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L A B-act a 2 00 6 ; 1 8 : 4 3 - 6

especial

Identicacin forense
de uido seminal
Gabriel Mayoral-Andrade,1,2
Eduardo Prez-Campos-Mayoral,2
Luca Martnez-Martnez,3 Pedro Hernndez-Cruz,3
Eduardo Prez-Campos1,3
1. Unidad de Bioqumica e Inmunologa ITO-UNAM, Oaxaca, Mxico.
2. Laboratorio de Patologa Clnica Dr. Eduardo Prez Ortega.
3. Centro de Investigacin en Ciencias Mdicas y Biolgicas,
Facultad de Medicina. UABJO.

ABSTRACT
A review of some methods used to detect seminal uid in rape cases. Cytological examination of spermatozoa, detection of acid phosphatase, and immunoassays for prostate specic antigen (PSA) to
provide forensic evidence among the most important in forensic identication. Also we mention some techniques DNA-based human identication.
Keywords. Forensic identication. Seminal uid. Prostate specic
antigen. Acid phosphatase. Short tandem repeats. Rape.

RESUMEN

INTRODUCCIN
El riesgo mundial de sufrir una violacin es cuatro veces ms
en la mujer que en el hombre. En una encuesta entre estudiantes en Mxico se encontr una prevalencia de 4.3%,
no habiendo diferencias estadsticamente significativas en el
sexo.(1) La edad ms frecuente es entre 16 y 24 aos de edad.
El tipo de victimizacin corresponde en orden de frecuencia a
violacin, abuso sexual, tentativa de violacin, y estupro.(2)
Ms del 70% de personas que han sido violadas, nunca pensaron que pudiera sucederles. Cerca de 75% de todos
los casos de violacin son cometidos por conocidos de la vctima.
En consideracin a lo anterior se hace necesario que los
rganos de procuracin de justicia en el pas tengan herramientas para el estudio cientfico de este tipo de problemas.
Aqu hacemos una revisin de diversas tcnicas empleadas por
la ciencia forense en el estudio del fluido seminal.
IDENTIFICACIN DE LA MUESTRA O
MANCHAS DE EVIDENCIA
Las muestras obtenidas de las manchas de evidencia o trazas de evidencia se debern emplear para: examen microscpico con objeto de visualizar espermatozoides, identificar fosfatasa cida como prueba presuntiva de presencia de semen,
e identificacin de antgeno prosttico especfico como prueba confirmatoria. Las muestras extradas de la escena del criCorrespondencia: Dr. Eduardo Prez-Campos, Centro de Investigacin en
Ciencias Mdicas y Biolgicas. Facultad de Medicina. Universidad Autnoma
Benito Jurez de Oaxaca. Ex-Hacienda de Aguilera s/n, Carretera a San Felipe del
Agua, Oaxaca, 68020, Mxico. Correo-e: perezcampos@prodigy.net.mx
L A B O R AT-ac ta Vo l . 18 N m. 2 2006

Presentamos una revisin de los mtodos empleados para detectar


e identicar el uido seminal, como es el examen microscpico, deteccin de fosfatasa cida y el antgeno prosttico especco. Adicionalmente comentamos respecto a las tcnicas basadas en el DNA
para la identicacin de individuos.
Palabras clave. Forense. Fluido seminal. Antgeno especco de
prstata. Fosfatasa cida. Espermatozoides. Secuencias cortas repetidas en tndem. Violaciones.

men sirven para efectuar anlisis del DNA de los sospechosos, mediante PCR (reaccin en cadena de la polimerasa) y
RFLPs (patrones de fragmentos de restriccin).
La recoleccin de la evidencia debe considerar hisopos
vaginales, orales, anales y peinado pbico, adems de muestras del cabello de la cabeza y pubis como controles, muestras de saliva, muestras de sangre, huellas digitales y ropa.
En el caso de ropa u otros materiales, la localizacin de
la mancha de evidencia se puede hacer mediante luz fluorescente. El espectro de excitacin de las muestras de semen
tiene longitudes de onda que van de 350 nm (UV) a 500
nm (azul-verde). Cuando las manchas de evidencia estn
sobre algodn blanco la ptima condicin de observacin es
de 505/555 nm (Ex/Em) y cuando la tela tiene un satinado
rosa la ptima condicin queda en 450/530 nm.(3) Aunque
se ha reportado que el semen es fluorescente a la luz ultravioleta emitida por una lmpara de Wood, se ha mostrado que
hay significativa inespecificidad en la fluorescencia debido al
empleo de aceites o cremas.(4)
Por ltimo, se debe sealar que todas las muestras deben
de colectarse en contenedores hermticos, para que no se contaminen.
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Gabriel Mayoral-Andrade y cols

Identicacin microscpica de espermatozoides

El semen est constituido por espermatozoides y plasma seminal. Entre 15 a 30% del volumen del semen proviene de
la prstata, 60-70% de las vesculas seminales y slo 10%
proviene de epiddimo. El espermatozoide tiene una cabeza,
una pieza media y un flagelo. La cabeza est constituida por
el acrosoma y el material gentico, y la pieza media tiene empaquetadas las mitocondrias.
Cuando el hombre eyacula, los espermatozoides tienen
un mximo de supervivencia dependiendo de la regin del
cuerpo donde se depositan; la posibilidad de encontrarlos depende fundamentalmente de que se haya o no realizado limpieza. La duracin aproximada en canal endocervical es de
114 h, en fondo de saco vaginal 120 h, rectal 65 h, anal 46
h, y en la boca de 6 h. En el caso de nios, si no se recolecta la evidencia antes de las 24 h es mejor no recolectarla.(5)
El estudio citolgico en busca de espermatozoides es un
estndar de oro aun si otros mtodos son empleados.(6)
Entre los procedimientos que se han utilizado para la
identificacin de espermatozoides en las muestras de fluido
vaginal estn la tincin de hematoxilina-eosina, la tincin
de Christmas tree (rojo rpido nuclear/picroindigocarmina) y fuscina alcalina. Tambin se han empleado variantes de
Giemsa-May-Grumwald, vgr: Diff-Quick, que emplea eosina
G y verde rpido.(7) La tcnica de Papanicolaou no se recomienda como rutina en una tcnica forense.(8) De las tcnicas
anteriores, de preferencia se debe emplear la de hematoxilinaeosina y la tincin de Christmas tree.(9)
El anlisis de clulas epiteliales glicogenadas (mediante tincin con cido peridico de Schiff ) en objetos de evidencia ha sido empleado para indicar una insercin vaginal,
este procedimiento se usa particularmente en cadveres.(10)
Fosfatasa cida

La fosfatasa cida es una fosfomonoesterasa no especfica, secretada por la glndula prosttica, est presente en grandes
cantidades en el fluido seminal. Se puede encontrar en otros
fluidos en muy bajas concentraciones. Aunque es muy raro, se
han descrito casos de hombres con muy baja concentracin de
fosfatasa cida y mujeres con alta concentracin de ella.(11)
Su identificacin es de mucha ayuda en casos de violaciones, en ellos, la presencia de semen debe confirmarse en
forma adicional por otro mtodo como: 1) La identificacin
microscpica de espermatozoides, 2) antgeno especfico de
vesculas seminales, y/o 3) la cuantificacin de antgeno prosttico especfico.(12)
La muestra de evidencia de la secrecin vaginal, obtenida mediante una sonda o mediante un hisopo humedecido con solucin salina, con el que se limpi la mancha de
evidencia, se deber frotar sobre un papel filtro en donde se
realizar la prueba. Otra forma de procesar la muestra, es presionando un papel blanco absorbente hmedo, sobre la su44

perficie que se sospecha que contiene semen o fluido vaginal.


Considerando que la fosfatasa cida es una protena soluble
al agua, sta se absorbe rpidamente al papel. Ya sobre ste se
hace la reaccin. Es decir, la bsqueda de fosfatasa cida nunca deber hacerse directamente sobre la prueba de la mancha
de evidencia.(13)
El principio de los mtodos se basa en que la fosfatasa
cida, cataliza en medio cido la hidrlisis del alfa-naftil fosfato. El alfa-naftol producido, reacciona con una sal de diazonio (Fast Red TR) formando un cromgeno prpura. En
algunos mtodos se les adiciona pentanodiol, para acelerar la
reaccin al actuar como aceptor del fosfato. El tartrato se puede emplear como inhibidor especfico de la denominada fraccin prosttica.
Una reaccin positiva significa la presencia de fosfatasa
cida. La positividad para la fosfatasa cida slo puede estar
dada por tejido prosttico, tejido de bazo, de hgado o de rin, es decir el nico lquido que puede ser aplicado o dispersado como tal es el lquido proveniente de secrecin genital
prstata-seminales-testculo. Por lo que una prueba positiva
se interpreta como la presencia de semen.
La cuantificacin de fosfatasa cida es un indicador ms
sensible de semen, que la identificacin de espermatozoides
en el fluido vaginal,(14) incluso puede ser un indicador del
tiempo aproximado del coito.(15)
Antgeno prosttico especco

El antgeno prosttico especfico (PSA) es una glicoprotena


de la familia de las serino proteasas, tambin conocido como antgeno p30.
Idealmente cuando la eyaculacin ocurre, se deben identificar los espermatozoides en la muestra de la vctima, sin embargo cuando el agresor se ha realizado vasectoma, la muestra puede no contener espermatozoides, en estos casos es de
utilidad identificar fosfatasa cida y el PSA.
El tiempo promedio en que desaparece la fosfatasa cida en muestras vaginales es de 14 h, mientras que el PSA se
puede encontrar todava a las 27 h. La medicin o identificacin del PSA se considera una prueba confirmatoria.
El PSA se encuentra en bajas concentraciones, menor a
1 ng/mL en leche materna, glndulas peri-uretrales, y fluido
amnitico. En orina femenina se han encontrado valores entre 0.12-1.06 ng/mL,(16) e incluso ligeramente mayores, con
un promedio de 3.72 ng/mL.(17) Por otra parte, se ha medido mediante inmunoensayo enzimtico, que el punto de corte del PSA en secrecin transvaginal es de 1.77 mg/mL en
muestras extradas en un rea de 0.5 0.5 cm. de la prenda
de vestir y preparadas en volmenes de 1.5 mL de PSA.(18) A
diferencia de las secreciones antes mencionadas, en semen el
promedio de PSA es de 820 000 ng/mL.(19)
Tomando en cuenta que los niveles en las muestras de
evidencia son mayores de 4 ng/ml de PSA, en los ltimos
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Otras molculas

Con objeto de mejorar la especificidad y sensibilidad en la deteccin de semen, se ha empleado la cuantificacin de un antgeno especfico de vesculas seminales (SVSA), las ventajas son
su especificidad y que permite la deteccin en semen diluido
ms de un milln de veces, sin embargo hay interferencia con
algunas protenas presentes en el fluido vaginal.(21)
Existen algunas otras protenas que se han empleado inicialmente como marcadores tumorales de cncer de prstata,
y que posteriormente se les ha dado una aplicacin forense.
Entre estos marcadores se encuentran la glicoprotena transmembranal denominada antgeno de membrana especfico
de prstata (PSMA), el pptido inhibitorio prosttico (PIP),
y el gen P-53.
Por ltimo, se ha reportado que la cuantificacin de zinc
en fluido vaginal es significativa para considerar la presencia
de fluido seminal.(22)
Anlisis molecular del DNA

En el caso concreto del fluido seminal, la obtencin del DNA


para su comparacin con la de los probables inculpados representa un problema tcnico, debido a que la muestra se encuentra o se puede encontrar con una mezcla de clulas de
epitelio vaginal y de espermatozoides. Para su estudio se requiere una extraccin del DNA partiendo de una lisis diferencial.(23) Este mtodo se basa en las diferencias de empaquetamiento del DNA en la cabeza del esperma y en los ncleos de
las clulas del epitelio vaginal, debido a que el DNA del espermatozoide tiene puentes cruzados de protamina. Esta dificultad es parcialmente resuelta con otros procedimientos, como el empleo de filtros con poros de 10 m, lo que da una
purificacin de espermatozoides del 98 al 99%.(24)
Los primeros en analizar un locus polimrfico caracterizado por un nmero de fragmentos de restriccin variable en
el campo de las ciencias forenses fue Jeffreys y cols en 1985,
el mtodo empleado se denomina RFLPs (restriction fragment
length polymorphism).
La bsqueda de polimorfismos en DNA minisatlite con
RFLPs se basa en identificar la longitud de fragmentos de resL A B O R AT- ac ta Vo l . 18 N m. 2 2006

triccin, mediante digestin del DNA con enzimas de restriccin e hibridizacin con sondas especficas. En este mtodo
se emplean sondas multilocus MLPs denominadas Huellas
de DNA (DNA fingerprints), o de un nico locus SLPs, tambin llamadas Perfiles de DNA (DNA profiling).(25) El problema de estas tcnicas es que el DNA debe estar ntegro, y
debe haber en cantidad suficiente (cabellos, manchas de sangre, semen, etctera). Las clulas deben ser frescas o recientemente muertas y sin daar.
Otra tcnica empleada en el estudio del DNA es el anlisis con la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR), de
microsatlites STRs. La posibilidad de exclusin individual
de los marcadores empleados por PCR es menor que con las
sondas unilocus. El anlisis de polimorfismos por PCR es
muy amplio. Una ventaja de la reaccin en cadena de la polimerasa es que se puede realizar con muy pequeas cantidades de la muestra. El anlisis de DNA puede ser estudiado en
un solo locus (singleplex system) o al mismo tiempo ms de un
locus (multiplex system).
Despus de la amplificacin se emplean mtodos para separar el DNA por su tamao, entre stos estn la electroforesis en geles de agarosa y de poliacrilamida. Los geles de agarosa separan molculas de 100 a 10 000 bases y se emplean
comnmente con VNTR (Variable number of tandem repeats),
mientras que los geles de poliacrilamida, que separan bien de
50 a 500 bases, son generalmente empleados para secuencias
cortas repetidas en tndem STRs (short tandem repeats). Otro
procedimiento altamente eficiente para separar las molculas
amplificadas de DNA, es el que utiliza la electroforesis capilar en STRs con nucletidos fluorescentes.(26)
La variacin gentica que se busca es de longitud, empleando STRs o variaciones de secuencia empleando polimorfismo en un solo nucletido SNPs (single nucleotide polymorphism).
En el anlisis molecular del DNA se utiliza un marcador gentico que tenga un patrn de herencia bien conocido, elevado polimorfismo (con muchas variaciones genticas,
de tal manera que la ms rara de las variantes de este gen no
pueda mantenerse a travs de una mutacin), con alto grado
de heterocigosidad, cuya herencia sea independiente de otros
genes, y con una tasa de mutacin baja. Existen tres tipos de
marcadores nucleares, los microsatlites, los minisatlites y los
de variacin de secuencia. En el DNA mitocondrial existen
slo dos marcadores polimrficos de variacin de secuencia
que corresponden a las regiones HVR1 y HVR2.
Hay marcadores tanto autosmicos dominantes como de
polimorfismos del cromosoma Y, de microsatlites (STRs) y
minisatlites (AMP-FLPs). Tambin hay polimorfismos de secuencia como HLADQA1, y polimorfismos de DNA repetido en tndem (MVR).(25)
Como ejemplo de los marcadores de STRs que se emplean en gentica forense estn los siguientes: HUMFES/
FPS, HUMF13A1, HUMTH01 TC11, HUMVWA31A,
45

Identificacin forense de fluido seminal

aos se han empleado como mtodo alterno la inmunocromatografa cualitativa de muestras extradas con HEPES-salina provenientes de hisopos. Estas mismas muestras pueden
ser adecuadas para la extraccin de DNA.(20)
Al comparar los mtodos citolgicos con la medicin de
fosfatasa cida y la cuantificacin de PSA a dos diferentes
tiempos (0 y 24 h), se ha reportado una sensibilidad para las
tres pruebas, al tiempo 0, de 67.5, 96 y 99.4%, respectivamente, en comparacin con las 48 h, la fosfatasa cida, baja
a 40.3% y el PSA disminuye discretamente a 96%. Adems
el PSA proporciona buenos resultados cuando la muestra proviene de sujetos oligosprmicos o azozprmicos.(7)

Gabriel Mayoral-Andrade y cols

HUMCSF1PO, HUMTPOX, HUMACTBP2 SE33, y


D21S11.(27)
Otros marcadores que han sido frecuentemente empleados en diversas poblaciones son los microsatlites D8S1179,
D21S11, D7S820, CSF1PO, D3S1358, TH01, D13S317,
D16S539, D2S1338, D19S433, vWA, TPOX, D18S51,
D5S818, FGA, adems de la Amelogenina; el D2S1338 y el
D19S433 proporcionan un alto nivel de discriminacin en
procedimientos forenses.(28,29)
Por ltimo, se recomienda que adicionalmente a los procedimientos de identificacin de espermatozoides o de fluido
seminal, se deba buscar alguna droga que se le haya administrado a la vctima. Actualmente se emplean con mayor frecuencia sustancias que producen prdidas de la conciencia o
del control muscular, y que incluso algunas de ellas pueden
llevar a la muerte. Entre las drogas de mayor uso que deben
localizarse estn: etanol, benzodiazepinas, GHB, ketamina,
escopolamina, anfetaminas, cocana, y relajantes musculares.(30)
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