idea a comprobacin. Pasaron meses mientras
preparaba mi primer experimento para comprobar si la
PCR (Reaccin en Cadena de la Polimerasa) funcionaba. Cuando estuvo todo listo, acomet mi tipo favorito
de experimento: el que slo necesita un tubo de ensayo y en el que la respuesta es positiva o negativa. Multiplicara la PCR la secuencia de ADN seleccionada? La
respuesta fue s (4).
La reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) se
volvi rpidamente una de las tcnicas ms ampliamente usadas en biologa molecular por una
buena razn: es rpida, es un medio relativamente
barato y simple de producir cantidades relativamente grandes de copias de ADN a par tir de cantidades
muy pequeas de molculas de material de ADN,
incluso si la fuente de ADN es de relativamente
pobre calidad.
Las tcnicas basadas en PCR emplean el concepto
de polimorfismo o de ADN polimorfico: poli =
muchas; mrfico = formas. Y se refiere a que
existen secuencias de ADN que son relativamente
variables entre diferentes individuos o especies.
Algunas regiones de ADN dentro de un genoma pueden ser sumamente conservados (no variar) entre
los individuos de una especie o entre especies de
una misma familia. Ese ADN conservado no ser
til para la utilizacin de mtodos analticos que
emplean el ADN para encontrar diferencias entre los
individuos.
Alternativamente, algunos de los intervalos de ADN
dentro del genoma tienden a variar moderada o extremadamente entre los individuos. Estos intervalos variables de ADN sern ms informativos al usar
el ADN para distinguir a los individuos uno de otro
o para distinguir las especies una de otra.

APLICACIONES
La identificacin con ADN o huella gentica se basa
en el estudio de una serie de fragmentos de ADN pre-

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sentes en todos los individuos, pero que poseen la

caracterstica de ser altamente variables o
polimrficos entre los mismos.
El anlisis de un determinado nmero de estas secuencias o fragmentos de ADN permite inclusive identificar a un ser humano con una probabilidad muy
cercana al 100%. Adems de ser muy poli-mrfico,
el ADN que se utiliza para este tipo de identificaciones, es un ADN no codificante o no expresivo, por lo
que no revela caractersticas feno-tpicas de los individuos; este hecho es de gran importancia a la hora
de considerar la creacin de las bases de datos
genticas (5).
Para analizar dichos polimorfismos del ADN se utilizan una serie de tcnicas que estn en continua evolucin, consiguiendo que cada vez la identificacin
por medio del ADN sea ms precisa y rpida.
Se parte entonces de unas regiones del ADN que presentan variabilidad entre los distintos individuos, es
decir, de regiones polimrficas del ADN. As, analizando un determinado nmero de regiones
polimrficas, la probabilidad de que dos individuos
sean genticamente iguales es prcticamente nula
(excepto en el caso de gemelos univitelinos).
El estudio de indicios biolgicos por PCR ha permitido la resolucin de un gran nmero de casos en
Criminalstica que hasta entonces eran desestimados
por no poseer la suficiente cantidad de muestra para
su anlisis por RFLP. Con el uso de la PCR muestras
tan mnimas como pueden ser un pelo con raz, una
minscula mancha de sangre o semen e incluso caspa son suficientes en muchos casos para llevar a cabo
un anlisis de identificacin gentica (1).
En estudios de diversidad gentica se emplean tanto
la PCR como una serie de tcnicas basadas en ella.
Hoy en da estas tcnicas son muy empleadas, no
obstante no hay una comprensin adecuada de los
principios que rigen estas tcnicas, ni el papel que
desempean los reactivos qumicos empleados en
su ejecucin. En un prximo artculo se presentar
una revisin bibliogrfica acompaada de un anlisis terico de lo biolgico, lo qumico y las probabilidades, para compendiar esta informacin que est
diseminada en diferentes textos y artculos cientficos.

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REFERENCIAS
(1) Entrala C. BIOTECNOLOGIA. Laboratorio de ADN
forense, Depto. de Medicina Legal. Universidad
de Granada, Espaa. 2000.
(2) Chang R. QUIMICA. Cuarta edicin. McGraw
Hill. Mxico. 1992.
(3) Moore S., Sargeant L.L., King T.J., Mattick J.S.,
Hetzel D.J., THE CONSERVATION OF

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DINUCLEOTIDE MICROSATELLITES AMONG

MAMMALIAN GENOMES ALLOWS THE USE OF
HETEROLOGOUS PCR PRIMER PAIRS IN
CLOSELY RELATED SPECIES. Mammalian
Genome 3,452-456. 1991.
(4) Mullis K.B., THE POLYMERASE CHAIN
REACTION, Birkhauser, Boston 1994
(5) Cornide M.T., DIVERSIDAD GENETICA Y MARCADORES MOLECULARES. CNIC, La Habana, 2000