Pontificia Universidad Catlica de Chile

Facultad de Ciencias Biolgicas

Departamento de Gentica Molecular y Microbiologa
Biologa de Microorganismos
BIO 151E-1

Informe n1:
Tcnicas bsicas de aislamiento,
deteccin e identificacin de
microorganismos

Nombre: Felipe Del Valle Batalla.

Profesores: Dras. Beatriz Dez y Carolina Serrano.
Jefe de Ayudantes: Daniela Ruiz.
Ayudante: Isidora Suazo.
Fecha de entrega: 1 de Octubre de 2014.
1

Introduccin y objetivos
Los procedimientos en el laboratorio de microbiologa deben ser realizados con precaucin y
rigurosidad para que se obtengan resultados experimentales confiables. Para conseguir este
objetivo es necesario manejar conceptos de esterilizacin de material, zona de trabajo y
seguridad en el ambiente del laboratorio (1).
Deben eliminarse los factores de riesgo comunitarios y personales procediendo cuidadosamente
con los implementos y utilizando indumentaria de vestimenta adecuada. Con respecto al manejo
de los materiales de laboratorio, siempre es necesario asegurarse de trabajar en el radio cercano
al mechero encendido para minimizar el riesgo de contaminacin de los medios de cultivo o
materiales en general. Tambin debe esterilizarse el material (2) mediante procedimientos como
el flameado de las tapas y bordes de tubos de ensayo adems de las asas metlicas utilizadas
para la inoculacin y siembra de los microorganismos (M.O.).
Cuando se tiene conocimiento y pericia sobre el manejo correcto de los utensilios del laboratorio,
es necesario comprender la utilidad, composicin y ventajas de los medios de cultivo que se
utilizarn para sembrar distintos M.O. y verificar sus caractersticas macro y microscpicas. En
su generalidad, los medios de cultivos contienen sustancias que son nutritivas para los M.O. que
se alojarn en ellos; se subdividen en medios slidos, semislidos y lquidos (3). De acuerdo al
propsito experimental y caractersticas del M.O. a cultivar, estos medios pueden ser selectivos
y contener indicadores que reflejen propiedades exclusivas para cada M.O.
El propsito fundamental de los medios slidos consiste en poder aislar un M.O. desde una
poblacin heterognea. Para lograr lo anterior se debe seguir un mtodo de siembra que permita
conseguir este objetivo, cabe recordar que para cada medio de cultivo (slido, semislido o
lquido) existe una manera de sembrar particular que en el caso de las experiencias realizadas
se trat de la siembra en cuadrantes.
Luego de haberse realizado la siembra e incubacin de la placa, es necesario verificar y describir
las caractersticas macro y microscpicas de los M.O. que se encuentran en ella. Para este
propsito primero se observ distintas placas de preparados previos y se describi su forma y
caractersticas macroscpicas. Cuando ya se ha descrito el M.O. sembrado de manera
macroscpica, es necesario realizar una prueba de tincin para conocer ms sobre sus
caractersticas microscpicas.

Las pruebas de tincin (4) permiten diferenciar a las bacterias segn su clasificacin Gram
(positivo o negativo), su formacin de esporas o su presencia de cpsula bacteriana. En el caso
de las experiencias prcticas realizadas, el trabajo fue enfocado hacia la diferenciacin por
carcter Gram.
Para complementar el conocimiento sobre la microbiota normal y ambiental, se tomaron muestras
de distintas partes inclusive del cuerpo. Se sembraron e incubaron para luego poder describir sus
caractersticas con los mtodos aprendidos en los pasos prcticos 1 y 2.
Los objetivos que se han propuesto para estas tres experiencias de laboratorio fueron en orden
de realizacin los siguientes. Poder familiarizarse con el material de laboratorio de microbiologa
y comprender sus aplicaciones, entender y aplicar conceptos de esterilizacin de materiales,
aislar y sembrar M.O. y poder emplear pruebas para determinar caractersticas macro y
microscpicas de los M.O.

Materiales y mtodos
Los materiales y mtodos a continuacin se detallan de acuerdo al prctico que correspondan de
manera correlativa.

Prctico 1: Procedimientos bsicos

Materiales y reactivos:
- Mechero bunsen.
- Asas de platino para siembra.
- Pipetas Pasteur.
- Placas de agar sangre.
- Placas de agar corriente.
- Placas de agar MacConkey.
- Tubo de ensayo con caldo corriente.
- Tubo de ensayo con agar semitendido.
- Tubo de ensayo con cultivo de S. aureus.
- Tubo de ensayo con cultivo de E. coli.
- Tubo de ensayo con cultivo de B. cereus.
- Microscopio.
- Aceite de inmersin.
- Set de placas Petri con cultivos bacterianos.
- Marcador permanente.

Mtodos:
1) Se realiz una esterilizacin de los materiales de laboratorio que se utilizaron de acuerdo a
las indicaciones de la gua de laboratorio.
2) Se practic la siembra de: (a) medio lquido a slido en agar normal de E. coli, (b) siembra de
medio lquido a slido en agar MacConkey de E. coli y (c) siembra de medio lquido a slido en
agar sangre de S. aureus.
Las siembras se realizaron de acuerdo a los procedimientos indicados en la gua de laboratorio
y se emple el mtodo de la siembra en zig-zag. Luego de sembradas, las placas fueron
etiquetadas con sus respectivos indicadores de fecha, operador, grupo, ayudante y M.O.
sembrado.
3) Se observ distintas placas Petri de preparados previos utilizando los microscopios
disponibles en los mesones y empleando el objetivo 100x con el aceite de inmersin tal como
se detalla en la gua de laboratorio para posteriormente anotar las caractersticas de forma y
agrupacin de cada una de ellas.

Prctico 2: Morfologa bacteriana: anlisis macroscpico y microscpico

Materiales y reactivos:
- Mechero Bunsen.
- Portaobjetos.
- Clips de madera.
- Asas de platino.
- Microscopio.
- Aceite de inmersin.
- Marcador permanente.
- Placa de agar normal con siembra de E. coli del prctico anterior.
- Placa de agar MacConkey con siembra de E. coli del prctico anterior.
- Placa de agar Sangre con siembra de S. aureus del prctico anterior.
- Set para tincin Gram: cristal violeta, lugol, alcohol-acetona y safranina.
- Set para tincin de esporas: verde de malaquita y safranina.
- Set para tincin de cpsula: tinta china y safranina.
- Set estril de bastoncillos para toma de muestras.
- Placas de agar normal, sangre y MacConkey.
- Cultivo S. pneumoniae.

Mtodos:
1) Se realiz una descripcin macroscpica de las siembras realizadas en el prctico 1,
practicndoseles luego la tcnica de tincin de Gram detallada en la gua de laboratorio.
2) Se realiz una descripcin microscpica de las placas sembradas en el prctico 1, se
registraron sus caractersticas (forma, agrupacin y respuesta a la tincin).
3) Se practic la tincin de espora a una muestra de B. cereus y se observ su detalle
microscpico. Tambin se realiz una tincin de cpsula para S. pneumoniae observndose
luego en el microscopio. Todas estas tinciones se realizaron de acuerdo a los procedimientos de
la gua de laboratorio.
4) Se tomaron muestras de microbiota normal y ambiental. Las muestras fueron tomadas de
acuerdo a los procedimientos detallados en la gua de laboratorio (9) y consistieron en las
siguientes: (a) Nasofarngea en agar sangre, (b) Nasal en agar sangre, (c) Ua, ocular del
microscopio y nasofarngea en agar MacConkey, (d) Boca en agar normal y (e) Nasofarngea en
agar normal. Todas las muestras fueron etiquetadas correctamente e incubadas para su posterior
anlisis en el prctico n3.

Prctico 3: Microbiota normal y ambiental

Materiales y reactivos:
- Placas con siembra del prctico 2, etiquetadas segn su contenido.
- Set para tincin Gram: cristal violeta, alcohol-acetona, lugol y safranina.
- Set para prueba de coagulasa.
- Set para prueba de catalasa.
- Microscopio.
- Aceite de inmersin.
- Asas de platino.
- Mechero Bunsen.
- Clip de madera.
- Portaobjetos.
- Pipetas Pasteur.
- Muestras problema a identificar (8 y 9).
- Batera de identificacin bioqumica estndar.
- Set API 10S.

Mtodos:
1) Se realiz un anlisis macroscpico de los cultivos realizados para la microbiota normal y
ambiental previamente incubados del prctico n2. Se describieron de manera detallada segn
los parmetros indicados en la gua de trabajos prcticos.
2) Se realiz test de identificacin para M.O. Gram positivo con sus respectivas pruebas de
catalasa y coagulasa tal como se especifica en la gua de procedimientos del laboratorio. Esta
prueba se practic para la muestra Nasofarngea en agar sangre.
3) Se realiz test de identificacin para M.O. Gram negativos sembrando la muestra problema 9
en la batera bioqumica estndar y en el test API 10S con cuidado de seguir las instrucciones
de la gua de laboratorio.
Nota importante: Cada vez que se hace referencia en la seccin de materiales y mtodos a los
procedimientos realizados segn la gua de laboratorio o prcticos, se est considerando lo
indicado en el elemento bibliogrfico que corresponde al tem 1.

Resultados
Los resultados para el prctico n1 de anlisis microscpico de muestras entregadas se
encuentran resumidos en la siguiente tabla.
Tabla 1: anlisis microscpico de las muestras proporcionadas en el prctico n1.

N de placa
102
103
105
106
107
109
110

Microorganismo
E. coli
Mezcla Gram (+) y (-)
S. aureus
C. glabrata
Cocacea Strepto
B. cereus
K. neumonae

Morfologa
Bacilo
Bacilo y cocceas
Staphylococcus
Coccea en ttrada
Coccea en cadena
Bacilo
Bacilo

Otras caractersticas
Gram (-)
Gram (-) y (+)
Gram (+)
Gram (+), violeta.
Gram (+)
Gram (+)
Gram (-)

Observaciones microscpicas de muestras preparadas, con su clasificacin. (+ = positivo, - = negativo).

Para el prctico n2, se resumen en la siguiente tabla las observaciones macroscpicas de los
cultivos
sembrados.
Tabla 2: anlisis macroscpico de las siembras del prctico n1 analizadas en el prctico n2.

Microorganismo
E. coli
E. coli
S. aureus

Medio de cultivo
Agar normal
Agar MacConkey
Agar sangre

Forma
Circular
Circular irregular
Irregular, fusiforme

Elevacin
Levantada
Plana
Convexa

Borde
Liso
Dentado, liso
Ondulada

Superficie
Lisa
Lisa
Rugosa

Otras caract.
Lechosa
Opaca
Opaca

Microorganismos analizados segn sus caractersticas macroscpicas. (caract.= caractersticas)

Los resultados de la tincin de Gram para las colonias sembradas en el prctico n1 y

analizados a travs del microscopio en el prctico n2 se resumen en la siguiente tabla.
Tabla 3: anlisis microscpico de las siembras del prctico n analizadas en el prctico n2.

Cepa
E. coli
S. aureus

Forma
Cocos-bacilos
Streptococcus

Resultado tincin gram

Gram (-)
Gram (+)

(+ = positivo, - = negativo)

Para las pruebas de tincin de esporas y cpsulas del prctico n1 los resultados fueron los
siguientes para su observacin macroscpica.
Tabla 4: anlisis microscpico de visualizacin para tipo de tinciones especficas de cpsula bacteriana y esporas.

Tincin

Observacin microscpica

Espora

En su mayora localizacin terminal

Cpsula

Difcil observacin

Los resultados del anlisis macroscpico de las siembras de microbiota normal y corporal se
resumen en la siguiente tabla.
Tabla 5: Descripcin macroscpica de caractersticas para los cultivos realizados en el prctico n2 de microbiota
ambiental y normal, observados en el prctico n3.
Cultivo (zona)
Tipo de agar
Nasofarngea
Sangre
Nasal
Sangre
Ua
MacConkey
Ocular microscopio MacConkey
Boca
MacConkey
Boca
Normal
Nasofarngea
Normal

Forma
Irregular
circular
N/C
N/C
N/C
Circular
Circular

Elevacin
levantada
levantada
N/C
N/C
N/C
levantada / plana
Plana

borde
ondulado
liso
N/C
N/C
N/C
liso
Liso

superficie
rugosa
lisa
N/C
N/C
N/C
lisa
lisa

Otras caractersticas
Brillante, con hemlisis
Opaco, con hemlisis
N/C
N/C
N/C
Color blanco translcido
Colo blanco opaco

Cultivo realizado y sus caractersticas macroscpicas relevantes. (N/C = no se aprecia cultivo o caractersticas).

Los resultados de tincin para las muestras de microbiota normal y ambiental segn carcter
Gram se verifican en la siguiente tabla.
Tabla 6: carcter Gram para cultivos seleccionados de microbiota normal y ambiental, con su respectivo medio de
cultivo.

Cultivo
Boca
Nasofarngea

Tipo de agar
Normal
Sangre

Tincin gram
Gram (-)
Gram (+)

(+ = positivo, - = negativo)

Para las pruebas de catalasa y coagulasa sobre la cepa Gram positivo se obtuvieron los
siguientes resultados, resumidos en la tabla a continuacin.
Tabla 7: Resultados de tests para muestra Gram positiva sometida a prueba de catalasa, coagulasa y

hemlisis.

Cultivo
Nasofarngea

Tipo de agar
sangre

Test realizado
Catalasa
Coagulasa
Hemlisis

Resultado
Positivo
Negativo
Positivo tipo Beta

Cultivo de la zona nasofarngea en su medio de siembra y sus respectivos resultados para las pruebas de catalasa,
coagulasa y hemlisis.

Discusin
Con respecto a la primera parte del prctico n1, se puede afirmar que el set de placas disponibles
de la Tabla 1, para la caracterizacin microscpica presentaba algunos problemas de
visualizacin al momento de su observacin. Lo anterior probablemente se debi a una incorrecta
preparacin de las tinciones, ya que se observaron ciertos impedimentos que dificultaron la
descripcin morfolgica de los preparados.
Para el procedimiento relacionado con la siembra descrita por la Tabla 2, es necesario recalcar
que el uso de los agares para E. coli pudo presentar una diferencia en cuanto a su caracterizacin
debido a que el Agar de tipo MacConkey es ms adecuado para cultivar este tipo de bacteria (5)
en comparacin con el agar normal. Para el S. aureus se puede aseverar que su crecimiento fue
satisfactorio en agar sangre pues esta bacteria crece mejor en medios poco selectivos pero
nutritivos (6) y en especial en este tipo de agar seleccionado.
Con relacin al uso de la tincin de Gram, se puede decir que este mtodo sirve para determinar
la estructura y grosor de la pared bacteriana (7). Aquellas bacterias que presentan una capa
gruesa de peptidoglicn y carecen de membrana externa se les llaman Gram positivas y a las
que poseen membrana externa teniendo una delgada capa de peptidoglicn se les llama Gram
negativas. El fundamento de la tincin Gram se basa en que no hay fijacin del cristal violeta en
la membrana de las Gram negativas.
En relacin a los resultados obtenidos que son presentados en la Tabla 3, se debe aclarar que
se tomaron de forma arbitraria las cepas de E. coli y S. aureus porque se conoca su
caracterizacin Gram (8), y efectivamente resultaron coincidentes con lo presupuestado.
Si bien la cantidad de placas analizadas no corresponde al total de las que haban en la mesa,
esto se debe a que se tom simplemente como propsito de anlisis las placas que fueron
sembradas por cada operario sin intervenir en las de los dems, por este motivo es que no se
encuentran todas las que se utilizaron descritas en los procedimientos y metodologa de los
prcticos.
Con respecto a los resultados proporcionados por la Tabla 4, es necesario recordar que para
teir esporas no se puede utilizar la tincin de Gram (9) y para este procedimiento se puede
afirmar que la tincin de la cpsula fue muy poco afortunada ya que se utiliz demasiado verde
de malaquita y esto deriv en una observacin defectuosa.

Para discutir los resultados relativos a la Tabla 5 es necesario considerar la poblacin bacteriana
de cada una de las zonas que se tomaron como representativas de flora bacteriana normal.
En el caso de la zona de la mucosa nasal se pueden encontrar en su mayora bacterias del gnero
Staphylococcus, en especial S. aureus (10), para la piel tambin se encuentran Staphylococcus,
en particular S. epidermidis (11). En el caso de la Boca (orofaringe) y de la nasofaringe se pueden
encontrar bacterias del gnero Streptococcus, Neisserias comensales y Fusobacterias
anaerbicas (12).
El crecimiento de las bacterias en agar sangre de acuerdo a la Tabla 5, resulta satisfactorio pues
se cultivaron zonas nasales y nasofarngeas que contienen en su mayora microorganismos del
gnero Staphylococcus que crecen de manera favorable en este tipo de agar (13).
En las siembras realizadas en agar MacConkey se presencia un fenmeno particular: No hay
crecimiento para ninguno de los cultivos realizados que se detallan en la Tabla 5. Esto puede
deberse principalmente a la caractersticas intrnsecas del agar MacConkey, que es un medio
altamente selectivo y diferencial eficiente para bacterias fermentadoras de lactosa (14) que no se
encontraran presentes en las muestras que fueron seleccionadas para crecer en este medio.
Para las muestras realizadas en agar normal no representa mayor sorpresa que se hayan
desarrollado los cultivos que fueron sembrados, ya que este agar es de tipo no selectivo y
altamente nutritivo (15).
Al interpretar los resultados de la Tabla 6, se puede apreciar que el contenido mayoritario de
bacterias del cultivo bucal corresponde a la clasificacin Gram negativo luego de su tincin. Esto
se puede relacionar con la flora microbiana de la boca que contiene un gran nmero de bacterias
del gnero Fusobacterium que resultan ser Gram negativas (16), al igual que las del gnero
Neisserias que habitan este ambiente (17).
Con respecto a las bacterias Gram positivo de la zona nasofarngea se puede respaldar esta
observacin con el hecho que un gran nmero de Streptococcus habitan esta zona y ellos son
del tipo Gram positivo (18).
Con relacin a la Tabla 7 que representa los tests realizados al cultivo nasofarngeo Gram positivo
se puede hacer las siguientes observaciones. El test de la catalasa que se fundamenta en la
descomposicin del perxido de hidrgeno en agua y oxgeno, tiene por objetivo diferenciar la
familia de los Micrococos de los Streptococcus (19).

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En este caso dio positivo ya que se presenci la produccin de burbujas y por lo tanto cabe pensar
que la presencia de una bacteria del tipo Staphylococcus.
Para el test de la coagulasa, que se fundamenta en la capacidad de los microorganismos para
coagular el plasma por accin de la enzima coagulasa (20) se observ que la muestra dio
negativo. La prueba fue realizada dos veces para evitar un falso positivo. Esto sugiere que se
tratara de algn tipo de Staphylococcus coagulasa negativo.
Finalmente, se observ que la placa mostraba hemlisis del tipo beta. Esto podra evidenciar que
realmente se trata de una bacteria del tipo Staphylococcus, que se condice con caractersticas
de su gnero (21).
En cuanto a la realizacin del test API 10S, no se evidenciaron sus resultados puesto que se
complet la batera de pruebas para las muestras problema 8 y 9 pero se llevaron a incubar por
los ayudantes.

Conclusiones
Con respecto a los objetivos se puede afirmar que se cumplieron a cabalidad en cuanto a la
familiarizacin y comprensin de los materiales de laboratorio. Tambin se pudo conseguir
adquirir tcnicas de esterilizacin de manera satisfactoria al igual que practicar la siembra y
aislamiento de microorganismos. Finalmente se pudieron realizar de manera efectiva bateras de
pruebas bioqumicas y su comprensin mediante los fundamentos biolgicos que las sustentan.

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Bibliografa
1) Gua de trabajos prcticos Biologa de Microorganismos, Pontificia Universidad Catlica de
Chile, 2014.
2) Microbiologa mdica, Murray.P, 6Ed., Editorial Elsevier Mosby, Ao 2009, Pg. 79.
3) Introduccin a la microbiologa, Tortora G.J., 9Ed., Editorial Mdica Panamericana, Ao
2007, Pg.168.
4) Referencia 3, Pg. 292.
5) Microbiologa clnica, Prats, G., 1Ed., Editorial Mdica Panamericana, Ao 2007, Pg. 255.
6) Infecciones producidas por Staphylococcus aureus, Pahissa, A., 1Ed, Editorial Marge, Ao
2009, Pg. 20.
7) Bacteriologa general: Principios y prcticas de laboratorio, Rodrguez, E., 1Ed. Editorial
Universidad de Costa Rica, Ao 2005, Pg. 63.
8) Fundamentos de epidemiologa: El arte detectivesco de la investigacin epidemiolgica,
Hernndez-Chavarra F., 1Ed., Editorial Universidad Estatal a Distancia, Ao 2002, Pg. 64.
9) Diagnstico Microbiolgico: Texto y Atlas en color., Winn, H., 6Ed., Editorial Mdica
Panamericana, Ao 2006, Pg. 244.
10), 11) Y 12) Referencia 5, pg. 5.
13) Referencia 6, Pg. 20.
14) Referencia 7, Pg. 134.
15) Tcnico especialista en laboratorio de atencin primaria Vol. II, Silva, M. , 1Ed., Editorial
Mad SL, Ao 2006, Pg. 171.
16) The Prokaryotes: Vol. 7: Proteobacteria: Delta and Epsilon Subclasses, Dworkin, M. ,
3Ed., Editorial Springer NY, Ao 2006, Pg. 1016.
17) Laboratory diagnosis of infectious diseases: essentials of diagnostic microbiology,
Engelkirk, P., 2Ed., Editorial Wolters Kluwer Health/Lippincott Williams & Wilkins, Ao 2007,
Pg. 273.
18) Microbiologa, Stanier, R., 2Ed., Editorial Revert S.A., Ao 1992, Pg. 276.
19) Referencia 9, Pg. 1383.
20) Pruebas bioqumicas para la identificacin de bacterias de importancia clnica, MacFaddin
J., 3Ed. Editorial Mdica Panamericana, Ao 2003, Pg. 88.
21) Manual de prcticas de Microbiologa I y II y Parasitologa, Olivas, E., 1Ed. Editorial
Universidad Autnoma de Ciudad de Jurez, Ao 2004, pg. 25.

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