UNIVERSIDAD NACIONAL SAN LUIS GONZAGA DE ICA

DIRECCION GENERAL DE INVESTIGACIN

INFORME FINAL DE INVESTIGACION

TTULO:

Diagnstico Bacteriolgico de Pasteurella

multocida Biotipo A, en Bovinos Benefeciados en el
Camal Municipal de Chincha

PRESENTADO POR:

MSC. VIOLETA ENRQUEZ PREZ.

M.V. CARLOS DEL SOLAR MORALES.

CHINCHA
FEBRERO 2015.
1

NDICE
Pag.
RESUMEN............................................................................................... 5
SUMMARY 6
I.

INTRODUCCIN 7
II.

MARCO TERICO 8

2.1

Antecedentes. .

2.2

Encuadre taxonmico/filogentico 9

2.3

Caractersticas generales de P. multocida.. 10

2.4

Ecologa. 12

2.5

Identificacin de especie. 13
2.5.1 Mtodos tradicionales.. 13
2.5.2 Mtodos moleculares 14
2.5.3 Metdos de tipado fenotpico 15

2.5.3.2

2.5.3.1 Determinacin de biovares

15

Determinacin del tipo capsular.

15

2.6 Patogenicidad 16
2.7 Factores de virulencia.

16

2.8 Patologas en diferentes animales. .

17

2.8.1 Aves.

17

2.8.2 Conejos..

18

2.8.3 Humanos

18

2.8.4 Ganado Porcino

20

2.8.5 Ganado Bovino

21

2.9 Trminos bsicos..

23

III.

IV.

MATERIALES Y METDOS

24

3.1 mbito de estudio..

24

3.2 Materiales y Equipos.

24

3.3 Mtodo estadstico.

25

3.3.1 Tipo, Nivel y Diseo de la Investigacin

25

3.3.2 Tamao de la muestra.

25

3.4 Hiptesis y Variables de estudio

26

3.4.1 Hiptesis

26

3.4.2 Variables

26

3.5 Tcnicas de Recoleccin de Informacin

27

3.5.1 Recoleccin.

27

3.5.1.1 En el Camal Municipal

27

3.5.2 En el laboratorio.

27

RESULTADOS Y DISCUSIN

31

4.1 Total de muestras bovinas procesadas..

31

4.2 Resultado de los cultivos en Agar Sangre al 5% en

Anaerobiosis..

31

4.3 Resultado de las Pruebas Bioqumicas (Hisopado nasal)

33

4.4 Resultados del cultivo de Pulmn y Tonsilas en Agar

sangre

35

4.5 Resultado de las Pruebas bioqumicas de las muestras de

Pulmn y

de Tonsilas..

36

4.6 Resultado de la Prueba Molecular (PCR)para la deteccin

de P. multocida...

37

V.

CONCLUSIONES.

39

VI.

RECOMENDACIONES

40

VII. FUENTES DE INFORMACIN 41

LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Colonia de P. multocida en Agar sangre.

10

Figura 2. Lesiones causadas por P. multocida

22

LISTA DE TABLAS
Tabla 1.sub especies de P. multocida.

12

Tabla 2. Cebadores de PCR especfica de especie.

28

Tabla 3. Volmenes empleados en la PCR.

29

Tabla 4. Condiciones de PCR especfica de especie.

29

LISTA DE CUADROS.
Cuadro 1. Perfil bioqumico de P. multocida.

14

Cuadro 2. Cultivo directo en Agar sangre 5%.....................................

32

Cuadro 3. Pruebas bioqumicas de muestras sospechosas

De hisopado nasal

34

Cuadro 4. Cultivo de pulmn y tonsilas en Agar sangre..

35

Cuadro 5. Pruebas bioqumicas de muestras sospechosas

De pulmn y tonsilas..

36

Cuadro 6. PCR mltiple de muestras de hisopado nasal,

Pulmn y tonsilas

38

RESUMEN

Las enfermedades respiratorias inmuno deprimen a los animales y en los

bovinos de cualquier edad es el problema relevante, presentndose con
mayor frecuencia en los de crianza extensiva porque estn ms expuestos a
diversos factores. Segn los reportes de diversos investigadores este
problema existe a nivel mundial, habindose aislado en diversas localidades
de nuestro pas, pero en Chincha an no se ha realizado ningn estudio, por
lo que el presente estudio tuvo como principal objetivo realizar el diagnstico
Bacteriolgico de Pasteurella multocida Biotipo A, en Bovinos Benefeciados
en el Camal Municipal de Chincha. Esta investigacin se realiz durante los
meses de Marzo 2014 a Febrero 2015, en bovinos mayores de 8 meses de
edad, procedentes de las crianzas lecheras de la Provincia de Chincha. Se
tomaron muestras de hisopado nasal en 140 hembras para la deteccin
bacteriolgica de P. multocida, biotipo A, mediante el cultivo en Agar sangre
al 5% y en anaerobiosis. El 93.57 % (131/140) de los animales dieron
reaccin negativa en el cultivo con agar sangre. El 6,473 % (9/140) de las
muestran formaron colonias sospechosas de P. multocida. Para confirmar
los resultados se cultivaron en agar sangre muestras de pulmn (n=10) y de
tonsilas (n=5), obtenindose 1 y 2 colonias sospechosas en los cultivos de
pulmn y tonsilas respectivamente. Todas las muestras sospechosas, tanto
de hisopado nasal como de pulmn y tonsilas, se sometieron a una batera
convencional bioqumica, dando resultados negativos para la presencia de
P. multocida. Adicionalmente,a los 140 cultivos de hisopado nasal y las
muestras de pulmn y tonsilas, se les aplic una prueba molecular de PCR
mltiple, para encontrar el gen KTM1 (Townsend et al., 2001),
resultado negativo.

Palabras clave: Pasteurella, Neumona, Bovino, Respiratoria

5

dando

SUMMARY

Immuno depress respiratory diseases to animals and cattle of any age is

the major problem, occurring more frequently in extensive rearing because
they are more exposed to various factors.According to reports from
various researchers this problem exists worldwide, having been isolated in
different localities of our country, but in Chincha has not been any studies,
so this studys mainobjective

was to perform

the Bacteriological

Diagnosis ofPasteurella multocida biotype A, Bovine Benefeciados in the

Municipal slaughterhouse of Chincha. This research was conducted during
the months of March 2014 to February 2015, in cattle older than 8 months
old, from dairy breeds of Chincha Province. Nasal swab samples were
taken in 140 females for germ detection of P. multocida , biotype A, by
culturing in 5% blood agar and in anaerobiosis. The 93.57 % (131/140) of
the animals had negative reaction onblood agar culture he 6,473 %
(9/140) of the samples formed suspect colonies of P. multocida. To confirm
the results were cultured onblood agar lung samples (n = 10) and tonsil (n
= 5) to give 1 and 2 suspect colonies in lung and tonsil cultures
respectively. All suspicious samples, both nasal swabs and lung and
tonsils, underwent a conventional battery biochemistry, giving negative for
the presence of P. multocida. Additionally, at 140 nasal swab cultures and
samples of lung and tonsils were applied molecular multiplex PCR test to
find the KTM1 gene (Townsend et al. , 2001) , giving negative results.

Keywords:Pasteurella, Pneumonia, Cattle, Respiratory.

I.

INTRODUCCIN.
En el Per y por ende en Chincha, la crianza de bovinos se realiza mediante
dos sistemas: la intensiva y la extensiva, estando ms expuestos a contraer
enfermedades la explotacin extensiva por obvias razones. En Chincha hay
ms explotaciones de tipo extensivo. Por lo general la productividad de sta
ganadera se ve afectada desde el nacimiento de las cras por la presencia
de enfermedades infecciosas como las diarreas y las neumonas [1].
Las neumonas son causadas por diferentes agentes bacterianos y virales,
siendo la Pasteurella multocida el agente predominante. La neumona es la
inflamacin del parnquima pulmonar que se acompaa frecuentemente con
la inflamacin de los bronquiolos y a veces con pleuritis [9].
La Pasteurella multocida suele formar parte de la flora normal de las vas
respiratorias altas, considerndosele como oportunistas, pues al bajar las
defensas del aparato respiratorio pueden descender y colonizar los
pulmones. La P. multocida afecta a varias especies de animales e inclusive
al ser humano [22].
La pasteurelosis neumnica bovina es una enfermedad infecciosa aguda
que es producida por la Pasteurella multocida biotipo A, que se presenta en
los animales estresados por diferentes causas, como son: el transporte a
largas distancias, la falta de alimento y agua (no comen ni beben), la fatiga,
sufren los cambios de climas, etc. [9.] Todos estos factores predisponentes
se presentan en los bovinos que llegan al camal municipal de Chincha, pues
por lo general provienen de la serrana (SENASA-CHINCHA). Por ello esta
investigacin ha tenido como objetivo general determinar la presencia de
Pasteurella multocida mediante hisopados nasales en bovinos que se
benefician en el Camal Municipal de Chincha, y como objetivo especfico
diagnosticar bacteriolgicamente a la Pasteurella multocida biotipo A en
bovinos.

II.

MARCO TERICO.
II.1 Antecedentes.

Louis Pasteur aisl en 1880 esta bacteria a partir de sangre de aves que
padecan clera aviar, caracterizndola morfolgica y bioqumicamente [55]
Este microorganismo ha tenido distintos nombres a lo largo del tiempo,
pudiendo ser Micrococcus gallicidus el primero de ellos [14]. En 1885, Kit
aisl el microorganismo de sangre de ganado vacuno, caballos y cerdos
enfermos, denominndolo Bacterium bipolarmulticidum[41]. Al ao siguiente
Hueppe

lo

renombr

como

Bacterium

septicaemiahaemorrhagica,

calificando como septicemia hemorrgica a la enfermedad que produca

esta bacteria en ganado bovino [36].
El nombre genrico de Pasteurella fue propuesto por Trevisan EN 1887, en
conmemoracin al trabajo de Louis Pasteur sobre dicho microorganismo.
Lignieres propuso una clasificacin de las pasteurelas en funcin del
hospedador (P. avicida, P. bovicida, P. boviseptica )[47].Ms tarde se
agruparon diferentes bacterias que presentaban caractersticas morfolgicas
y bioqumicas similares en P. sptica. El nombre definitivo de P. multocida
fue asignado por Rosenbusch y Merchant en 1939 [81].
Pasteurella multocida es una especie que habita normalmente como
saprofito en la regin naso farngea (tracto respiratorio superior) de los
bovinos. De sta especie se conocen 5 biotipos capsulares: A, B, D, E, F
[46], de los cuales el biotipo A al exacerbarse puede ocasionar una

morbilidad de 4.6 a 89% en bovinos de todas las edades pero de

preferencia en terneros de 6 meses a 2 aos de edad [15].
Pasteurella multocida es un patgeno oportunista de amplia distribucin
mundial tanto en veterinaria como para la salud humana [1,2]. Algunos
serotipos estn relacionados con varios tipos de pasteurelosis, tales como:
clera aviar en especies aviares [3], septicemia hemorrgica en el ganado
[4], rinitis atrfica o neumona en el cerdo [9]. Las infecciones humanas por

P. multocida usualmente pueden ocurrir a partir de mordeduras de perros y

gatos provocando linfangitis, en pacientes inmunocomprometidos, as como
meningitis y endocarditis [13,15].
8

Koneman y col, 1992 [42], recomendaron la metodologa para aislar o

identificar bacterias mediante pruebas bioqumicas especficas.
Leotta

col,

2006[45]en

Argentina,

identificaron,

biotipificaron

caracterizaron 30 cepas de Pasteurella multocida.

Estudios realizados en Mxico, reportan que con frecuencia aslan el biotipo
A, a partir de pulmones neumnicos de bovinos, debido a factores pre
disponentes que desencadenan la neumona, como son: el estrs por el
transporte, la falta de alimento y agua, muchas corrientes de aire, la
humedad, etc.[ 52].
II.2 Encuadre taxonmico/filogentico.
P.

multocidaes

una

especie

bacteriana

encuadrada

en

el

ordenPasteurellales, familia Pasteurellaceaey gnero Pasteurella. La familia

Pasteurellaceaees una familia muy heterognea, que se ha sometido a
mltiples

reclasificaciones

sobre

la

que,

todava,

se

continan

cuestionando sus relaciones taxonmicas. Actualmente comprende 13

gneros segn la FormerlyList of Bacterialnameswith Standing in
Nomenclature(http://www.bacterio.cict.fr/):Actinobacillus,
Avibacterium,
Lonepinella,

Bibersteinia,
Mannheimia,

Gallibacterium,
Nicoletella,

Aggregatibacter,

Haemophilus,

Pasteurella,

Histophilus,

Phocoenobactery

Volucribacter[63, 54].
II.3 Caractersticas generales de P. multocida.
Es un coco bacilo, pleomrfico, Gram negativo, inmvil, capsulado, no
esporgeno, anaerobio facultativo, que presenta una tincin bipolar tpica y
crece bien en agar sangre, agar chocolate Mueller Hinton pero no en agar
MacConkey. En agar sangre las colonias se observan pequeas, circulares,
convexas y de 1 a 3 mm de dimetro, generalmente de aspecto mucoso,
grisceo o blanquecino (Figura 1), y de olor caracterstico (debido a la gran
produccin de indol), [68, 69].
9

Pueden aparecer sueltos o agrupados en parejas o cadenas cortas. Son

pocos resistentes a los agentes fsicos y qumicos y sobreviven muy poco
tiempo en el medio ambiente [33].

Figura 1. Colonias de P. multocida en placa de Agar sangre.

Towsend y col, 2001[78], utilizando la tcnica de PCR mltiple, lograron la

tipificacin capsular, identificando 5 biotipos: A, B, D, E, F. Dan reacciones
de oxidasa y catalasa positivas, reducen los nitratos a nitritos y son indol
positivos [43].
Leotta y col, 2006, [46], realizaron pruebas de sensibilidad y hallaron que
este microorganismo es sensible a: ampicilina, cefalotina, ceftiofur,
enrofloxacina,

estreptomicina,

florfenicol,

gentamicina,

tetraciclina

tiamulina.
Allan y col, 1989,[2] reportaron niveles de resistencia superiores al 80%
para estreptomicina y tetraciclinas y Clavijo y col, 2002, [23] hallaron una
resistencia de 50.8% a la estreptomicina.
Forma parte de la flora normal de las vas respiratorias superiores en
animales sanos, particularmente en las amgdalas y las criptas amigdalinas
[27]. Por ello es que puede aislarse de animales clnicamente sanos [52].

Se les consideran como oportunistas pues al bajar las defensas del aparato
respiratorio pueden descender y colonizar los pulmones.Esta bacteria
produce en su fase de crecimiento logartmico una sustancia soluble que es

10

txica para macrfagos y leucocitos de rumiantes, llamada leucotoxina

(exotoxina) que es considerado como el principal factor de su virulencia.
Ultra estructuralmente, son microorganismos unicelulares procariotas, sin
ncleo definido, que por lo general tienen un tamao de 0.5 a 5u, poseen
una pared celular compuesta de peptidoglicano y algunos tienen flagelos y
pilis. Poseen un nucleoide de ADN y en el citoplasma contienen plsmidos,
vacuolas y ribosomas. Tienen membrana citoplasmtica compuesta por
fosfolpidos y algunos poseen cpsula. Carecen de mitocondrias, aparato de
Golgi y retculo endoplasmtico[13].
Para su crecimiento y desarrollo necesitan de un aporte energtico y se
reproducen por fisin binaria. Son los organismos ms abundantes del
planeta y se les encuentra en todos los hbitats terrestres y acuticos.
Tabla N 1.Subespecies de P. multocida

Subespecie
P. multocida. Subsp. multocida
P. multocida. Subsp. sptica
P. multocida. Subsp.. gallicida

Dulcitol

Sorbitol

La subespecie multocida es la ms frecuente en todo tipo de

hospedadores, siendo las subespecies gallicida y septicamucho menos
habituales. As, la subespecie multocida es la ms comn en ganado
porcino[8], adems de ganado bovino [7], aves y gatos [75, 21, 51, 26, 57], y
perros [53].
La subespecie septica es aislada normalmente en aves (especialmente en
salvajes), perros y, sobre todo, en gatos [76, 26, 59, 53].En ganado vacuno
los datos de aislamiento de esta subespecie son escasos [5,6], y ms an lo
es en el caso del ganado porcino [80].En humanos esta subespecie se
asocia frecuentemente a infecciones de heridas o mordiscos producidos por

11

perros o gatos, mientras que la subespecie multocida se asocia ms

frecuentemente a procesos respiratorios [17].
Por ltimo, la subespecie gallicida es la menos comn de las tres, y es
tpica de muestras procedentes de aves, especialmente acuticas y
salvajes[35].
II.4 Ecologa.
Los miembros del gnero Pasteurella se encuentran habitualmente como
comensales de las mucosas del tracto digestivo y respiratorio superior de
mamferos y aves aparentemente sanos de todo el mundo. P. multocida ha
sido aislada de muchas especies animales (vacas, bfalos, cerdos, cabras,
pavos, pollos, patos, gansos, gatos, perros, etc.), a partir de animales
aparentemente sanos y enfermos [75].
Este microorganismo no persiste mucho tiempo en el medio ambiente
dependiendo su viabilidad de las condiciones de temperatura y humedad
[70]. Puede permanecer viable en el agua de 7 a 25 das y en suelo durante

ms de 21 das, pero se inactiva tras la exposicin directa al sol durante 10

minutos [54]. Adems puede sobrevivir durante largos perodos en materia
orgnica [12].Se inactiva a 60C en 1 min o en fenol al 0,5% en 15 min [74].
El hbitat ideal de esta bacteria es el tracto respiratorio de aves y
mamferos, producindose la transmisin, fundamentalmente, mediante
contacto directo, aerosoles o ruta fecal-oral [70].
II.5 Identificacin de especie.
II.5.1 Mtodos tradicionales.
Debido a la gran heterogenicidad que presenta P. multocida, y a que
lascondiciones de cultivo pueden influir en la expresin de ciertos
caracteresfenotpicos disminuyendo, por lo tanto, la repetibilidad y fiabilidad
de estosmtodos para la identificacin [49];la utilizacin de pruebas
bioqumicas no se considera un mtodo preciso para laidentificacin de esta
especie bacteriana [26]. Adems, existenotras especies con un aspecto
12

macroscpico o microscpico similar, y que,afectando a los mismos

animales, pueden tener caractersticas bioqumicas muysimilares, como por
ejemplo Manheimmia haemolytica o Pasteurella pneumotropica [49].Aun as,
es un sistema fundamental parauna identificacin bsica y para clasificar los
aislados en los diferentes biovaresy subespecies.
El mtodo convencional de identificacin de P. multocida implica lautilizacin
de una serie de pruebas bioqumicas[69] que pueden realizarse de manera
tradicional o mediantealgn sistema comercial, como pueden ser las
galeras multisustrato API 20NEy API20E (Biomerieux); (Cuadro 3).

Cuadro 1. Perfil Bioqumico de Pasteurella

multocida.

_
_
_

Catalasa
Oxidasa
Mac Conkey
Indol
Gelatina
Urea
Motilidad
ODC
Fermentacin Maltosa
Fermentacin Glucosa
Fermentacin Manitol

2.5.2. Mtodos moleculares.

Se han descrito varias tcnicas de reaccin en cadena de la polimerasa
(PCR) para identificar P. multocida. Se describi, por ejemplo, una PCR que
detectaba el gen psl que codifica para una protena similar a P6 de
13

Haemophilus influenzae[8]. No obstante, la ms utilizada es la PCR descrita

por Townsend en (2001)[79], que detecta una secuencia de ADN nica en P.
multocida y que ha demostrado una alta sensibilidad y especificidad.
2.5.3 Metdos de tipado fenotpico.
2.5.3.1 Determinacin de biovares.
La determinacin de biovares se realiza mediante las pruebas bioqumicas
descritas por Feagan et al. (1995) y Blackall et al. (1997) [29,8], que incluyen
una batera de 7 azcares: glucosa, trehalosa, xilosa, dulcitol, sorbitol,
lactosa, y manitol, adems de la prueba de la ODC y la produccin de
ureasa. Mediante el patrn bioqumico derivado de estas pruebas se
clasifica, si es posible, cada biovar. Cada sub especie, a su vez, tiene
definidos ciertos biovares. As, la sub especie multocida comprende los
biovares 1,2,3,4,9,12,14; la sub especie septica los biovares 5,6,7, y 10; y la
sub especie gallinicamente el biovar [29].
2.5.3.2 Determinacin del tipo capsular.
El antiguo sistema para determinar el tipo capsular estaba basado en
lahemaglutinacin pasiva de eritrocitos sensibilizados frente a los antgenos
capsulares [11]. Ms tarde se describieron nuevos mtodos rpidos y
sensibles para identificar el tipo capsular A mediante la prueba de la
hialuronidasa estafiloccica [16],y el tipo capsular D mediante la prueba de
la acriflavina [16]. Los tipos capsulares B y E han sido identificados tambin
mediante diferentes mtodos, como son la prueba de la inmunizacin pasiva
en ratones [69]y la prueba de coaglutinacin [68].
Actualmente se utilizan tcnicas moleculares para la diferenciacin de los5
tipos capsulares. Se han descrito tcnicas de PCR simples y especficas
para la deteccin de un determinado tipo capsular, como, por ejemplo, para
el tipo capsular A [73],y el B, causante de la septicemia hemorrgica [78]No
obstante, se ha diseado una PCR mltiple [79],que es capaz de identificar
todos los tipos capsulares en la misma reaccin, adems de poseer una alta
14

especificidad y sensibilidad, por lo que se considera la mejor opcin para

detectar los distintos tipos capsulares de P. multocida.
2.6 Patogenicidad.
P. multocida produce numerosas enfermedades en un amplio rango
deespecies animales, afectando a mamferos y aves (tanto domsticos
comosalvajes) en todo el mundo, provocando en muchos casos importantes
prdidaseconmicas [83]. Como ya se indicanteriormente, se trata de una
especie bacteriana muy heterognea, con unaenorme variacin respecto al
hospedador al que afecta, patogenicidad yespecificidad de antgenos [16].
Se considera que P. multocida tiene un papel primario en los procesos
desepticemia hemorrgica en ganado bovino y bfalo [16], yen RAP en
cerdos [9]. En el caso de las aves, esta bacteriaes la responsable del clera
aviar [16], aunque algunos autores sugieren que su papel es meramente
secundario [68]. En elcaso del desarrollo de afecciones respiratorias s
parece claro su papel comopatgeno oportunista, provocando, por ejemplo,
neumona en cerdos [61,62], en bovinos y ovinos [5],en conejos [25].

2.7 Factores de virulencia:

CPSULA: La cpsula protege a la bacteria de la fagocitosis y de la
actividad bactericida mediada por el complemento; permitiendo de esta
manera la sobrevivencia y su proliferacin en el tracto respiratorio [44].
ENDOTOXINAS:

Como

todas

las

bacterias

Gram.-negativas,

las

endotoxinas son parte estructural de la pared del microorganismo, y al morir,

esta se libera provocando una serie de alteraciones en cadena que
causando fiebre y serios trastornos circulatorios[44].
LEUCOTOXINAS: Es el principal factor de virulencia de la bacteria ya que
ataca letalmente los leucocitos comprometiendo an ms los mecanismos
de defensa pulmonar[44].
15

2.8 Patologas en diferentes animales.

2.8.1 Aves.
En aves P. multocida produce clera aviar, enfermedad muy frecuente,que
afecta a aves salvajes y domsticas y que tiene una importancia
econmicamundial [68,18,19, 7].Estaenfermedad ha sido reconocida y
asociada a las aves desde hace ms de 200aos [71]. Desde entonces se
han reseado brotes en una granvariedad de especies aviares y en distintos
lugares

del

mundo

[31,

32];

OIE,

2004;

[71].

Se

trata

de

la

enfermedadinfecciosa ms importante en aves acuticas en Norte Amrica

[31],causando la muerte de miles de animales cuando se producen

brotesimportantes [65,71]. EnEspaa esta enfermedad no supone un

problema grave, ya que ha sidodesplazada por la implantacin de medidas
higinico-sanitarias y teraputicas,aunque de vez en cuando aparezcan
brotes agudos [58].El clera aviar es causado por diferentes tipos capsulares
y somticos deP. multocida [68], aunque en la mayora de los casosagudos
de enfermedad estn implicados aislados de tipo capsular A y serotipo 1 [82,
68,73].

La epidemiologa de la enfermedad es bastante compleja, dependiendo la

gravedad de la misma de numerosos factores como la especie de ave
hospedadora, su edad y lnea gentica, estado sanitario (estrs, otras
enfermedades concomitantes, inmunosupresin), factores de manejo
(densidad animal, cambios bruscos de temperatura, etc.), adems de la
cepa bacteriana y factores ambientales [20, 53, 57].
Se presenta generalmente como una enfermedad hiperaguda que cursa con
bacteriemia generalizada, de alta morbilidad y mortalidad, pero, tambin,
con forma crnica y sntomas clnicos y lesiones relacionadas con
infecciones localizadas (OIE, 2004). Al parecer, las aves portadoras
(domsticas y salvajes) juegan un papel fundamental en la transmisin y en
el mantenimiento de esta enfermedad, habindose demostrado que P.
multocida se encuentra en la mucosa de faringe, trquea y cloaca de
animales

asintomticos

[24,71,53]
16

Adems,

parece

ser

que

las

avesmigratorias pueden extender la enfermedad, transmitiendo la bacteria a

las aves domsticas [18].Se pueden afectar todas las especies de aves,
aunque los pavos son especialmente susceptibles [66, 49].
La forma de transmisin ms frecuente es mediante el contacto directo aveave, aunque el agente puede distribuirse, adems, por medio de jaulas,
sacos de comida, zapatos y equipo, por ejemplo [67].Esta enfermedad
parece que no se transmite, sin embargo, a travs del huevo [11]. El
canibalismo es tambin, una importante va de transmisin, ya que esta
bacteria puede estar presente en muchos tejidos de las aves muertas [ 31,
71].Cuando se presenta un brote, el medioambiente, especialmente el agua,

acta como fuente de contaminacin, sobre todo en poblaciones densas [10].

Adems, en condiciones favorables, P. multocida sobrevive durante largos
periodos de tiempo en sedimentos, especialmente pantanosos [10].

2.8.2 Conejos.
P. multocida afecta tambin a los conejos, produciendo abcesos y mastitis
[27] y representando el patgeno respiratorio ms importante en aquellos
animales empleados en laboratorio [69].La pasteurelosisque se produce en
estos animales es muy contagiosa, afectando principalmente,al tracto
respiratorio superior, pudiendo causar la muerte del animal [69]. En la
mayora de las ocasiones se aslan cepas de tipo capsularA o D y, a veces,
de tipo capsular F [39].
2.8.3 Humanos
La pasteurelosis es considerada como una enfermedad zoontica,
aunquegeneralmente las consecuencias no son graves para el hombre [81].
No se ha demostrado que la infeccin pueda transmitirse de un humano a
otro, ni que elagua y/o alimentos puedan ser fuentes de infeccin [ 81].
Lo msfrecuente es que las infecciones se produzcan a consecuencia de
mordiscos y/oaraazos de perros y, sobre todo, de gatos, pero tambin de
17

otros animalescomo ratas, leones, panteras, conejos, etc. [3]. Tambin se ha

descrito la infeccin mediante el mero lamido demascotas en piel daada o
aparentemente intacta, inhalacin delagente o, incluso, sin contacto
aparente con animales [81].Estos procesos son causados por las
subespecies multocida y septica, ya que son las que se encuentran con
mayor frecuencia en mucosas de perros y gatos [35, 51, 53]. Se ha estimado
que el 66% de los perros y el 90% de los gatos son portadores de este
microorganismo, por lo que no es de extraar que tras un mordisco/araazo
de estos animales se produzca la infeccin de la herida y, normalmente, la
formacin de abcesos que se pueden llegar a complicar, dando lugar a Teno
sinovitis,

artritis,

osteomielitis,

celulitis,

etc.

[81].

En

pacientes

inmunodeprimidos, P. multocida acta como patgeno oportunista y puede

llegar a producir infecciones graves. En pacientes con alteraciones
respiratorias, el microorganismo coloniza el pulmn, pudiendo producir
neumona, empiema y abcesos pulmonares [81]. En ltimo caso se pueden
producir septicemias graves, normalmente en pacientes que presentan
disfuncin heptica y, en general, inmunodeprimidos (recin nacidos,
ancianos, enfermos de SIDA), dando lugar, entre otros procesos, a
peritonitis, endocarditis, abcesos en cerebro y meningitis [81].
Por otra parte, se ha sugerido que la colonizacin y/o infeccin del tracto
respiratorio en el hombre por P. multocida pueda ser debida a la exposicin
al ganado porcino [64],siendo habitual encontrar portadores de P. multocida
entre personasencontacto con cerdos con y sin PMT [61]. Por lo tanto, las
personasen

contacto

con

estos

animales

(operarios,

veterinarios,

ganaderos, etc.) y,especialmente, las que tienen alguna enfermedad

pulmonar o inmunosupresinde algn tipo, son las ms susceptibles a
padecer algn tipo de pasteurelosis.
2.8.4 Ganado Porcino.
Es una enfermedad bacteriana que se caracteriza por bronconeumona y
evoluciona

ocasionalmente,

con
18

pericarditis

pleuritis,

afectando

generalmente a cerdos mayores de un ao, y creando severas prdidas a

nivel industrial[8,61].
Los signos clnicos ms importantes son

fiebre, disnea y cianosis sin

compromiso entrico, sugieren una condicin de neumona. Esta infeccin

bacteriana puede ser subclnica o asociada con neumona y septicemia de
diferente intensidad, que producen muertes de los animales y una menor
tasa de crecimiento[11]. Las neumonas asociadas a P. multocida son
usualmente consideradas como secundarias a la neumona enzotica por
Micoplasmas, Haemophilus pleuropneumoniae o H. parasuis o infecciones
virales. En la forma aguda: los cerdos muestran disnea y respiracin
abdominal dificultosa, tos, descargas nasales no muy abundantes, fiebre de
40 - 41.1 C, se puede observar respiracin bucal, cianosis de las
extremidades y los ruidos pulmonares son, por lo general, fuertes. La forma
crnica o Pasteurelosis subaguda: la neumona es menos severa, pero
persisten la tos y la fiebre [27].
Los hallazgos post - mortem: frecuentemente el cadver est congestionado
y existe presencia de espuma en la trquea. El edema que se observa al
corte del tejido pulmonar es evidente. Se observa una neumona exudativa;
reas atelectsicas son observadas en los lbulos pulmonares anteriores y,
en casos graves, tambin en los lbulos diafragmticos. Por lo general, se
observa una pleuresa fibrinosa [79].
Por su similitud clnica a la Peste Porcina Clsica (PPC), Erisipela,
Salmonelosis y Disentera porcina, se requiere el diagnstico diferencial.
Con el "objeto de tomar las medidas de proteccin que correspondan,
siempre se deber considerar a nivel de campo que la sospecha es de PPC"
[27]. Frotis de la superficie de corte de los pulmones afectados o de sangre

cardiaca en tincin Leishman, muestran masas de cocobacilos con una

coloracin bipolar.
2.8.5 Ganado Bovino.
19

En bovinos, P. multocida produce neumonas. Es una afeccin respiratoria

aguda que afecta sobre todo a terneras y vaquillonas de raza de carne y a
vacas adultas cuando se les somete al estrs de un transporte prolongado,
llamada tambin Fiebre del Embarque, fiebre del transporte y enfermedad
respiratoria bovina, debido a su asociacin con el estrs producido por el
transporte de los animales [4,9].La pasteurelosis neumnica raras veces
ocurre en el animal sano o no estresado [30].Es cosmopolita, pues se han
reportado casos en casi todos los pases del mundo [77]. La transmisin es
por va digestiva y respiratoria. Se elimina por la saliva y las heces [62]
Puede empezar despus de 5 a 14 das despus del estmulo estresante.
Se observa fiebre, apata, tos, estornudos, incremento de la frecuencia
respiratoria, anorexia, lagrimeo, secrecin nasal serosa o mucopurulenta,
estornudos, dificultad para respirar y beber, cesa la rumia, descenso de la
produccin de leche, etc. Si se produce bacteriemia hay toxemia [9].El
estrs suprime los mecanismos de defensa de los bovinos lo cual permite la
proliferacin de las pasteurelas en las vas respiratorias superiores, para
despus bajar y colonizar las vas respiratorias inferiores y causar
bronconeumona con una distribucin crneo-ventral en el pulmn [27].La
presencia de la cpsula favorece la resistencia a la fagocitosis [3]. Entre las
pasteurelas aisladas con frecuencia en casos de fiebre del transporte, se
encuentra P. haemolytica biotipo A, serotipo I y varios serotipos del grupo A
de P. multocida.
Para el diagnstico, adems del cuadro clnico se le puede aislar mediante
hisopados, para luego sembrarlo en agar sangre. La identificacin se realiza
aplicando la tcnica de PCR o ELISA [79].
A la necropsia se observa la hepatizacin de los pulmones, inflamacin
mucohemorrgica en nariz, laringe, trquea, bronquios y pulmones.Los
animales enfermos deben ser identificados y aislados, tratndolos con
agentes antibacterianos de amplio espectro de 3 a 5 das [27].

20

Aplicar oxitetraciclina 10 mgr/kpv/da, IM o IV de 3 a 5 das.,

dihidroestreptomicina 25 mg/kpv/da, IM de 3 a 5 das, Ceftiofur 1-2
mg/kpv/da, por 3 das IM o SC. , enrofloxacina 2 a 5 mg/kpv/da de 3 a 5
das[48].
Aplicando buena higiene y alimentacin, alojamientos bien ventilados sin
humedad y tambin existen las vacunas. La vacunacin debe hacerse no
menos de tres semanas antes del embarque o el traslado a los corrales de
engorde y puede repetirse cuando llegan al corra. [27].
Para Leotta y col 2006 [45], el principal mtodo para el control de las
enfermedades causadas por Pasteurella multocida en animales de cra
intensiva es un adecuado manejo sanitario.

Figura 2. Lesiones producidas por P. multocida en bovinos.

2.9 Trminos Bsicos.

A: Adenina
ADH: Arginina Hidrolasa
21

AMY: Amigdalina
ARN: cido Ribonucleico
CIT: Citrato
Cm: Centmetro
ELISA: Enzyme-Linked InmunoSorbent Assay
G: Guanina
H2S: cido sulfhdrico
IND: Indol
INO: Inositol
Kb: Kilobases
L: Litro
Pb: Pares de bases
PFGE:Pulsed Field Gel Electroforesis (Electroforesis en campo pulsado)
PMT:Pasteurella Multocida Toxin
PCR:Polimerase Chain Reaction
U:Unidades
URE:Ureasa
V:Voltio
g:Microgramo.
l: Microlitro.
III.

MATERIALES Y METDOS.
III.1mbito de estudio.
Esta investigacin se realiz en el Camal Municipal de Chincha y en el
laboratorio de Microbiologa de la Facultad de Medicina Veterinaria de la
UNICA, durante los meses de Marzo 2014 hasta Febrero 2015. Asimismo,
22

para corroborar los resultados, se cont con la colaboracin del Laboratorio

de Biotecnologa y Genmica FARVET de Chincha.
Las coordenadas de ubicacin de la Ciudad de Chincha son:
Latitud: 12o 48 sur
Longitud: 75o 38 occidental.
Altitud: 200 msnm.
Temperatura promedio: 26oC
III.2Materiales y Equipos
MATERIALES Y MEDIOS DE CULTIVO.
- Hisopos y Cooler.
- Tubos de ensayo
- Agua peptonada 1%
- Placas petri,
- Medio de cultivo: Agar Mac Conkey
- Reactivos para pruebas bioqumicas: Catalasa, Oxidasa, Indol, Gelatina,
-

Ornitina (ODC), Urea, Maltosa, Glucosa, Manitol

Reactivos para la coloracin Gram.
Lminas porta y cubreobjetos
Asa de siembra
Estufa
Autoclave
Estereoscopio
Microscopio de Campo Claro.

III.3Mtodo estadstico
III.3.1 Tipo, Nivel y Diseo de la Investigacin.
Esta investigacin esun estudio de tipo descriptivo, transversal que busc
realizar el diagnstico bacteriolgico de P. multocida, biotipo A en bovinos
sacrificados en el Camal Municipal, mediante cultivos en agar sangre al 5%
en anaerobiosis, tcnicas bioqumicas y pruebas moleculares, para lo cual
se emplearon 140 muestras de hisopado nasal, as como pulmones y
tonsilas provenientes de los animales sacrificados en ese centro de abasto,
por un periodo de 7 meses. Como el presente trabajo de investigacin es
de tipo descriptivo, se utilizaron

medidas de tendencia central, como

grficos, histogramas, porcentajes, cuadros y fotos.

3.3.2 Tamao de la muestra.

23

El estudio de campo se realiz durante los meses de Junio a Diciembre

2014, en bovinos procedentes de las diversas crianzas distribuidas en
diferentes reas geogrficas de la Provincia de Chincha.
En el Camal Municipal de Chincha, se benefician bovinos los das lunes,
mircoles, viernes y sbados, con un promedio de 15 reses diarias, es decir
60 semanales, 240 mensuales, haciendo un total en 7 meses de 1,680
bovinos. Se tomaron 5 muestras al azar de hisopados nasales una vez por
semana durante 7 meses, es decir se utilizaron un total de 140 bovinos.
El tamao muestral fue obtenido mediante la frmula de muestreo de
prevalencia lmite (Ahlbom y Norell, 1990), tomndose como referencia una
prevalencia mnima de 2,4% de animales persistentemente infectados, con
un nivel de confianza del 95%:
n=

Z2.p .q .
E2

Donde:

Z2 = Es el coeficiente de confianza cuyo valor depende del nivel de

confianza, para 95% le corresponde Z2/2 =1.96,
p =

Nos indica la proporcin de unidades que poseen el atributo de

inters en la poblacin.

q=

Probabilidad negativa.
E=

Es el error mximo permisible que estamos dispuestos a cometer para

estimar para un nivel de confianza establecido.

n = 3,84. 0,024. (0,976)
(0,005)2
n = 0,07823616
0,0025
n = 36.

Sin embargo, se trabaj con 140 muestras de hisopado nasal para una
mayor confiabilidad de los resultados, y adicionalmente, se aadieron las
muestras de pulmn y tonsilas, as como se aplic pruebas moleculares al
24

100% de los hisopados nasales y a las muestras sospechosas de los

rganos (pulmn y tonsilas).

III.4Hiptesis y Variables de estudio

III.4.1 Hiptesis
HO: Presencia de Pasteurella multocida biotipo A
Ha: Ausencia de Pasteurella multocida biotipo A.
III.4.2 Variables
Independiente:
Las muestras de hisopado nasal.
Dependiente:
Pasteurella multocida biotipo A.
III.5Tcnicas de Recoleccin de Informacin.
III.5.1 Recoleccin
III.5.1.1 En el Camal Municipal:
a) A cada animal escogido al azar, se le asign un nmero (nmero de
muestra)

se

rotularon

los

nmeros

en

los

tubos

de

ensayo

correspondiente.
b) Las muestras se recogieron por medio de hisopado nasal previo lavado de
las fosas nasales del animal con suero fisiolgico para quitar las impurezas
propias del transporte; se introdujo y se frot en la cavidad nasal el hisopo
estril.
c) Seguidamente, se procedi a colocar cada hisopo conteniendo la muestra
en un tubo de ensayo que contena agua peptonada al 10% preparada para
tal fin y se deposit dentro del Cooler con hielo para su conservacin.
d) Inmediatamente tomada las muestras, se transportaron hacia el Laboratorio
de Microbiologa de la Facultad de Medicina veterinaria de la Universidad
San Luis Gonzaga de Ica, para su posterior estudio.
III.5.2 En el laboratorio.
a) Se prepar el Columbia Agar sangre al 5% (Biomerieux) en anaerobiosis, y
se deposit en las cajas petri.
b) Se procedi a la siembra de las muestras en las respectivas placas
mediante el mtodo de diseminacin en placa.
c) Las placas se incubaron a 37C durante 72 horas.
25

d) Transcurrido ese tiempo, se hizo la lectura de las placas; esta se hizo en

base a las caractersticas macroscpicas y microscpicas de las colonias
(tincin Gram);

las colonias sospechosas del gneroPasteurellase

identificaron segn los siguientes criterios: presencia de colonias mucoides

medianas, cocobacilos gramnegativos, y se sometieron a pruebas
bioqumicas convencionales (catalasa, oxidasa, Mac Conkey, Indol,
Gelatina, Urea, Motilidad, Ornitina desacarboxilasa, Fermentacin en
maltosa, glucosa y manitol). (Biomerieux).
Adicionalmente, los cultivos de hisopado nasal y de las muestras
sospechosas de pulmn y tonsilas, fueron remitidas al Laboratorio de
Biotecnologa y Genmica FARVET de Chincha, y sometidas a la prueba
molecular de PCR mltiple para el diagnstico confirmativo, siguiendo el
protocolo propuesto por Townsend y col. (2001), que detecta una secuencia
de ADN nica en P.multocida y que ha demostrado una alta sensibilidad y
especificidad y adems, es capaz de identificar todos los tiposcapsulares
en la misma reaccin, por lo que se considera la mejor opcin para detectar
los distintos tipos capsulares de P. multocida.
Protocolo de Townsend y col., (Laboratorio FARVET):
a) En primer lugar, se realiz la extraccin de ADN hirviendo dos colonias
en 100 ul de agua Mili-Q en un bao mara a 100C durante 10 minutos.
b) El extracto se mantuvo congelado a -20C y se utiliz para todas las
reacciones de PCR.
c) Todos los cebadores utilizados fueron sintticos preparados por Roche
diagnosis y segn el modelo propuesto por Townsend et al. Donde se
busca amplificar el fragmento KMT1, nico en P. multocida, y segn la
tcnica propuesta por el fabricante (Roche):
Tabla2. Cebadores de PCR especfica de especie.

Nombre cebador
KMT1T7
KMT1SP6

Secuencia de cebadores (5 3)
ATCCGCTATTTACCCAGTGG
GCTGTAAACGAACTCGCCAC
26

Como control positivo, se utiliz la cepa de referencia NCTC 10322, cuyo

genoma figura en el Gene Bank.
Las amplificaciones se realizaron en todos los casos en un termociclador
modelo Rotor-Gene 3000 (Corbet, Sydney, Australia).La mezcla de PCR se
llev a cabo en un volumen final de 25 ul. Las cantidades utilizadas se
detallan en la tabla 3, mientras que las condiciones de la reaccin se
describen en la tabla 4.
Tabla 3. Volmenes empleados en la PCR especfica de especie.

Reactivos
Agua bidestilada estril (Sigma)
Tampn 10 X con MgCl2
Desoxinucletidostrifosfato (dNTPs)(250l/10mM)
(Biotools)
Cebadores (20 M)
Taq DNA polimerasa (0.5) (Biotools)
ADN extrado
Total

volumen
14,9 l
2,5 l
0,5 l
1 l de cada uno
0,1 l
5 l
25 l

Tabla 4. Condiciones de PCR de especie P. multocida

Fase
Desnaturalizacin inicial
Desnaturalizacin
Hibridacin 30 ciclos
Elongacin
Elongacin final

Temperatura
95
95
55
72
72

Tiempo
5 minutos
30 segundos
30 segundos
30 segundos
10 minutos.

Purificacin
El producto de cada PCR (ADN amplificado) fue purificado utilizando el kit
QIAquick PCR Purification (QIAGEN), siguiendo las instrucciones del
27

fabricante. Este protocolo consta de una serie de pasos que incluyen

diversas centrifugaciones con diferentes tampones, pasando la muestra
por una columna con un filtro.
En la columna, en presencia de sales y a un determinado pH, el ADN se
adsorbe a la superficie de la membrana de la columna de purificacin
silica-gel, pasando los contaminantes a travs de la columna. Las
impurezas se eliminan mediante sucesivos lavados con otro tampn y
finalmente se eluye el ADN purificado con un tampn especfico en un
eppendorf (1,5 ml), mantenindose congelado a -20 C de temperatura.
Este ADN purificado se utilizar para su posterior secuenciacin .
Secuenciacin:
Para secuenciar el ADN purificado se utiliz un secuenciador automtico
modelo ABI PRISM 3730 DNA (Applied Biosystems) (Lab. FARVETChincha). Las secuencias fueron alineadas mediante el software
ClustalW(http://www.ebi.ac.uk/clustalw). Tras efectuar el anlisis de las
secuencias, stas fueron comparadas con las incluidas en las bases de
datos GeneBank. Para ello se utiliz el programa FASTA y el software
BLAST (www.pubmed/BLAST/nucleotide).

IV.

RESULTADOS Y DISCUSIN.
CONTRASTACIN DE LA HIPTESIS: Ante la hiptesis formulada en el
proyecto, si la P. multocida estaba presente o no enlos bovinos beneficiados
en el Camal Municipal de Chincha,se tienen los siguientes resultados:
28

4.1 Total de muestras bovinas procesadas:

Se estudiaron un total de 140 (n= 140) muestras, procedentes de los bovinos
beneficiados en el Camal Municipal de Chincha. Todos los bovinos
beneficiados se encontraban en aparente buen estado de salud.

4.2 Resultado de los cultivos en Agar Sangre al 5% en anaerobiosis:

Los resultados se muestran en el cuadro 2:

Cuadro 2. Cultivo directo en Agar Sangre 5% en Anaerobiosis

(Hisopado Nasal)
MESES

29

Mues
tra

N de
Muest
ra

Junio

Julio

Agos Setiembr
to
e

Octub
re

Noviemb Diciembr
re
e

Resultados
1

Hisop
ado
Nasal

Sospech
oso
Sospech
oso

Sospech
oso

Sospech
oso
Sospech
oso
-

Sospech
oso

5
6
7

Sospech
oso
Sospech
oso

10

11

12

13

14

Sospecho
so

15

16

17

18

19

20

Total de muestras:

140

% de muestras negativas:

93.57

Negativas: 131

Sospechosas: 9

% de muestras sospechosas: 6,43

% de muestras positivas:

Como se puede apreciar en este cuadro, solo se pudieron observar 9

(n=9) muestras sospechosas de P. multocida,las cuales mostraron
colonias grises mucosas, confluentes sin presencia de hemlisis en
placas de agar sangre y que equivale a un 6, 43% del total de
muestras.Las restantes (n=131), dieron negativo al cultivo, lo que equivale
a un 93.57% del total.

30

Todas las muestras sospechosas presentaron un aspecto macroscpico

similar enmedio agar-sangre Columbia (Biomerieux), formando colonias
grandes, de color blanquecino, mucosas y de olor caracterstico. En la
tincin de Gram se observaron bacilos cortos que presentaron una
bipolaridad tpica. Ninguno de ellos creci en agar McConckey
(Biomerieux), no produjeron hemlisis y resultaron positivos a la prueba
de la oxidasa (reaccin dbil) y de la catalasa. Todas estas caractersticas
eran indicativas de que las muestras sospechosas podran pertenecer al
gnero Pasteurella, por lo que las muestras sospechosas se sometieron a
las pruebas bioqumicas para llegar a determinar si eran de la especie
Pasteurella.
Por lo tanto, se utiliz la galera de pruebas bioqumicas convencionales
ya que es un sistema rpido y sencillo de realizar y, que se indica como
til para identificar las bacterias pertenecientes a P. multocida.[7, 45].

4.3 Resultado de las Pruebas Bioqumicas (Hisopado nasal).

Se puede observar en el cuadro 3.

31

6.3 Identificacin

Cuadro 3. Pruebas Bioqumicas. (Muestras sospechosas de

Hisopado Nasal)
Meses
Juni
Agost Setiem Octub Noviem Diciemb
o
Julio
o
bre
re
bre
re

Pruebas

N de muestra sospechosa
Ningu
Ningu
3 4 2 3 5 no
4
5
no
1
9

Oxidasa

Mac Conkey

_ _ _ _ _

Catalasa

Indol

_
_

_
_ _
_ _
_ _ _
_ _

Gelatina
Urea
Motilidad
Ornitina
Desacarboxila
sa
(ODC)
Ferment.
Maltosa
Ferment.
Glucosa
Ferment.
Manitol

De las 9 muestras de hisopado nasal sospechosas

especie

Ningun
o

P.

multocida,(por

sus

_
_

de pertenecer a la

caractersticas

macroscpicas,

microscpicas y pruebas bioqumicasbsicas), ninguna fue identificada

por la galera multisustrato como P. multocida, lo que supone que los
microorganismos que formaron las colonias pertenecen a otra especie,
con

algunas

caractersticas

32

semejantes

Pasteurella

(P.

pneumotropica, Mannheimia haemolytica, etc), o quizs pertenecen a

alguna especie de bacterias no fermentadoras (Non fermenter sp).
Con la finalidad de estar ms seguros con el diagnstico, se procedi
tambin a evaluar muestras de pulmn y de tonsilas de alguno bovinos
muestreados al azar, consiguiendo los siguientes resultados:

4.4 Resultados del cultivo de Pulmn y Tonsilas en Agar sangre.

Cuadro 4. Cultivo de Pulmn y Tonsilas en Agar sangre
(anaerobiosis).

N de Muestra

Setiembre
Pulmn

Sospechoso

Total de muestras de pulmn: 10

Meses
Noviembre
Pulmn
Tonsila

Sospechoso

Sospechoso

Total de muestras de Tonsilas: 5

Muestras negativas: 90%

Muestras negativas: 60%

Sospechosas: 10%

Sospechosas: 40%

Positivos: 0 %

Positivas: 0%.

A los cultivos de las muestras de pulmn y de tonsilas de los bovinos, solo

se encontraron una muestra sospechosa de P. multocida en pulmn y 2
en las tonsilas.

33

4.5 Resultado de las Pruebas bioqumicas de las muestras de

Pulmn y de Tonsilas.

Cuadro 5. Pruebas Bioqumicas de Muestras sospechosas

(Pulmn y Tonsilas)
Meses

Pruebas

Setiembre
Pulmn
N muestra
2

Noviembre
Tonsila
N de muestra
1
4

Indol

Gelatina

Urea

Catalasa
Oxidasa
Mac Conkey

Motilidad
Ornitina
Desacarboxilasa
(ODC)
Ferment. Maltosa
Ferment. Glucosa
Ferment. Manitol

Como se puede observar en este cuadro, todas las muestras presentaron

perfiles parecidos: dieron negativo para el agar Mac Conkey, gelatina,
motilidad, y f. a la maltosa; en cambio dieron positivo para catalasa y
oxidasa, Indol, urea, ODC, f. a la glucosa y manitol. Estos resultados de
identificacin bioqumica fuerontomados con cautela ya que, como se
detallaba en la bibliografa consultada, la identificacin mediante estas
34

pruebas resulta en ocasiones problemtica en el caso de la especie P.

multocida. Ello es debido a la gran variabilidad existente en los perfiles
bioqumicos, hecho que puede llevar a confusin en la delimitacin e
identificacin de las especies y subespecies dentro del gnero Pasteurella
[6,7,59,60] .
Asimismo,

se

pudo

observar

un

comportamiento

bioqumicovariablehecho ya destacado e investigaciones como las

Christensen et al., 2004
-

La actividad enzimtica de la Ornitina decarboxilasa (ODC) fue positiva

en un 91,67 % de los casos., coincidiendo con otras investigaciones, ya

que las variantes negativas suelen ser mucho menos frecuentes [75,84].
Un 100% de los sospechosos utiliz la catalasa y oxidasa.
- En el caso de la utilizacin de la D-glucosa se obtuvo un 91.67 % de

resultados sospechosos.
- El 75% de los aislados utiliz el D-manitol.
- En el caso del indol se observaron 6 muestras (3/12) (25%) negativos a esta
prueba, lo que indicaba, a priori, que no pertenecan a la especie P. multocida,
ya que clsicamente se considera que esta especie es, salvo excepciones,
positiva a la prueba del indol [54].
- Debido a estos resultados inusuales se procedi a realizar la prueba
molecular de PCR mltiple.
4.6. Resultado de la Prueba Molecular para la deteccin de P.
multocida.
Los resultados tan variados que se obtuvieron, no se ajustaron
exactamente al perfil bioqumico de P. multocida, por lo que se decidi
que todas las muestras tanto del hisopado, como de los rganos
muestreados se sometieran a la prueba molecular de PCR mltiple, para
lo cual se solicit la colaboracin del laboratorio FARVET de la Ciudad de
Chincha, donde finalmente se realiz y se obtuvieron
resultados:

35

los siguientes

Cuadro 6. PCR mltiple de muestras de Hisopado nasal, pulmn y

tonsilas.

Muestra

Pasteurella multocida

(Gen KMT1)***
1 20 *
21 30 *
31 40 *
41 50 *
51 60 *
61 70*
71 80 *
81 90*
91 100 *
101 110 *
111 120 *
121 130 *
131 140 *
Pulmn 1 10 **
Tonsilas 1- 5 **
*Suspensin del medio de transporte
**rgano
***Townsend 2001.
El 100 % de las muestras dieron negativo para el gen KMT1, por lo que
no corresponden a P. multocida.

V.

CONCLUSIONES.
Despus de haber realizado el diagnstico bacteriolgico de las muestras de
hisopado nasal, y rganos de bovinos beneficiados en el Camal Municipal de
Chincha, se llega a las siguientes conclusiones:
1. Se realizaron los cultivos de hisopado nasal (n=140) en agar sangre, y se
obtuvieron 9 colonias sospechosas.

36

2. Asimismo, se agregaron al azar muestras de pulmones (n=10) y tonsilas

(n=5) de los bovinos beneficiados en el Camal Municipal, las mismas que
fueron sometidas a cultivo en agar sangre al 5% y en anaerobiosis. Se
obtuvieron una muestra de pulmn (10%) y dos muestras de tonsilas
sospechosa a P. multocida(40%).
3. Las colonias sospechosas de hisopado y de rganos, fueron sometidas a
una batera de reactivos bioqumicos, dando como resultado negativo al
perfil de P. multocida.
4. Dada la naturaleza heterognea de P. multocida, estn descritas multitud
de variedades bioqumicas dentro de la especie [62], por lo que en el
estudio bioqumico se pudo observar distintos comportamientos de cada
una de las colonias.
5. Para mayor seguridad en el diagnstico, se aplic a todas las muestras
una prueba molecular de PCR mltiple, obteniendo todos los resultados
negativos a P. multocida.
6. Se concluye que P. multocida no est presente en los bovinos
beneficiados en el Camal Municipal de Chincha.
VI.

RECOMENDACIONES.
Despus de haber realizado este trabajo de investigacin, se recomienda lo
siguiente:
1. Seguir haciendo diagnsticos bacteriolgicos constantes en bovinos y
en otras especies beneficiadas en el Camal Municipal a fin de detectar la
P. multocida.
2. Para realizar una identificacin rutinaria deP. multocida las galeras API
20E pueden suponer una buena opcin, y en el caso de que existan
dudas sobre el resultado se puede recurrir a la realizacinde ciertas

37

pruebas

bioqumicas

de

forma

convencional

(especialmente

ODC,sorbitol, indol) para, de este modo, confirmarlo.

3. Debido a la gran variabilidad existente enlos perfiles bioqumicos, hecho
que puede llevar a confusin en la delimitacin eidentificacin de las
especies y subespecies dentro del gnero, se recomienda realizar
estudios de genotipificacin de P. multocidautilizando la tcnica de
electroforesis de campo pulsado (PFGE), descrita como el sistema de
tipado gold standar para la caracterizacin molecular de P. multocida
[72b], debido a que esta tcnica presenta una elevada tipabilidad y poder

discriminatorio aplicada a la caracterizacin de este patgeno, as como

una buena reproducibilidad [57],siendo estos parmetros superiores a los
obtenidos con otras tcnicas de tipificacin molecular, tales como REA,
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