Pontificia Universidad Catlica de Chile

Facultad de Ciencias Biolgicas

Departamento de Gentica Molecular y Microbiologa
BIO151E Biologa de Microorganismos (Seccin 1)

Informe N1
Tcnicas bsicas del laboratorio de
Microbiologa

Alumno: Ignacio Levet Henrquez

Profesoras: Susan Bueno, Carolina Serrano
Jefe de ayudantes: Daniela Ruiz
Ayudante: Jaime Alcorta
Fecha de entrega: 29/09/2014

Introduccin
Existen diversas condiciones necesarias para el trabajo en laboratorio, con el fin de
mantener la seguridad de quienes trabajan al interior de ste y los que se encuentran en
su entorno. La seguridad biolgica busca disminuir y prevenir la salida y/o exposicin a
agentes potencialmente peligrosos empleados en el rea de la microbiologa (bacterias,
hongos, virus). Para ello existen elementos que deben siempre tenerse en cuenta al
momento de trabajar en el laboratorio, como las tcnicas de laboratorio, equipos de
seguridad y condiciones ptimas de las instalaciones, los que incluyen normas esenciales
como el uso de delantal, el manejo y esterilizacin correctos del material empleado y
mantener los mesones en orden (para ms detalles, ver referencia 1).
Los microorganismos pueden vivir y desarrollarse en un entorno que les entregue los
ingredientes qumicos necesarios para llevar a cabo reacciones metablicas. Los medios
de cultivo son disoluciones estriles que contienen sustancias nutritivas que permiten este
desarrollo. Existen diversos tipos de medios de cultivo que varan en su composicin, lo
que hace variar tambin el tipo de microorganismo que puede crecer en ellos. Por
ejemplo, Escherichia coli es capaz de crecer en medios simples ya que su capacidad
biosinttica no requiere de grandes fuentes de carbono o factores de crecimiento, a
diferencia de Leuconostoc mesenteroides, una bacteria exigente que requiere de otras
sustancias
como
aminocidos
y
vitaminas
(2).
La siembra consiste en colocar microorganismos en un medio para que puedan
desarrollarse, procedimiento que permite aislarlos y que se realiza en condiciones de
esterilidad y sobre un recipiente, como un tubo de ensayo o una placa de Petri, que
contiene el medio de cultivo.
Cultivar bacterias en medio slido permite la obtencin de colonias, poblaciones
bacterianas que se observan macroscpicamente y que entregan informacin sobre la
unidad formadora (bacteria inicial) de sta, ya que tienen caractersticas propias en
cuanto a forma, elevacin, margen, superficie, brillo y color.
Para la observacin microscpica de bacterias es necesario usar tcnicas de tincin, que se
basan en caractersticas estructurales y permiten establecer un contraste con el campo
claro de observacin al microscopio. Ya que por lo general las superficies celulares se
encuentran cargadas negativamente, los colorantes usados en tinciones son compuestos
catinicos, como el azul de metileno, el cristal violeta y la safranina; estos dos ltimos son
empleados en la tincin de Gram, muy importante para comenzar a identificar bacterias
desconocidas al dividirlas en dos grandes grupos: Gram(+) y Gram(-) y permitir conocer la
forma y disposicin en que se encuentran. Otras tinciones empleadas son la de cpsula, de
esporas y de Ziehl Neelsen, siendo esta ltima empleada para identificar bacilos cido-

alcohol resistentes (ej: Mycobacterium tuberculosis) que por esta caracterstica no pueden
ser identificados mediante la tincin de Gram. En el anlisis microscpico debe emplearse
adecuadamente el microscopio de luz con el objetivo 100x y aceite de inmersin para
observar las bacterias (3).
Para complementar las tcnicas ya mencionadas, existen pruebas bioqumicas que
permiten diferenciar bacteria mediante el uso de reactivos y sustancias que alteren el
medio de cultivo y la posterior observacin del comportamiento de las bacterias vivas
ante stos; este estudio se conoce como fisiotaxonoma bacteriana y se puede obtener
informacin al respecto con ensayos de enzimas (catalasa, coagulasa) y siembras en
bateras bioqumicas (convencional, API). (4)
La realizacin de estas actividades prcticas se puede resumir en los siguientes objetivos:
-Identificar el material usado en el laboratorio de microbiologa, as como las normas de
seguridad
bsicas
empleadas
en
ste.
-Conocer
los
diferentes
medios
de
cultivo
y
sus
utilidades.
-Describir bacterias de acuerdo a sus caractersticas macroscpicas y microscpicas.
-Realizar tinciones diferenciales de distinto tipo para analizar bacterias al microscopio.
-Emplear pruebas bioqumicas en cultivos bacterianos para la identificacin de especies.

Materiales y mtodos
Aislamiento de bacterias:
-Asas de platino
-Pipeta Pasteur
-Placas de Petri
-Tubos de cultivo
-Medios de cultivo: placas de agar corriente, sangre y McConkey; tubo de agar semitendido
-Bacterias: Bacillus cereus, Escherichia coli y Staphylococcus aureus
-Muestras preparadas con tinciones de Gram, verde de malaquita y tinta china
(Procedimiento detallado en referencia 5)
*En 3.2, las siembras en agar slo se realizaron en cuadrantes.

Anlisis microscpico y macroscpico de bacterias:

-Medios de cultivo: placas de agar corriente, sangre y McConkey
- Bacterias: Bacillus cereus, Escherichia coli y Staphylococcus aureus
-Cristal violeta
-Lugol
-Alcohol-cetona
-Safranina
-Tinta china
-Verde de malaquita
-Microscopio ptico
-Aceite de inmersin
(Procedimiento detallado en referencia 6)

Pruebas bioqumicas:
-Cultivos de flora normal y ambiental.
-Perxido de hidrgeno (agua oxigenada)
-Test de aglutinacin
-Bateras bioqumicas convencional y API
(Procedimiento detallado en referencia 7)

Resultados
Prctico N1: Procedimientos bsicos

Durante el prctico, se entregaron placas previamente preparadas con microorganismos a

los que se les haba aplicado tinciones. La observacin de estas muestras se realiz como
introduccin a la identificacin de tipos bacterianos con ayuda del microscopio ptico.
En la Tabla I se encuentran los resultados de las observaciones, donde cabe mencionar:
-Los preparados N101 a N107 fueron teidos con tincin de Gram
-El preparado N109 fue teido con verde de malaquita (tincin de espora)
-El preparado N110 fue teido con tinta china (tincin de cpsula)
Tabla I. Registro de datos de preparaciones teidas.

Preparacin

Forma

Agrupacin

Afinidad
Tintorial
Gram

Cpsula Esporas

N101

Bacilos

En cadena

N102

Bacilos

Sin agrupacin

N103

Bacilos/cocos

En cadena/en
racimos

+/-

N105

Cocos

En racimos

N106

Cocobacilo

Sin agrupacin

N107

Cocos

En cadena

N109

Cocos

En cadena

N110

Cocobacilo

Sin agrupacin

Simbologa: +;(positivo), -;(negativo), X;(No hay afinidad) +/-;(mezcla)

Prctico N2: Morfologa bacteriana: Anlisis macroscpico y microscpico

Anlisis
Macro

Bacteria

Tipo de
Agar

Color

Forma

Elevacin

Borde

Superficie

Caract. Fsicas

Contaminada

S. aureus

Corriente

Blanco

Circular

Cncava

Liso

Lisa

Crea, brillante,
color

S. aureus

Sangre

Blanco

Circular

Cncava

Liso

Rugosa/Escamo
sa

Crea, brillante,
color

Sin colonia
aislada

S. aureus

Tendido

Blanco

Puntiforme

Sin
posibilidad
de anlisis

Sin
posibilidad
de anlisis

Sin posibilidad
de anlisis

Transparente

E. coli

Lquido
Sangre

Gris

Circular

Levantada

Liso

Lisa

Opaca, color

S. aureus

Lquido
Sangre

Incoloro

Puntiforme

Plano

Liso

Rugosa

Transparente,
sin color

E. coli

Tendido
McConkey

Fucsia

Irregular

Plano

Liso

Lisa

Color brillante

No hubo
crecimiento

B. cereus

Tendido
McConkey

B. cereus

Lquido

Turbidez
selectiva

Filamentos
Blancos

E. coli

Lquido

Turbidez
selectiva

Filamentos
Blancos

E. coli

Corriente

Blanco

Puntiforme

Levantada

Liso

Lisa

Transparente,
brillante, color

B. cereus

Corriente

Blanco

Circular

Plana

Dentado

Rugosa

Crea, brillante,
color

B.cereus

Sangre

blanco

circular

plana

liso

lisa

crea

K.pneumoniae

McConkey

rosado

circular

convexa

liso

rugosa

color

Streptococcus
A

Sangre

incoloro

puntiforme

plano

liso

rugosa

Transparente,
opaca, sin color

Tabla II. Anlisis macroscpico de colonias bacterianas.

Anlisis de Tinciones
Tincin de Gram
Tincin de esporas
Tincin de cpsula

Tabla III. Anlisis microscpico mediante tincin.

Microorganismo

Tincin
Gram

Esporas Cpsula

Forma, Agrupacin

S. aureus

cocos, de color morado, agrupacin en

racimo

E.coli

bacilo, de color rosado, sin agrupacin

especfica

B.cereus

bacilo, en cadena, esporas de color

verde y bacteria de color rosado

Klebsiella
pneumoniae

fondo negro,cpsulas incoloras, clula

color rosada

Simbologa: + (positivo); - (negativo); X (no se realizaron sobre la bacteria)

Prctico N3: Microbiota normal y ambiental

A partir de las muestras sembradas en agar, provenientes de diferentes partes del cuerpo
y del entorno, se realiz un anlisis de una muestra de la regin nasofarngea empleando
tincin de Gram y pruebas bioqumicas enzimticas, las que se resumen en la tabla IV.

Tincin de Gram

Pruebas bioqumicas

Cocceas en racimo

Catalasa

Coagulasa

Cocceas en cadena

Tabla IV. Anlisis de cultivo extrado de regin nasofarngea.

Simbologa: +, positivo; -, negativo.

Anlisis
Macro

Lugar de
toma de
muestra

Tipo de
Agar

Color

Forma

Elevacin

Borde

Superficie

Caract. Fsicas

Charco de
Agua

Corriente

Naranjo
Amarillo
Blanco

Circular
Circular
Circular

Plana
Plana
Levantada

liso
liso
liso

lisa
lisa
lisa

Brillante
Brillante
Opaca

Borde
lavamanos

McConkey
(El agar
cambio a un
color caf)

Caf

No hay
colonias
aisladas (se
obrserva que
pueden ser
circulares)

Convexas

Liso

lisa

Brillante

Cuello

Sangre

Blanco
Rosado
Amarillo

circular
circular
circular

plana
pulvinada
pulvinada

liso
liso
liso

lisa
lisa
lisa

Opaca
brillante
brillante

Guardapolvo

Sangre

Naranjo
Beige*

Circular
Circular

Pulvinada
Pulvinada

Ondulado
Ondulado

lisa
lisa

Opaca
Opaca

n.o

Pizarra

McConkey

n.o

Puerta

McConkey

n.o

Tos

McConkey

n.o

Basurero

McConkey

n.o

Techo

Corriente

Contaminada

Zapatilla

Corriente

Amarillo

Circular

Convexa

Liso

Lisa

Cerea, brillante, color

Blanco

Circular

Cncava

Ondulado

Lisa

Cerea, opaca, color

Naranjo

Circular

Levantada

Liso

Lisa

Cerea, brillante, color

Reloj

Corriente

Anaranjado

Circular

Plana/
Levantada

Liso

Lisa

Cerea, brillante, color

Slo una
pequea
colonia
aislada

Odo

Sangre

Blanco

Circular

Convexa

Liso

Lisa

Crea, brillante, color

claro

n.o.

Boca

Sangre

n.o.

Ombligo

Sangre

Blanco

circular

plana

liso

lisa

brillante transparente

n.o.

Ambiente

corriente

amarillo

circular

convexa

liso

lisa

Crea

Tabla IV. Anlisis macroscpico de colonias de flora normal y ambiental en placas de agar.
Simbologa: -,(no hubo crecimiento); *,(no hay colonia aisladas); n.o,(no observado)

Discusin
Al analizar macroscpicamente los cultivos hechos (ver Tabla II.), se observ que la colonia
de S. aureus en agar corriente se encontraba contaminada (aparecieron marcas de color
distinto al resto de la placa). Este hecho puede atribuirse a un mal manejo de la tcnica de
siembra, por ejemplo, que se haya operado fuera de la zona de esterilidad, de modo que
la placa habra captado algn microorganismo del entorno. Tambin cabe destacar el
ptimo desarrollo que experimentaron los cultivos en agar sangre, que es un medio muy
nutritivo y que permite crecer a un gran nmero de microorganismos.
Dentro del mismo anlisis, se observ que B. cereus no present crecimiento en agar
McConkey. Esto se explica por el carcter selectivo de este agar, que al contener sales
biliares y cristal violeta inhibe el crecimiento de bacterias Gram(+)(8), clasificacin a la cual
pertenece B. cereus (9).Para el anlisis microscpico de las bacterias cultivadas se
emplearon diferentes tinciones. En el caso de la tincin de Gram para B. cereus, se dio un
falso negativo atribuido a una falla en la aplicacin de la tincin, ya que por bibliografa se
confirm que la bacteria mencionada es Gram(+).
Los resultados mostrados en la Tabla IV indican la presencia de ms de un tipo bacteriano
en la muestra de regin nasofarngea, los cuales diferan en su respuesta a la tincin de
Gram y su distribucin espacial. Se determin que el ensayo de catalasa dio positivo
debido a la formacin de burbujas en la disolucin de perxido de hidrgeno + bacterias,
as como la prueba de coagulasa dio negativa ya que el lquido empleado como test de
aglutinamiento no mostr cambios en la distribucin homognea de su color azul.
Un hecho llamativo en el estudio de las colonias de flora normal y ambiental (ver Tabla V)
fue que el agar McConkey, en el que se cultiv un frotis del borde de un lavamanos,
cambi de color, pasando de su habitual tono rojizo a tonos caf amarillentos. La
explicacin a este hecho se encuentra en las bacterias presentes en el frotis, las cuales
habran utilizado las peptonas del agar y alcalinizado el medio de cultivo. Asimismo, hubo
dificultades en general para observar colonias aisladas en todas las siembras hechas en
agar McConkey, lo que podra deberse a la carencia de nutrientes esenciales en el
desarrollo de las bacterias sembradas y/o a la selectividad del medio.

Conclusiones
El conocimiento y adecuado manejo del material de laboratorio es esencial para una
buena ejecucin de los pasos prcticos, lo que permite obtener resultados correctos y
hacer del trabajo en laboratorio una experiencia segura. Gracias a esto, se logr efectuar
diversos tipos de cultivo y analizar las caractersticas de los microorganismos que se
utilizaron, as como tambin identificar las diferencias entre los medios de cultivo
empleados (por ejemplo, el agar sangre es un medio muy nutritivo que permite el
crecimiento de una gran cantidad de especies, mientras el agar McConkey demostr ser
un medio ampliamente selectivo en el desarrollo de microorganismos) y la capacidad que
otorgaban a las bacterias de poder formar colonias observables macroscpicamente para
su anlisis. El uso de tinciones diferenciales result muy til a la hora de observar las
bacterias al microscopio ptico, visualizndose sus estructuras definidas y con informacin
de importancia como su afinidad a la tincin de Gram o la presencia de cpsula.
Igualmente tiles fueron las pruebas bioqumicas de enzimas catalasa y coagulasa, que
permiten detectar o descartar rpidamente la presencia de ciertas especies.

Bibliografa
1) Manual de bioseguridad en el laboratorio, Organizacin Mundial de la Salud, 3
edicin, 2005, pginas 11, 12.
2) Biologa de los microorganismos, Brock T.D., Madigan M.T., Martinko J.M., Parker J.,
10 edicin, Pearson, 2004, pginas 107, 108.
3) Gua de trabajos prcticos BIO151E, pgina 32.
4) Referencia 3, pginas 55-58.
5) Referencia 3, pginas 30, 31.
6) Referencia 3, pginas 49-51.
7) Referencia 3, pginas 57, 58.
8) Bacteriologa General: Principios y Prcticas de Laboratorio, Rodrguez E., Gamboa M.,
Hernndez F., Garca J., Editorial U. de Costa Rica, 2005, pgina 134.
9) Microbiologa Alimentaria: Metodologa Analtica para Alimentos y Bebidas, Del
Rosario M., Anderson P., Caldern y Pascual V., 2 edicin, Ed. Daz de Santos, 2000,
pgina 93.