UNIVERSIDAD MAYOR DE SAN SIMON

FACULTAD DE CIENCIAS Y TECNOLOGIA

INGENIERIA QUIMICA

Aislamiento de microorganismos capaces de

producir PHA (Polihidroxialcanoatos)

DOCENTE: DR. DANIEL GUZMAN DUCHEN

UNIVERSITARIO: NOVILLO CINTRA BRUNO ALEJANDRO
MATERIA: LABORATORIO DE INVESTIGACION
FECHA: 29/11/2013

COCHABAMBA-BOLIVIA

Contenido
1.
INTRODCCION......................................................................................................................... 3
2.

ANTECEDENTES...................................................................................................................... 3

3.

JUSTIFICACION........................................................................................................................ 4

4.

OBJETIVOS............................................................................................................................... 4

5.

4.1.

Objetivo general.......................................................................................................... 4

4.2.

Objetivos especficos.................................................................................................. 4

MARCO TEORICO.................................................................................................................... 5

5.1.

MICROORGANISMOS........................................................................................................... 5

5.2.

CLASIFICACION DE LOS MICROORGANISMOS................................................................5

5.2.1.
I.-

Virus:.................................................................................................................................. 6

5.2.2.
I.

Microorganismos Acelulares........................................................................................... 6
Microorganismos Celulares............................................................................................ 8

Eucariontes............................................................................................................................. 8

a)

Protozoos........................................................................................................................... 8

b)

Hongos microscpicos...................................................................................................... 10

c)

Algas Microscpicas......................................................................................................... 10

II.

Procariotas........................................................................................................................ 11

a)

Bacterias........................................................................................................................... 11

5.3.

Clasificaion de bacterias segn el medio hbitat..................................................................15

Termfilos............................................................................................................................... 15
Psicrfilos.............................................................................................................................. 16
Alcalfilos............................................................................................................................... 16
Halfilos.................................................................................................................................. 16
Otros grupos:......................................................................................................................... 17

5.4.

AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS..........................................................................18

5.5.

OBTENCIN DE CULTIVOS PUROS..................................................................................19

5.6.

PLASTICOS BIODEGRADABLES.......................................................................................20

5.7.

TEST DE IDENTIFICACIN DE BACTERIAS GRAM NEGATIVO.......................................22

6.

MATERIALES Y REACTIVOS................................................................................................. 29

7.

METOLOGIA........................................................................................................................... 31

9.

RESULTADOS......................................................................................................................... 39

10.

CONCLUSIONES................................................................................................................. 47

11.

RECOMENDACIONES........................................................................................................ 48

12.

BIBLIOGRAFIA..................................................................................................................... 49

1. INTRODCCION
Los polihidroxialcanoatos (PHA) son polisteres intracelulares sintetizados por
diferentes especies bacterianas. Las caractersticas fsicas de los PHA como la
densidad, punto de fusin, fuerza de tensin y elongacin son similares a los
plsticos derivados del petrleo, pero, a diferencia de stos, los PHA se degradan
completamente hasta CO2 y H2O.
El costo de produccin de los PHA es superior al del polipropileno. Por esta razn,
en los ltimos aos han surgido varias alternativas para mejorar la produccin de
estos biopolmeros, entre las cuales se destacan: la utilizacin de
microorganismos recombinantes, la polimerizacin in vitro catalizada por PHA
polimerasa, y el uso de ingeniera gentica para la sntesis de PHA en plantas. 1
2. ANTECEDENTES
Los plsticos de origen petroqumico son ampliamente utilizados debido a du fcil
modelamiento y alta resistencia qumica, pero son un problema ambiental, debido
a su alto peso y conformacin molecular, la accin de los microorganismos en los
procesos degradadores es mnima, por lo cual permanecen en el ambiente
durante amplios periodos de tiempo
Las medidas que se han adoptado para solucionar el problema engloba desde el
reciclaje hasta la incineracin de las mismas, las cuales no son soluciones muy
viables debido a los procesos son costosos, no abarcan todos los desechos y
generan emanaciones gaseosas nocivas para el ambiente, las cuales en los
ltimos aos estn siendo ms restringidas por las nuevas legislaciones
ambientales.
La sobre poblacin humana, combinado con el actual estilo de vida exige el uso
racional, eficiente y auto sostenible de fuentes naturales para producir sustancias
amigables para el medio ambiente como los polihidroxialcanoatos (PHA). 2
El primer hidroxialcanoato en ser estudiado fue el poli 3 hidroxibutirato (PHB), el
cual fue descubierto por lemoigue en 1926 (lemoigne, 1926). En 1994 se identifico
el cido 3-hidroxi-2-butenoico producido por la bacteria del genero Nocardia. En
1972, a partir de estudios en aguas residuales, se confirm la presencia de otras
sustancias como los cidos 3-hidroxivalerico (3HV), 3-hidrocihexanoico (3HHx) y
3_hidrociheptanoico (3HHep) mediante la extraccin con cloroformo. En 1976, la
empresa inglesa Imperial Chemical Industries (ICI) empez estudios para producir

Universidad nacional de Colombia, 2008, articulo, bacterias productoras de

polihidroxicalcanoatos (PHA) como una alternativa para la remocin de carga organica de
aguas residuales
2
Sao Paulo-Brasil, Noviembre 2008, Efecto del gen FafH1 en la produccion de PHA
conteniendo monmeros insaturados por Pseudomonas Putida, Diego Armando
Castello Franco

polihidrocibutirato (PHB) a partir de Ralstonia eutropha, depositando en 1981, una

patente para la produccin del copolimero P(3HB-co-3HV). Este copolimero es
conocido como BIOPOL y es obtenido a partir de glucosa y acido propionico.
Cargill dow polymers comercializa sus resinas EcoPla in Japn. Algunas de las
marcas que estn en el mercado actualmente son NODAS TM (Copolimero de
hidroxibutirato e hidroxihexanoato).3
3. JUSTIFICACION
El centro de biotecnologa (CBT) de la Universidad Mayor de San Simn se
encuentra trabajando desde hace ms de 10 aos con microorganismos
extremofilos con el fin de investigar las posibles
aplicaciones de estos
microorganismos y a su vez difundir diferentes tcnicas biotecnolgicas para la
transformacin de recursos naturales de inters en la regin. Entre estos
microorganismos extremofilos el CBT viene trabajando especialmente con
microorganismos halfilos como ser la cepa Halomonas boliviensis la cual produce
grandes cantidades de plsticos biodegradables, polihidroxibutirato (PHB). Es por
este motivo que se debe estudiar e identificar nuevos microorganismos halfilos
para analizar sus posibles aplicaciones biotecnolgicas.
La aplicacin de la difusin de las tecnologas desarrolladas en el centro estn
orientadas a mejorar las condiciones de nutricin, salud y proteccin ambiental;
por lo tanto su explotacin deriva en nuevas y ms eficientes formas de prevenir y
combatir enfermedades, en la optimizacin de procesos industriales, el desarrollo
de nuevos productos farmacuticos y el desarrollo de nuevas fuentes de energa

4. OBJETIVOS
4.1. Objetivo general

Aislar microorganismos halfilos de lagunas salinas en la regin Sud Lipez

(Potos) para analizar posteriormente su capacidad de produccin de
polihidroxialcanoatos (PHAs)

4.2. Objetivos especficos

1. Aislar bacterias halfilas de muestras liquidas de lagunas salinas
localizadas en Potos
2. Obtener cepas puros de las muestras con las que se trabaje
3. Estudiar la capacidad de produccin de plsticos biodegradables
(polihidroxibutirato PHB) de las colonias separada
Sao Paulo-Brasil, Noviembre 2008, Efecto del gen FafH1 en la produccion de PHA
conteniendo monmeros insaturados por Pseudomonas Putida, Diego Armando
Castello Franco
3

5. MARCO TEORICO
5.1.

MICROORGANISMOS

Un microorganismo, tambin llamado microbio, es un ser vivo que solo puede

visualizarse con el microscopio. La ciencia que estudia los microorganismos es la
microbiologa. Son organismos dotados de individualidad que presentan, a
diferencia de las plantas y los animales, una organizacin biolgica elemental. En
su mayora son unicelulares, aunque en algunos casos se trate de organismos
centicos compuestos por clulas multinucleadas, o incluso multicelulares.
El concepto de microorganismo carece de cualquier implicacin taxonmica o
filogentica dado que engloba organismos unicelulares no relacionados entre s,
tanto procariotas como las bacterias, como eucariotas como los protozoos, una
parte de las algas y los hongos, e incluso entidades biolgicas de tamao
ultramicroscpico, como los virus. Estos ltimos generalmente no son
considerados seres vivos y por lo tanto no son microorganismos en sentido
estricto; no obstante, tambin estn incluidos en el campo de estudio de la
microbiologa.
Muchos microorganismos son patgenos y causan enfermedades a personas,
animales y plantas, algunas de las cuales han sido un azote para la humanidad
desde tiempos inmemoriales. No obstante, la inmensa mayora de los microbios
no son en absoluto perjudiciales y bastantes juegan un papel clave en la biosfera
al descomponer la materia orgnica, mineralizarla y hacerla de nuevo asequible a
los productores, cerrando el ciclo de la materia.4
5.2.

CLASIFICACION DE LOS MICROORGANISMOS

Los microorganismos los podemos clasificar segn su organizacin en acelulares

y celulares. En el primer grupo se encontraran los virus, priones y viroides,
mientras que en el segundo grupo nos encontraramos con otros dos subgrupos:
los procariotas, donde estaran las bacterias y los eucariotas donde estaran los
protozoos, las algas microscpicas y los hongos microscpicos.
En el siguiente cuadro, podemos observar los
microorganismos, y el reino al que pertenecen,
detenidamente de cada uno de ellos:

http://es.wikipedia.org/wiki/Microorganismo

diferentes tipos de
despus hablaremos

Tabla # 5.1 Clasificacin De Microorganismos

Fuente:
https://sites.google.com/site/micr00rganism0salba/clasificacion-de-losmicroorganismos
5.2.1. Microorganismos Acelulares
I.-

Virus:
Los virus son entidades no celulares de muy pequeo tamao. Son agentes
infectivos de naturaleza obligadamente parasitaria intracelular, que necesitan su
incorporacin al protoplasma vivo para que su material gentico sea replicado, y
que pueden transmitirse de una clula a otra. Cada tipo de virus consta de una
sola clase de cido nucleico (ADN o ARN, nunca ambos), con capacidad para
codificar varias protenas, algunas de las cuales pueden tener funciones
enzimticas, mientras que otras son estructurales, disponindose stas en cada
partcula virsica (virin) alrededor del material gentico formando una estructura
regular (cpsida)
Estructura:
Los virus presentan una amplia diversidad de formas y tamaos. Una partcula
vrica completa, conocida como virin, consiste en un cido nucleico rodeado por
una capa de proteccin proteica llamada cpside.
-cido nucleico: contiene la informacin especfica y el potencial para modificar
operaciones en la clula infectada. Los virus pueden tener distintos tipos de cidos
nucleicos y las molculas de stos pueden presentar diversas formas. As pueden
contener ADN o ARN. Pueden estar formados por una sola cadena, siendo
entonces monocatenarios, o por dos, bicatenarios. Las molculas de cido
nucleico pueden ser circulares o lineales. Algunos virus presentan el genoma
fragmentado como ocurre con el virus de la gripe que posee ocho fragmentos de
ARN monocatenario.

-Cpside: es la estructura proteica que rodea al cido nucleico. El conjunto

formado por el cido nucleico y la cpsida recibe el nombre de nucleocpsida
vrica. En algunos virus la cpsida est formada por un solo tipo de protenas, pero
en la mayora est formada por la asociacin de varias cadenas polipeptdicas
distintas. Las cadenas polipeptdicas se asocian y dan lugar a las unidades
morfolgicas de la cpsida, los capsmeros. La forma de los virus viene
determinada por la forma de unin de los capsmeros.
Figura # 5.1 Estructura de un virus complejo y un virus con envoltura

Fuente:
https://sites.google.com/site/micr00rganism0salba/clasificacion-de-losmicroorganismos
En general, estas son las principales morfologas vricas:
-Helicoidal: es la organizacin ms sencilla, formados por un nico tipo de
protenas, se disponen en torno al cido nucleico y dan lugar a estructura
cilndrica. Esta formacin produce viriones en forma de barra o de hilo, pueden
ser cortos y muy rgidos, o largos y muy flexibles.
- Polidricos: los ms simples de este tipo son los icosadricos, que poseen 20
caras, cada una de las cuales es un tringulo equiltero formado por la unin de
tres protenas distintas. Cuanto mayor sea el nmero de caras, ms esfrico
parece el virus.
-Complejas o mixtas: combinan las estructuras helicoidal y polidrica A la porcin
polidrica, se le llama cabeza, en cuyo interior se encuentra el cido nucleico, y la
porcin helicoidal constituye la cola. Algunos virus poseen una placa basal y,
adems, espculas y fibras que le ayudan a unirse a la clula que van a infectar.
-Envoltura membranosa: algunos virus poseen por fuera de la cpside una
membranosa, que es un fragmento de la clula en la que se reprodujo. Esta
membrana est constituida por una bicapa lipdica que procede de la clula

hospedadora y por protenas insertadas en la bicapa codificadas por el genoma

vrico.
La cubierta o envoltura vrica est implicada en el reconocimiento entre la partcula
vrica y su clula hospedadora, por lo que los virus dependen de ella para poder
infectar. Los virus que poseen cubierta se llaman virus envueltos, y los que
carecen de ella, virus desnudos.
5.2.2. Microorganismos Celulares
I.
Eucariontes
Se denomina eucariotas a todas las clulas que tienen su material hereditario (su
informacin gentica) encerrado dentro de una doble membrana, la envoltura
nuclear, que delimita un ncleo celular.
Hay tres tipos de microorganismos eucariotas, los protozoos (hetertrofos y sin
pared celular), las algas microscpicas (auttrofos y con pared celular de celulosa)
y los hongos microscpicos (hetertrofos y con pared celular de quitina).
a) Protozoos
Los protozoos son microorganismos eucariotas, unicelulares, hetertrofos, sin
pared celular. La mayora son de vida libre en medios acuticos o hmedos,
aunque algunos se han adaptado al parasitismo en animales y vegetales
produciendo enfermedades, o simbiosis con ellos.
Se reproducen asexualmente por biparticin y sexualmente, normalmente por
conjugacin.
La respiracin en algunos protozoos es aerobia y en otros anaerobia. En la
primera toman el oxgeno de su medio ambiente y expulsan el dixido de carbono
a travs de la membrana celular. En la segunda necesitan metabolizar ciertas
sustancias de las cuales obtienen el oxgeno.
Estructura:
En los protozoos se distingue una forma activa que se conoce en la mayora de
ellos con el nombre de forma vegetativa o trofozoito. En muchos casos, el
trofozoito tiene la capacidad de transformarse en una forma de resistencia,
conocida como quiste.

El componente fundamental del cuerpo del protozoo es el protoplasma, el cual

est diferenciado en ncleo y citoplasma.
Ncleo: los ncleos de los protozoos tienen formas, tamaos y estructuras
variadas. La mayora de los protozoos contienen un solo ncleo, pero hay muchos
que tienen dos o ms ncleos. El ncleo aparece como una vescula constituida
por una membrana perfectamente definida que envuelve el nucleoplasma en el
que se encuentran el o los nucleolos y la cromatina nuclear. Estructuralmente, los
ncleos pueden clasificarse en dos tipos principales: vesicular (en el que casi
siempre se pueden observar uno o varios nucleolos que destacan sobre el resto
del material cromatnico) y compacto (en el que el material cromtico aparece de
un tamao uniforme, llenando casi todo el ncleo, por lo que ste toma un aspecto
denso y compacto).
Citoplasma: La parte extra nuclear del cuerpo del protozoo es el citoplasma.
Est compuesto de un sistema coloidal que a menudo est formado por una parte
perifrica, densa, denominada ectoplasma, y otra parte medular fluida llamada
endoplasma. En el citoplasma se encuentran distintos orgnulos como
mitocondrias, aparato de Golgi, vacuolas (pulstiles o digestivas), retculo
endoplasmtico, etc. que participan en las distintas funciones inherentes a la vida
del protozoo. La superficie del cuerpo esta cubierta por una membrana cuya
estructura se corresponde, en principio, con la membrana unidad de cualquier
clula. Este sera el caso de la plasma-membrana o plasmalema de muchos
protozoos (amebas y algunos flagelados). En otros protozoos, como en los
ciliados, la membrana limitante del cuerpo presenta una estructura mas
complicada y recibe el nombre de pelcula.
Figura # 5.2 Estructura de un protozoo

Fuente:
https://sites.google.com/site/micr00rganism0salba/clasificacion-de-losmicroorganismos

b) Hongos microscpicos
Los hongos son microorganismos eucariotas unicelulares o pluricelulares carentes
de pigmentos fotosintticos, por lo que no pueden realizar la fotosntesis, tienen
por lo tanto una nutricin hetertrofa mediante la absorcin de alimento orgnico
muerto (nutricin saproftica) previamente digerido en el exterior de las clulas
gracias a la secrecin de potentes enzimas.
La mayora de los hongos viven en ambientes terrestres, bien en el suelo o sobre
materia vegetal muerta, a cuya descomposicin contribuyen. Muchos hongos son
parsitos de plantas y animales.
Los hongos pluricelulares forman esporas que al desprenderse y germinar
producen filamentos microscpicos denominados hifas, cuyas clulas pueden
estar completamente separadas (hifas septadas) o bien incompletamente o bien
incompletamente (sinfonadas). El conjunto de las hifas de un hongo se denomina
micelio. Muchas esporas se forman despus de la reproduccin sexual mediante
la fusin de gametangios, como las oosporas de los oomicetes y las zigosporas de
los zigomicetes, o bien dentro de esporangios como las ascas (ascosporas) y los
basidios (basidiosporas).
c) Algas Microscpicas
Figura # 5.3 Algas Microscopicas

Fuente:
https://sites.google.com/site/micr00rganism0salba/clasificacion-de-losmicroorganismos

Son organismos auttrofos de organizacin sencilla, que hacen la fotosntesis

productora de oxgeno. Pertenecen al reino Protista. Forman un grupo muy
heterogneo pues se encuentran especies unicelulares, pluricelulares
microscpicas o macroscpicas, e incluso especies de gran talla (hasta mas de 20
metros) que por su forma semejan plantas superiores al disponer de falsas races,
tallos y hojas. Las algas viven perfectamente en medios acuticos. Siendo de gran
importancia las de origen marino (fitoplancton), pues constituyen el primer eslabn
de la cadena alimentaria marina. Otras viven en aguas dulces, termales, en el
fango o incluso sobre la corteza de los hongos.
Las algas contienen cloroplastos donde se encuentran los pigmentos
fotosintticos, entre los que hay varios tipos de clorofilas, xantofilas y
carotenoides. La pared celular suele ser de celulosa, como en las plantas
superiores, pero a veces se les aaden otras molculas como pectina, xilanos y
mananos. En ocasiones, a los componentes de la pared celular se les aaden
sustancias minerales como el carbonato clcico o slice, que endurecen la cubierta
de la clula. Hay tambin algunas algas unicelulares que carecen de pared celular.
Como mecanismos de locomocin tienen los flagelos y el movimiento deslizante.
La clasificacin de los diferentes grupos de algas tiene en cuenta, entre otros
caracteres, los pigmentos fotosintticos presentes, los materiales de reserva del
citoplasma y la composicin de la pared celular.
II.

Procariotas

Se llama procariotas a las clulas sin ncleo celular diferenciado, es decir, cuyo
material gentico se encuentra disperso en el citoplasma, reunido en una zona
denominada Nucleoide.
a) Bacterias
Anatoma de una bacteria sencilla
Una bacteria simplificada est formada por tres capas externas que envuelven las
estructuras internas; la capa pegajosa protege la pared celular rgida, que a su vez
cubre la membrana celular semipermeable. El flagelo es un medio de locomocin
y los pelos que se extienden por fuera de la cpsula ayudan a la bacteria a
sujetarse a las superficies. El material gentico est contenido en el ADN que
forma el nucleoide. Los ribosomas que flotan en el citoplasma intervienen en la
sntesis de protenas.

El material gentico de la clula bacteriana est formado por una hebra doble de
ADN circular (vase cidos nucleicos). Muchas bacterias poseen tambin
pequeas molculas de ADN circulares llamados plsmidos, que llevan
informacin gentica, pero, la mayora de las veces, no resultan esenciales en la
reproduccin. Muchos de estos plsmidos pueden transferirse de una bacteria a
otra mediante un mecanismo de intercambio gentico denominado conjugacin.
Otros mecanismos por los cuales la bacteria puede intercambiar informacin
gentica son la transduccin, en la que se transfiere ADN por virus bacterianos
(vase Bacterifago), y la transformacin, en la que el ADN pasa al interior de la
clula bacteriana directamente desde el medio.
Las clulas bacterianas se dividen por fisin; el material gentico se duplica y la
bacteria se alarga, se estrecha por la mitad y tiene lugar la divisin completa
formndose dos clulas hijas idnticas a la clula madre. As, al igual que ocurre
en los organismos superiores, una especie de bacteria origina al reproducirse slo
clulas de la misma especie. Algunas bacterias se dividen cada cierto tiempo
(entre 20 y 40 minutos). En condiciones favorables, si se dividen una vez cada 30
minutos, transcurridas 15 horas, una sola clula habr dado lugar a unos mil
millones de descendientes. Estas agrupaciones, llamadas colonias, son
observables a simple vista. En condiciones adversas, algunas bacterias pueden
formar esporas, que son formas en estado latente de la clula que permiten a sta
resistir las condiciones extremas de temperatura y humedad.
Clasificacin:
La clasificacin taxonmica ms utilizada divide a las bacterias en cuatro grandes
grupos segn las caractersticas de la pared celular. La divisin Gracilicutes
incluye a las bacterias con pared celular delgada del tipo Gram negativas; las
bacterias de la divisin Firmicutes tienen paredes celulares gruesas del tipo Gram
positivas; las de la Tenericutes carecen de pared celular y las de la cuarta divisin
Mendosicutes tienen paredes celulares poco comunes, formadas por materiales
distintos a los tpicos peptidoglucanos bacterianos. Entre las Mendosicutes se
encuentran las Arquebacterias, un grupo de organismos poco comunes, que
incluyen a las bacterias metanognicas, anaerobias estrictas, que producen
metano a partir de dixido de carbono e hidrgeno; las halobacterias, que
necesitan para su crecimiento concentraciones elevadas de sal, y las
termoacidfilas, que necesitan azufre y son muy termfilas. Se ha discutido sobre
la conveniencia de que las Arquebacterias se incluyeran en un reino aparte, ya
que estudios bioqumicos recientes han mostrado que son tan diferentes de las
otras bacterias como de los organismos eucariotas (con ncleo diferenciado
englobado en una membrana). Estos cuatro grandes grupos de bacterias se

subdividen adems en unas 30 secciones numeradas, alguna de las cuales se

dividen a su vez en rdenes, familias y gneros.
Las bacterias son organismos relativamente sencillos. Las principales partes en
las que se divide una bacteria son:
Figura # 5.4 Estructura de una bacteria

https://sites.google.com/site/micr00rganism0salba/clasificacion-de-losmicroorganismos
-Cpsula: Capa gelatinosa de naturaleza glucoproteica, rodea por la parte externa
a algunas bacterias. Es una proteccin contra la accin de los anticuerpos y la
fagocitosis y evita la prdida de humedad. Las bacterias con cpsula son ms
virulentas (patgena).
-Pared celular: Es una envoltura rgida y fuerte que da forma a las clulas
bacterianas. Evita los posibles daos que producen cambios de presin osmtica.
Existen dos tipos:
-La Gram positiva: son ms gruesas y esta compuesta por una capa de
glucopeptidos.

-La Gram negativa: compuesta por dos capas, una de glucopeptidos rodeada de
una bicapa fosfolipdica, lipoprotenas y glucolipdica. Son ms resistentes a los
antibioticos.

Figura # 5.5 Diferencia entre Gram positivas e Gram negativas.

Fuente:
https://sites.google.com/site/micr00rganism0salba/clasificacion-de-losmicroorganismos

-Membrana plasmtica: Es una envoltura que rodea al citoplasma bacteriano. Su

estructura y composicin es similar a la membrana de eucariotas. Controla el
intercambio de sustancias con el medio y presenta ciertas evaginaciones,
llamadas mesosomas (Prolongaciones internas de la membrana plasmtica que
contienen enzimas respiratorios y colaboran en el proceso de la divisin celular).
-Citoplasma: Medio celular limitado por las membranas, muy semejante al de la
clula eucariota. En el se realizan la mayora de las reacciones metablicas de la
bacteria.
-Ribosomas: Son orgnulos globulares encargados de sintetizar protenas a partir
de la informacin gentica que les llega del ADN.
-Cromosoma (nucleoide): es una regin irregular que contiene una molcula de
ADN circular y doble no asociado a histonas. Contiene la informacin gentica.
Suele haber un cromosoma accesorio, llamado plasmido o episoma, que contiene
la informacin necesaria para la formacin de pilis, la resistencia a antibiticos, la
degradacin de sustancias naturales,
-Pilis (Pelos): Filamentos protenicos derivados de la pared que funcionan como
estructuras de fijacin. Algunos estn huecos y permiten el intercambio de material
gentico en el mecanismo parasexual.

https://sites.google.com/site/micr00rganism0salba/clasificacion-de-losmicroorganismos

-Flagelos:Son prolongaciones cuya longitud es varias veces la de la bacteria.

Aparecen en nmero entre 1 y 100 Intervienen en el desplazamiento y su
estructura no es homloga a la de los flagelos de eucariotas. 5

https://sites.google.com/site/micr00rganism0salba/clasificacion-de-losmicroorganismos

5.3.

Clasificaion de bacterias segn el medio hbitat

Microorganismos Extremofilos
La palabra extremfilo proviene del griego filo, que significa afecto o amor. Es
decir, el significado de extremfilo es "amante" de las condiciones extremas.
Estas condiciones extremas, fuera de las comnmente llamadas normales,
podramos resumirlas en:
1. Temperaturas muy elevadas (44 121 C) o bajas (-2, 20C)
2. Alta salinidad (NaCl 2-5M)
3. Alta alcalinidad (pH arriba de 8) y/o alta acidez (pH menor de 4)
Existen varias clases de extremfilos y se clasifican atendiendo al ambiente en el
que viven.
Figura # 5.6 Clasificacin de microorganismos extremofilos

Termfilos
Estos organismos tienen un crecimiento ptimo en temperaturas situadas entre los
70-80C. Sus hbitats comunes son las fuentes termales volcnicas terrestres,
termales submarinas, etc. La adaptacin de estos organismos es debido a la alta
estabilidad trmica de sus enzimas.
Ejemplos:
1. Bacterias Thermus acuaticus: crecen a T mayores de 70C
2. Sulfolobus acidocaldarius: crece a partir de 85C
3. Pyrolobus fumarii: temperatura ptima de crecimiento es de 105C.

Psicrfilos
Estos organismos presentan un desarrollo ptimo a bajas temperaturas. (Desde
los 20C hasta los -5C). Las protenas poseen unas caractersticas que hacen
que pierdan su rigidez y ganen flexibilidad en su estructura para la realizacin de
sus funciones catalticas en las condiciones de bajas temperaturas. Las
membranas contienen mayor proporcin de cidos grasos no saturados,
permitiendo as que su fluidez y capacidad de transporte se mantenga bajo
condiciones muy fras.
Ejemplos:
- Bacterias gram negativas: Moraxella, Psychrobacter, Polaribacter, Moritella,
Vibrio y Pseudomonas.
- Bacterias gran positivas: Arthrobacter, Bacillus y Micrococcus.
- Arqueas: Methanogenium, Methanococcoides y Halorubrum.
- Hongos y levaduras: Penicillium, Cladosporium, Cndida y Cryptococcus
Alcalfilos
Son organismos que viven en ambientes con pH por encima de 9. Sus hbitats
son muy bsicos, como lagos sdicos y suelos muy carbonatados. Estos
organismos necesitan aislar el interior de la clula del medio alcalino exterior, ya
que algunas molculas especialmente las hechas de ARN se rompen a pH
superior a 8.
Ejemplos:

Bacterias aerbicas no marinas, muchas especies de Bacillus Spirulina

(cianobacterias) Arqueas.
Algunos alcalofilos son tambin halfilos, la mayor parte de estos
pertenecen al dominio Archaea.

Halfilos
Se refiere a los organismos que habitan en medios con presencia abundante de
sales. Sus hbitats son zonas litorales, salinas y lagunas salobres. En organismos
normales, la sal hace que mueran por deshidratacin debido a la smosis. Si el

entorno es salino, con mucha concentracin de sales, el agua del interior de las
clulas tiende a salir hacia su exterior. Es decir, se desecan y mueren. Uno de los
mecanismos que han desarrollado, es el de albergar en el interior de sus tejidos,
concentraciones de un soluto compatible a las sales (como cido
polihidroxibutrico o PHB) mayores que en el exterior. As el agua penetra por
smosis. La mayora de estos halfilos pertenecen al dominio Archaea.
Ejemplos:
Gnero Halobacterium, que viven en entornos como el Mar Muerto, como la
Haloarcula marismortui.
Acidfilos
Organismos que viven en medios con pH menor de 5. Para soportar el bajo pH,
estos organismos emplean una gama de mecanismos, como una superficie de
membrana cargada positivamente, una alta capacidad reguladora interna y
sistemas nicos de transporte.
Ejemplos:

Ferroplasma acidarmanus, crece en ambientes de pH cercano a cero.

Cyanidyum caldariuym, es capaz de vivir en pH cercano a cero
manteniendo el interior de la clula en un nivel casi neutro.
Acontium cylatium, Cephalosporium sp y Trichosporon cerebriae
(eucariotas del reino fung).

Otros grupos:
1. Anhidrobiticos o xerfilos: Viven en ausencia de agua o son capaces
de resistir la desecacin viviendo con muy poca. Ejemplo: Selaginella
lepidophylla

2. Barfilo o Piezfilo: Se desarrollan en ambientes con presin muy alta

(lechos ocenicos profundos de hasta once mil metros de profundidad: fosa
de las Marianas)
3. Criptoendolitos: Organismo de suelos profundos. Viven a muchos metros
bajo el suelo, incluso en medio de rocas; el Bacillus infernus fue aislado a

2700 metros bajo la superficie del suelo; el Desulforudis audaxviator fue

encontrado entre 1500 y 2800 metros de profundidad, en el suelo de una

mina de oro (Cuenca de Witwatersand, Sudfrica) donde soporta una

temperatura de sesenta grados centgrados y un pH de 9,33.
4. Metalotolerantes: Organismos que sufren altas concentraciones de metal
en su entorno (cobre, cadmio, arsnico, zinc). Por ejemplo, el Ferroplasma
y el Cupriavidus metallidurans, que tolera el arsnico.
5. Radifilo: Soportan gran cantidad de radiacin, como la bacteria
Deinococcus radiodurans, el Thermococcus gammatolerans, o unos
microbios recogidos en los acantilados de Devon, Inglaterra, que
consiguieron sobrevivir casi 600 das expuestos a los rayos csmicos y sin
oxgeno.
6. Poliextremfilos: Acumulan resistencias diversas a varios ambientes
hostiles: Deinococcus radiodurans, Kineococcus radiotolerans, el
Thermococcus gammatolerans o el Sulfolobus acidocaldarius)
7. Los tardgrados: Se deshidratan para quedar como muertos durante
cientos de aos en condiciones de criptobiosis y pueden resistir en el
espacio.6
5.4.
AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS
Figura # 5.7 Crecimiento De Microorganismos En Una Caja Petri

Fuente:
http://www.pomif.com/pages/practicas/bacteriologia/aislamiento/_img/_introduccion
/image002/!

http://www.astrofisicayfisica.com/2013/05/clasificacion-de-los-extremofilos-curso.html

Es la separacin de un determinado microorganismo del resto de microorganismos

que le acompaan. El mtodo ms usual es la siembra por estra sobre un medio
de cultivo slido adecuado dispuesta en una placa de Petri como se puede
observar en la figura # 5.7.
Para ello se toma una pequea cantidad de muestra con un asa de platino y se
reparte sobre la superficie del medio de cultivo. Sobre el medio quedan separadas
e inmovilizadas las clulas bacterianas. Tras la incubacin en condiciones
adecuadas, cada clula viable origina una colonia visible resultado de sucesivas
divisiones celulares. Cada colonia bacteriana tiene unas caractersticas
determinadas en cuanto a su forma, borde, elevacin, tamao , consistencia, etc..
Los tipos de bacterias presentes en la muestra original es visible como tipos
diferentes de colonias. A partir de colonias separadas suficientemente es posible
obtener un cultivo puro de cada uno de los tipos de bacterias presentes en la
muestra original.
El xito del aislamiento, de la separacin sobre el medio de cultivo, depende de la
superficie sobre la que se ha distribuido la muestra. Es muy importante realizar el
mayor nmero de estras posible. En las primeras estras aparecern colonias
confluentes o una masa continua de microorganismos. En las estras finales
debern aparecer colonias separadas unas de otras. El aislamiento requiere un
reducido inculo de partida. La sucesiva disminucin del tamao de la poblacin
sobre el asa (por descarga sobre el medio de cultivo) al recorrer el medio de
cultivo, debe asegurar que finalmente algunas clulas queden suficientemente
separadas (aisladas unas de otras) sobre la superficie.
Criterios para la diferenciacin de colonias El aspecto de las colonias, su
coloracin, tamao, etc. permiten diferenciar diferentes bacterias, aunque son
propiedades generales muy influenciadas por las condiciones de cultivo, por lo que
a continuacin se realiza una descripcin muy general. Las colonias pueden ser
opacas, translucidas o transparentes. Algunas producen pigmentos fluorescentes
cuando se iluminan con luz ultravioleta. Otras aparecen con superficie
pulverulenta, otras son lisas, o rugosas, o poseen anillos concntricos. En
ocasiones el olor es tambin caracterstico.
5.5.
OBTENCIN DE CULTIVOS PUROS
Se trata de obtener el cultivo de un solo tipo microbiano en un medio de cultivo,
por ejemplo en un tubo inclinado de agar nutritivo. Para ello, se obtiene una
pequea cantidad de masa bacteriana de una colonia separada en el aislamiento.
Con ella se inocula un nuevo medio de cultivo haciendo estras muy juntas. La

Incubacin en condiciones adecuadas proporcionar un cultivo puro. Puede

repetirse el proceso con cada tipo de colonia. Se obtendr una coleccin de
cultivos puros, separados, de los microorganismos que coexistan en la muestra
original.
Es aconsejable hacer un segundo aislamiento antes de proceder a la obtencin
del cultivo puro. Si todas las colonias de la segunda placa resultan idnticas,
puede usarse una de ellas para establecer el cultivo puro. Obtenido el cultivo puro
es conveniente comprobar su pureza mediante una tincin de Gram. Los cultivos
puros de microorganismos son mantenidos en el laboratorio por resiembras (pase
de un medio de cultivo a otro) sucesivas. Una de las copias puede ser liofilizada
para su conservacin.7
5.6.
PLASTICOS BIODEGRADABLES
El plstico biodegradable est fabricado con materias primas orgnicas que
proceden de fuentes renovables, como la fcula de patata , que al final de su vida
til, al ser eliminado como residuo orgnico, este se descompone en un corto
perodo de tiempo, en presencia de microorganismos; sirviendo de abono orgnico
para las plantas.
La norma europea UNE 13432 especifica los requisitos y procedimientos para
determinar la biodegradabilidad y compostabilidad de este material en un mximo
de seis meses sin ecotoxicidad del humus. Es importante tener en cuenta que no
todos los plsticos biodegradables son compostables y viceversa, nicamente los
que cumplan la normativa UNE 13432 cumplen estas especificaciones. 8
5.6.1. Clasificacin de los Plsticos Biodegradables:
1. Polmeros qumicamente sintetizados: son susceptibles a la accin de
microorganismos y no pueden ser usados con fines comerciales debido a
su alta tasa de biodegradabilidad Ejm: cido poliglicolicol, alcohol
polivinilico, etc
2. Pastico biodegradables a base de almidn: en este tipo de plstico, el
almidn acta como complemento y la vez sirve como relleno y agente
adherente para crear una mezcla entre pastico y almidn (almidn
polietileno). Las bacterias del suelo degradan el almidn y tambin alteran
la matriz del plstico, aumentando la biodegradabilidad pero generando
nuevos compuestos recalcitrantes que quedaran en el ambiente durante
largos periodos de tiempo
3. Polihidroxialcanoatos son los nicos polmero 100% biodegradables
7

Universidad de Granada, 2006, artculo cientfico, Tcnicas de cultivo. Aislamiento.

Obtencin de cultivos puros
8
http://es.wikipedia.org/wiki/Pl%C3%A1stico_biodegradable

5.6.2. Polihidroxialcanoatos
Polihidroxialcanoatos (PHAs) son una familia de polisteres compuestos
principalmente de cidos hidroxialcanoicos acumulados en forma de granulos
intracelulares acumulados en forma de grnulos, que pueden representar hasta el
80% de la masa celular figura # 5.2. Los cuales sirven como fuente de carbono y
enegia y equivalentes reductores. Son producidas bajo condiciones
desbalanceadas de cultivo, decir con exceso en la fuente carbono y limitacin en
los elementos esenciales (Nitrgeno N, Azufre S, Oxigeno O, Fosforo P, Magnesio
Mg)

Figura # 5.8. Microfotografia electrnica de Pseudomonas putida con grnulos de

PHA (luengo et al. 2003)
La acumulacin de este polmero se puede considerar una estrategia desarrollada
por las bacterias para su supervivencia en ambientes cambiantes. Ademas de
servirle a la clula como fuente de carbono, los PHA tambin sirven como fuente
de energa para el proceso de enquistamiento (Azetobacter sp.) y esporulacin
(bacillus sp.), para la fabricacin la proteccin de complejo nitrogenasa en las
bacterias fijadorasd de nitrgeno, ya que el PHA actua como compuesto oxidable y
tambin es constituyente de la membrana citoplasmtica de bacterias. 9

Sao Paulo-Brasil, Noviembre 2008, Efecto del gen FafH1 en la produccion de PHA
conteniendo monmeros insaturados por Pseudomonas Putida, Diego Armando
Castello Franco
9

5.7.

TEST DE IDENTIFICACIN DE BACTERIAS GRAM NEGATIVO

El Biolog GN2 (gram negativas) de microplacas est diseado para la

identificacin y caracterizacin de muy amplia gama de bacterias gram negativas
aerobias. Microplacas y base de datos de Biolog se introdujeron por primera vez
en 1989, que emplea un novedoso patentado qumica redox . Esta qumica,
basado en la reduccin de tetra sodio, responde al proceso de metabolismo en
lugar de a metablica por productos. La qumica de Biolog funciona como un
reportero universal de metabolismo y simplifica el proceso de prueba como
productos qumicos de revelado de color no necesitan ser aadido. Desde el GN2
de microplacas no depende de crecimiento para producir identificaciones que
proporciona la capacidad de superior para todos los tipos de organismos gram
negativos; fermentadores, los no fermentadores y organismos fastidiosos todos se
identifican con un solo panel de la base de datos para la microplaca GN2 es ahora
ms de 500 especies es , con mucho, la base de datos de identificacin basada en
kit ms grande disponible .
5.7.1. GN2 MICROPLACAS
La biologa GN2 microplacas realizar 95 pruebas discreto al mismo tiempo y da un
patrn de reacciones caracterstico llamado una huella dactilar metablica. Estos
patrones de reaccin de huellas digitales proporcionan una gran cantidad de
informacin contenida convenientemente en una sola biologa de microplacas. Los
patrones de huellas dactilares metablicas se comparan un especimen identificado
con el software de base de datos Microlog . Otros mtodos de identificacin por
medio de kits aerbicos se basan en un nmero mucho menor o prueba. En
consecuencia, la limitacin significativa de estos productos es el nmero limitado
de especies y tipos de organismos que se pueden identificar. Adems, estos
productos fueron diseados para abordar las necesidades de la prueba clnica /
hospital de rutina. La biologa GN2 microplacas fue diseado para atender las

necesidades de ms amplio rango para los usuarios, incluyendo los laboratorios

de pruebas ambientales y de los animales y los laboratorios de enfermedades de
las plantas , as como laboratorios de referencia clnica .
Hay aproximadamente 4.000 especies de bacterias nombradas y esto es slo una
fraccin del nmero total de especies en el medio ambiente. El Sistema
MicroLog ofrece la caracterstica nica de las bases de datos definidas por el
usuario personalizados. Si un organismo se encuentra fuera de la base de datos
MicroLog , el usuario puede guardar el patrn a una base de datos personalizada
para referencias futuras. Si el organismo se asla de nuevo, el laboratorio tendr el
patrn guardado en lugar de simplemente obtener una " sin identificacin.
Algunos otros mtodos proporcionan suplementarios pruebas fuera de lnea para
su uso junto con el panel de identificacin. Este enfoque es inconveniente y no
produce una biblioteca patrn expandido. Una identificacin de la microplaca
Biolog GN2 es superior a mtodos menos precisos debido a que:
1. El Sistema MicroLog basa su identificacin en aMayor nmero de pruebas .
Hay ms de 4 x 1.028 patrones posibles de una sola microplaca
2. El Sistema MicroLog cubre muchas ms especies
3. mtodos o de edad avanzada se han desarrollado para detectar patgenos
clnicos de rutina , y no se identifican adecuadamente otros organismos
importantes, tales como: . spp Acinetobacter , Aeromonas spp , Bordetella
spp , Haemophilus spp , Pseudomonas spp , Vibrio spp y Yersinia spp

Varios mtodos tienen diferentes nmeros y tipos de organismos dentro de su

base de datos. La Tabla 5.2 , compara varios mtodos por medio de kits
populares. El Biolog GN2 microplaca tiene nmero mucho mayor de pruebas , que
proporciona una mayor discriminacin de huellas digitales y una base de datos
mayor .

fabricante
Biolog , Inc Microlog
BioMerieux Vick GNI +
API BIoreieux 20 y NFT
BBL Crystal

Nmero
de
especies
aerobias en la
base de datos
501
104
180
105

Nmero de
pruebas
usado para
la deteccin
95
29
20
28

Tabla 5.2. Comparacin de la prueba Commercial Kits para Gramnegativos

Para ms de un nmero limitado de pruebas utilizadas para identificar un
desconocido, algunos mtodos se basan principalmente en la fermentacin de
azcares. Este enfoque no proporciona la necesaria medio ambiente para cada
organismo de inters. Muchas bacterias no pueden utilizar azcares a travs de
un proceso fermentativo y reaccionar dbilmente o nada en absoluto con estos
mtodos. El nmero ms grande y ms diversa gama de pruebas en el GN2
microplaca proporcionar para mayor exactitud y precisin.
El GN2 microplaca ha demostrado una precisin comparable a los mtodos
moleculares y sin el gasto. Tabla 3, proporciona resultados representativos de un
estudio independiente con no rutinaria aislados en comparacin con un mtodo
molecular:10
BIOLOG
porcentaje de respuestas correctas a nivel
INC
de especie
Microlog
fermantadores
80%
no fermentadores
88%
global
85%

Metodo
molecular
72%
100%
89%

Tabla 5.3: Tcnicas de Comparacin de la fenotpica y genotpica

10

Comparison of Phenotypic and Genotypic Techniques of Identification of Unusual

Aerobic Pathogenic Gram Negative Bacilli. Y.W. Tang, N.M. Ellis, M.K. Hopkins, D.E.
Dodge, and D.H. Persing,Journal of Clinical Microbiology, December 1998, p. 3674-3679

5.7.2. Biolog Gen II Revolucionario

Sistema de Identificacin Microbiolgica. La segunda generacin de ID
microbiolgica con las siguientes ventajas:
Sin tincin Gram
Sin Pre Test ni Post Test
En un solo panel ID de todas las bacterias Gram Positivo y Gram Negativo
Slo un minuto para la configuracin
Ms de 1000 especies detectables.
El gran avance es la nueva qumica oxido reduccin, que permite la inspeccin de
las bacterias Gram positivas y Gram-negativas en el mismo panel. Ya no son
necesarias las tinciones de Gram y otras pruebas previas. Se consigue la
configuracin de un protocolo en menos de 1 minuto.
Incluso con un Biolog Gen II el usuario puede detectar un nuevo microorganismo e
incluirlo en su base de datos.
Biolog dispone de tecnologa con mltiples plataformas para todas las
necesidades, desde las ms simples sistemas manuales a los ms completos
sistemas automticos.
Las microplacas de 96 recipientes permiten un seguro diagnostico
Los sistemas Omnilog permiten identificacin de bacterias Gran negativo, Gran
positivo, aerbicas, anaerbicas, hongos filamentosos, levaduras y fenotipos por
micro array.
5.7.3. Anatoma de una identificacin Biolog Gen II
La nueva qumica de xido reduccin de Biolog Gen II es aplicable a una gama sin
precedentes de las bacterias Gram positivas y Gram negativas. Como se muestra
a continuacin, Biolog Gen II disecciona y analiza la capacidad de la clula de
metabolizar todos los tipos principales de productos bioqumicos, adems de
determinar otras importantes propiedades fisiolgicas tales como el pH, salinidad,
la tolerancia al cido lctico. La identificacin se puede realizar manualmente o
con todos los instrumentos Biolog incluyendo el MicroStation semi-automtico y
el automatizado OmniLog.

Figura # 5.9. Placas BIOLOG GN2 determinacin de propiedades fisiolgicas

71 Fuentes de carbono ms 23 ensayos de Sensibilidad Qumica
5.7.4. LAS PLATAFORMAS DE IDENTIFICACIN DE BIOLOG
A) OmniLog Combo Plus
Automatizar la identificacin de bacterias aerobias y permitir identificar tambin
hongos filamentosos, levaduras y bacterias anaerobias.
Lectura de Resultados a tiempo real y plenamente automatizada Permite la
posibilidad de emplear el sistema para realizar pruebas de fenotipado microbiano
empleando los Phenotype Microarrays Software de introduccin e interpretacin
de resultados Software Retrospect 2.0 de gestin de datos para evaluar
tendencias
B) OmniLog Plus ID System
Automatizar la identificacin de bacterias aerobias y permitir identificar tambin
hongos filamentosos, levaduras y bacterias anaerobias. Lectura de Resultados a
tiempo real y plenamente automatizada Software de introduccin e interpretacin
de resultados Software Retrospect 2.0 de gestin de datos para evaluar
tendencias

C) OmniLog Combo System

Automatizar la identificacin de bacterias aerobiasLectura de resultados a tiempo
real e incubacin plenamente automatizadaPermite la posibilidad de emplear el
sistema para realizar pruebas de fenotipado microbiano empleando los Phenotype
Microarrays
Software de introduccin e interpretacin de resultadosSoftware Retrospect 2.0 de
gestin de datos para evaluar tendencias
D) OmniLog ID System
Automatizar la identificacin de bacterias aerbias Lectura e incubacin de
resultados a tiempo real y plenamente automatizadaSoftware de introduccin e
interpretacin de resultadosSoftware Retrospect 2.0 de gestin de datos para
evaluar
tendencias
E) GEN III Microstation System
Automatizar la identificacin de bacterias aerobias y anaerbias, levaduras y
hongos filamentosos Registro y lectura de resultados automtica (carga manual de
las microplacas e incubacin independiente)Software de introduccin e
interpretacin de resultadosSoftware Retrospect 2.0 de gestin de datos para
evaluar tendencias
F) GEN III MicroLog M System
Registro y lectura de resultados manual para la identificacin de bacterias
(incubacin y lectura a cargo del usuario)Software de introduccin e interpretacin
de resultados11

Automatizacin GEN III

YT
FF
AN
PM (Phenotype
Lectura
(Aerbios) (Levaduras) (Mohos) (Anaerbios) Microarrays)
Lectura
OmniLog
Contnua
Combo Plus.

Lectura
OmniLog
Contnua
Plus

OmniLog Lectura
Combo
Contnua
System
Lectura
OmniLog Contnua

GEN
IIILectura Puntual

Microstation
GEN III MLx

Tabla 4 Plataforma de sistema de identificacin de microorganismos BIOLOG

11

Microbial identification state of sciencia performance with unmatched power & versatily
Biolog Inc 21124 Cabot blvd, Hayward, CA USA (www.biolog.com)

6. MATERIALES Y REACTIVOS
6.1.

EQUIPOS

Autoclave
Cmara de flujo laminar
Balanza analtica
Phmetro Orin
Refrigerador 4C
Micro pipetas gilson de 20-200 L
Cmara fotografa
6.2. MATERIALES DE LABORATORIO
Asa vidrio
Cajas Petri 100*20mm
Vasos de precipitado
Pipetas mecanica reguladas para tips
Tips de 20-200 L
Asa de vidrio
Asas plsticas esterilizadas
Micro tubos (tubos Eppendorf)
Tubos falcn
Microplacas Biolog de Identificacin
Gradillas para microtubos de ensayo
Algodn
Gasa
Papel toalla
Papel higinico
Guantes desechables
Guantes trmicos
Esptula
Envases para pesar
Bolsas plsticas

Papel aluminio
Para film
Marcador de vidrio
Cmara fotogrfica
6.3. REACTIVOS
ACIDO SULFURICO H2SO4
NaCl
MgSO4*7H2O
CaCl2*2H2O
KCl
NaBr
Peptona
Extracto de levadura
Glucosa
Agar
K2HPO4
NH4Cl
FeSO4*7H2O
GLUCOSA
GLUTAMATO DE SODIO
AGUA DESTILADA
SALES MARINAS
Alcohol al 70%

7. METOLOGIA
7.1. PREPARACION DE MEDIO DE CULTIVO
El medio de cultivo para el crecimiento de microorganismos halfilos, esta
detallado en la tabla:
Tabla # 1. Medio HM
COMPUESTO
NaCl
MgSO4*7H2O
CaCl2*2H2O
KCl
NaBr
Peptona
Extracto
de
levadura
Glucosa
Agar( solo para
medio solido)

%(w/v)
4,5
0,025
0,009
0,05
0,006
0,5
1
0,1
2

Para Un Volumen Vt
Se procede al clculo segn la formula
w
V [ml ]
(
v)
=
t

W compuesto

100

7.1.1. Preparacin del medio liquido HM

Pesar los compuestos de la tabla # 1 en una balanza analtica, sin la adicin de
agar.

Figura 7.1.- medio liquido HM

Regular el PH entre un valor 8 y 8,5
Separar el medio en matraces con un volumen aproximado de 60 a 80ml
Sellar los matraces con un tapon de algodn y aluminio para proceder a su
esterilizacin en el autoclave a 121C y 1,2 atm durante 15 minutos

Figura # 7.2.- Autoclave

7.1.2. Preparacin de medio solido HM
Pesar los compuestos en una balanza analtica para la gelificacion del medio de
cultivo utilizar agar
Proceder a su esterilizacin en el autoclave a 121C y 1,2 atm durante 15 minutos
Y separarlo en cajas Petri evitando su contaminacin usando una cmara de flujo
laminar o un mechero bunsen, la adicion del medio solido debe ser hasta la mitad
de la caja petri. Tal y como se puede observar en la figura # 7.3.

Figura # 7.3.- medio solido HM

7.2. CRECIMIENTO Y AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS

Para el cultivo de microorganismos agregar 1ml de la muestra seleccionada en el
medio liquido HM y proceder a su incubacin en el shaker a una temperatura de
37C. con 200 rpm durante 24 horas aproximadamente

Figura # 7.4.- incubacin medio liquido

7.2.1. Mtodo de dilucin
Luego de 24hr se puede observar la turbiedad en el medio de cultivo HM lo cual
indica que el crecimiento de los microorganismos de la muestra problema. Para el
aislamiento de estos microorganismos se utilizara un medio HM solido, se debe
trabajar en un ambiente adecuado para evitar contaminar las muestras.
Para el aislamiento de microorganismos se utilizara el mtodo de diluciones que
ser detallado en la Figura # 7.5. , para esto de proceder llenar 7 micro tubos con
0,9 ml de medio liquido HM del tubo falcon y rellenar 0,1 ml de la muestra en el
primer micro tubos agitar bien y trapazar 0,1ml del primer micro tubos al segundo
as sucesivamente:

Figura # 7.5.- Mtodo De Dilucin

Dependiendo de la turbiedad de la dilucin proceder a su seleccin y sembrar
20L de la solucin en una caja Petri contenido medio solido HM ya preparado y
con la ayuda de una aza de vidrio esterilizada esparcir en el medio para su
posterior seleccin, sellar bien la caja Petri y llevar a la incubadora a 37C durante
24 hrs a 48 hrs.

Figura # 7.6.- Dilucin de microorganismos

Figura # 7.7.- Siembra de microorganismos

7.2.2. Seleccin de microorganismos
De manera cualitativa observamos si en las diluciones la formacin de colonias, si
podemos diferenciar los microorganismos en la caja petri podemos proceder a su
seleccin, segn sus caractersticas morfolgicas, un ejemplo de una caja petri
donde se puede diferenciar los microorganismos aislados se ve en la figura # 7.6.

Figura # 7.6.- colonias de microorganismos de flora epifitica

7.2.3. Replicacin de microorganismos
La colonia seleccionada es retirada con una asa y cultivada de nuevo en una caja
Petri contenido el medio solido HM, proceder a la numeracin de la colonia y
anotando los datos de la colonia con un marcador de alcohol con el nmero de la
cepa.
Sellar bien la caja Petri y llevar a la incubadora a 37C durante 24 hrs.

7.3. PRODUCCION DE PLASTICO BIODEGRADABLE

7.3.1. Preparacin del medio liquido
Para la produccin de plsticos biodegradables se utilizo el medio HM2 el cual
tiene una concentracin elevada de fuente de carbono (Glucosa) y una
concentracin baja de fuente de nitrgeno (Glutamato de sodio) lo cual provoca en
los microorganismso la acumulacin de plstico biodegradable, este medio esta
detallado en la tabla # 2:
Tabla 2.- medio HM2
N
1
1
1
1
1
2
3

Compuesto
NaCl
MgSO4*7H2O
K2HPO4
NH4Cl
FeSO4*7H2O
GLUCOSA
GLUTAMATO
SODIO

%(W/V)
5
0,5
0,22
0,4
0,005
2,5
DE
0,2

Para Un Volumen Vt
Se procede al clculo segn la formula
w
V [ml ]
(
v)
=
t

W compuesto

100

Pesar Se utilizara un volumen de cultivo de 150ml, la produccin se la

realizara en matraces Erlenmeyer de 1000 L

Separar los compuestos N 1 en un matraz Erlenmeyer e aadir un

volumen de agua destilada igual a 2/3 del volumen total V t.

Regular el PH de la solucin a 7
Separa 100ml de la solucin en varios matraces de 500ml o 1000ml
Sellar con tapn de tela y aluminio para su procedente esterilizacin
Separar los compuestos N 2 en un matraz Erlenmeyer de 500ml e aadir

un volumen de agua destilada equivalente a 1/6 del volumen total V t.

Sellar con tapn de tela y aluminio para su procedente esterilizacin
Separar los compuestos N 3 en un matraz Erlenmeyer de 500ml e aadir

un volumen de agua destilada equivalente a 1/6 del volumen total V t.

Sellar con tapn de tela y aluminio para su procedente esterilizacin en el
autoclave a 121C y 1,2 atm durante 15 minutos

7.3.2. Siembra de microorganismos productores de plstico

Se utilizara microorganismos obtenidos del aislamiento del aislamiento de las
muestras problema, estos deben tener no ms de 48-72 horas de cultivo en cajas
Petri con el medio HM. Para esto se toma una cepa seleccionada y se toma una
buena cantidad de la misma con una asa de cultivo, esta se coloca en tubo
Eppendorf que contiene 1ml de medio de cultivo HM2 y se procede a diluir la
completamente la muestra. Posteriormente se siembra en los matraces
preparados (figura # 9 y 10) y se procede a incubarlos por 30 horas a T= 37C y
200 rpm

Figura 9.- Medio liquido HM2

Figura 10.- replicacin de microorganismos

7.3.3. Centrifugacin de microorganismos

Una vez que han crecido los microorganismos el medio se torna de un color
conciso y lechoso lo cual nos indica un crecimiento positivo de la cepa
seleccionada en el medio HM2 (figura # 11)

Figura # 11.- Crecimiento del microorganismos en el medio HM2

Separar 10 ml de la muestra en tubos falcn e introducirlos en la centrifugadora de
3000 rpm de manera opuesta durante 5 minutos (figura # 12).

Figura # 12.- Centrifugadora

Una vez centrifugado se formaran dos fases desechar la fase liquida y volver a
realizar el mismo procedimiento hasta concluir el medio de cultivo restante, se
obtendr un pellet que son los microrganismos obtenidos al final de todo el cultivo
(figura # 13)

Figuura 13.- Separacin De Microorganismos

7.3.4. Secado de microorganismos

Una vez desechado la fase liquida se procede a secar los microorganismos, se
introduce los tubos falcn en la estufa a 60C por aproximadamente 24-48hrs
7.3.5. Hidrolisis PHB
Una vez que la biomasa este completamente seca se pes 10mg de esta es tubos
de ensayo, posteriormente se aadi 10 ml de H 2SO4 y se llev a la estufa a una
temperatura de 100C por un tiempo de 1 hora.
El H2SO4 se aade para romper la pared celular y de esta manera dejar salir en su
interior los plsticos biodegradables, las cuales se hidrolizan por la accin de este
compuesto
Se procede a hacer diluciones 1/10, 1/100, 1/1000, para su posterior lectura en el
espectrofotmetro.
7.3.6. Seleccin de microorganismos capaces de producir PHB
La presencia de un polmero se verifica por medio de un barrido en el
espectrofotmetro desde 200nm a 400nm, siendo la presencia de plstico cuando
la elevacin de la curva o pico se extiende en 235nm
8. Test de Identificacin de bacterias GRAMNEGATIVAS
8.1.

PROCEDIMIENTO PARA UTILIZAR GN2 MICROPLACAS

El procedimiento de prueba es rpida y sencilla, con la participacin slo 5 pasos:

1) Un cultivo puro en medio liquido de una bacteria se cultiva en un Biolog
Crecimiento universal w/5%.
2) Las bacterias se tomaron muestras de la superficie del agar placa, y se
suspendieron a una densidad especificada en el documento GN / GP Fluido de
inoculacin
3) 150 L de suspensin bacteriana se pipete en cada microplaca del GN2
4) La microplaca se incuba a 30 o 35 C (dependiendo de la naturaleza del
organismo) de 4-24 horas.
5) Las microplacas se leen visualmente o con el Biolog MicroStation o Sistema
OmniLog, en comparacin con la base de datos GN, y un resultado se determina.

9. RESULTADOS
9.1. Crecimiento y Aislamiento de microrganismos
9.1.1. Muestra: Laguna de Palpani
Cultivo de microorganismos
Hubo considerable respuesta por parte de la flora epifita de esta seccin
aportando un crecimiento considerable
Mtodo de dilucin
Se realizaron diluciones de 10 -5 10-6 10-7 pero no se observaron resultados de
adaptacin al medio solido HM
9.1.2. Muestra: Laguna de Coruto
Cultivo de microorganismos
Hubo considerable respuesta por parte de la flora epifita de esta seccin
aportando un crecimiento considerable
Mtodo de dilucin
Se realizaron diluciones de 10 -6 10-7 se observ aporte y adaptacin por parte de
los microorganismo
Seleccin de microorganismos
Se procedi a la seleccin cualitativa de microorganismos por caractersticas
morfolgicas
Replicacin de microorganismos
No se realiz la replicacin de estas especies
9.1.3. Muestra: Laguna Kollpa
Cultivo de microorganismos
Hubo una respuesta satisfactoria por parte de la flora epifita de esta seccin
aportando un crecimiento considerable
Mtodo de dilucin
Se realizaron diluciones de 10 -6 10-7 se observ aporte y adaptacin por parte de
los microorganismo, adquirindose las colonias bien separadas en la dilucin 10 -6
Seleccin de microorganismos
Se procedi a la seleccin cualitativa de microorganismos por caractersticas
morfolgicas
Replicacin de microorganismos
Se procedi a la numeracin de colonias y cultivo de las mismas en medio HM
solido aislados
9.1.4. Muestra: Laguna hedionda

Cultivo de microorganismos
Para una primera instancia el medio se coloro obscuro se procedio a realizar una
vez mas el cultivo
Para una segunda instancia hubo una respuesta satisfactoria por parte de la flora
epifita de esta seccin aportando un crecimiento considerable
Mtodo de dilucin
Se realizaron diluciones de 10 -6 10-7 se observ aporte y adaptacin por parte de
los microorganismo, adquirindose las colonias bien separadas en la dilucin 10 -6
Seleccin de microorganismos
Se procedi a la seleccin cualitativa de microorganismos por caractersticas
morfolgicas
Replicacin de microorganismos
Se procedi a la numeracin de colonias y cultivo de las mismas en medio HM
solido aislado
9.2. Produccin de plstico biodegradable
9.2.1. Muestra: Laguna kollpa 2 (agua) cepa N5
Replicacin de microorganismos
Se realiz el paso de microorganismos del medio solido HM al medio lquido HM
se llev a 200 rpm durante 30 hrs no se obtuvo respuesta de crecimiento por parte
de esta especie
Morfologa
Lisa
Contorno regular
Colonias pequeas
Convexa
Su color es Crema Claro
Brillosa

Figura # 9.1. Laguna kollpa 2 (agua) Cepa 5 toma microscopio

9.2.2. Laguna Bush salina (agua) Cepa N5

Replicacin de microorganismos
Se realiz el paso de microorganismos del medio solido HM al medio lquido HM2
se llev a 200 rpm durante 30 hrs no se obtuvo respuesta de crecimiento por parte
de esta especie

Morfologa
Lisa
Contorno regular
Convexa
Su color es crema claro
Brillosa

9.2.3.
9.2.4.
9.2.5.
9.2.6.
9.2.7.
9.2.8.

Figura # 9.3.

Laguna Bush salina (agua) Cepa N5 toma microscopio

Laguna hedionda 2 (suelo) cepa N2

Replicacin de microorganismos
Se realiz el paso de microorganismos del medio solido HM al medio
lquido HM2 se llev a 200 rpm durante 30 hrs no se obtuvo respuesta
de crecimiento por parte de esta especie

9.2.9.
9.2.10. Morfologa
Formacin de una colonia enorme
Crecimiento Rpido
Semi Lisa Aterciopelada
Plana
Su color es blanco
Opaca

9.2.11.

9.2.12.

9.2.13.
9.2.14.
Figura # 9.4.Laguna hedionda 2 (suelo) cepa N2 toma
microscopio
9.2.15.
9.2.16. Laguna hedionda 2 (suelo) cepa N6
9.2.17.
9.2.18. Replicacin de microorganismos
9.2.19. Se realiz el paso de microorganismos del medio solido HM al medio
lquido HM2 se llev a 200 rpm durante 30 hrs no se obtuvo respuesta
de crecimiento por parte de esta especie
9.2.20.
9.2.21. Morfologa
Lisa
Contorno Regular
Convexa
Color crema suave
Brillosa
9.2.22.
9.2.23.
9.2.24.

9.2.25.
9.2.26.
9.2.27.
9.2.28.
9.2.29.
9.2.30.

Figura # 9.5. Laguna hedionda 2 (suelo) cepa N6 toma microscopio

9.2.31.
9.2.32.
9.2.33.
9.2.34. Laguna hedionda 2 (suelo) Cepa 5
9.2.35.
9.2.36. Replicacin de microorganismos
9.2.37. Se realiz el paso de microorganismos del medio solido HM al medio
lquido HM2 se llev a 200 rpm durante 30 hrs, se obtuvo respuesta
satisfactoria de crecimiento por parte de esta especie, el medio claro se
torn un color lechoso
9.2.38.
9.2.39. Morfologia
Rugosa
Contorno irregular
Planas
Su color es Blanco
Opaca
9.2.40.
9.2.41.

9.2.42.
9.2.43. Figura # 9.6. Laguna hedionda 2 (suelo) Cepa 5 toma microscopio
9.2.44.
9.2.45.
9.2.46. Centrifugacin y secado
9.2.47. Se realiz la sedimentacin de la biomasa, su procedente secado
9.2.48.
9.2.49. Hidrolisis
9.2.50. 10 mg de muestra seca se diluyo en 10ml de H2SO4, se llev a la
estufa a 100C durante y se realizaron diluciones con H2SO4 a 1/10,
1/100, 1/1000 para su posterior medicin
9.2.51.
9.2.52. Seleccin de microorganismos capaces de producir PHB
9.2.53. En el espectrofotmetro se realiz un barrido desde 200nm a 400nm,
siendo la presencia de plstico cuando la elevacin de la curva o pico se
extiende en 235nm la grfica que pudimos observar fue la siguiente:
9.2.54.

9.2.55.
9.2.56. Donde observamos que se form un pico aproximadamente a 235nm
con una absorbancia de 0,712
9.2.57. TEST DE IDENTIFICACIN DE BACTERIAS GRAMNEGATIVAS
GN2
9.2.58.

9.2.59.
9.2.60. Figura # 9.7. Pigmentacin de microplacas BIOLOG GN2 de
bacterias de la laguna hedionda 2 (suelo) cepa5
9.2.61.
9.2.62.

9.2.63. Figura # 9.8. Resultado de las microplacas BIOLOG GN2 de

bacterias de la laguna hedionda 2 (duelo) cepa5
9.2.64.

9.2.65.

9.2.66. Comparando los resultados con la grfica 5.9. ilustrada anteriormente

con los obtenidos por la prueba de tincin GRAMNEGATIVA
consideramos que las condiciones ptimas de vida para el
microorganismos son:
9.2.67.
PH ligeramente acido.
Concentraciones altas de NaCl.
Azucares importantes como: Cyclodextrin, Adotinol, D-fructuosa, D-glucosa,
Minositol, D-meliblose, L-Rhamnose, Sorbitol, Sucrose.
Contenidos altos de hexosa (fosfatos)
No suele ser Reductor.
cidos carboxlicos importantes como: L-Histidina, Acido Urocanico,
Inosine, 2,3-Butadeniol, Fenilalina, L-Prolina, Glycerol.

10.

CONCLUSIONES

10.1.1.
1. Se logr aislar algunos microorganismos de laguna kollpa y se procedi a
su respectiva numeracin, pero una vez realizadas el anlisis de produccin
de plsticos se pudo evidenciar que ninguno de los microorganismos
separados fueron capaces de producir plsticos
2. Se trabajaron con una serie de microrganismo extrados de lagunas como
ser laguna palpani, laguna de coruto, laguna kollpa, laguna bush salina,
laguna hedionda, donde se encontr un cepa de microorganismo capaces

de producir plstico biodegradable extrada de la laguna hedionda, despus

del tratamiento de hidrolisis se realiz un barrido en espectrofotmetro
obteniendo una curva en 235nm con una absorbancia de 0,712

3.
10.1.2.
10.1.3.
4. La cepa 5 de la laguna hedionda 2 (Suelo) productora de plstico
biodegradable tiene una morfologa especialmente caracterstica con
respecto a las dems cepas la cual es Rugosa de Contorno irregular Planas
y opaca a diferencia de las dems cepas que son lisas brillosas y de
contorno regular
10.1.4.
5. Mediante la prueba de identificacin de bacterias gramnegativas Biolog
GN2 en microplacas cualitativamente podemos observar que las bacteria
identificada en la prueba metabolica es de carcter gram positiva por la
cantidad de With positivos adems que el patrn de respuesta genera
algunos resultados sobre las carateristicas de optimo crecimiento de la
bacteria como:
PH ligeramente acido.
Concentraciones altas de NaCl.
Azucares importantes como: Cyclodextrin, Adotinol, D-fructuosa, D-glucosa,
Minositol, D-meliblose, L-Rhamnose, Sorbitol, Sucrose.
Contenidos altos de hexosa (fosfatos)
No suele ser Reductor.
cidos carboxlicos importantes como: L-Histidina, Acido Urocanico,
Inosine, 2,3-Butadeniol, Fenilalina, L-Prolina, Glycerol.
10.1.5.
10.1.6.

11.RECOMENDACIONES
11.1.1.
11.1.2.

Es recomendable del estudio ms amplio de las muestras para

clasificar las bacterias productoras de alguna fuente para as descubrir

la funcin adecuada de cada producto producido
11.1.3.
11.1.4.

Ampliar la cantidad de especies de bacterias productoras de

plsticos biodegradables tendr que ser el objetivo global de esta rea

de investigacin
11.1.5.
11.1.6.

De igual manera es recomendable probar con diferentes medios de

cultivo para el aislamiento de bacterias con el fin de adecuar un medio

que maximice la produccin de (PHA)
11.1.7.
11.1.8.
11.1.9.
11.1.10.

12. BIBLIOGRAFIA
12.1.1.
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