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Direction Gnral de lAlimentation

Laboratoire national de la
Protection des vgtaux

LABORATOIRE DE REFERENCE

Sous-direction de la Qualit et de la Protection des Vgtaux

METHODE OFFICIELLE

M
Vgtal : platane (Platanus spp.),
Dtection de
Ceratocystis platani
par pigeage biologique

Laboratoire de mise au point


Station de Mycologie
Domaine de Pixrcourt
BP 90059
54220 MALZEVILLE

Rf. : MF/97/09 version b

Laboratoire de rfrence : Laboratoire national de la protection des vgtaux


MF/97/09 version b
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Revue
Les mthodes de dtection publies au bulletin officiel sont revues priodiquement en fonction des priorits
dfinies par le sous directeur de la qualit et protection des vgtaux.

Modification
Les modifications des mthodes officielles peuvent tre effectues en tant que de besoin, elles sont
numrotes et dates sur chaque mthode.

Distribution
Les mthodes de dtection publies au bulletin officiel de la rpublique franaise par la Sous Direction de
la Qualit et Protection des Vgtaux sont les mthodes de rfrence utilises dans le cadre des analyses
officielles. Elles sont disponibles sur le site Internet du Ministre de lagriculture et de la pche
(www.agriculture.gouv.fr).

Limite de responsabilit :
La publication dune mthode de dtection propose par le laboratoire de rfrence ou le LNPV est de la
responsabilit du Sous-Directeur de la Qualit et de la Protection des Vgtaux.
La Sous-Direction de la Qualit et de la Protection des Vgtaux, le laboratoire de rfrence ou le LNPV
ne peuvent en aucun cas tre ports responsables des conditions dutilisation de cette mthode dans le
cadre des analyses de routine effectues dans les laboratoires utilisateurs.

Manipulation des organismes de quarantaine :


Les organismes phytopathognes de quarantaine sont lists dans la directive 2000/29 modifie pour lUnion
Europenne et de nombreux autres pays. En France, en application du code rural, leur dtention et leur
manipulation exigent des prcautions en terme de confinement et sont soumis autorisation prfectoral
pralable. Les laboratoires manipulant ces organismes doivent sassurer quils respectent toutes les
exigences rglementaires les concernant.

Management de la qualit :
Les laboratoires doivent tablir un systme de management de la qualit conforme aux exigences de la
norme ISO/CEI 17025 et notamment en ce qui concerne les exigences gnrales concernant la comptence
des laboratoires dtalonnages et dessais

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Sommaire
1- Introduction 4
2- Objet .4
3- Domaine dapplication .4
4- Dfinitions ..5
5- Principe .5
6- Consommables et produits .5
7- Matriel..6
8- Echantillonnage et chantillon ...6
8.1 Echantillonnage ..6
8.2 Prparation de lchantillon pour analyse .6
9- Mode opratoire ....6
9.1 Prise danalyse ..6
9.2 Mise en place des contrles .. 6
9.2.1 Tmoin ngatif de processus .6
9.2.2 Tmoin positif de processus ..6
9.3 Mise en pratique ...7
9.3.1 Prparation du matriel et consommables ..7
9.3.2 Mise en place des chantillons ..7
9.3.3 Incubation ..7
9.4 Observation ...7
9.5 Expression des rsultats .7
9.5.1 Lecture des rsultats 7
9.5.2. Validation de lanalyse ...8
9.5.3. Interprtation des rsultats 8
9.5.4. rapport dessai .8
10. Schma du mode opratoire ..9
11. Rfrences bibliographiques .9
12. Annexes 10-13

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VEGETAL : PLATANE (PLATANUS SPP.),


DETECTION DE Ceratocystis platani
PAR PIEGEAGE BIOLOGIQUE

Avertissements et prcautions de scurit


Dcontamination des restes de lchantillon aprs analyse, en chaleur humide par passage
lautoclave pression de vapeur au moins 20 minutes 121C ou par tout autre traitement permettant
dobtenir un rsultat quivalent.
Dsinfection du matriel recyclable (verrerie, rpartiteur, ) soit par strilisation dans les conditions
prcdentes (si le matriel le supporte) soit par trempage dans une solution dhypochlorite de Sodium ou
deau de Javel, dilue et titre au moins 1% de Chlore actif, au minimum 10 minutes, ou par tout autre
moyen permettant darriver un rsultat quivalent .
limination de tous les diffuseurs et tuyaux du dispositif d'aration la fin de lanalyse.
1. Introduction
Le champignon Ceratocystis platani (Walter) Engelbrecht et Harrington (synonyme : Ceratocystis
fimbriata Ellis et Halsted f.sp. platani Walter, synonyme : Endoconidiophora fimbriata (Ellis et Halsted)
Davidson f.sp. platani Walter), agent du chancre color du platane, est un ascomycte de lordre des
ophiostomatales. Sa forme imparfaite (stade conidien) est Chalara sp.
Les platanes (Platanus spp.) sont les seuls htes de cette forme spcifique.
Ceratocystis platani (Walter) Engelbrecht et Harrington est un agent de trachomycose (dgnrescence
du systme vasculaire) provoquant de graves dprissements et entranant rapidement la mort des
arbres (3 7 ans). Les arbres atteints sont priori reconnaissables par leur feuillage clairsem et
jauntre, ainsi que le dprissement dune ou plusieurs branches.
Le champignon se manifeste sous forme de lsions de lcorce, reconnaissables leur aspect de
flamches de couleur bleu-noir ou violette sur le tronc et les branches. Il pntre obligatoirement par des
blessures et gagne lintrieur de larbre par les rayons ligneux et les vaisseaux.
Le parasite est principalement vhicul par les outils infects soit loccasion dlagages, soit lors de
travaux de terrassement. La dissmination peut galement seffectuer par lintermdiaire des eaux de
canaux et de rivire, par simple contact racinaire et partir de tissus vgtaux infects morts.
Conformment aux exigences sanitaires des vgtaux ou produits vgtaux, Ceratocystis platani est
considr comme un organisme de quarantaine (Annexe II, partie II : Organismes nuisibles prsents
dans la communaut et importants pour toute la communaut sils se trouvent sur certains vgtaux ou
produits vgtaux ). La lutte contre ce champignon concerne les vgtaux de Platanus, destins la
plantation, lexception des semences, et les bois de Platanus, y compris celui qui na pas gard sa
surface ronde naturelle.

2. Objet
Cette mthode qualitative s'applique la dtection de Ceratocystis platani. Elle est utiliser pour les
analyses officielles notamment dans le cadre des contrles phytosanitaires rglementaires pour les
parasites de quarantaine en surveillance du territoire et l'importation.
Seuls les laboratoires remplissant les conditions pour lintroduction ou la circulation de certains
organismes nuisibles pour des travaux des fins dessais (Directive 2008/61/CE) peuvent maintenir et
manipuler des champignons de quarantaine ou rglements vivants et cela dans des strictes conditions
de quarantaine.

3. Domaine d'application
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La mthode par pigeage biologique (Grosclaude et al. (1988)) permet de dtecter C. platani :
 dans des chantillons collects sur arbre en place , de prfrence en bordure de lsions,
lendroit o le champignon est le plus actif:
- soit laide dune tarire de type Pressler (carottes de bois)
- soit par tout autre moyen permettant un prlvement quivalent (copeaux de bois )
 dans tout autre matriel susceptible dhberger le champignon (dbris darbres dprissant ou
morts, sciure, eau, terre, etc. .....).

4. Dfinitions
Cellule conidiogne : cellule qui produit une ou plusieurs conidies.
Endoconidie : spore asexue (= conidie) dj forme l'intrieur de la cellule conidiogne.
Prithce : fructification (souvent globuleuse) contenant asques et ascospores, issue de la reproduction
sexue.
Ascospores : spores rsultant d'un processus de reproduction sexue toujours formes dans un sac
appel asque qui s'ouvre maturit pour les librer.

5. Principe
Le principe de la mthode consiste utiliser une bchette de bois de platane sain, que l'on corce avant
de la mettre en contact avec le matriel tester dans un milieu liquide ar. La bchette de platane sain
joue le rle de pige spcifique vis vis du champignon ventuellement prsent dans le matriel
tester (cf. Paragraphe 7- Annexe 3).

6. Consommables et produits
6.1. Bchettes provenant de platane sain- de diamtre de 5 15 mm environ- de longueur peu prs
quivalente la hauteur du rcipient utilis.
Un lot de bchettes homogne correspond des tronons dbits dans un ou plusieurs rameaux
prlevs le mme jour, sur le mme arbre.
A leur arrive au laboratoire, les rameaux sont stocks dans un rfrigrateur (ou une chambre
froide), une temprature de 5 3C. Les extrmits des rameaux sont protges pr alablement
par un film plastique de type Parafilm afin dempcher le desschement du vgtal. Une
tiquette portant la rfrence du lot (anne- numro dordre chronologique) et date de prlvement
est appose sur le conditionnement contenant les rameaux. Un contrle visant vrifier leur
fracheur est effectu avant utilisation (le phlome doit tre encore vert).
6.2. Ethanol 70% [Produit inflammable, maintenir loign des sources de chaleur et des
flammes nues].
6.3. Eau distille ou osmose ou eau de source.
6.4. Acide lactique ou solution de bleu de mthyle environ 0,5% dans de lacide lactique.
6.5. Eau de Javel ou solution dhypochlorite de sodium (NaOCl), 1% de Chlore actif minimum
[Produits corrosifs manipuler avec prcautions].
6.6. Coton, papier absorbant.
6.7. Vernis ongle ou baume du Canada (conservation de lames).
6.8. Film plastique de type Parafilm.

7. Matriel
7.1. Dispositif d'aration avec tuyaux avec ou sans diffuseurs (type aquarium).
7.2. Rcipient de type Erlenmeyer ou bocal dune contenance minimale de 200 ml
7.3. Aiguilles de prlvement.
7.4. Lames et lamelles pour montage microscopique et scotch
7.5. Loupe binoculaire (minimum x25).
7.6. Microscope photonique (grossissement 20 1000) avec micromtre ou tout autre systme
permettant la mesure des lments observs..
7.7. Autoclave pression de vapeur permettant datteindre une temprature de 121 pendant au moins
20 minutes ou tout autre traitement permettant dobtenir un rsultat quivalent.
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7.8. Brleur alcool ou tout autre matriel permettant la strilisation daiguilles la flamme.
7.9. Pompe air.
7.10. Rpartiteurs en mtal ou en plastique.
7.11. Anti-retour pour pompe air (ncessaire si la pompe air est plac en dessous du niveau de leau).
7.12. Rfrigrateur (T= 5 3C) ou chambre froide.
7.13. Recommandation : Poste de travail en conditions striles (poste de scurit microbiologique, )

8. chantillonnage et chantillons
8.1 chantillonnage (cf. Annexe 4 : Symptmes et conseils de prlvement)
L'chantillon peut tre constitu:
a) de carottes de bois (un minimum de 2 carottes est recommand), dune longueur denviron 5 cm,
prleves laide dune tarire de type Pressler dans une direction approximativement radiale par
rapport au tronc ou la branche qui porte un symptme suspect,
b) de petits fragments de bois, de sciure, (de prfrence, volume infrieur ou gal 200 ml),
c) de terre prleve au voisinage darbres atteints par le chancre color, deau dun cours deau
traversant une zone contamine
Chaque chantillon est dpos dans un conditionnement individuel bien hermtique (ex.: flacon plastique
avec bouchon vissant) et parfaitement identifi.
Les outils sont dsinfects avant et aprs prlvement par trempage dans de lthanol 70% ou de leau
de Javel (ou solution dhypochlorite de sodium (NaOCl)), dilue et titre au moins 1% de Chlore actif ou
dans lalcool brler ou par tout moyen convenable, le tout suivi dun gouttage nergique et flambage.

8.2 Prparation de l'chantillon pour analyse


Dans la mesure du possible, lchantillon est exploit ds son arrive au laboratoire. Lanalyse peut tre
reporte de quelques jours (5 maximum). Lchantillon est alors conserv au rfrigrateur 5C 3C.
Si ncessaire, les fragments de vgtaux sont dcoups sous une hotte permettant de travailler en
conditions striles, laide dun instrument pralablement dsinfect (tremp dans lalcool brler puis
pass la flamme et refroidi).

9. Mode opratoire
9.1. Prise d'analyse
Le test se pratique sur l'ensemble de l'chantillon, qui doit tre prpar pour pouvoir tre immerg dans
le bocal
9.2. Mise en place de contrles
9.2.1. Tmoin ngatif de processus
Un tmoin ngatif est test pour chaque lot dchantillons afin de vrifier :
- ltat sanitaire du lot de bchettes-pige vis vis du Ceratocystis platani,
- labsence de contamination pendant la phase de traitement de lchantillon,
- labsence de contamination croise entre chantillons pendant la dure de lanalyse.
Une bchette- pige, corce, provenant du mme lot de bchettes que celles utilises pour analyser les
chantillons, est place, seule, dans un bocal tmoin, avec le mme dispositif de diffuseurs que les
bocaux tests. Ce bocal tmoin est mis incuber dans les mmes conditions que les chantillons tester
(cf. Annexe 3).
9.2.2. Tmoin positif de processus
Un tmoin positif est ralis pour chaque lot dchantillons. Celui-ci permet de contrler la sensibilit du
lot de bchettes et de montrer que lanalyse sest droule de faon optimale (critre de performance).
Une bchette-pige, provenant du mme lot de bchettes que celles utilises pour analyser les
chantillons est place dans un bocal tmoin avec un chantillon hbergeant Ceratocystis platani. Cet
chantillon est constitu dun fragment de culture pure du champignon. Cette souche de rfrence est
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conserve au rfrigrateur et rgnre en tant que de besoin (cf. Annexe 5 : Rgnration des souches
de Ceratocystis platani). Le bocal tmoin est mis incuber dans les mmes conditions que les
chantillons tester.
9.3. Mise en pratique (cf. Annexe 3 : Dispositif et matriel)
9.3.1. Prparation du matriel et consommables
- Ecorcer les bchettes saines,
- Prparer un bocal par chantillon analyser et l'identifier par une rfrence unique,
- Pour des chantillons constitus de carottes ou de fragments de bois, remplir peu prs moiti
chacun des bocaux avec de l'eau osmose ou de leau distille ou de leau de source,
- Pour des chantillons de terre, deau ou de sciure, la quantit deau osmose est peu prs
quivalente la quantit dchantillon tester,
- Prparer les systmes tuyau-diffuseur (un par bocal).
9.3.2. Mise en place des chantillons
Sous hotte permettant la ralisation des manipulations en conditions striles, chaque chantillon est trait
individuellement (le plan de travail, les ustensiles et les mains sont dsinfects lthanol 70% entre
chaque chantillon) :
- Disposer lchantillon tester dans le bocal rfrenc correspondant (cf. Annexe 3).
- Plonger le systme tuyau-diffuseur puis une bchette- pige dont le sommet doit merger de leau,
- Recouvrir immdiatement le bocal avec un film plastique de type Parafilm, de faon bien hermtique
(ou tout autre moyen quivalent) afin dviter tout risque de contamination et de dissmination,
9.3.3. Incubation (dans une pice climatise TC= 22 6C)
- Monter le dispositif
- Brancher la pompe
- Laisser incuber 3 semaines maximum, en s'assurant que le bullage entrane un brassage de l'eau de
chaque bocal,
- Surveiller l'apparition dun myclium blanc et/ou d'une coloration noire sur la partie merge des
bchettes piges.
9.4. Observation (sous loupe binoculaire et microscope photonique) (cf. Annexe 1 : Tlomorphe et Annexe
2 : Anamorphe)
Aprs plusieurs jours dincubation, si C. platani est prsent, on peut observer sur la partie merge de la
bchette:
- des amas d'aspect humide, voquant la neige fondante.
Un prlvement ce niveau (de prfrence avec un scotch) pour examen microscopique rvle des
cellules conidiognes laissant chapper des masses d'endoconidies caractristiques de C. platani. Les
conidies sont hyalines, cylindro-tronques, ventuellement encore groupes en files raides (en moyenne
5- 40 x 3- 6 m). (cf. annexe 2). Plus rarement, des endoconidies doliformes (7- 12 x 6- 9 m) sont
formes en chanes courtes.
- des prithces du champignon, dont le col, trs allong (longueur : en moyenne 400 - 800 m), est
facilement reconnaissable mme la loupe binoculaire, sous forme dune sphre noire surmonte
d'une soie noire faisant saillie du bois. Les ascospores ont une forme caractristique de chapeau melon
(4-8 m) (cf. annexe 1).
- des chlamydospores, paroi paisse, bulbeuses ou ampoules, bruntres maturit, isoles ou en
chane, de dimension en moyenne 11-19 x 9-15 m sont parfois prsentes (cf. annexe 2).

9.5. Expression des rsultats


9.5.1 Lecture des rsultats
Pour conclure la prsence de Ceratocystis platani sur la bchette-pige, il est ncessaire :
- dobserver sous la loupe binoculaire la prsence dun myclium blanc voquant la neige
fondante
- de vrifier par un montage entre lame et lamelle la prsence de cellules conidiognes librant les
endoconodies (cf. Annexe 2)
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Sils sont prsents (car certaines souches de C. platani ne produisent pas de prithces) :
- dobserver sous la loupe binoculaire la prsence et l'aspect des prithces de C. platani,
- de vrifier par un montage entre lame et lamelle la forme des ascospores de C. platani (cf. fiche
annexe 1).
Dautres espces, Ceratocystis paradoxa, Ceratocystis moniliformis, ont des anamorphes semblables
celles de Ceratocystis platani, cependant elles ne sont pas signales sur platane.
Les mesures des structures observes au microscope photonique (endoconidies, longueur du col des
prithces, ) ne sont ralises quen cas de doute.

9.5.2. Validation de lanalyse


Lanalyse nest valide quaprs avoir effectu les observations sur :
- le tmoin ngatif de processus
- le tmoin positif de processus
- la bchette-pige de la prise dessai
9.5.3 Interprtation des rsultats
Le tableau dcisionnel ci-dessous rsume toutes les possibilits dinterprtation des rsultats obtenus sur la
prise dessai et les contrles mis en place.

Contrles
Tmoin ngatif non
contamin
et
Tmoin positif non
contamin*

Tmoin ngatif non


contamin
et
Tmoin positif
contamin

Tmoin ngatif
contamin
et
Tmoin positif non
contamin*

Tmoin ngatif
contamin
et
Tmoin positif
contamin

Contamine

Dtect

Dtect

Indtermin
(faux positif ?)

Indtermin
(faux positif ?)

non
Contamine

Indtermin
(faux ngatif?)

Non dtect

Indtermin
(faux ngatif?)

Non dtect

Prise
dessai

* Prvoir la rgnration de la souche de rfrence ou lutilisation dune autre souche de rfrence

9.5.4 Rapport dessai


Exprimer le rsultat dans un tableau comportant les informations ci-dessous ou par une phrase du type :
 lorsque le rsultat de l'analyse est ngatif :
"Ceratocystis platani non dtect sur l'chantillon analys par pigeage biologique.", en citant la
rfrence et le titre de la mthode ci-dessus.
 lorsque le rsultat de l'analyse est positif :
"Ceratocystis platani dtect sur l'chantillon analys par pigeage biologique.", en citant la rfrence et
le titre de la mthode ci-dessus.
 lorsque le rsultat de l'analyse est indtermin :
"Ceratocystis platani indtermin sur l'chantillon analys par pigeage biologique.", en citant la
rfrence et le titre de la mthode ci-dessus.
Si possible, des informations sont donnes sur la cause de lindtermination.
Dans ce cas, un nouveau prlvement peut tre transmis au laboratoire.
La mise en vidence de C. platani peut tre confirme par l'envoi au laboratoire de rfrence de lames
fixes et d'une fiche de renseignements dont l'imprim est demander au laboratoire.
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10. Schma du mode opratoire

11. Rfrence bibliographique


 ENGELBRECHT CJB., HARRINGTON TC.. Intersterility within Ceratocytis fimbriata. Mycologia 2005. 97-1
 GROSCLAUDE C., OLIVIER R., PIZZUTO J.C., ROMITI C. ET M ADEC S. (1988). Dtection par pigeage du
Ceratocystis fimbriata f. platani, Application ltude de la persistance du parasite dans du bois infect.
European Journal of Forest Pathology, 18 : 385-390.
 OEPP/EPPO (2003). Diagnostic protocols for regulated pests. Bulletin 33, 249- 255
 VIGOUROUX A. (1979) Une mthode simple de recherche de Ceratocystis fimbriata f.sp. platani sur arbre
en place. European Journal of Forest Pathology 9, 316-320

12. Annexes
Annexe 1 : Tlomorphe de Ceratocystis platani
Annexe 2 : Anamorphe de Ceratocystis platani
Annexe 3 : Matriel et dispositif
Annexe 4 : Symptmes et conseils de prlvement des chantillons
Annexe 5 : Rgnration des souches de Ceratocystis platani

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ANNEXE 1 : TELEOMORPHE

Au microscope photonique

Prithces
- Col trs long (400 - 800 m)
- : 140 - 220 m
- Absence dappendice

A la loupe binoculaire

LNPV- SM

LNPV-SM
LNPV-SM

Ascospores
- Forme caractristique de chapeau melon
- Longueur : 4 - 8 m

LNPV-SM

LNPV-SM

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ANNEXE 2 : ANAMORPHE (FORME CHALARA)

LNPV-SM

LNPV-SM

Endoconidies
Deux types dendoconidies :
1) Hyalines, tronques, cylindriques, ventuellement groupes en chanes courtes
Dimensions : 5 - 40 x 3 - 6 m
2) Doliformes, brun-ple
Dimensions : 7 12 x 6 9 m
Cellules conidiognes de couleur brun-clair

Chlamydospores
- Bulbeuses, bruntres et paroi paisse,
- Dimensions 11 - 19 x 9 -15m

LNPV-SM

LNPV-SM

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ANNEXE 3 : MATERIEL ET DISPOSITIF


Pompe air

Diffuseurs

Anti-retour

Tuyau en silicone

Rpartiteur

Dispositif des pigeages biologiques

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Annexe 4
Symptmes et conseils de prlvement des chantillons sur arbre en place

 Symptmes
Reprer un platane suspect, porteur de symptmes
suspects :
 Feuillage clairsem et jauntre
 Dprissement dune ou plusieurs branches
 Prsence d une lsion de couleur bleu-noir ou violette,
en forme de flamme, sur le tronc ou les grosses
branches,

Les lsions peuvent tre dtendue


variable. Leurs marges montrent des
bandes ou plages allonges de couleur
bleu-violette, bleu-noir (plus visibles
lorsque lcorce est enleve) ou mouille

GDON Marseille

GDON Marseille

GDON Marseille
Zones de coloration caractristique dune section de tronc de platane infect

 Prlvement
Lchantillon peut tre constitu de tout matriel susceptible dhberger le champignon : sciure,
fragment de bois, carotte, Dans ce dernier cas, les chantillons sont collects en bordure de
ces lsions, si possible laide dune tarire de type Pressler. Les prlvements sont alors
effectus dans une direction radiale, sur une profondeur denviron 5 cm, Chaque chantillon est
dpos au fur et mesure dans un conditionnement individuel , bien hermtique, et portant une
rfrence unique.
Important : Les outils sont compltement dsinfects lthanol 70%,(ou par tout autre moyen
de mme pouvoir dsinfectant), avant et aprs prlvement, et entre chaque chantillon.

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Annexe 5 : Rgnration des souches de Ceratocystis platani

La rgnration dune souche consiste effectuer un repiquage sur milieu glos solide (voir
composition ci-dessous), conditionn de prfrence dans des botes de Petri de diamtre
90mm, partir dune souche pure du champignon, conserve sur milieu de culture glos ou
en tube contenant de lhuile minrale ou . :
Pour un litre
 Extrait de Malt : 12g 1g
 Chloramphnicol (200ppm) : 2ml s.s. 100l
 Agar Agar : 15g 1g
 Eau osmose : qsp 1000ml 10ml

1- Repiquage :
Les repiquages peuvent seffectuer sous une hotte flux dair strile ou sous une loupe
binoculaire.
Un fragment de myclium du champignon est prlev laide dun instrument (scalpel,
aiguille, ..) strilis (ex. : tremper linstrument dans lalcool brler, le passer la flamme
et le refroidir) puis dpos directement sur le milieu de culture raison dun implant par bote
(prvoir si possible de 3 4 repiquages).
2- Incubation :
Les botes ensemences sont mises en incubation dans une enceinte temprature
contrle (T= 22 6C), avec un clairage de type lumire du jour photopriode de 12
heures ou dfaut dans une pice climatise (T= 22 6C), la lumire du laboratoire.
Loprateur ralise des observations rgulires des botes ensemences. Si des pollutions
apparaissent, loprateur procde de nouveaux repiquages.
3- Codification et stockage des souches de rfrence :
Chaque bote ensemence porte la mme rfrence que la souche mre et la date du
repiquage.
Environ 10 15 jours aprs repiquage, loprateur vrifie sous la loupe binoculaire la
croissance du myclium et la prsence de prithces long col portant leur extrmit les
masses mucilagineuses contenant les ascospores du champignon.
Les souches sont alors parafilmes, stockes dans une bote hermtique, parafilme, au
rfrigrateur puis utilises en tant que de besoin.
4- Ralisation du tmoin positif de processus :
Un fragment de cullture denviron 10mm sur 5mm est prlev puis dpos dans le bocal
tmoin laide dun instrument strilis (voir paragraphe 1).

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