Caracterizao morfolgica detalhada da Infeco por vrus Hendra de

diferentes tipos de clulas utilizando super-resoluo e imagem

convencional

Resumo
Introduo: Vrus Hendra (HeV) um vrus pleomorfico pertencente famlia
Paramixovrus. O nosso objetivo a longo prazo compreender o processo de
montagem de virions HeV. Como um primeiro passo, procurou-se determinar a
clula mais apropriada em um sistema de cultura para estudar este processo,
e, em seguida, utilizar este modelo para determinar a morfologia do vrus e
identificar o local da montagem por imaginologia das principais protenas de
vrus codificado em clulas infectadas.
Mtodos: Uma srie de clulas primrias e linhas de clulas imortalizadas
foram infectadas com HeV, fixado em vrios pontos temporais ps-infeco,
marcado para as protenas HeV e fotografada por confocal, super-resoluo e
microscopia eletrnica de transmisso.
Resultados: Foram observadas diferenas significativas na distribuio da
protena viral, dependendo do tipo de clula infectada. As 8 hpi da protena G
do HEV foi detectada no retculo endoplasmtico e a protena M foi observada
predominantemente
no
ncleo
em
todas
as
clulas
testadas. Aos 18 hpi, clulas Vero HEV infectados mostraram protenas M e G
em toda a clula e em sees de microscopia eletronica de transmisso
(TEM), em estruturas semelhantes a vrus pleomrficos. Em HEV infectando
clulas
MDBK,
A549
e
HeLa,
protena
M
do
HEV
foi observada predominantemente no ncleo com protena G na membrana.
Em clulas primrias endoteliais da aorta de bovinos e sunos infectadas com
HEV e duas linhas de clulas derivadas de basto, a protena M do HEV no
foi
observada
a
nveis
to
elevados
no
ncleo
em
qualquer ponto de tempo testado (8,12, 18, 24, 48 hpi), mas observou-se
predominantemente na superfcie da clula em um padro ponteada
co-localizada com protena G. Estas estruturas positivas HEV M e G foram
confirmados
como
HEV
virions
redondos
por
TEM
e
super-resoluo (SR) microscopia. Imagiologia SR demonstrarram pela
primeira vez imagem de protenas sub-virion de paramixovrus
e a respectiva localizao de HEV G, protenas M e N dentro de virions.
Concluso: Esses resultados fornecem novas perspectivas sobre a estrutura

de HEV e mostram que para estudos de HEV por imaginologia a

escolha de clulas de cultura de tecidos pode afetar os resultados
experimentais. Os resultados tambm indicam que HEV deve ser considerado
um vrus predominantemente redondo com um dimetro mdio de
aproximadamente 280 nm por TEM e 310 nm por imagem SR.
Palavras-chave: vrus Hendra, paramixovrus, microscopia confocal,
microscopia, Super-resoluo, a protena M, protena G.
Introduo:
Vrus
Hendra
(HEV),
Nipah vrus (NIV) e Cedar vrus (CedPV) esto estreitamente relacionados,
juntos formam o gnero Henipavirus da famlia Paramyxoviridae. Os morcegos
so
o
reservatrio
dos
henipavirus
e
tem
sido
a
fonte
de
um
nmero de eventos spill-over. Surtos HEV tem-se restringido at agora
ao norte da Austrlia [1], mas surtos por NIV ter ocorrido em Bangladesh,
Malsia/
Singapura
e
ndia
[2]. Nestes eventos spill over, animais domsticos e seres humanos so
infectadas com taxas de mortalidade significativas que, para VNI
em particular, variam de 40-100% de [3].
Replicao do paramyxovirus ocorre dentro
do citoplasma da clula
hospedeira e partculas de vrus surgem a partir da superfcie da clula,
incorporando uma parte da membrana da clula hospedeira como o envelope
viral. No entanto, os mecanismos precisos envolvidos no trfico da protena
intra-celular
e
montagem
da
partcula
infecciosa
no so claras para muitos vrus [4], incluindo paramyxovrus.

Os cdigos do genoma do HEV para 6 principais protenas. A nucleoprotena

(N), fosfoprotena (P) e protena polimerase interagem com o genoma de RNA
para formar um complexo de ribonucleoprotena (RNP). Alm de
a protena P, o gene P tambm codifica vrias protenas menores
[6].
Localizao
sub-celular
destas
protenas
V,
W
e
C
foi demonstrada em clulas infectadas com protenas C e V
presentes por todo o citoplasma e protenas W presente
no ncleo (mas no o nuclolo). Todas as trs protenas
tambm foram detectados em virions purificados [7]. Protenas V, W e C
do HEV esto presentes em relativamente pouca quantidade e suas
funes permanecem pouco claras, embora tenham sido mostradas
para inibir a transcrio e a replicao [8].

A maioria dos trabalhos sobre as protenas henipavirus em clulas infectadas

centrou-se sobre as glicoprotenas F e G encontrados do lado de fora
dos
virions
como
eles
so
a
chave
para
o
anexo
e
processos de internalizao do vrus. A glicoprotena G do HEV
liga-se a sua superfcie celular os receptores B2 e efrina
B3 [9-11], que so mais altamente expressos em neurnios,
arterial
endotelial
e
clulas
do
msculo
liso
[12-14].
O
F
(fuso)
sofre
uma
glicoprotena
conformacional
mudar quando G liga-se a uma clula hospedeira e conduz fuso
do virion com a membrana da clula hospedeira [15] para iniciar
o processo de replicao de vrus. As protenas F de ambos
os vrus NIV e HEV demonstraram ser sintetizados de forma inativa e precisa
de ativao por cathepsins (imagino ser catepsinas) que sejam susceptveis
a ter lugar dentro do compartimento do endosomal [16,17].
A protena
da
matriz
HEV
(M),
por
analogia
com
outros
paramixovrus,

crucial
para
a
morfognese
e
virion
juntamente com a RNP constitui o contedo de virions. O
papel preciso que a protena M executa na morfognese viral
claro,
embora
expresso,
de
protena
Niv
M
em
tecido
clulas de cultura leva formao de partculas semelhantes a vrus
[18] e em E. coli, a formao de partculas redondas de tamanho
entre 20 e 50 nm [19]. Patch et al. [20] identificou uma
pequena sequncia de protena Niv M que foi fundamental para a brotao
partculas de viral-like. Protena M do Niv, juntamente com outras
Protenas M de um pequeno nmero de outros paramixovrus
[21-24] encontrado no ncleo das clulas infectadas, mas
a razo precisa (s) para este fato no so claras. Em seus estudos,
[25] Wang et al. Observou a protena M do Niv primeiro no ncleo
e
em
seguida,
depois
da
infeco,
dentro
do
citoplasma
na
membrana
plasmtica.
Alm
disso,
este
trnsito
o atravs do ncleo parece ser essencial para a correto
brotamento viral. Esses autores tambm demonstraram que o surgimento
da
protena
M
do
VNI
ocorre
dentro
do
ncleo,
e
que
este
parece
ser
importante
para
o
vrus
brotao. Em clulas infectadas com o vrus sincicial respiratrio
(RSV), houve uma reduo na transcrio da clula hospedeira
levantando a possibilidade de que este possa ser uma funo da energia
nuclear
da
protena
M
localizada
[21].
Uma compreenso da estrutura virion uma etapa chave no
o processo para desvendar a montagem do henipavirus. Usamos
confocal e microscopia eletrnica de transmisso (TEM) para comparar
protena
HEV
e
produo
de
virion
em
diferentes
linhas celulares. Alm disso, os dois sistemas de super-resoluo
(SR) de imagem foram usados para determinar se a resoluo sub-virion

de
protenas
paramixovrus
era
vivel.
Estas
observaes
levou
a
concluses
importantes
a
respeito
da
morfologia
do
vrus
da
HEV
e
a
adequao
de
vrios
linhas de clulas como modelos in vitro da replicao do HEV.
Resultados
Protena M e protena G em clulas Vero infectadas com HEV
Postulamos
que
a
co-localizao
das
duas
protenas
HEV
M
e
G
como
mostrado
por
microscopia
confocal
indicaria
ou o local de montagem do vrus ou a presena
individual de
partculas virais em culturas de clulas infectadas. As clulas Vero foram
infectadas a uma MOI de 8 ento fixado em 8, 18 e 24 horas
aps a infeco (IPH) e marcadas com anticorpos para HEV N,
M e G. Na 8 hpi, HEV protena G foi localizado no interior do
citoplasma
em
um
retculo
endoplasmtico
(ER)
padro.
Co-marcao com anticorpos contra uma enzima encontrada no
a isomerase dissulfeto de ER, protena (PDI), mostrou que quase
co-localizao
completa
com
a
protena
G
confirmando
a sntese de protenas no RE (Figura 1a, b). Em contraste,
HEV M foi localizada dentro de ncleos de clulas infectadas, principalmente
no
nuclolo
(Figura
1c). As
protenas
M
e
G
do
HEV
no foram co-localizados no momento. At 18 de HPI havia
um grande nmero de sincicios em toda a cultura com grande
expresso
de
ambas
as
protenas
M
e
G
ao
longo
no citoplasma da clula e na membrana celular (Figura 1d).
Protena
N
foi
distribudo
por
todo
o
citoplasma
em pequenas manchas puntiformes em 8 HPI (Figura 1e) e por 18 hpi,
estava presente em grandes quantidades em todo o citoplasma da clula
e em pequena 'lagos' (Figura 1-F). A Figura 2a mostra uma tpica
rea de infeco na maior ampliao ilustrando
protenas HEV M
e protenas G (a 18 hpi) aparentemente associada bleblike,
estruturas
sobre
a
superfcie
da
clula.
No

claro
qual
das
estruturas
na
imagem
so
virions.
As Figuras 2b e 2c mostram uma regio semelhante, como mostrado por
TEM.
Estruturas
ligadas

membrana
de
formas
variveis
e tamanhos contm um grande nmero de pequenos complexos de
ribonucleoprotena
tubular
(RNP)
(Figura
seta
2B).

no est claro se essas estruturas so partculas infecciosas HEV

ou
extruses
de
membrana
das
clulas
infectadas.
Apesar de no haver identificao bvia de doenas infecciosas
em partculas de clulas Vero infectadas com HEV eles so rotineiramente
usado
para
produzir
stocks
de
vrus
infecciosos.
A
morfologia de partculas semelhantes a vrus presentes nestas preparaes
foi
investigado
usando
eletrnica
de
contraste
negativo
microscopia.
A
maioria
das
estruturas
intactas
observadas
usando esta tcnica foram redondas com um dimetro mdio
de aproximadamente 242 nm (n = 15, SD 43) (Figura 2d).

HEV protena M e G em A549, clulas MDBK e HeLa

Para determinar se os padres de HEV M e protena G
visto em clulas Vero foram tpico de clulas infectadas por HEV em geral,
A549,
MDBK
e
linhas
de
clulas
HeLa
foram
infectadas
e fixados em 8 e 18 hpi. Enquanto foram pequenas diferenas
entre estas linhas de clulas, em clulas infectadas com HEV
fixado
em
18
hpi
o
padro
global
observado
consistiu
protena G do HEV na membrana celular e a maioria das protena M no
ncleo
com
alguns
difusamente
localizado no citoplasma. Nas clulas A549, a maioria das
Protena L no foi co-localizada com a protena H, embora
houve um pequeno nmero de co-localizada pontos na membrana celular
que provavelmente representam virions (figura 3a, b). Em clulas MDBK a
protena
M
do
HEV
foi
vista
em
alta
nveis,
tanto
no
ncleo
como
no
citoplasma
(Figura
3c,
d) mas novamente muito pouca protena M foi observada no
membrana celular. HEV protena G esteve presente na clula
membrana, mas apenas uma pequena proporo parecia ser
em associao com a protena H. Em clulas HeLa, como mostrado
na Figura 3e, f, enquanto que a infeco tinha progredido significativamente
para
formar
um
grande
contendo
cerca
de
sinccio
15
ncleos
no
centro
da
imagem,
o
nvel
de
HEV
M
a expresso da protena foi baixa, com a maioria localizada dentro do ncleo.
Pequenas
quantidades
de
protena
H
eram
visto
na
membrana
celular
num
padro
pontuada.
A
maioria da protena G HEV foi localizado na membrana da clula, com muito
pouco presentes dentro do citoplasma.

Protena M e G em clulas articas endoteliais de bovino (BAEC) e

porcino (PAEC)
Como uma das principais metas para henipaviruses in vivo so
clulas endoteliais [26], as culturas primrias de ambos de porcino e bovino.
As clulas endoteliais articas de porcino (PAEC) e bovino (BAEC) eram
preparadas e infectadas com HEV. Estas espcies foram inicialmente
seleccionadas com base na sua sensibilidade tanto para HEV quanto NIV
[27].
Eles
foram
fixados
em
8,
18,
24
e
48
hpi
e
marcadas
com
anticorpos
individuais
especficos para as protenas M e G do HEV. No houve significativa
diferenas observadas na expresso de protena M do HEV.

As protenas G porcina e entre as clulas endoteliais de bovino.

Em ambos os tipos de clulas, s 8 hpi, HEV G foi visto em um ERlike
nveis de padro e baixa de M rotulagem foram vistos em
alguns ncleos (dados no mostrados). No entanto, a 18 hpi l
houve uma diferena significativa na expresso M e G em
Clulas PAEC e BAEC quando comparadas com clulas Vero
(Figuras 1 e 4). Nas clulas endoteliais, a protena G era HEV presente em um
padro
ER,
mas
tambm
como
pontos
na
superfcie celular (Figura 4a). A protena M de HEV era predominantemente
visto
em
pontos
sobre
a
superfcie
celular
e
os
baixos
nveis em alguns dos ncleos (Figura 4b). Os padres de rotulagem individuais
para
HEV
M
e
G
co-localizada
nos
pontos na superfcie celular (Figura 4C). Interessantemente, em clulas
onde houve um nmero significativo de pontos sobre a superfcie da clula
parecia
haver
um
menor
nvel
de
rotulagem
M no ncleo. importante ressaltar que, em nenhum momento foi testado o
padro
de
protenas
M
e
G
do
HEV
visto.
As linhas celulares imortalizadas (ver acima) observadas em HeV infectando
clulas endoteliais primrias.

Protenas HEV M e G no rim morcego e morcego pulmo derivado

linhas celulares
Os morcegos so os hospedeiros reservatrios de HEV e NIV, ainda aparecem
ser resistente doena induzida por vrus. Duas linhagens crivadas de
morcego
de
rim
e
pulmo
(Paki,
Palu)
[28] foram selecionadas. Elas estavam infectados com o HEV, fixada em
8, 18 e 24 hpi e anticorpo marcado para detectar HEV M
e protenas G. Protena do vrus Hendra M esteve presente nos s ncleos em
nveis baixos em 8 hpi e, em seguida, predominantemente
na membrana celular em pequenos pontos a 18 hpi.
Protena G vrus Hendra era difcil de detectar em 8 hpi, mas foi
presente em um padro de ER-like e em pontos na membrana celular
a 18 hpi. A protena M e protena G marcados como pontos positivos
na
superfcie
da
clula
mostrou
colocalizao
clara
das
duas
protenas
(amarelo,
Figura
4d),
como
observado nas culturas de clulas endoteliais.

Resoluo de imagem Sub-virion de HEV NM e protenas G

O limite de resoluo em microscopia de luz de cerca de
250-300
nm,
no
plano
xy,
e
~
500
nm
na
z
plano, tornando-o difcil de definir os pontos vistas no microscpio confocal
como
partculas
virais.
Desenvolvimentos
recentes
em
imaginologia
SR
melhoraram
significativamente
a
resoluo
vivel
usando
microscopia
de
luz.
Baseado
sobre os dados obtidos, a hiptese de que clulas endoteliais primrias seria
um
sistema
modelo
melhor
que
as
linhas
celulares
imortalizadas,
com
base
histria de cultura tecidual, observou que a expresso da protena HEV
padro foi notavelmente semelhante em ambas as espcies de
clulas endoteliais, bem como as clulas de rim derivadas de basto.
Escolhemos essas clulas, portanto, para novas experincias SR.
As lamelas de clulas PAEC e clulas Paki foram infectados com HEV, fixada
em
18
hpi
e
preparado
para
confocal
e
dois diferentes sistemas de microscopia SR. As lamelas foram
marcadas com anticorpos individuais que reconhece protena L HEV
e protenas N, que foram detectadas com espcies- especificas de
imunoglobulinas
por
imagem
confocal.
Estas
protenas foram selecionadas quanto sua distribuio, tal como avaliado
a partir de outros paramixovrus, dentro do envelope de membrana viral (HEV
N)
e
formando
a
glicoprotena
no
exterior
virion
(HEV
G).
Usando microscopia confocal convencional pequenas partculas positivas HEV
de
G
(Figura
5a,
b)
e
HEV
N
(Figura
5b)
foram facilmente detectados na superfcie das clulas PAKI. Enquanto
os pequenos pontos mostraram co-localizao das duas protenas virais, no
foi
possvel
detectar
qualquer
estrutura
dentro dos pontos fluorescentes. Grandes reas de rotulagem N
so vistos na Figura 5b (seta) e estes correspondem aos
'lagos' de protenas observadas em clulas Vero infectada com HEV no
citoplasma (Figura 1f).
Esgotamento de fase solo (GSD) microscopia de super-resoluo
licenas
de
~
100
nm
resoluo
lateral
sem
melhora
na
resoluo
do
plano
z.
A
Figura
5c
ilustra
uma
pequena regio da superfcie de uma clula que mostra o PAKI
partculas virais como estruturas redondas com G (verde) do lado de fora e N
(vermelho)
do
lado
de
dentro.
O
dimetro
mdio
de
as
partculas
era
314
nm
(n
=
20,
DP
39).
Iluminao
Microscopia
(SIM)
permite
Estruturado-3D
um aumento de duas vezes na resoluo em todas as trs dimenses.
Figura 5d uma imagem de uma seco de pastoreio da clula
membrana com partculas semelhantes a vrus claramente resolvido com
a protena G (verde) como crculos redondas com um significativo
dimetro de cerca de 300 nm (n = 40, DP 50). HEV

Protena N (vermelho) foi detectada dentro das estruturas esfricas

confirmando que eles eram HEV partculas virais. Em imagens
obtida
com
ambos
os
sistemas,
havia
regies
de
HEV
protena G de rotulagem que parecia estar na superfcie
da
clula
o
que
pode
representar,
quer
acumulaes
de
HEV protena G antes da montagem do vrus ou partculas semelhantes a vrus
falta
de
protena
N
sobre
a
membrana.
(Figura 5d seta).
Imagem por microscopia eletrnica de transmisso (TEM) confirma
partculas redondas so tpicas estruturas paramixovrus
A confirmao final das partculas redondas visto em microscopia SR
como
virions
paramixovrus-like
foi
fornecida
por
processamento de HEV clulas infectadas PAEC e Paki para
Imagem TEM. Seces de clulas infectadas mostraram a presena de
grandes
nmeros
de
partculas
redondas
(Figura
6a)
a
maior
ampliao
(figura
6b)
mostrou
o
morfologia tpica de um paramixovrus com um revestimento distorcido
indicando
a
presena
de
glicoprotenas
F
e
G
em
na parte externa do vrus, um envelope de membrana e RNPs
dentro
do
vrus.
O
tamanho
destes
virions
foi
varivel
com um dimetro mdio de 284 nm (n = 20, DP 61).
Estruturas no pleomrficos semelhantes s detectadas em HEV
foram
vistos
em
clulas
Vero.
HEV M protena associado com a membrana ou RNP do vrus?
Para resolver esta questo, as clulas PAEC foram infectados como acima
e co-rotulados para HEV protenas G e M, G e N, N e M
e analisada por imagiologia SR SIM. Os resultados indicam
que a protena G constantemente rotulada em um anel em torno dos
virions, mas havia poucas imagens para mostrar a protena M
formando um anel no interior da protena G HEV (Figura 7, linha
a). Protena HEV N formaram estruturas irregulares no anel de protena G
(Figura
7
linha
b)
e
protena
HEV
M
parecia
de se associar com a protena N (Figura 7 fileira c).

Discusso
O
processo

de

replicao

paramixovrus

montagem

vrus

manteve-se
mal
definido,
apesar
da
importncia
dos
paramyxoviruses como caxumba e sarampo na sade de humanos. Isto foi
devido,
em
parte,
s
dificuldades
inerentes
realizao de anlise estrutural de paramixovrus pleomrfico, partculas com
protenas
contendo
regies
desordenadas
que
os
tornam
difceis
de
analisar.
Assim,
o
primeiro
da estrutura tridimensional de um paramixovrus (vrus Sendai)
no foi obtido at 2009, quando a estrutura foi determinada
por
meio
de
tomografia
crio-eltron
[29].
Nesta
estrutura,
o
nucleocapsdeo
estava
livre
dentro
do
virion
e
a
protena
de
matriz
foi
ligado
ao
interior
da
partcula.
Dois anos mais tarde a estrutura 3-D de sarampo foi obtido
e demonstraram que as hlices protena de matriz formadas revestindo
o
ribonucleocapsdeo
em
vez
de
a
membrana
interior
do
vrus [30]. Como generalizada qualquer uma destas configuraes
entre
os
paramixovrus
no

conhecida.
Aqui utilizou-se uma srie de tcnicas diferentes para ajudar
elucidar alguns aspectos da replicao de um relativamente novo
grupo de paramixovrus, os henipaviruses. A infeco de uma variedade de
linhas celulares, bem como clulas endoteliais primrias deram
resultados surpreendentemente diferentes. Na fase inicial (8 IPH) de HEV
infeco de clulas Vero no havia nenhum sinal de formao de vrus
na membrana celular, mas a 18 e 24 hpi o padro de
vrus M e marcao da protena G foi difcil de interpretar. Em
contraste, em A549, HeLa e clulas MDBK infectadas com
HeVand fixada em 18 hpi a maioria da protena M foi HEV
no
ncleo
com
alguma
rotulagem
no
citoplasma.
Hendra
protena G do vrus estava presente no ER e em nveis elevados
na membrana celular, mas com pouca co-localizao com a
Protena M. Nestas ltimas
trs linhas celulares, apareceu
ser reduzido o trfico de protena M do HEV do ncleo
para a membrana celular. Embora a resposta de interferon defeituoso
em
clulas
Vero
[31]
pode
complicar
a
interpretao
destas
experincias,
as
razes
para
o
acmulo
aparente
da protena M do HEV no ncleo de A549, clulas MDBK
e clulas HeLa continuam por resolver. Claramente, imortalizada
linhas de clulas so capazes de produzir partculas virais infecciosas, mas
os padres de protenas HEV M e G visto nestas linhagem de clulas
no foram observadas em clulas endoteliais de culturas infectadas por HEV
em qualquer um dos pontos de tempo 8-48 horas (dados no
mostrados).
Que
papel
pode
desempenhar
nos
ttulos
de
vrus infeccioso produzido em diferentes linhas de clulas permanece obscura.
Como as clulas endoteliais so um importante alvo para HEV e
Niv in vivo [26] os resultados obtidos com a infeco de

estas clulas foram vistos como de particular interesse no contexto

do processo de montagem in vivo do vrus. Os relatrios anteriores
envolvendo
Niv
mostraram
algumas
diferenas
na
infectividade de
clulas endoteliais a partir de diferentes sitios [32]
com clulas endoteliais de aorta refratrios infeco, a menos
modificada para expressar o receptor efrina B2. Isto est em
contraste com os resultados aqui apresentados em que duas espcies
de clulas endoteliais articas primrias foram facilmente infectadas
com
HEV.
Resultados
semelhantes
foram
obtidos
com
VNI
(Dados
no
apresentados).
Em um estudo recente de replicao de um nmero henipavirus
de linhas celulares, Aljofan et al. [27] relataram que os nveis de protena e
ttulos
virais
variou
consideravelmente
entre
tipos de clulas. Os maiores nveis de produo de vrus
foram obtidos com clulas Vero, clulas HeLa so intermedirias
e A549 produzir um ttulo mais baixo do vrus. Os autores
no
abordaram
a
questo
da
distribuio
subcelular
de protenas virais. Nossos dados so amplamente compatveis
e resultados tambm podem indicar possveis razes para a
diferenas na produo de ttulo do vrus observado que a partir de
diferentes
linhas
celulares.
protena M de Niv foi relatado para o trnsito do ncleo
[25], mas este o primeiro relato de que isso ocorra em clulas HEV
infectadas.
A
funo
do
trfico
nuclear
de
henipavirus
Protena
M

clara,
mas
um
relatrio
recente
Wang
et al. [25] mostraram que para Niv, a protena M teve tanto
localizao nuclear e motivos de exportao e foi ubiquitinated no ncleo.
Prevenir
este
processo
teve
dramticos
efeitos negativos sobre o trfico de protena M dentro do citoplasma e
brotamento
viral.
A
localizao
nuclear
de
protena
M
tem
sido
relatado
para
outros
paramixovrus,
incluindo
Vrus Sendai [23], o vrus da doena de Newcastle [24] e
RSV [22]. Protena de M de RSV, enquanto presente no ncleo,
excluda do nuclolo e sua exportao a partir do ncleo
baseia-se
no
receptor
exportador
crm-1
[21].
Contudo
os autores relataram que a protena M foi ento encontrada no
citoplasma em contraste com as clulas infectadas por HEV, onde quase
toda a protena M
detectvel aparece sob a forma de virions
na
membrana
celular.
A
funo
do
processo
permanece obscura, mas um papel na inibio de acolhimento transcrio
celular
tem
sido
proposto
para
a
protena
M
de
RSV
[21]. Uma observao inesperada neste estudo foi uma tendncia
para as clulas com maior nmero de partculas de vrus
ter o menor nvel de protena M no ncleo de HEV. Uma explicao possvel

que em vez de uma sntese contnua e trfico de HEV M atravs

do ncleo durante o processo de infeco, h uma onda
sntese
de
M;
a
protena
se
move
atravs
do
ncleo
mas
no

continuamente
substituda.
O
mecanismo
e
funo
de
um
tal
processo
continua
altamente
especulativo.
Muitas
questes
permanecem
sobre
o
Acordo
de
as protenas do vrus dentro da partcula viral e da estrutura
do local de montagem do vrus. O arranjo da protena M foi recentemente
estudado
por
vrus
do
sarampo
e
tem sido sugerido que ele est estreitamente relacionado com o
RNP, em vez de a face interna do envelope viral [30].
H muito poucos relatos do uso de microscopia para SR
imagem estrutura viral, embora o valor da imagem latente SR
recentemente tem sido demonstrado para vrus vaccinia [33].
Neste estudo, ns investigamos o valor de dois muito diferentes
SR.
Microscopia
localizao
usando
GSDIM
/
dSTORM
se
baseia
na
deteco
de
fluorforos
individuais,
cuja posio pode ser determinada com preciso nanomtrica.
GSDIM
/
dSTORM
torna
a
maioria
dos
fluorforos
transitoriamente no fluorescente atravs da realizao de terreno
depleo estado e reversivelmente a transferncia das molculas
a um "off-state" (Triplet- e Dark-estados). Devido reversvel
natureza
deste
processo,
quase
todos
os
fluorforos
pode
ser trabalhada ao ser transitoriamente na sua fluorescente 'onstate'
durante
o
tempo
de
aquisio.
Com
base
na
posio
informaes dos fluorophores detectados, um nico SuperResolution
imagem

calculado
[34,35].
Em
contraste,
3DStructured
Iluminao
Microscopy
(3D-SIM)
funciona
para iluminar a amostra com um padro conhecido (neste caso
um padro de grade). O padro de grade produz alta frequncia
informaes sob a forma de franjas onduladas que pode ser
matematicamente extrapolados para resultar num aumento de duas vezes
na
resoluo
em
X,
Y
e
Z
[36].
Apesar
de
diferenas significativas entre os dois sistemas de SR, ambos
deu imagens muito semelhantes de virions HEV e demonstraram
para a resoluo de sub-partculas primeira vez de paramixovrus
protenas
e
a
morfologia
rodada
de
virions
HEV.
Imagem
de virions co-etiquetado para a presena de proteina M do HEV, N e protenas
G fornecida uma primeira indicao de que a protena M
parecia
estar
associada
com
a
RNP,
em
vez
de
a
envelope
viral.
Globalmente, estes resultados indicaram que HEV deve ser descrito
como um vrus predominantemente redondo com um dimetro
de 280-310 nm, dependendo da mtodo de imagem. Como o

As amostras permaneceram hidratado durante todo o rotulagem e

processo de imagem de microscopia SR, um dimetro de vrus
de aproximadamente 300 nm, deve oferecer uma estimativa mais precisa
do
vrus
vivo
em
dimenso.
Apesar da evidncia sorolgica clara de infeco pelo VHE, real
isolamento do vrus a partir de morcegos no provou simplesmente [37].
Um objetivo adicional deste trabalho foi identificar qualquer difeconferncias em localizao de protenas HEV M e G entre clulas de morcego
e
de
no-morcego.
Comparao
do
padro
de
expresso
Protenas M e G em clulas endoteliais VHE-infectadas com que
visto em duas linhas de clulas derivadas de basto indicaram que no houve
diferena observvel entre os dois tipos de clulas em resposta
a infeco por henipavirus, mas houve diferena pronunciada entre estes dois tipos de clulas e de outras linhas de clulas contnuas.
Concluso
Estes resultados fornecem novas perspectivas sobre a estrutura
de
HEV.
Eles
destacaram
os
benefcios
da
imagem
SR
para
estudos
de
estrutura
e
mostrar
paramixovrus
que, em estudos de imagem para HEV a escolha de cultura de tecidos
clulas podem afetar os resultados experimentais. Os resultados obtidos
usando
vrias
abordagens
de
diferentes
imagens
indicam
que HEV deve ser considerado um vrus predominantemente
redondo
com
um
dimetro
mdio
de
aproximadamente
280 nm por TEM e 310 nm por imagem SR.

Mtodos
Preparao
e
cultura
de
clulas
primrias
Seguindo
a
eutansia,
cerca
de
3
cm
pedaos
de
aorta foram coletadas assepticamente a partir de um porcos adultos 24 hr
e 14 dias de vitelo envelhecido e colocado em meio RPMI + FCS a 10%.
Os tecidos foram lavados em PBS + antibiticos (Pen / Strep e
Fungizona) duas vezes, depois tratado com colagenase (Sigma
Aldrich) e incubadas a 37 C durante 15-20 min. As clulas foram
recuperadas por centrifugao a 1500 RPM durante 5 min, e
o sedimento de clulas ressuspenso em 5 mL de meio de crescimento
(EMEM, Gibco) e adicionado a uma cultura de tecidos de 25 centmetros
frasco (Corning). As culturas de clulas endoteliais mostraram
essencialmente
a
morfologia
celular
era
homognea
que
mantida durante at 10 passagens. Todas as experincias foram
realizado em culturas de menos de seis passagens.
Culturas primarias foram imunomarcadas para a presena de
PECAM e eram> 90% positiva para este marcador de clulas
(Dados
no
apresentados).

Cultura de linhas celulares

As linhas de clulas (Vero, ATCC CCL81; A549, ATCC CCL185;
HeLa, ATCC CCL2; MDBK, ATCC CCL22) foram cultivadas em EMEM com
10%
de
soro
de
vitelo
(EMEM-GM)
e
passadas
como necessrio. Estes foram incubados a 37 C em 5%
CO2. As duas linhas de clulas derivadas de morcego foram preparados como
previamente descrito [28].
Clulas
para
a
microscopia
confocal
e
super-resoluo
As clulas foram infectadas em BSL-4 com uma baixa passagem de Hendra
Redlands vrus (vrus Hendra / Austrlia / cavalo / 2008 / Redlands)
[38]. As clulas cultivadas em placas de 24 poos contendo 13 milmetros
lamelas de vidro foram infectadas a uma MOI de 8 e infeces
foram
parados
no
tempo
apropriado,
removendo
EMEMGM
e substituindo-o com 4% de paraformaldedo em PBS.
As clulas para microscopia de super-resoluo foram cultivadas em 6 bem
placas contendo lamelas e foram infectadas como para confocal
microscopia. As clulas fixadas foram removidos a partir do 4-BSL
laboratrio e toda a rotulagem foi realizado em condies normais
condies de laboratrio.
Preparao
do
inoculo
de
vrus
por
colorao
negativa
Uma alquota de um inoculo preparado conforme descrito HEV
anteriormente [39], foi fixado em um 1: (v / v) com uma relao de 8%
paraformaldedo em PBS, para cumprir com a segurana biolgica
protocolos e armazenado a 4 C. Uma grade formvar revestido foi
flutuava sobre uma gota de inoculo durante 5 minutos e transferida
para uma gota de Nanodrop (nanossondas) durante 1 min.
A grade foi apagado e fotografada em um CM120 Philips
microscpio eletrnico.
Processamento de clulas infectadas para TEM
As
clulas
foram
semeadas
em
lamelas
thermanox
(ProSciTech) e processados para microscopia eletrnica como anteriormente
descrito [40].
Processamento
de
clulas
para
imagem
confocal
e
SR
As clulas foram semeadas em lamelas de vidro 13 milmetros em 24 poos
placas (Nunc) de imagem confocal e SIM e 18 milmetros
lamelas quadrados para SR imaging GSD. Eles foram incubados
durante a noite, e infectadas com HEV num MOI de 8 como
descrito anteriormente. Fixaram-se em 18 hpi em 4% (w / v)
paraformaldedo
em
tampo
fosfato
salino
e
removido
a partir da rea de conteno. Elas foram armazenadas a 4 C
em PBS.

Imunomarcaao por Fluorescncia

As clulas fixadas foram permeabilizadas com 0,1% (v / v) de Triton X100 em PBS durante 10 min e lavadas em PBS. Especfica norotulagem foi bloqueada com uma incubao de 30 min em 0,5%
albumina de soro bovino em PBS (PBS / BSA) e todos os anticorpos
foram diludos em PBS / BSA. Os anticorpos primrios estavam
incubadas durante 60 min e depois foram detectadas 3 5 min lavagens
com imunoglobulinas especficas da espcie fluorescente conjugados
diludo
a
1:
200
em
PBS
/
BSA
(Life
Technologies).
Depois de 3 5 min lavagens com PBS e uma lavagem dH20, ncleos
foram coradas com uma diluio de 1: DAPI (Sigma) em 4000
dH20.
As
lamelas
foram
montadas
em
Vectashield
(Vector
Laboratories)
e
selado
com
verniz
para
as
unhas.
Os
anticorpos
primrios
e
conjugados
fluorescentes
Anti-Hendra
anticorpos:
coelho
anti-HEV
G
1:
2000
(AAHL
levantadas contra a protena G Niv recombinante expresso em
Clulas CHO), humana G (mAb m102.4-HEV anti generosamente
presenteado por Broder CC) 1: 1000 [41] coelho anti-HEV N
1: 2000 (AAHL, levantou contra a protena N recombinante Niv
expresso em clulas CHO), anticorpo monoclonal anti-M HEV
01:10 (AAHL, [42]), Protena dissulfureto isomerase de 1: 1000
(Quantum Scientific), PECAM 01:50 (Santa-Cruz). Speciesspecific
Os
anticorpos
secundrios
eram
da
Life
Technologies
e conjugado com Alexa 488, 568, 543 ou 647 (1: 200).
Os anticorpos primrios e conjugados fluorescentes
Anti-Hendra
anticorpos:
coelho
anti-HEV
G
1:
2000
(AAHL
levantadas contra a protena G Niv recombinante expresso em
Clulas CHO), humana G (mAb m102.4-HEV anti generosamente
presenteado por Broder CC) 1: 1000 [41] coelho anti-HEV N
1: 2000 (AAHL, levantou contra a protena N recombinante Niv
expresso em clulas CHO), anticorpo monoclonal anti-M HEV
01:10 (AAHL, [42]), Protena dissulfureto isomerase de 1: 1000
(Quantum
Scientific),
PECAM
01:50
(Santa-Cruz).
de
espcies
anticorpos
secundrios
especficos
eram
da
Life
Technologies
e conjugado com Alexa 488, 568, 543 ou 647 (1: 200).

Imagiologia por fluorescncia

Para

confocal

convencional

imagiologia

as

lamelas

marcadas

foram fotografadas com um microscpio confocal Leica SP5. Dados

coleo estava usando Leica LAS AF. Iluminao Estruturado-3D
Microscopia
foi
realizada
num
OMX
V4
3DSIM
sistema
equipado
com
um
(1,42
NA)
objetiva
60x
(GE
Sade
/
Applied
Precision).
Reconstruo
da
imagem
era
com softWoRx (GE Healthcare / Precision Aplicada).
Para
super-resoluo
GSDIM-imaging
com
o
SR
Leica
GSD, 18 milmetros lamelas foram armazenados em PBS aps imunomarcao
a 4 C. As lamelas foram montadas sobre uma nica
corredia
depresso
(76
mm
x
26
mm)
e
a
cavidade
preenchido com aprox. 100 ul de PBS contendo 50 mM de Mercaptoetilamina
(Sigma-Aldrich,
#
30070)
ajustado
para
pH 7,4 como tampo de imagem. A imagiologia foi realizada
com um sistema GSD Leica SR usando um 100 (NA 1,47) objetivo
e
uma
ampliao
ps
1,6x
(160

no
total).
O
dois
fluorforos
foram
gravadas
sequencialmente
e
imagem
aquisio, anlise nica molcula e reconstruo de imagem
foi
realizada
com
Leica
LAS
AF
2.6.1.
Figuras 1, 2, 3, 4, 5 e 6 foram preparadas usando o Adobe
Photoshop e Figura 7 foi preparado utilizando Fiji (NIH).