Kromatografi Kolom Vakum

abstrak

Pemurnian kromatografi merupakan bagian terpadu dari sintesis organik. Kering Kolom
Vacuum Chromatography disajikan di sini, memiliki kekuatan menyelesaikan baik, mudah
diterapkan pada kromatografi skala besar (hingga 100 g) dan cepat. Selain itu, teknik ini
ekonomis dan ramah lingkungan karena penurunan yang signifikan dalam pelarut dan jumlah
silika digunakan. Oleh karena itu, alternatif yang sangat baik untuk umum digunakan flash
Kolom Kromatografi untuk pemurnian dalam sintesis organik.
Dalam upaya kami untuk mensintesis jumlah besar dari LNA NRTI, 1,2 kita secara teratur
memurnikan jumlah hingga 100 g sangat functionalised nukleosida dan karbohidrat derivatif.
Silika gel teknik kromatografi kolom konvensional termasuk flash Kolom Chromatography3
mampu pemisahan miskin nilai yang melebihi 10 g menuntut pemurnian campuran reaksi
setelah pembagian ke dalam beberapa batch kecil. Hal ini tidak layak karena jumlah besar
silika gel, pelarut dan waktu yang dibutuhkan.
Dalam pencarian kami untuk metode yang sederhana dan efisien untuk pemisahan skala besar
campuran kompleks, kami menemukan kembali dan selanjutnya mengembangkan teknik
pertama kali dijelaskan oleh LM Harwood disebut "Kolom kering" flash Chromatography.4
Teknik ini telah terutama digunakan untuk perusahaan kecil hingga menengah pemurnian
skala (<2 g) dengan kekuatan pemisahan menyaingi bahwa dari analisis TLC. Kami sekarang
telah diadaptasi teknik ini untuk kromatografi skala besar (lebih dari 10 g campuran senyawa)
tanpa kehilangan kekuatan menyelesaikan baik diamati dengan jumlah yang lebih kecil pada
kolom yang lebih kecil. Kami telah menyiapkan dan dielusi kolom besar (diameter 10-13 cm)
sampai dengan 100 g campuran kompleks dalam 1-2 jam tergantung pada jumlah dan ukuran
fraksi dikumpulkan, efisiensi pompa dan jenis jenis silika yang digunakan . Kami telah
memilih untuk nama versi perbaikan dari Harwood itu teknik Kolom Dry Vacuum
Chromatography (DCVC) karena "flash" menyesatkan dalam konteks ini.
Setup eksperimental umum yang disarankan oleh inventor4,6 dan others7,8 terdiri dari gelas
ditemukan di laboratorium kimia organik. Namun, pengaturan ini tidak praktis karena
diperlukan untuk membongkar untuk setiap fraksi (Gambar 1), yang membosankan dan
memakan waktu
Setup secara signifikan ditingkatkan dengan menggunakan corong pemisah biasa, 9 adaptor
dengan pistol dan tiga-cara kran terpasang pada pistol yang memungkinkan seseorang untuk
membiarkan udara ke saluran tanpa mengubah pompa off (Gambar 2a). Satu-satunya
kelemahan dengan setup ini adalah bahwa dengan besar saluran kaca masir (diameter lebih
dari 10 cm) cenderung untuk mendapatkan sangat tinggi dan sebagai konsekuensi praktis.
Kami telah memecahkan masalah ini dengan merancang vakum kompak bukti penerima
(Gambar 2b). Adaptasi kami setup eksperimental telah secara signifikan mengurangi waktu
yang dibutuhkan untuk DCVC dan memberikan konstruksi yang mudah untuk menangani
untuk kromatografi skala besar maupun kecil.

Prosedur eksperimen dapat diringkas sebagai berikut (lihat bagian eksperimental untuk
prosedur rinci):
Sebuah corong kaca sinter dari size10 sesuai diisi dengan sekitar 6-7 cm dari silika longgar
dan mengetuk untuk memberikan permukaan yang datar.
Vakum diterapkan dan permukaan ditekan tegas untuk memberikan sepenuhnya tingkat, baik
dipadatkan tidur tinggi sekitar 4,5-5,5 cm.
Kolom diperiksa untuk void dan saluran dengan menuangkan n-heptana ke tempat tidur silika
sambil menerapkan vakum. Jika kolom dikemas dengan baik, pelarut akan turun dalam garis
horizontal.
Campuran dipisahkan dilarutkan dalam pelarut didih rendah yang sesuai (misalnya. Etil
asetat, metanol) dan pra-teradsorpsi pada silica.11 silika ditambahkan sebagai lapisan
seragam tipis di atas kolom dan langkah (2) diulang .
Kolom gradien dielusi dengan sistem pelarut yang cocok dan fraksi dimonitor oleh TLC.
Beberapa masalah bisa timbul karena penguapan pelarut pada kromatografi. Makhluk
kesulitan yang paling signifikan dalam melakukan gradien elusi dikendalikan dan kondensasi
air di gelas. Hal ini dapat dicegah dengan menghindari pelarut yang mudah menguap seperti
dietil eter, diklorometana dan pentana. Campuran dari n-heptana, etil asetat, dan metanol
direkomendasikan karena mereka mudah untuk menangani dan menghapus setelah
perpisahan telah dicapai.
Elusi senyawa biasanya disertai buih di bawah sinter tersebut. Sebagai aturan praktis,
senyawa akan mengelusi dalam campuran pelarut dimana nilai Rf adalah ca. 0,5 pada analisis
TLC.

Ketika chromatographing campuran senyawa (approx. 20-50 g) dengan Rf ~ 0,05 (TLC)

pada saluran kaca masir dengan diameter 10 cm, kita biasanya mengumpulkan 100 mL fraksi
dengan elusi gradien. Biasanya ini menghasilkan senyawa yang> 95% murni dengan HPLC.
Jika pemisahan yang lebih baik yang diinginkan gradien pelarut yang berbeda dan koleksi
fraksi yang lebih kecil biasanya meningkatkan hasilnya.
Untuk mendapatkan pemisahan yang baik, pilihan jenis silika yang benar adalah penting.
Resolusi ditentukan oleh ukuran partikel. Sebagai panduan kasar, mengurangi ukuran partikel
memberikan resolusi yang lebih baik. Di sisi lain, partikel yang terlalu kecil akan
menghasilkan kolom yang sangat kompak yang terelusi sangat lambat. Menurut inventor6
dan lain-lain, 7 TLC silika tanpa pengikat gipsum (5-25 m) harus digunakan untuk DCVC
karena lebih murah daripada silika digunakan untuk kromatografi biasa (misalnya flash
Kolom Kromatografi) dan karena "biasa" silika terlalu bebas mengalir untuk memungkinkan
mudah kolom packing. Hal ini juga berlaku di tangan kita untuk Merck Silica Gel 60 (40-63
mm) digunakan untuk Flash Kolom Kromatografi karena prosedur kemasan normal tidak
menghasilkan kolom yang cukup kompak. Akibatnya, pelarut hanya menuangkan melalui
kolom affording pemisahan sangat miskin. Jika kolom dikemas menggunakan pompa vakum
tinggi, kolom kompak dengan pemisahan yang baik dapat disiapkan. Namun, pendekatan ini
tidak diinginkan karena beberapa alasan, sebagian besar dari semua karena waktu yang lama
diperlukan untuk mempersiapkan kolom tersebut.
Jika Merck Silica Gel 60 (15-40 mm) digunakan, masalah dihindari. Kami telah mengalami
masalah ketika menggunakan Merck Silica Gel 60 (15-40 m) bukan TLC silika (5-25 m) dan
di tangan kita saat yang sama diperlukan untuk mempersiapkan kolom dengan kedua jenis
silika. Meskipun sulit untuk mereproduksi kondisi kromatografi yang tepat, data
menunjukkan bahwa TLC silika (5-25 m) tanpa pengikat gipsum menawarkan pemisahan
sedikit lebih baik dibandingkan dengan Merck Silica Gel 60 (15-40 mm) seperti yang
diharapkan karena partikel yang lebih kecil ukuran. TLC silika (5-25 m) adalah sekitar 1015% lebih murah daripada Merck Silica Gel 60 (15-40 mm). Selain itu, kolom dikemas
dengan TLC silika (5-25 m) membutuhkan sekitar 10-15% lebih sedikit silika massa
dibandingkan dengan Merck 60 (15-40 mm). Namun, kolom dikemas dengan TLC silika
menjadi sangat kompak dan karena itu secara signifikan lebih lambat di eluting.
Silika pilihan kami adalah Merck Silica Gel 60 (15-40 m) karena menawarkan resolusi yang
sangat baik dan memberikan jauh lebih cepat eluting kolom daripada yang dikemas dengan
TLC silika.
Sebuah contoh khas dari campuran senyawa yang dipisahkan berhasil ditunjukkan pada
Gambar 3. TLC analisis dari campuran senyawa dalam 10% n-heptana, 90% etil asetat (v / v)
menunjukkan 4 senyawa dengan nilai Rf: 0,45 (1 ), 0,25 (2), 0,20 (3) dan 0,10 (4). Senyawa
yang berhasil dipisahkan dan terisolasi pada skala 10 g dalam 1,5 jam termasuk kemasan
kolom, elusi dan penguapan fraksi pelarut yang mengandung senyawa murni. Kolom
(diameter 10 cm, tinggi 5 cm, Merck silika gel 60, 15-40 mm) dielusi dengan 0-100% etil
asetat dalam n-heptana (v / v) dengan 5% kenaikan konsentrasi etil asetat untuk setiap fraksi
dikumpulkan (dua puluh satu fraksi 100 mL). Setelah isolasi, identitas senyawa digambarkan

di bawah ini didirikan oleh NMR. Senyawa yang diinginkan 2 diisolasi di 98 +% kemurnian
oleh HPLC dan 1H-NMR.
Kesimpulannya, DCVC menyediakan metode yang kuat, cepat dan ekonomis untuk besar
serta pemisahan skala kecil. Selain itu, teknik ini unggul dalam kekuatan resolusi Flash
Kromatografi Kolom karena mengurangi difusi selama pemisahan kromatografi. Ini berarti
bahwa setiap senyawa terelusi dalam pecahan lebih sedikit dan kurang kontaminasi silang
dari fraksi diamati.
Kami telah menggunakan Kolom Dry Vacuum Chromatography untuk pemurnian berbagai
campuran kompleks terdiri nukleosida sangat functionalised dan karbohidrat dengan hasil
yang sangat baik. Hal ini dimungkinkan untuk melakukan DCVC menggunakan campuran
nonchlorinated, pelarut nonvolatile seperti n-heptana, etil asetat dan metanol. Ini dan jumlah
sangat berkurang silika digunakan dibandingkan dengan teknik lain mengurangi dampak
lingkungan dari proses. Pemisahan senyawa dengan Rf ~ 0.05 (oleh analitis TLC)
setidaknya harus diharapkan, tetapi dengan pengalaman pemisahan seefisien mereka dengan
analisis TLC dapat dicapai.
Peralatan kromatografi dirakit seperti yang digambarkan pada Gambar 2a atau 2b. Analytical
TLC dilakukan dengan menggunakan Merck 5554 lembar silika 60 aluminium. Silika
digunakan untuk DCVC adalah Merck 15.111 silika gel 60 (15-40 mm) dan Merck 9385
silika gel 60 (40-63 m) yang dibeli dari Merck Eurolab. TLC silika tanpa pengikat (5-25 m)
dibeli dari Sigma-Aldrich Denmark. Pelarut yang kelas HPLC dari LABSCAN. Vacuum
diaplikasikan dengan pompa Vacuubrand MZ 2C diafragma vakum (1,7 m3 / h, 10 mbar)
bukannya aspirator air untuk alasan enviromental. Corong kaca masir (porositas 3) dengan
diameter hingga 17 cm tersedia secara komersial.

Kolom kering Vacuum Chromatography

Kolom Packing: Sebagai panduan kasar, 1 cm2 permukaan silika dapat diisi sampai dengan
kira-kira. 500 mg campuran senyawa. Namun, ukuran sampel per cm2 dapat meningkat
secara substansial jika resolusi kurang diperlukan. Corong kaca harus minimal 7 cm dari
sinter ke bibir memungkinkan setiap fraksi pelarut yang akan ditambahkan dalam satu batch
bukan perlahan-lahan dituangkan ke permukaan silika. Sebuah silinder disinter corong kaca
(porositas 3) diisi dengan 6-7 cm longgar Merck 15.111 silika gel 60 (15-40 mm) dan
kemudian mengetuk untuk memberikan tingkat permukaan silika. Corong kaca ditempatkan
dalam labu Buchner dan vakum diterapkan. Silika ditekan tegas dengan benda datar (kaca
misalnya. Atau stopper karet) untuk memberikan datar, kolom silika yang dipadatkan sekitar.
Tinggi 4,5-5,5 cm. Perhatian khusus harus diambil untuk kompres silika di lingkar corong
kaca dengan spatula. Kolom diperiksa untuk void dan saluran dengan menuangkan n-heptana
ke permukaan (dilindungi oleh kertas saring) sambil menerapkan vakum. Jika kolom telah

disiapkan dengan baik, pelarut akan turun dalam garis horizontal. Jika hal ini tidak terjadi,
kolom harus tersedot kering dan prosedur kemasan di atas diulang. Dengan senyawa asam
sensitif, silika dapat pra-diobati dengan campuran 1-5% Et3N, n-heptana (v / v) selama
prosedur kemasan.
Dalam pengalaman kami, kolom tinggi dari sekitar. 4,5-5,5 cm tidak meningkatkan resolusi
dan kolom pendek harus dihindari karena secara signifikan mengurangi daya pemisahan.
Kolom pendek (app. 1-3 cm tinggi) bisa sangat baik untuk pemisahan yang sangat sederhana
tapi benar-benar menyediakan lebih dari penyaringan dari langkah kromatografi yang
sebenarnya.
Contoh Aplikasi: Sambil menyiapkan kolom, campuran senyawa harus pra-teradsorpsi pada
Merck silika gel 60 (15-40 mm) .11 Campuran dilarutkan dalam volume kecil menggunakan
pelarut yang sesuai (misalnya campuran EtOAc dan MeOH) dan silika ditambahkan. Untuk
mendapatkan pemisahan yang optimal diinginkan untuk menerapkan sampel pada kolom di
setipis lapisan mungkin. Untuk alasan ini, tidak lebih dari ca. 1: 1 (w / w) silika harus
digunakan untuk pra-adsorbsi. Pelarut dihapus dari bubur dengan pengurangan tekanan pada
evaporator rotary. Sebuah splashguard harus digunakan karena silika memiliki
kecenderungan untuk bertemu ketika hampir kering. Bubur tidak harus diuapkan untuk
menyelesaikan kering dalam satu langkah karena ini dapat mengakibatkan kerak yang keras.
Sebaliknya silika harus tergores bawah sisi labu sebelum pelarut terakhir telah dihapus (jika
jenis kasar silika digunakan untuk pra-adsorpsi hal ini sangat mudah dihapus dari labu).
Ketika silika kering, itu dipindahkan ke mortar dan tanah untuk memberikan bubuk halus
yang ditambahkan dalam lapisan seragam tipis di atas kolom. Vakum diterapkan dan
permukaan ditekan kuat seperti pada langkah kolom packing.
Sistem Pelarut: Kolom ini dikembangkan oleh elusi gradien menggunakan sistem pelarut
yang cocok. Bagi sebagian besar pemisahan, campuran n-heptana, EtOAc dan MeOH sangat
baik. Campuran pelarut paling polar ditambahkan pertama diikuti oleh fraksi pelarut biasanya
dengan 1-10% kenaikan dalam komponen yang paling polar. Sistem pelarut kami pilihan
untuk kebanyakan pemisahan adalah 0-100% EtOAc dalam n-heptana (v / v) - dengan
penambahan sebesar 5%. Untuk campuran yang sangat polar, adalah lebih baik untuk
memulai dalam campuran pelarut yang lebih polar dari n-heptana, EtOAc dan beralih ke
pelarut campuran EtOAc, MeOH ketika 100% EtOAc tercapai.
Elusi: Ketika sistem pelarut telah diputuskan, vakum diterapkan pada kolom. Fraksi pelarut
pertama dituangkan pada permukaan dilindungi kertas filter kolom. Sementara fraksi yang
eluting fraksi berikutnya siap. Fraksi pelarut tidak boleh disiapkan sebelumnya karena ini
terlalu memakan dan penguapan dapat mengakibatkan miskin gradien elusi waktu. Fraksi
pelarut pertama biasanya hilang karena adsorpsi pada silika. Ketika fraksi telah tersedot
melalui kolom (yaitu pelarut menetes perlahan dari kolom), udara diizinkan masuk ke setup
dengan memutar tiga arah kran (Gambar 2) dan fraksi pelarut dikumpulkan. Vakum
diterapkan lagi dan fraksi pelarut selanjutnya dituangkan ke permukaan kolom. Elusi
senyawa dipantau oleh TLC.

Sebagai aturan praktis, senyawa akan mengelusi dalam campuran pelarut di mana mereka
memiliki nilai Rf sekitar 0,5 pada analisis TLC. Elusi senyawa sering co-terjadi dengan buih
di bawah sinter tersebut. Ukuran pecahan dan peningkatan komponen yang lebih polar dalam
sistem pelarut bervariasi dengan pemisahan yang diinginkan. Fraksi yang lebih kecil dan
peningkatan lambat dalam polaritas meningkatkan resolusi signifikan, tetapi juga
membutuhkan waktu lebih lama.

Tips dan Trik untuk Lab: Kolom Troubleshooting dan Alternatif

Kromatografi kolom adalah teknik pemurnian yang biasa digunakan di laboratorium di
seluruh dunia. Dilakukan dengan benar sederhana dan cepat dapat mengisolasi senyawa yang
diinginkan dari campuran. Tapi seperti banyak aspek kimia praktis, pengaturan cepat dan
efisien dan berjalan kolom adalah sesuatu yang dapat mengambil tahun untuk menguasai.
Berikut kami berikan beberapa tips dan trik untuk menjalankan kolom, tips untuk beberapa
masalah umum yang dihadapi selama kromatografi kolom, dan beberapa "cepat dan kotor"
alternatif untuk kolom penuh.
Menjalankan Kolom
Kami sebelumnya telah melihat bagaimana pak kolom dan bagaimana memilih peralatan dan
pelarut yang diperlukan. Setelah Anda telah mengatur ini, Anda akan siap untuk memuat dan
menjalankan kolom Anda. Memuat kolom melibatkan menempatkan sampel langsung ke
bagian atas kolom dan memungkinkan untuk menyerap ke silika.
Untuk memuat kolom:
1.Dissolve sampel dalam jumlah minimum pelarut (5-10 tetes). Sebuah pelarut sedikit lebih
polar daripada yang akan Anda gunakan untuk kolom dapat digunakan jika ini membantu
dengan pembubaran sampel. Jika Anda perlu menggunakan pelarut seperti diklorometana
atau sesuatu yang lebih kuat, metode kering-loading dijelaskan di bawah ini mungkin lebih.
2.Dengan menggunakan pipet atau jarum suntik dengan jarum tebal, menetes sampel
langsung ke atas silika. Cobalah untuk tidak mengganggu permukaan. Idealnya, sampel harus
merata di seluruh permukaan secara sehingga membentuk sebuah band horisontal tipis.
3.Setelah seluruh sampel telah ditambahkan, memungkinkan kolom untuk mengeringkan
sehingga tingkat pelarut menyentuh bagian atas silika.
4.Hati-hati menambahkan lapisan pasir (approx. 2-5 mm). Ini akan membantu mencegah
permukaan silika dari yang terganggu sebagai pelarut lebih ditambahkan.
5.Gunakan pipet untuk hati-hati menambahkan lebih pelarut sehingga tingkat pelarut adalah
sekitar 10 mm di atas puncak pasir.
6.Biarkan pelarut ini untuk mengalirkan sampai tingkat pelarut adalah sekitar 1-2 mm di atas
puncak pasir.
7.Ulangi langkah 5 dan 6 sekali atau dua kali lagi. Ini akan memastikan bahwa sampel Anda
diserap ke silika.
8.Akhirnya, tambahkan sebanyak pelarut yang diperlukan. Anda sekarang telah siap untuk
mulai menjalankan kolom Anda.

Jika senyawa Anda memiliki kelarutan miskin dalam sistem pelarut yang memberikan
pemisahan terbaik, adalah mungkin untuk mengeringkan memuat sampel ke kolom.

Untuk mengeringkan memuat senyawa Anda, Anda akan perlu:

Labu bulat-dipercaya

silika kering

Sebuah pelarut dimana sampel larut sepenuhnya

rotary evaporator

metode:

Larutkan sampel dalam pelarut yang sesuai. Transfer ke labu bulat-dipercaya jika tidak sudah
dalam satu.
Menambahkan silika kering untuk sampel terlarut (approx. 10-20 kali massa sampel).
Swirl atau aduk perlahan untuk memastikan semua silika ditangguhkan dalam larutan.
Lembut menguap pelarut dengan menggunakan rotary evaporator sampai silika kering dan
bebas mengalir. Jika masih minyak, menambah silika dan ulangi prosedur.
Hati-hati menambahkan pelarut untuk kolom Anda sehingga tingkat pelarut adalah sekitar 2-3
cm di atas bagian atas silika. Gunakan pipet untuk memastikan permukaan silika tidak
terganggu.
Tuangkan silika kering yang jenuh dengan sampel Anda ke dalam kolom dan memungkinkan
untuk menetap. Pastikan bahwa tingkat pelarut selalu tetap di atas puncak silika dan tidak ada
gelembung yang hadir. Cara terbaik untuk melakukannya adalah dengan menambahkan silika
jenuh perlahan.

Ikuti langkah 4-8 dari metode basah-loading yang dijelaskan di atas untuk sepenuhnya
menyerap sampel ke kolom.