PRCTICA NO.

9: EXTRACCIN DE DNA POR LAS TCNICAS DE SOLVENTES, LISIS

ALCALINA Y MTODO CASERO
Yadira Alejandra Alvarado Solis, laboratorio de Fisiologa y Bioqumica de los Microorganismos, Programa de
Qumica, Departamento de Ciencias Qumico Biolgicas, Instituto de Ciencias Biomdicas, Universidad
Autnoma de Ciudad Jurez.
Resumen: En este artculo se abordan los distintos mtodos para la extraccin de DNA que se pueden realizar
en un laboratorio, as como los procesos que se llevan a cabo para determinar su peso molecular por
electroforesis.
Palabras clave: DNA, extraccin, electroforesis, peso molecular.
Introduccin
En el DNA celular se encuentran especificadas las
secuencias de aminocidos de todas las protenas y
las secuencias de nucletidos de todas las cadenas
de RNA. Un segmento de DNA que contenga la
informacin necesaria para la sntesis de un
producto biolgico funcional recibe el nombre de
gen.
Una clula corriente tiene miles de genes por lo que
las molculas de DNA suelen ser muy grandes; las
nicas funciones conocidas del DNA son el
almacenamiento y la transmisin de informacin
biolgica.
Los nucletidos estn formados por tres
componentes: (1) una base nitrogenada, (2) una
pentosa y (3) un fosfato como se muestra en la
figura 1:

Figura 1: Estructura de los nucletidos

La molcula sin el grupo fosfato se denomina
nuclesido, las bases nitrogenadas derivan de dos
compuestos las pirimidinas y las purinas. Tanto el
DNA como el RNA contienen dos bases de
purinicas principales, la adenina y la guanina. El
DNA y el RNA contienen tambin dos bases
pirimidinicas principales, la citosina se encuentra en
ambos tipos de cido nucleico pero la segunda base
pirimidinica es timina en el DNA y uracilo en el
RNA como se muestra en la figura 2.

Figura 2: a) Bases puricas y pirimidinicas, b)

Pentosas: Desoxirribosa y Ribosa.
Los cidos nucletidos contienen dos tipos de
pentosas, los desoxinucleotidos del DNA contienen
desoxiribosa y los ribonucleotidos del RNA
contienen ribosa como demuestra en la figura 2.
Las pirimidinas y purinas libres son compuestos
dbilmente bsicos y por ello se denominan bases.
Tienen una serie de propiedades qumicas que
afectan a la estructura, y en ultimo termino la
funcin, de los cidos nucleicos, las purinas y las
pirimidinas presentes en el DNA y RNA son
molculas altamente conjugadas; esta propiedad
tiene efectos importantes sobre la estructura, la
distribucin electrnica y la capacidad de absorcin
de la luz de los cidos nucleicos, por efecto de la
resonancia todas las bases de los nucletidos
absorben la luz UV y se caracterizan por una fuerte
absorcin a longitudes de ondas cercanas a 260nm
como se muestra en la figura 3.

Figura. 3 Longitudes de onda del espectro visible.

Las bases puricas y pirimidinicas son hidrofobias y
relativamente insolubles en agua en el pH celular
cercano a la neutralidad, a pH acido o alcalino las
bases adquieren carga y aumenta su solubilidad en
el agua; las interacciones hidrofobias de apilamiento
que sitan paralelamente los planos de los anillos de
dos o ms bases son uno de los dos tipos principales
de interacciones entre las bases. (Lehninger, 2005)
Todo mtodo de separacin emplea las diferencias
entre las cosas que se van a separar, el tamao y la
carga son dos propiedades de las molculas que se
utilizan con frecuencia para su separacin.
Una de las tcnicas ms utilizadas es la
electroforesis en gel que emplea estas dos
propiedades. La electroforesis se basa en el
desplazamiento de partculas con carga en un campo
elctrico, la carga de las molculas que se van a
separar ocasionan que se desplacen por el gel hacia
el electrodo de carga opuesta. Los cidos nucleicos
y los fragmentos de oligonucletidos tienen carga
negativa a neutra por la presencia de los grupos
fosfato; cuando estas molculas con carga negativa
se colocan en un campo elctrico entre dos
electrodos, migran todas hacia el estado positivo
como se muestra en la figura 4a.
La mayora de las separaciones se realizan en gel de
agarosa y en posicin horizontal, este se llama gel
submarino debido a que el gel se coloca dentro de
una solucin amortiguadora en una cmara como se
muestra en la figura 4b.

Figura 4: a) Campo elctrico de la muestra, b)

Preparacin del gel de agarosa
Una vez separados los fragmentos de DNA deben
tratarse para poderlos observar. El mtodo original
para detectar los productos que se separan, se basa
en el marcaje radioactivo de la muestra, un
marcador es un tomo o molcula que permite
visualizar otra molcula las molculas de DNA
experimentan una reaccin que incorpora al
marcador radioactivo al DNA cuando los
oligonucletidos
radio
marcados
producen
exposiciones en las proporciones de la placa con las
cuales entran en contacto y al revelar esta placa las
posiciones de las sustancias marcadas se observan
como bandas oscuras como se muestra en la figura
5.

Figura 5: Electroforesis en gel de agarosa.

Procedimiento
Extraccin por mtodo casero: Para la extraccin de
DNA por este mtodo se utilizo taza de fresas
frescas trituradas en un mortero con agua hasta que
quedaran hechas pur, esta molienda se traslado a
un vaso de precipitado y se le agrego una pisca de
sal, 200 mL de agua destilada y 30 mL de jabn
liquido, se mezclo y se dejo reposar por 10 minutos,
se le agrego 3g de ablandador para carne y se dejo
reposar 5 minutos ms, pasado este tiempo se
agrego 100 mL de alcohol etlico deslizndolo por

la pared del vaso de precipitado, observndose

como se separaba, las protenas y los cidos
nucleico es entre ellos el DNA en una capa blanca
en la superficie del vaso, se extrajo cuidadosamente
esta capa y se coloco en un dos tubos eppendorf de
1.5 mL y se centrifugaron los tubos por 10 minutos
a 4000 rpm y se elimino el sobrenadante para dejar
lo sedimentado y se le agrego agua destilada,
posteriormente se le agrego isopropanol y se volvi
a centrifugar a 4000 rpm por 10 minutos
conservando el sobrenadante que es donde se
encuentra tanto los cidos nucleicos con el DNA y
las protenas y se guardo en refrigeracin en otro
tubo eppendorf de 1.5 mL hasta el momento de ser
empleado para la electroforesis.
Extraccin por lisis alcalina: Se tom 10 mL de
caldo de bacteria crecidas por 24 horas y se
transfiri a un tubo de plstico y se centrifugo por 5
minutos a 3000 rpm, se elimino el sobrenadante y al
precipitado se le agrego 2 mL de NaOH a 0.2 N y 2
mL de SDS al 1% y se agito hasta homogenizar y se
dejo reposar por 10 minutos y se volvi a
centrifugar a 4000 rpm por 10 minutos y se
transfiri el sobrenadante a otro tubo eppendorf
descartando el precipitado ya que en el
sobrenadante se encuentra tanto los cidos nucleicos
como el DNA como protenas, al sobrenadante se
agrego 2 mL de isopropanol helado y se agito hasta
observar un condensado blanco en todo el tubo, se
tomaron 1.5 mL de este condensado y se coloco en
otro tubo eppendorf y se centrifugo a 13000 rpm por
30 segundos, se descarto el sobrenadante y se dejo
secar el precipitado invirtiendo el tubo en papel
secante, se le agrega 150 L de agua destilada y se
aplica agitacin en el vortex hasta homogenizar el
precipitado y se refrigera a -20C hasta la
realizacin de la electroforesis.
Extraccin por solventes orgnicos: Se tom 10 mL
de caldo de bacteria crecidas por 24 horas y se
transfiri a un tubo de plstico y se centrifugo por 5
minutos a 3000 rpm, se elimino el sobrenadante y se
re suspendi el precipitado en 400 L de buffer TE
y se centrifugo a 14000 rpm por 15 minutos y se
recupero el precipitado volviendo a re suspender en
400 L de buffer TE en un tubo eppendorf estril, se
incubo a temperatura ambiente por 15 minutos y se
paso la muestra a una jeringa y de ah a otro tubo
eppendorf, para precipitar a las protenas se aadi
600 L de fenol-cloroformo-alcohol isoamilico, se
agito y centrifugo por 5 minutos a 14000 rpm y la

fase superior se traslada a otro tubo eppendorf y se

vuelve
a repetir el paso para precipitar las
protenas, para eliminar el fenol se aadi 600 L
de cloroformo, se agito y se centrifugo a 14000 rpm
por 5 minutos se toma la fase superior y se coloca
en toro tubo y se vuelve a repetir este paso para
eliminar el fenol; para precipitar a los cidos
nucleicos se aadi 1 mL de isopropanol al 70%
helado y se centrifugo por 5 minutos a 14000 rpm,
se mezclo suavemente hasta observar unas fibras
blanquecinas y para lavar el precipitado se
centrifugo 2.5 mL de la mezcla a 14000 rpm por 5
minutos y se elimina el sobrenadante, se lava con
etanol y se descarta el sobrenadante y se deja secar
el precipitado invirtiendo el tubo sobre papel
secante, se agregan 150 L de agua destilada y se
aplica agitacin en el vortex hasta homogenizar el
precipitado y se refrigera a -20C hasta la
realizacin de electroforesis
Al da siguiente se preparo el gel de agarosa con 1
gr de agarosa y 125 mL de buffer que ayuda a que el
gel tenga un pH de 8 ya que la migracin del DNA
depende de las cargas negativas de los fosfatos, y
las cargas dependen del pH del medio, y se disolvi
en 1000 ml de agua destilada, y se mezclo hasta
obtener una muestra homognea. Se coloco el gel de
agarosa en la cmara de electroforesis en posicin
horizontal y se le aadi el buffer de carga, y se
coloco el cepillo por encima del gel pero sin
romperlo hasta que estuviera polimerizado, una vez
listo el gel se coloco cada una de las muestras tanto
del laboratorio 1 como del laboratorio 2 y se corri
el gel en la cmara electrofortica.
Resultados
Solo se observo en el gel de agarosa la muestra de
los pozos 1 y 3 que corresponden a las tcnicas de
extraccin por solventes orgnicos y la extraccin
por el mtodo casero de los equipos 2 y 4 del
laboratorio 1, mientras que las dems muestras
corridas no presentaron suficiente presencia de
cidos nucleicos para tomarlas como positivas.
Discusin y Conclusin
El mtodo de lisis alcalina explota las diferencias en
las propiedades de desnaturalizacin y re
naturalizacin del DNA plasmodio (pequeos
crculos de DNA cerrados covalentemente), la
alcalinizacin con NaOH en presencia de un
detergente fuertemente anicnico (SDS), provoca la

lisis celular, la desnaturalizacin de las protenas y

la liberacin de los plsmidos. Los plsmidos se ven
menos afectados por su pequeo tamao y
estructura superen rollada. La neutralizacin del
medio en presencia de una concentracin alta de sal
(acetato potsico), provoca la precipitacin de las
protenas (por el tratamiento con el detergente y la
insolubilidad de la sal potsica del vodevil sulfato),
los agregados insolubles de protenas se separan por
centrifugacin del DNA plasmodio que queda en el
sobrenadante y conserva mayoritariamente su
estructura nativa; en las muestras tratadas en el
laboratorio solo se agrego NaOH como nica fuente
de sal a diferencia de lo que se menciona en la
bibliografa que adems del NaOH se le aade
acetato potsico, tal vez fue este factor lo que afecto
a que a que el DNA no se separa del material
condensado en donde tambin se encontraban las
protenas y a su vez no se hayan liberado lo
suficiente del medio en donde estaban y la cantidad
de DNA recuperado no haya sido el suficiente para
dar una seal al momento de correo la
electroforesis, ya que ninguna de las dos muestras
que se coloco en el gel que fueron tratadas con lisis
alcalina dio resultado positivo.

favorecer la precipitacin. Tambin puede realizarse

una precipitacin selectiva con concentraciones
salinas elevadas (precipitacin salina) o una
precipitacin de las protenas mediante cambios del
pH, como fue en el caso de la extraccin de DNA
por el uso de estos solventes orgnicos, en esta
prctica solo la muestra del equipo 2 del laboratorio
1 mostro resultados positivos, por lo que se puede
presumir que los solventes eliminaron la mayor
parte de material interferente que permiti que al
realizar la electroforesis mostrara una seal positiva.

Mientras que en la tcnica casera para extraccin de

DNA adems de que la fresa fue fresca y no se lavo
llevando
consigo
cualquier
contaminacin
microbiana, indirectamente se aplica la tcnica de
lisis alcalina al usar sal casera y el ablandador de
carne que tambin contiene una gran cantidad de
sales y en varias ocasiones de papana una enzima
que provoca la desnaturalizacin de las protenas
adems de la accin del jabn liquido que hace que
haya interacciones electrostticas entre el jabn y el
material presente en la muestra de fresa, aunque no
permiti la total liberacin del DNA mezclado con
la gran cantidad de protenas presentes, si concentro
material suficiente en esta tcnica lo que permiti
que hubiera una gran seal positiva la hora de correr
el gel y observarlo en la cmara de UV.

Nelson David, Cox Michael, Lehninger Principios

de Bioqumica, Cuarta edicin, editorial Omega,
Capitulo 8: Nucletidos y cidos nucledos, paginas
273-279.

A menudo se efecta una extraccin con disolventes

para eliminar los contaminantes de los cidos
nucleicos. Por ejemplo, suele emplearse una
combinacin de fenol y cloroformo con objeto de
eliminar las protenas. Para concentrar los cidos
nucleicos suele realizarse una precipitacin con
isopropanol o etanol. Si la cantidad de cido
nucleico diana es escasa, puede aadirse a la mezcla
un portador inerte (como el glucgeno) para

Por lo que se puede concluir que cada tcnica se

basa en las propiedades de cada uno de los solventes
empleados ya sea alcalinos u orgnicos y como
interaccionen con el DNA para extraerlo y
purificarlo eliminando as cualquier material que
pueda interferir, adems de que se debe conocer de
que tipo organismo o tejido se va a extraer el DNA
ya que de ello depender las condiciones que se
deban tomar para extraer el material y la cantidad
necesaria para analizar la muestra ya sea por
electroforesis o por cualquier otro mtodo.
Referencias

Campbell Mary, Farrell Shawn, Bioqumica, Cuarta

edicin, editorial Thompson, Intercaptulo B:
Tcnicas de biotecnologa de cidos nucleicos,
paginas 356-359
Baynes John W., Dominiczak Marek H.,
Bioqumica medica, Segunda Edicin, 2007,
Editorial Elsevier, Capitulo 31: Acido ribonucleico,
pagina 445, http://books.google.com.mx/books?
id=OCWP08sZok4C&pg=PA445&lpg=PA445&dq
=moleculas+de+6+kb&source=bl&ots=OFFzBwwu
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