Biorremediacin

El problema de la contaminacin
Hay una presencia creciente de sustancias
txicas, tales como como los compuestos
alifticos halogenados, hidrocarburos
aromticos, bifenilos policlorados y otros
compuestos orgnicos e inorgnicos que
contaminan agua, aire y suelo
Algunas sustancias llegan al ambiente en
bajas concentraciones, pero son sujetas a
bioacumulacin o biomagnificacin durante
su paso por la cadena alimentaria
2

Que hacer?
Identificar el problema
Establecer la naturaleza y el grado del riesgo
Decidir la mejor accin de remediacin
Ventajas de la biorremediacin
Menor costo que otras alternativa
Costo de incineracin para todos los sitios en EEUU: $1.7.1012

Se trata en general de una solucin permanente

Muchas veces se logra mineralizacin en lugar de transferencia entre fases
3

Procesos celulares
sustrato

transformacin

Compuesto qumico
(contaminante)

CELULA
aceptor de
electrones
Oxgeno
Nitrato
Sulfato
otros

Compuesto modificado
pero no completamente
eliminado

Sistemas
enzimticos
mineralizacin
nutrientes
Nitrgeno
fsforo
metales (trazas)

Contaminante destrudo
formacin de CO2 + H2O

Reacciones catalizadas por

microorganismos
Deshalogenacin: un tomo de cloro es remplazado por un tomo de
hidrgeno Cl2C = CHCl + H+ ClHC = CHCl + Cl Hidrlisis: ruptura de una molcula orgnica con adicin de agua
RCOOR + H2O

RCOOH + ROH

Clivaje: Divisin de una cadena orgnica en dos segmentos

RCOOH

RH + CO2

Oxidacin: Reaccin con formas nucleoflicas de oxgeno (H2O, OH-)

CH3CHCl2 + H2O

CH3CCl2OH + 2H+ + 2e-

Reduccin: Reaccin con formas electroflicas de hidrgeno (H+)

CCl4 + H+ + 2e-

Deshidrohalogenacin

CCl3CH3

CHCl3 + ClCCl2CH2 + HCl

Vas catablicas

Diversidad en la
biodegradacin
de tolueno

Vas catablicas

http://umbbd.msi.umn.edu/index.html
Microbial biocatalytic reactions and
biodegradation pathways
188 pathways
1293 reacciones
1199 compuestos
833 enzimas
467 microorganismos
50 grupos funcionales orgnicos

Anlisis previos
Un requisito previo en cualquier estrategia de remediacin es
la caracterizacin del sitio, respecto a los factores que puedan
afectar el proceso
La biorremediacin es un procedimiento con rigor cientfico,
que debe ser ajustado especficamente para cada condicin
particular, para minimizar las limitaciones cinticas y
ambientales.
Por lo tanto, los costos iniciales para caracterizacin del sitio,
evaluacin de factibilidad pueden ser mayores a los costos
dasociados con tecnologas ms convencionales
8

Caracterizacin de aceptores de
electrones
En acuferos, suelos y
sedimentos predominan
condiciones anxicas

Caracterizacin de otros componentes

abiticos
1. Disolucin y precipitacin de CaCO3, que cambia la alcalinidad
y afecta la concentracin de Ca2+
2. Conversin de FeS en pirita (FeS2), que lleva a la prdida de
H2S
3. Disolucin reductiva de Fe(III) por oxidacin de S2-, que
consume H2S produciendo Fe2+ soluble y SO42- o S0

10
Maurer and Rittmann, 2004 Biodegradation 15: 419434

Caracterizacin de las comunidades

microbianas autctonas

Como parte de la caracterizacin del sitio para

determinar la estrategia de remediacin apropiada
Como parte del monitoreo del progreso y la efectividad
del proceso de remediacin

11

Ecologa de la degradacin

12

Diagrama de biorremediacin

Bioremediation

in situ

Engineered

Biostimulation

Adding Oxygen
-Bioventing
-Biosparging

Adding Oxygen
and Nutrients

ex situ

Intrinisic

Landfarming

Bioreactor

Bioaugmentation

Adding Oxygen,
Nutrients and Bacteria

13

Biorremediacin in situ:
1. Bioestimulacin

14

Ranking de accidentes de barcos

petroleros

35

Exxon Valdez 1989 Costa de Alaska

49 000
15

Jernelov, A. The Threats from Oil Spills: Now, Then, and in the Future, AMBIO (2010) 39:353366

Cul fue el mayor derrame de

petrleo de la historia?

1.200.000 tn (Golfo Prsico, 1991)

16

Derrame del Exxon Valdez

(1989)

Atlas & Hazen, Environ Sci Technol (2011) 45, 6709-6715

Bioremediacin in situ
Bioestimulacin

18
Atlas & Bragg, Microbial Biotechnology (2009) 2, 213-221

Bioremediacin in situ
Exxon Valdez

19

Bioremediacin in situ
Exxon Valdez

La bioremediacin no aumenta la extensin de la degradacin

La bioremediacin aumenta la cintica de degradacin
20

Exxon Valdez 20 aos despus

PAH no accesible

La mayor parte de PAH fue eliminado

No hay deficiencia de nutrientes

No hay
posibilidad de
ms
bioremediacion

21
Atlas & Bragg, Microbial Biotechnology (2009) 2, 213221

Procesos que afectan la disponibilidad

de materia orgnica en suelos

22
Andreoni & Gianfreda, Appl Microbiol Biotechnol (2007) 76:28730

Limitaciones de la bioremediacin
Prestige oil spill

recalcitrancia
viscosidad (difusin)
accesibilidad
co-metabolismo

23
Gallego et al, Org Geochem 37: 1869- 1884

Cometabolismo como estrategia

de biorremediacin
degrada 300
compuestos

24

Biorremediacin in situ:
2. Atenuacin natural
Tecnologa relativamente simple
Puede ser llevada a cabo con mnima disrupcin del sitio
Suele requerir tiempos ms prolongados que otros mtodos
Requiere un programa de monitoreo de larga duracin
La duracin afecta el costo
Si

las velocidades de atenuacin son muy lentas la pluma los

contaminantes pueden migrar
25

Derrame de petrleo Golfo de

Mxico (2010)

Actividad cientfica en las primeras etapas

Documentar las condiciones previas al impacto
Monitoreo del movimiento del petrleo
Monitoreo del dao en los recursos naturales
Decisiones tcnicas para contener el derrame
26

Actividades de remediacin en el
golfo de Mxico

27

Uso de dispersantes
636 millones litros de petrleo
5.000.000 litros dispersante!

OD ?

Corexit
Solvente: 2-butoxiethanol (2-BE) o eter de petrleo
Detergente: sulfonato orgnico
Estabilizante: propylene glicol
Otros componentes (anticongelantess, etc)

Objetivo
Bajar la tensin superficial
de la interfase agua-aceite
Formar microgotas que
queden suspendidas para la
biodegradacin de las
fracciones solubles liberadas
28

Compromiso en el uso de
dispersantes

OD ?

Schmidt, CW 2010 Environmental Health Perspectives 118, A339-A344

Monitoreo de la densidad y
actividad microbiana
Aumento en
densidad celular
en la pluma

Descenso en OD
sugiere catabolizacin
de HC

30
Hazen et al., 2010 Science 330. 204-208

Phylogenetic Oligonucleotide
Arrays
PhyloChip > 106 sondas de ARNr 16S

16S rRNA gen como marcador

Scaneado del PhyloChip. Se

analiza la fluorescencia. Si da
positivo para >90% de las sondas
se considera presencia

16S rRNA gen es amplificado a

partir del ADN metagenmico o
las molculas de 16S rRNA son
usadas directamente

PhyloChip teido y lavado

El pool de amlicones se fragmenta

(200-500 bp) y se marca con
biotina

16S hibrida con sus secuencias

complementarias sobre la superficie
del chip
31

Phylogenetic Oligonucleotide
Arrays
Concepto de sondas mltiples
Lo microorganismos pueden ser
detectados con mltiples sondas con
niveles de especificidad idnticos y
jerrquicos

Se pueden hacer chips con

distinto nivel de especificidad
Ajustando la especificidad de las
sondas (e.g. SRP-phylochip, RHCphylochip, Anaerochip, etc)
32

Cambios en la composicin de las

comunidades microbianas
16S rRNA
phylochip

Phospholipids fatty
acids (PLFA)

33
Hazen et al., 2010 Science 330. 204-208

Composicin de comunidades en la
pluma de contaminacin

Bacterias psicroflicas degradadoras de hidrocarburos y otros

organismos no cultivados de ambientes fros contaminados con
hidrocarburos
34
Hazen et al., www.sciencexpress.org / 24 August 2010 / Page 1 / 10.1126/science.1195979

Functional Gene
Arrays (FGA)

35

Functional Gene Arrays

(Geochip)

24253 - 50mer
> 57000 genes
>150 grupos funcionales
36

Functional Gene Arrays

(Geochip 3.0)

28000 - 50mer
57000 genes
292 grupos funcionales
gyrB para anlisis filogentico

37

Clasificacin funcional de genes

4,000-5,000 genes funcionales detectados por muestra

1652 genes involucrados en la degradacin de hidrocarburos
38
Hazen et al., www.sciencexpress.org / 24 August 2010 / Page 1 / 10.1126/science.1195979

Clasificacin funcional de genes

El petrleo es el factor dominante

en la estructuracin de la
comunidad funcional microbiana
39
Lu et al., 2011 Microbial gene functions enriched in the Deepwater Horizon deep-sea oil plume The ISME Journal 5, 1 10

Genes para la degradacin

aerbica de PAH
nah: naftaleno 1,2 dioxigenasa

Los genes que codifican para la degradacin de PAH son

ms abundantes en la pluma, y algunos son nicos
40
Lu et al., 2011 Microbial gene functions enriched in the Deepwater Horizon deep-sea oil plume The ISME Journal 5, 1 10

Genes para la degradacin

anaerbica de PAH

Aunque hay oxgeno presente, tambin hay enriquecimiento

en genes que codifican para la degradacin anaerbica
gen bbs: -oxidation de benzylsuccinato
para la degradacin anaerbica de tolueno
41

Lu et al., 2011 Microbial gene functions enriched in the Deepwater Horizon deep-sea oil plume The ISME Journal 5, 1 10

Conclusiones de los anlisis

moleculares
Existe una gran diversidad de poblaciones que degradan
HC en la pluma a altas profundidades del ambiente marino
Las comunidades microbianas estn sujetas a una rpida
adaptacin en respuesta a la contaminacin
Existe el potencial para la bioremediacin intrnseca de la
contaminacin de petrleo

42
Hazen et al., www.sciencexpress.org / 24 August 2010 / Page 1 / 10.1126/science.1195979

2010: Derrame en el golfo de Mxico

43
Nature, Vol 466, 12 Aug 2010, p. 802

Whole-Community RNA
Amplification (WCRA)
random hexam

Promotor de T7 RNA polimerasa

Gao et al., Appl Environ Microbiol 53, 563571 (2007)

Bioventing
Proceso de airear suelos para
estimular actividad biolgica in
situ y promover biorremediacin.

45

Sistema tpico de biorremediacin de un

acufero
Pozo de
inyeccin

Nutrientes/
Oxgeno

Agua a
tratar

Pozo de recuperacin

pluma contaminada

46

Biorremediacin in situ:
3. Bioaumentacin

Frecuentemente fertilizantes
(caros) para microorganismos
ya existentes.
Pocas veces se analiza el
resultado de la adicin
separada de nutrientes (cf
bioestimulacin)

The reservoir contains up to a 30-day

supply of Bacta-Pur beneficial
biotechnologies and nutrients. The
nutrients have been specially developed
to allow rapid growth and to optimize
nitrifier production. A dosing pump
transfers precise quantities of
bacterial/nutrient mixture to the
bioreactor.

47

Bioremediacin: por qu los resultados de

laboratorio tienen poco uso prctico?

48

Limitaciones a la funcionalidad de
un inoculante
Baja concentracin del contaminante
Incluye problemas de baja solubilidad o baja biodisponibilidad

Presencia de compuestos inhibitorios

Depredacin
Reduccin de poblaciones activas

Preferencia por otras fuentes de carbono

Incapacidad de dispersin
El microoganismo no llega al contaminante
49

Limitaciones fisiolgicas y
regulatorias a la biorremediacin
Falta de induccin del opern catablico
Falta de reconocimiento del efector regulatorio

Falta de reconocimiento del sustrato

Enzimas catablicas en la bacteria

Stress celular
Por el mismo contaminante o el ambiente

Caos metablico por mltiples contaminantes

Generacin de intermediarios txicos o vas muertas

Balance termodinmico del proceso de degradacin

Potencial redox y disponibilidad de aceptor de electrones
50

Desafos en la construccin de
GMB para uso en bioremediacin
Problema

Solucin

E coli no es suficientemente robusta

Usar bacterias ambientales

Resistencia a antibiticos como

marcador de seleccin

Marcadores no antibiticos y resistencia

extrable

Funciones codificadas en plsmidos

Integracin estable en cromosoma

Expresin dependiente de inductores

qumicos

Expresin dependiente en input

ambiental

Fuerte seleccin contra los

genes/circuitos implantados

Ortogonalizacin de la funcin
51

Inhibicin metablica en co-cultivo

Reduccin de quitina por PAO1
Aeromonas hydrophila
Pseudomonas aeruginosa
Aeromonas hydrophila

Pseudomonas aeruginosa

ReduccinReduccin
de quitinade
porquitina
AH-1N

52
Jagmann et al. Environmental Microbiology (2010) 12, 17871802

Inhibicin metablica en co-cultivo

Produccin de acetato
Cultivos
puros
AH-1N

Cultivos mixtos

Produccin de piocianina

53
Jagmann et al. Environmental Microbiology (2010) 12, 17871802

El cuello
Diseodedebotella
cepasen
degradadoras
la biodegradacin
de
no est necesariamente
clorotolueno
en la enzimologa
Cl

CH3

Cl

CH2OH

TOD dioxigenasa (de Pseudomonas putida F1)

todC1C2BA

Cl

CH2OH

xylB

Cl

CHO

Cl

COOH

TOL (pWW0 de P. putida mt-2)

xylC

va orto cromosomal
en el husped

Cl

COOH

Cl

OH

OH

JB2

PA142

OH

TCA
OH

Velocidad
Integracinde
estable
flujos metablicos
Produccin
Funcional endelavas
conversin
secundarias
de 2-Cl
improductivas
tolueno en 2 Cl benzoato
No
Control
crecen
fisiolgico
utilizando
de 2-Cl
vas tolueno
degradativas
54

Haro & de Lorenzo 2001 Journal of Biotechnology 85, 103-113

Uso de microarrays para evaluar los

patrones de expresin en P putida

55

Respuesta funcional de P. putida KT2440

a tolueno, o-xyleno y 3-MB
3 MB: 3-metil benzoato: sustrato
o-xyleno: anlogo no digerible

56
Domnguez-Cuevas P et al. J. Biol. Chem. 2006; 281:11981-11991

Los contaminantes son tomados como

fuentes de stress, ms que de nutrientes
Consecuencia
En ambientes
heterogneos los
microorganismos
migran hacia
regiones con
menores
concentraciones de
contaminantes

La maquinaria
transcripcional es
reasignada a tolerar
stress
Slo una pequea
fraccin se redirige a la
degradacin del
compuesto orgnico

57
Domnguez-Cuevas P et al. J. Biol. Chem. 2006; 281:11981-11991

Los compuestos orgnicos

halogenados
Solventes
Agentes desengrasantes
Pesticidas
Productos farmacuticos
Plastificantes
Fludos hidrulicos y de transferencia trmica
Intermediarios de sntesis qumicas,
58

Declorinacin reductiva anaerbica

PCE, TCE, DCE y VC actan como aceptores de electrones
TCE Reductase

tetracloroeteno tricloroeteno

cis-dicloroeteno

VC reductase

cloruro de vinilo

eteno

Dehalobacter
Desulfuromonas

Se requiere carbono y una fuente de energa (dador de electrones)

La fermentation de compuestos orgnicos produce H2, que actua como dador
de electrones
59

Declorinacin a eteno vs presencia

de Dehalococcoides

ausente

ausente

ausente

60
Hendrickson et al., 2002 Appl Environ Microbiol 68, 485495

Secuencias similares, pero no

idnticas

61
Hendrickson et al., 2002 Appl Environ Microbiol 68, 485495

Degradacin de TCE en
microcosmos
metanol

lactato
TCE
cDCE

TCE

KB-1
TCE

cDCE

VC

KB-1
eteno

VC

eteno

62
Major et al., Environ Sci Technol 2002, 36:5106-5116

Degradacin de TCE en
microcosmos
TCE

cDCE
eteno
d=-1

d=+1

VC

d=+73
Las secuencias de
Dehalococcoides aumentan
progresivamente en
abundancia y se desplazan
dentro del rea de tratamiento
63
Major et al., Environ Sci Technol 2002, 36:5106-5116

Liberacin lenta de hidrgeno

64

Biorremediacin in situ:
4. Fitoremediacin
El uso de plantas para extraer, secuestrar o detoxificar
contaminantes
Elementales

Orgnicos

Metales pesados, radionucleidos

PAH, halogenados, nitroaromticos

i)

Extraccin y traslocacin a
tejidos vegetales

ii)

Secuestro en races

iii)

Conversin en especies menos

txicas

65

Limitaciones de la fitoremediacin
i)

El tiempo necesario para obtener efectos aceptables

ii) La profundidad limitada de las races

iii) El crecimiento lento de las plantas
iv) La sensibilidad a algunos contaminantes
v) El problema de ser parte de la cadena alimentaria
vi) La dependencia del cambio en las condiciones climticas
66

Rizoremediacin: Contribucin de
microorganismos en la rizosfera a la
degradacin de contaminantes
Criterios de seleccin
1.Capacidad de crecer rpidamente en un medio simple
2.Capacidad estable de degradar naftaleno
3.Capacidad de colonizar eficientemente la raz

67
Kuiper et al.2001 MPMI 14, 1197-1205

La rizosfera controla la degradacin de

los contaminantes orgnicos

68

Cul es el efecto de los exudados sobre la

actividad?
Pseudomonas fluorescens HK44
fusin nahG-lux
El extracto de raz
inhibe la expresin
de nahG

69
Kamath et al., 2004 Environ Sci Technol 38, 1740-1745

Cul es el efecto de los exudados sobre la

actividad?
Bioluminiscencia total

Degradacin de naftaleno

Crecimiento de biomasa

La proliferacin de genotipos
competentes compensa la
interferencia en la expresin de
nahG

Bioluminiscencia especfica

70
Kamath et al., 2004 Environ Sci Technol 38, 1740-1745

Cul es el efecto de los exudados sobre la

diversidad?

% desap (12d)

68

68
71
Cebron et al., 2011 Environmental Microbiology 13, 722736

Cul es el efecto de los exudados sobre la

diversidad?

El agregado de exudado favorece el aumento la

diversidad de la poblacin de degradadoras y el
aumento del nmero de bacterias conteniendo
genes de la dioxigenasa PAH-RHD
Los exudados modifican las poblaciones de
bacterias degradadoras de naftaleno. Dos
ensambles diferentes pueden tener eficiencias
de degradacin similares.
72
Cebron et al., 2011 Environmental Microbiology 13, 722736

Bioremediacin ex situ:
1. Landfarming
1. Impermeabilizacin
2. Excavado
3. Remocin de piedras
4. Aplicacin (<1.5m)
5. Fertilizacin
6. Arado (oxigenacin)
73

Bioremediacin ex situ:
1. Landfarming
Ventajas
Simple para disear y operar
Tiempos de tratamiento relativamente cortos (6-24 meses)
Desventajas
Requerimiento de grandes reas
Liberacin de compuestos voltiles
Necesidad de impermeabilizacin
Vulnerabilidad a metales pesados
Degradacin incompleta
74

Bioremediacin ex situ:
1. Landfarming

http://www.opds.gba.gov.ar/index.php/leyes/ver/148

Bioremediacin ex situ:
1. Landfarming

Bioremediacin ex situ:
2. Soil piling

Bioremediacin ex situ:
2. Soil piling

78

Bioremediacin ex situ:
2. Biopilas
Ventajas
Relativamente simple para disear y operar
Tiempos de tratamiento relativamente cortos (6-24 m)
La biodegradacin es efectiva para un amplio rango de
contaminantes
Desventajas
Requerimiento de grandes reas (menos que landfarming)
Liberacin de compuestos voltiles
Vulnerabilidad a metales pesados
Los suelos con baja permeabilidad son dificiles de airear
79

Bioremediacin ex situ:
3. Compostaje
Agregado de mat. voluminoso 30%
Agregado de nutrientes
Agregado de materia orgnica
Temp: 55 oC
Ancho: 3-4 m
Altura : 1-1.5 m (minimo)

Grande para retener el calor

Lmite para obtener buena oxigenacin

Aireacin : mezcla (1/d - 1/mes)

Humedad: 40-60%

Buena actividad vs buena oxigenacin

80

Bioremediacin ex situ:
3. Compostaje
Fase latente (Temp ambiente)
colonizacin y aclimatacin)

Fase crecimiento (20C-40C)

altas tasas de respiracin, aumento
de temperatura
Fase

termoflica (40C-60C)
se alcanza el pico de temperatura

Fase

mesoflica (40C-temp amb)

Segunda fase mesoflica (ms

lenta). Transformacin de materia
orgnica en compuestos hmicos,
nitrificacin

Bioremediacin ex situ:
3. Compostaje
Tratamiento de lixiviado
Sujeto a regulacin ambiental
Presencia de metales pesados
Produccin de olores
Relativamente grandes necesidades de espacio
Operacin y monitoreo continuo
82

COMPOCHIP

83
Danon et al. 2008 FEMS Microbiology Ecology 65, 133144

84

85

86

87

Bioremediacin ex situ:
4. Bioreactor (slurry phase)
Suelo
contaminado
Lquido
contaminado

Vapor
Agitador
Control de
temperatura

Nutrientes

Salida de
lquido
Suelo a secar
Entrada de aire
88

Bioremediacin ex situ:
4. Bioslurry
Ventajas
Relativamente rpido (semanas a 6 meses)
Tcnicamente simple y efectivo
Mayor control de variables operativas (pH, temperatura,
oxgeno, nutrientes, etc)
Desventajas
Vulnerabilidad a metales pesados
La deshidratacin del slido tratado puede ser dificil
Se debe disponer el agua no reciclada
Mayor costo
89

Tiempos de biorremediacin
La remediacin in situ depende de la
extensin, profundidad y concentracin de la
contaminacin. Vara entre 1-6 aos
La remediacin ex situ utilizada para
contaminantes fcilmente biodegradables o
cuando se usan bioreactores puede llevar
slo 1-7 meses
90

Ventajas y desventajas de la
biorremediacin
+
Menor costo que
opciones alternativas
En muchos casos no
produce residuos
secundarios

Pozos de inyeccin se
tapan
Problemas de biodisponibilidad
Difcil de implementar
en matrices de baja
permeabilidad
Requiere monitoreo y
mantenimiento continuo
91

Temas importantes en
biorremediacin
Aspectos regulatorios y reportes independientes
de estudios controlados
Bioremediacin de compuestos recalcitrantes en
ambientes complejos
Predicciones basadas en modelos cinticos
tradicionales no funcionan
Cmo saber que est funcionando?
Cun limpio es limpio?
92

Cmo mejorar

la bioremediacin?

93
Ramos et al., Trends in Biotechnology (2011)

doi:10.1016/j.tibtech.2011.06.007

Integracin de microarrays en
biorremediacin

Temas crticos
Especificidad
Sensibilidad
Cuantificacin
94
Wagner et al., Microbial Ecology 53, 498506 (2007)