MINISTERIO DE EDUCACIN

PLAN DE FORMACIN DE PROFESORES CON

ESPECIALIDAD EN BIOLOGA
MDULO NMERO UNO
UNIDAD NMERO DOS

TECNICA DE REACCION DE POLIMERASA, PCR

NOMBRE DEL ESPECIALISTA: MILAGRO ELIZABEHT MALDONADO DE

GARCA

NOMBRE DEL EXPERTO: RHINA ESMERALDA ESQUIVEL

ESMA, SANTA TECLA 20 DE FEBRERO DE 2015.

INTRODUCCION

El presente trabajo est basado en la tcnica de la Reaccin de Polimerasa, la

cual fue desarrollada en 1983, por Dr. Kary Mulls, tiene el fin de familiarizarse
con los componentes de la reaccin, sus aplicaciones en diferentes campos,
especialmente en la rama de la Biologa.
La caracterstica principal de la investigacin es conocer los pasos para
elaborar una tcnica de PCR, los reactivos que se requieren para ello, la
descripcin de cada ciclo y cul es el producto final.
Para la investigacin se ha consultado diferentes fuentes de informacin y
todas coinciden en la importancia que tiene esta tcnica para la elaboracin de
mltiples copias de una especfica cadena de ADN y su importancia en el
conocimiento para investigar anomalas congnitas, enfermedades
hereditarias, test de paternidad, duplicacin de ADN fsil.

OBJETIVOS:
GENERAL:
EXPLICAR ADECUADAMENTE LA TECNICA DE REACCION EN CADENA DE
POLIMERASA Y SU APLICACIN EN BIOLOGIA

ESPECIFICOS:
CONOCER LA MARCHA EN LA REACCION EN CADENA DE POLIMERASA
(PCR)
INVESTIGAR LA APLICACIN DE LA REACCION EN CADENA DE
POLIMERASA EN LA VIDA COTIDIANA

DESARROLLO

1- Etapas de un ciclo de reaccin de PCR

a) Desnaturalizacin del ADN doble cadena (se separa en dos cadenas
simples a 94 C) mediante la aplicacin de calor
b) Hibridacin de los iniciadores a la zona 3 especfica de cada una de
las hebras Los iniciadores se adhieren al sitio de unin del cebador en
cada cadena de ADN (40-65 C)
c) Extensin del cebador por actuacin de la DNA polimerasa. Cada
cadena acta como molde para la amplificacin de ADN, esta reaccin
es catalizada por ADN polimerasa TAQ. El nmero de molculas de ADN
se duplica cada vez que se repite el ciclo (74 C).
En cada ciclo se obtienen dos nuevas molculas de ADN

2- Escriba los reactivos e investigue las cantidades utilizadas en una

reaccin de PCR

Los 4 desoxirribonucletidos-trifosfato (dNTP), sustratos para

polimerizar nuevo ADN.
Dos cebadores o iniciadores (en ingls, primers), oligonucletidos que
son, cada uno, complementarios a una de las dos hebras del ADN. Son
secuencias cortas, de entre seis y cuarenta nucletidos, normalmente de
dieciocho a veintids, que permiten que la polimerasa inicie la reaccin.
Deben estar enfrentados y a no mucha distancia. Delimitan la zona de
ADN a amplificar, es decir, corresponden a los nucletidos que definen
los extremos de la secuencia que se desea replicar.

Iones divalentes. Se suele usar magnesio (Mg2+), agregado

comnmente como cloruro de magnesio (MgCl2), o algn otro catin
divalente. Tambin se puede emplear manganeso (Mn2+), para
mutagnesis de ADN mediante PCR, ya que altas concentraciones de
Mn2+ incrementan la tasa de error durante la sntesis de ADN. Actan
como cofactores de la polimerasa.
Iones monovalentes, como el potasio.
Una solucin tampn o buffer que mantiene el pH adecuado para el
funcionamiento de la ADN polimerasa.
ADN polimerasa o mezcla de distintas polimerasas con temperatura
ptima alrededor de 70 C (la ms comn es la polimerasa Taq).
ADN molde, que contiene la regin de ADN que se va a amplificar.
Termociclador, el aparato que mantiene la temperatura necesaria en
cada una de las
etapas que conforman un ciclo

Condiciones estndar para un PCR

(Clculos para 50 l en cada tubo)
Concentracin
inicial 1
dNTPs
Magnesio
Oligo forward
Oligo reverse
enzima
Buffer
Agua
ADN

10 mM
25mM
10 M
10 M
5U/ l
10 x
0.1 mg/ml

Concentracin
final en la
reaccin
200 M
1.5mM
1 M
1 M
1U
1x
0.1 mg
genmico

Cantidad
para un tubo
1 l
3 l
5 l
5 l
0.2 l
5 l
29.8 l
11 l

Cantidad
para 10
tubos
10 l
30 l
50 l
50 l
2 l
50 l
298 l

3- Escriba para que utilizara PCR

Practicas forense, identificar microorganismos especficos a partir de una
pequea cantidad de ADN, identificacin de cadveres, test de
paternidad, Diagnstico rpido en la deteccin de enfermedades de
transmisin sexual.
La clonacin del ADN para la secuenciacin, la filogenia basada en el
ADN, el anlisis funcional de genes, el diagnostico de trastornos
hereditarios, la identificacin de huellas genticas (usada en tcnicas
forenses y prueba de paternidad), taxonoma, la deteccin y diagnstico
de enfermedades infecciosas, son algunas de las aplicaciones donde la
PCR ha sido implementada como una tcnica de gran valor.

4- Elabore una marcha de la Tcnica del PCR

Extraccin de ADN, colocarlo en el tubo 1, agregar el Primer 1 al tubi
dek PCR, el Primer se adhiere a sitios sobre las cadenas de ADN que
se encuentran en cualquiera de los extremos del segmento de la
copia. Los Primer tienen la capacidad de copiar secuencias de ADN
especifica no se dirigen a sitios errneos
Luego agregar el Primer 2 los cuales se adhieren al segundo sitio
Agregar los nucletidos en el tubo de PCR con A;C, G y t que har el
cdigo de ADN, estos bloques de construccin gentica sern
utilizados para crear miles de millones de copias
El ltimo paso es agregar polimerasa de ADN en el tubo, esta acta
como un lector del cdigo de ADN ya que adhiere los juegos de
nucletidos para crear las copias de ADN.

Esta polimerasa particular de ADN es capaz de soportar altas

temperaturas de la reaccin de PCR.
El tubo est lleno con los componentes de la reaccin. La mquina
precisa los cambios de temperatura durante la siguiente hora y esto
es importante para que la reaccin se lleve a cabo
Corrida electrofortica
Anlisis de los productos amplificados: secuenciacin

5- Investigue las modalidades del PCR que existen

Mltiple
RFLPs polimorfismos de longitud de fragmentos sin restriccin
SSCPs (polimorfismo conformacional cadena sencilla)
Anlisis de heteroduplex
Secuenciacin de DNA
Hay otras fuentes que dicen que son
Monoplex
Multiplex
Nested
Real time

6- Investigue los tipos de polimerasas que se usan en una reaccin

de PCR
La polimerasa Taq es un tipo de ADN polimerasa termoestable,
nombrada de esta forma debido a que es producida por la bacteria
Thermus aquaticus (T-aq) y a partir de la cual fue aislada en el ao 1968
por Thomas D. Brock1 A menudo suele abreviarse como "Taq Pol" (o
simplemente como "Taq"), y es frecuentemente utilizada en las tcnicas
de PCR, un mtodo que se utiliza para amplificar secuencias cortas de
ADN
Termolbiles: T ptima de 37-42C. Se desnaturalizan con el calor
Termoestables: T ptima de 74 C. Resiste durante 40-50a 96C

7- Escriba que es un Primer y un Primer Degenerado

Los primer: oligonucletidos, son secuencias cortas de ADN (18-25 bases),
sirven como punto de inicio de la replicacin del ADN; molculas lineales con
un grupo hidroxilo en el extremo 3 , son los cebadores iniciadores de la
reaccin, son necesarios para que la enzima polimerasa comience a sintetizar
copias de ADN
Para la eleccin de los primer, existen una serie de normas que nos pueden
ayudar, aunque hay que indicar tambin que existen programas de ordenador
que nos facilitan esta tarea (DNAsis, Primer3, etc.).

El contenido en G + C debe ser aproximadamente del 50%. La relacin

mxima de purinas/pirimidinas ser 60%/40%.

Deben evitarse zonas con largas secuencias de una sola base.

No seleccionar cebadores que en su extremo 3 tenga una importante

estructura secundaria.

Se recomienda que los extremos las ltimas bases sean G o C.

Se debe evitar la complementariedad entre la pareja de iniciadores. Si

esta existe entre los extremos 3existe la posibilidad de que se formen
dmeros de iniciadores.

Normalmente deben tener un tamao de 18-30 pb.

La Temperatura de hibridacin de los cebadores debe ser similar en

ambos y ser variable en funcin de la secuencia de los mismos.
Generalmente oscila entre los 45 y 60 C.

Si el primer es menor a 20 pb, la temperatura de fusin (Tm), se calcula

en base a la siguiente frmula:
Tm= 4 (G+C) + 2(A+T)

Siendo G, C, T y A el nmero de cada una de las bases que forman cada uno de
los oligos. La temperatura de hibridacin debe ser aproximadamente 5 menor
que la temperatura calculada

8- Investigue los diferentes aplicaciones de PCR en la BIOLOGIA

En paleontologa y Antropologa la PCR permite recuperar las escasas
cantidades de ADN que an no se han degradado. Algunos lugares en
que el ADN podra preservarse son la brea las cenizas volcnicas, el
mbar, hielos histricos polares o glaciares y ambientes ridos,
sedimentos, as como en los cristales de apatita de restos de esqueleto,7
siendo posible de ese modo caracterizar cadveres, fsiles u otros restos
mediante genotipado por anlisis de microsatlites o incluso genomas
de taxones extintos, amplificados de este modo, como pueden ser los
realizados mediante el ADN genmico del hombre de Neanderthal.8 El
propsito sera utilizar este ADN amplificado para posteriormente
realizar estudios filogenticos o etnogrficos o de poblaciones mediante
la comparacin de secuencias de ADN, o el estudio de las causas de la
separacin evolutiva de dos especies.
Monitoreo y Diagnstico temprano en enfermedades infecciosas
Identificacin de determinado patgeno en una muestra biolgica
especifica

La clonacin
Mutagenesis
ADN antiguo
Enfermedades hereditarias
Test de paternidad
Diagnstico rpido en la deteccin de Enfermedades de transmisin
sexual
La clonacin del ADN para la secuenciacin, la filogenia basada en el
ADN, el anlisis funcional de genes, el diagnostico de trastornos
hereditarios, la identificacin de huellas genticas (usada en tcnicas
forenses y prueba de paternidad), taxonoma, la deteccin y diagnstico
de enfermedades infecciosas, son algunas de las aplicaciones donde la
PCR ha sido implementada como una tcnica de gran valor.
La biotecnologa simplifica muchos experimentos de I.G. permite muchos
estudios de expresin gentica
secuenciacin directa de secuencias amplificadas
deteccin de mutaciones
seguimiento de la efectividad de tratamiento de enfermedades
diagnsticos de enfermedades genticas e infecciosas
en ciencia forense: identificacin de restos biolgicos, determinacin de
paternidad,
pruebas periciales en criminalstica
en arqueologa y paleontologa

Prcticamente, la tcnica RCP tiene aplicaciones sin lmites. Hace ms fcil la

clonacin. A los investigadores les permite amplificar y analizar muestras
minsculas de ADN de una diversidad de fuentes, que van desde escenas de
crmenes hasta restos arqueolgicos. Por ejemplo, los cientficos han empleado
la RCP para analizar el ADN mitocondrial obtenido de los huesos del
Neandertal. Una parte del genoma del Neandertal fue secuenciado en 2006, y
los investigadores

BIBLIOGRAFIA

http://es.wikipedia.org/wiki/Reacci%C3%B3n_en_cadena_de_la_polimerasa
http://es.slideshare.net/mpbu3n0/pasos-para-pcr
http://www.monografias.com/trabajos11/tamau/tamau.shtml#PCR#ixzz3SKJOka
zf
-http://biologia.laguia2000.com/tecnicas-en-biologia/componentes-de-la-pcr

-Biologia de Solomon

Solomon, Eldra P., Linda R. Berg y Diana W. Martin

Biologa, Novena edicin
ISBN: 978-607-481-934-2