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Y SU IMPORTANCIA EN LA INVESTIGACION
CRIMINALSTICA.
Lic. Jaime Robleto Gutirrez
Defensor Pblico, San Jos
NDICE
TTULO I.- QU ES EL A.D.N. Y SU IMPORTANCIA PARA LA INVESTIGACIN FORENSE.
CAPTULO 1.- ENFOQUE BIOQUMICO.
Seccin a) REFERENCIAS HISTRICAS
Seccin b) DESCUBRIMIENTO DEL A.D.N
Seccin c) CARACTERSTICAS GENERALES DEL A.D.N
Seccin d) PROLEGMENOS A LAS PRUEBAS CON A.D.N
CAPTULO 2.- ENFOQUE FORENSE.
Seccin a) PRINCIPIOS BSICOS DE INMUNOHEMATOLOGIA
Seccin b) LOS ASESINATOS DEL SENDERO- INGLATERRA. PRIMER CASO EN LA
HISTORIA FORENSE EN SER RESUELTO MEDIANTE EL PERFIL GENTICO
Seccin c) JEFFREYS, MINISATLITES Y LA PRUEBA RFLP
Seccin d) MULLIS- REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA (0 TCNICA DEL P.C.R
d.1-CONCEPTO DE P.C.R.
d.2-MATERIALES Y PROCEDIMIENTOS NECESARIOS PARA LA TCNICA DEL P.C.R.
d.3-MEJORAS Y NUEVAS APLICACIONES DE LA TCNICA P.C.R.
d.4-INTERPRETACIN BSICA DE LAS PRUEBAS P.C.R.
Seccin e) ANLISIS COMPARATIVO ENTRE LAS PRUEBAS R.F.L.P. DE JEFFREYS Y EL
P.C.R. DE MULLIS
Haciendo un smil ciberntico un tanto burdo, diremos que el cuerpo de los animales, plantas y el homo
sapiens es el hardware y el A.D.N. es el software que sintetiza incluso la constitucin del CPU.
Este trabajo pretende bajo el apercibimiento que es reproductivo de datos logrados por otros- acercar al
abogado verdadero dummie de las ciencias exactas- y a los legos en general, a un mundo desconocido y
fascinante: la biologa molecular. Para ello utilizaremos un lenguaje llano pero estricto en trminos y
conceptos.
Incluiremos algunas observaciones personales y hasta breves ancdotas que despertarn un
poco de hilaridad en el rido terreno de lo que nos es desconocido.
Nuestro viaje inicia con Darwin y sus vivencias en las islas Galpagos, pasando por Mendel y la irona de no
conocer en vida el xito y la fortuna (aunque en principio no le interesaban, en razn de su condicin de
clrigo). Exploraremos los aportes de Watson y Crick, cuyo modelo helicoidal del A.D.N. an nos acompaa.
Sin menoscabar la importancia del eminente Sutton y el dans Johannsen, quien en 1909 acu el trmino
gen.
Asimismo, haremos un pormenorizado estudio de la estructura del A.D.N. permitiendo as, un adecuado y
necesario prolegmeno a las pruebas cientficas que nos ocupan.
Luego, bajo una perspectiva forense, enunciaremos principios bsicos de inmunohematologa, sin los cuales
correramos el riesgo de estropear las muestras que permiten la extraccin del A.D.N. Particularmente
rescataremos la importancia de los qumicos anticoagulantes que deben aplicarse a las muestras de sangre.
Researemos el primer caso resuelto con la valiosa tcnica RFLP del Doctor Alec Jeffreys, genetista ingls
que cambi para siempre la criminalstica, mientras busca otro objetivo de otra naturaleza. As, se logr la
captura del asesino del sendero en Narborough (Gran Bretaa) en los aos ochentas.
Profundizaremos en la tcnica pre-citada y avanzaremos hacia la tcnica ms empleada en la actualidad: el
P.C.R. o Reaccin en cadena de la Polimerasa, del Dr. Mullis en Estados Unidos. No obviaremos el detalle de
esta maravilla forense y la compararemos con la prueba de Jeffreys. Tambin puntualizaremos los avances,
mejoras y nuevas aplicaciones del P.C.R. en la gentica y la medicina.
A manera de ilustracin, criticaremos el caso de O. J. Simpson, quiz uno de los ms polmicos y publicitados
de la historia. Veremos como la prueba cientfica del A.D.N. cedi ante el sistema de jueces en conciencia.
En el Ttulo II, aportaremos datos (con su representacin grfica), de la estadstica costarricense en pruebas de
P.C.R. durante los aos de 1998 y 1999. Para este propsito hemos contado con la valiossima colaboracin
de las Doctoras Sandra Silva y Marta Espinoza, del Centro de Biologa Molecular y Celular de la Universidad
de Costa Rica y la Unidad de A.D.N. seccin de Bioqumica del Departamento de Laboratorio de Ciencias
Forenses del Organismo de Investigacin Judicial, respectivamente.
Finalmente expondremos conclusiones pragmticas y viables de fcil constatacin, discutiendo a la vez
aspectos especulativos que la ciencia dirimir a su tiempo.
Preguntarnos acerca del A.D.N. es cuestionarnos quienes somos, es revelar la identidad oculta que nos
determina fisiolgicamente (en el fenotipo y genotipo). La importancia de estas interrogantes resulta
impactante, esperamos poder suplir un poco de conocimiento a tan importante tpico.
La hiptesis de este trabajo, consiste en aseverar nuestra creencia, de que, la predisposicin a las
conductas desviadas, especialmente la delincuencia, no se transmite genticamente mediante factores
hereditarios de progenitores a hijos y dems descendientes. O al menos, pensamos- como hiptesis
subsidiaria-, que no sera el nico factor que explique la etiologa del delito, ya que la nurtura, para el
punto en examen, es ms determinante que el perfil gentico de un individuo.
unidades de azcar en cada tira. Cada uno de estos peldaos consiste en un par de bases: A y T o C y G; no
hay otra combinacin pues slo as, se obtienen peldaos de igual tamao. Cada una de estas parejas se unen
a travs de puentes de hidrgeno: dos en el par A T y tres en el par C G.
De forma que la concepcin de la doble hlice inici inmediatamente una profunda revolucin en la
forma de analizar datos por parte de los genetistas. El gen dej de ser una entidad misteriosa, cuyo
comportamiento slo se poda investigar con experimentos de hibridacin; se convirti muy pronto en
cambio, en un objeto molecular real. (6)
Otro gran avance que produjo el modelo Watson-Crick es que sugiere un mecanismo muy sencillo de
duplicacin. Ya que el A.D.N. tiene la forma de una doble hlice y puede escindirse por el medio, a lo largo, y
cada mitad puede construir una molcula completa. La molcula primero se desenrolla y los puentes de
hidrgeno que unen los pares de bases se rompen ordenadamente, abrindose por el centro cada peldao.
Entonces, cada base en la media hebra puede encontrar pareja dentro de las bases libres en el citoplasma. Las
unidades nuevas ocupan los viejos lugares con el orden de la escala original, y as se tiene que cada mitad de
A.D.N. original constituy una nueva mitad complementaria. En 1958, Messelson y Stahl probaron esto a
travs de un experimento con bacterias cultivadas en un medio alimenticio enriquecido con nitrgeno pesado.
En 1959 se confiri al doctor Arthur Kornberg y a su colega Severo Ochoa el Premio Nobel, ya que
lograron sintetizar A.R.N. partiendo del A.D.N. en un tubo de ensayo, ello constituy- en criterio de Edward
Frankl- uno de los experimentos ms emocionantes a favor de la teora de la duplicacin del A.D.N. por
escisin y reconstitucin de escalas. Se afirma que El descubrimiento de que los cidos nucleicos son un
componente esencial de la materia viva, fue llevado a cabo por Frederich Miescher, en el curso de sus
investigaciones acerca de los componentes qumicos del ncleo celular... (7)
Sin embargo, transcurrieron cerca de ochenta aos desde el descubrimiento hasta que el papel
fundamental en la transmisin de los caracteres hereditarios, le fuera atribuido al A.D.N. Wilhein Roux lanz
la idea de que el ncleo celular y ms concretamente los cromosomas constituan el material base de la
herencia.
Seccin c) CARACTERSTICAS GENERALES DEL A.D.N.
El A.D.N. es una molcula que determina la naturaleza fundamental de toda la vida, se encuentra en
cada una de las clulas del cuerpo y sus iniciales resumen su nombre qumico: cido desoxirribonucleico. En
su estructura, as como en la del A.R.N. participan o estn presentes las primidinas y las purinas. Adems
como su nombre lo indica reside en el ncleo de la clula, aunque es posible extraer A.D.N. mitocondrial, y en
general ...ejerce un control doble sobre la vida de un organismo. Dirige el metabolismo, las actividades
incesantes que mantienen funcionando la maquinaria del cuerpo. Determina asimismo, la herencia, la
transmisin de rasgos que hace perdurar la especie durante centenares, miles y a veces hasta millones de
aos.(8)
El cido desoxirribunucleico es un gran polmero compuesto de monmeros llamados nucletidos, los
cuales se agrupan en series. Cada nucletido, est formado por un azcar 2! Desoxirribosa que contiene una
base nitrogenada unida al carbono 1! y un grupo fosfato unido al carbono 5!. La base nitrogenada puede ser
timina, citosina, adenina, o guanina; las dos primeras son bases pirimidnicas y las dos ltimas son purinas.
Los nucletidos se unen unos con otros por medio del grupo fosfato, formando enlaces fosfodister, donde el
grupo fosfato se enlaza al oxgeno que est unido al carbono 3! Del siguiente nucletido. De esta forma, los
polinucletidos tienen un extremo con un grupo trifosfato libre unido al carbono 5! del azcar desoxirribosa.
La mayora de las veces, el A.D.N. se encuentra en forma de doble hebra. Se dice que las hebras son
complementarias, pues cada base nucleotdica se une especficamente con otra base por medio de puentes de
hidrgeno, siguiendo las reglas de apareamiento de Watson y Crick, As la Timina se une con la adenina a
travs de dos puentes de hidrgeno, mientras que la citosina se une a la guanina por medio de tres puentes de
hidrgeno. Las hebras complementarias del A.D.N. son antiparalelas, puesto que la terminal 5! De una hebra
gentica de una clula a sus descendientes, y tambin llevan informaciones entre ciertos componentes
celulares. Se puede sealar en general, que los cidos nucleicos estn constituidos por la polimeracin de
unidades llamadas nucletidos. Se reconocen dos tipos de cido nucleico: el desorribonucleico o A.D.N. y
el ribonucleico o A.R.N. Estos cidos son molculas formacionales que controlan los procesos bsicos del
metabolismo celular, la sntesis de macromolculas, la diferenciacin celular y la transmisin del patrimonio
gentico de una clula a sus descendientes.(11) As pues el A.D.N. es el responsable del almacenamiento y
transmisin de la informacin gentica, y se encuentra en los cromosomas, y en pequeas cantidades en las
mitocondrias y en los cloroplastos. En general, el orden de enlace de los nucletidos provee un casi infinito
nmero de posibilidades de secuencias, lo que hace que el A.D.N. de cada persona muestre patronos
individuales que no se repiten.(12)
La variacin que existe se debe a tres fenmenos: 1-La mezcla de un juego de los cromosomas de dos
individuos nicos. 2- Reparticin al azar de los veintitrs pares de cromosomas en la meiosis del padre y la
madre. 3- Recombinacin meitica, que mezcla las secuencias en cada cromosoma.(13)
En resumen, el DNA director de la clula, controla todas las actividades celulares desde su despacho
de ejecutivo en el ncleo. Los planos de fabricacin de millares de protenas estn en otros tantos genes que
constituyen diramos- los archivos de la clula: los cromososmas... el DNA no hace todo el trabajo solo.
Crea asistentes y les atribuye responsabilidades. Estos asistentes son las diversas clases de molculas de
RNA. Un grupo lo constituyen las molculas de RNA mensajero, copias qumicas de genes que contienen el
plano para una protena especfica. Estas molculas salen al citoplasma y dicen a los ribosomas, factoras
de protenas, que protenas han de hacer. Otra creacin del DNA es el RNA de transferencia, cuyas molculas
estn constituidas para captar aminocidos sueltos especficos y llevarlos al lugar debido de la lnea de
montaje. Conforme los diversos aminocidos ocupan sus lugares, van formando una cadena protenica,
ordenada segn las instrucciones qumicas contenidas en el gene. La protena recin formada se desprende de
la lnea de montaje y la maquinaria ribosmica queda dispuesta para fabricar ms de la misma protena, o
acaso para recibir otro conjunto de instrucciones... (14)
Es importante acotar que Cada unidad de informacin hereditaria se identifica con el nombre de gen,
trmino propuesto por el botnico dans Johannsen en 1909 para reemplazar a los diversos vocablos con los
que se hasta ese momento se denominaba a los elementos hereditarios.
Cada gen est compuesto por cido desoxirribunucleico que es el material que constituye la
estructura de los cromosomas y est, por ende, considerado el vehculo de la herencia biolgica; se lo
identifica internacionalmente con las siglas ADN o DNA (correspondiente a su denominacin en idioma
ingls)...(15) Como bien seala Maris Martnez, citando al Breve Glosario de Biotecnologa de la UNESCO,
se puede definir a los cromosomas, como las estructuras cuneiformes situadas en el ncleo de una clula que
almacenan y transmiten informacin gentica; es la estructura fsica portadora de los genes. Los cromosomas
estn compuestos esencialmente de ADN y protena y contienen la mayor parte del ADN de la clula. Cada
especie tiene un nmero caracterstico de cromosomas.
Como ya habamos indicado, los cromosomas fueron vinculados por primera vez a la herencia por
Walter Sutton (citologista) en 1903, adems Cada uno de los genes ocupa un lugar especfico en el
cromosoma y origina un producto caracterstico que define cada alternativa de un carcter diferencial. (16)
Resulta esencial, de previo a continuar con nuestro estudio, proceder a definir trminos genticos bsicos, para
ello, utilizaremos la obra de Stella Maris Martnez. La palabra genotipo se refiere a la constitucin gentica
de un individuo, esto es, a la clase de genes que ese individuo ha heredado para un rasgo en particular. El
aspecto o apariencia de tal individuo con relacin a ese rasgo se conoce con el nombre de fenotipo. Ambos
trminos deben tambin su creacin a Johannsen.
La posibilidad de variacin de un organismo existe gracias a un cierto grado de maleabilidad del
genoma (conjunto de la informacin gentica contenida en el cromosoma), que permite el diseo de nuevas
combinaciones de genes mediante dos mecanismos principales: la recombinacin gentica y la mutacin. La
recombinacin gentica es el proceso de intercambio de informacin hereditaria entre dos organismos
reposar por varias horas, de esta manera las clulas se separan en Plasma y plaquetas, leucocitos y eritrocitos
(esto significa que se ha utilizado un anticoagulante).
Si al tomar muestras de sangre no se usan anticoagulantes, o si se derrama por causa de una herida, al
centrifugarse o quedar en reposo, se separa suero y coagulo. Algunos de los anticoagulantes que se utilizan en
la actualidad en el laboratorio forense son EDTA y ACIDO CITRICO-CITRATO-DEXTROSA o A.C.D.
El EDTA (etilendiamino tetractico) es el anticoagulante ms usado y se emplea en una concentracin de 1 a 2
mg/ml de sangre. Previene la coagulacin al remover el calcio del plasma por precipitacin. Se usa en la toma
de muestras para anlisis de A.D.N., en pruebas de paternidad y en casos criminalsticos, para determinar
marcadores genticos eritrocticos e isoenzimas en muestras de sangre fresca.
El cido ctrico-citrato-dextrosa (A.C.D.) acta secuestrando el in calcio, lo que inhibe la coagulacin de la
sangre. Permite la conservacin de los glbulos rojos por un lapso de 21 das. Se utiliza como anticoagulante
de preferencia en anlisis de A.D.N. La sangre recolecta en la escena del crimen, ya sea del suelo o de las
paredes, se recoge en forma estril, sin anticoagulantes, pues ya est coagulada y se coloca en un tubo de
ensayo tambin estril. Segn entrevista efectuada a la Dra. Marta Espinoza, (20) para tomar las muestras se
utilizan torundas una especie de aplicadores con punta de algodn similares a los usados para la limpieza del
odo, slo que son ms largos y totalmente estriles. Si hay una mancha de sangre en la piel, pero est seca, la
Dra. Espinoza seala que la muestra se toma raspndola. Adems indic que tratndose de restos seos, su
aptitud para pruebas de A.D.N. es variable segn las condiciones ambientales, pero en espacios abiertos, su
utilidad mxima es de unos veinte aos. Como nota curiosa, agregamos que la citada especialista nos indic
que el semen se conserva mejor en tela, para muestra un botn (el vestido manchado de semen que guard
Mnica Lewinsky y motiv la confesin pblica del Presidente Bill Clinton). Es importante rescatar de esta
entrevista, que el secuenciador automtico para pruebas de P.C.R. (que estudiaremos posteriormente) vale
aproximadamente 44 millones de colones (en 1999) y el Poder Judicial no dispone de uno, nicamente est
disponible en la Ciudadela de la Investigacin de la Universidad de Costa Rica.
Seccin b) LOS ASESINATOS DEL SENDERO INGLATERRA. PRIMER CASO EN LA HISTORIA
FORENSE EN SER RESUELTO MEDIANTE EL PERFIL GENTICO.
En el tranquilo pueblo de Narborough (Reino Unido), de poco ms de seis mil habitantes, la maana del 22 de
noviembre de 1983 fue macabra, se encontr el cuerpo sin vida y desnudo de una jovencita de 15 aos de
edad, Lynda Rosemarie Mann, al lado de un sendero cercano a la poblacin. El forense determin que fue
estrangulada con su propia bufanda y posteriormente fue ultrajada sexualmente, del cuerpo de la vctima se
extrajo semen que revel que el ofensor tena sangre tipo A positivo (el cual tienen un 10 % de la poblacin).
Como es de esperar, se desat una verdadera cacera sin resultados efectivos, en un primer momento se pens
que el autor poda ser algn paciente de un hospital psiquitrico situado muy cerca del sitio del hallazgo, pero
esa hiptesis fue descartada rpidamente. Aqu, conviene recordar que no se ha demostrado cientficamente
que los enfermos mentales tengan una mayor disposicin a la delincuencia que los mentalmente sanos.
Cuando ya la tranquilidad pareca volver a Narborough, el 31 de julio de 1986, Dawn Ashworth fue
encontrada muerta en otro camino, en un lugar cercano adnde ocurri el primer asesinato. Ambas vctimas,
eran de la misma localidad, eran caucsicas, de 15 aos de edad, haban muerto estranguladas, haban sido
violadas y adems asistan al mismo colegio. El semen encontrado en la menor, indicaba tambin que la
sangre del violador era A positivo. Un asesino en serie acechaba a la comunidad.
Sin embargo, a diferencia, de Lynda Mann, Dawn Ashworth fue violada antes de morir, segn determin el
patlogo forense y opuso una mayor resistencia. A juzgar por las lesiones de su cuerpo, se dijo que debi haber
sufrido mucho de previo a fenecer. La polica intensific su bsqueda y arrest a un joven de 17 aos, Richard
Buckland, como principal sospechoso, adems lo incriminaba el hecho de que existan pruebas que intimidaba
a las jovencitas del pueblo con insinuaciones indecorosas, tras largas horas de interrogatorio, Buchland acept
haber matado a Dawn Ashworth, pero dijo no haber asesinado a Lynda Mann, por los detalles que brind a la
polica acerca de la posicin del cuerpo y otros aspectos no conocidos por la prensa, las autoridades no tenan
patrn magntico que traen los productos comerciales. Como ese patrn es caracterstico de cada persona se
le llam huella digital gentica en concordancia con la huella dactilar, que tambin es nica. Sin embargo las
sondas multilocus (MLP) cedieron pronto el lugar a las sondas unilocus (SLP) que dan solo un patrn de 2
bandas por personas. Aunque las sondas mltiples tienen una mayor capacidad de exclusin, su produccin e
interpretacin de los resultados presentan varias dificultades que no se dan con sondas simples. Una mezcla
de 2-4 de stas nos dan resultados ms claros y equivalentes a una sonda mltiple. La gran capacidad de
exclusin e inclusive de inclusin de esta nueva tecnologa se debe a que existen zonas (locus) en el ADN que
son muy variables. Estas se denominan, una vez cortadas enzimticamente, RFLPs (Restriction Fragment
Lenght Polymorphism). Su longitud est dada por el mayor o menor nmero de veces que una unidad bsica
de ADN se repite dentro de ese locus: VNTR (Variable Number of Tandem Repeats). Cada uno de los tamaos
de ese fragmento constituye un alelo del locus.
Para efectos forenses, el locus ser ms importante cuantos ms alelos tenga. En la actualidad se
trabajan algunos loci que tienen entre 20 y 30 alelos, tales como el MCT-118 (D1580) y el APO B.
Recientemente, un locus relacionado con los antgenos H.L.A. (DRB) se describi con 60 alelos. Como
heredamos un gen materno y otro paterno, el nmero posible de patrones de dos bandas se hace enorme y
cuando se combinan las capacidades de exclusin de dos o ms locus podramos tener una probabilidad tal
que, estadsticamente, no alcanzara la poblacin de un pas o inclusive la poblacin mundial, para encontrar
otro individuo semejante. Es por ello que tenemos un gran empeo en utilizar rutinariamente esa tecnologa
en Costa Rica, la cual se puede utilizar con sangre fresca (paternidades), y manchas de sangre, semen o
cabellos foliculados generalmente hallados en homicidios y violaciones.(21) Conviene incorporar en este
apartado, lo reseado por Carmen Prez Una buena pista es la que aporta una informacin til para el
desarrollo de la investigacin, aunque a veces nicamente conduzca a otra. Desde el punto de vista de los
anlisis del DNA, la mejor materia es la sangre, porque suele contener una mayor cantidad de clulas y, por
tanto, ms material gentico para analizar. Adems la extraccin del DNA resulta ms fcil.
El semen tambin contiene una gran cantidad de clulas y es bastante estable, pero en el caso de
tomas vaginales a partir de la vctima suele estar ms contaminado que la sangre, porque tiene restos de sus
secreciones vaginales y hay que separarlas previamente para estudiarlo.
Un cabello se conserva bien durante mucho tiempo, pero tambin acostumbra a estar ms
contaminado, ya que suele tener material gentico de otros individuos. Algo parecido ocurre con la saliva:
impregnada en la goma adherente de los sobres y sellos se puede conservar en perfecto estado durante aos,
pero slo es til si contiene clulas de la mucosa epitelial de la boca.(22)
A continuacin, delimitaremos conceptos bsicos que nos ayudarn a obtener una mayor comprensin
del contenido de la exposicin, para ello nos basaremos en el artculo del Dr. Rafael Marn Rojas, cuya cita ya
fue indicada, el Dr. Marn es adems Master en Ciencias y a la fecha de la publicacin funga como Jefe de
Laboratorio Clnico del Hospital San Juan de Dios en San Jos, Costa Rica.
Locus: fraccin del A.D.N. que contiene una caracterstica.
VNTR: repeticin secuencial de una unidad bsica de A.D.N. dentro del RFLP.
Enzima de Restriccin: molcula orgnica capaz de cortar la molcula del A.D.N. en pequeos
pedazos o RFLPs por sus dos extremos o sitios de restriccin. Es una verdadera tijera gentica.
Enzima Polimerasa: hace lo contrario, une nucletidos para formar un pedazo de A.D.N.
(oligonucletido), tomando como punto de partida un primer (cebo o semilla).
Sonda: equivalente de un primer grande. Su misin es encontrar RFLPs dentro de los miles que
produce una enzima de restriccin. Pegado a ella lleva un sistema que sirve para revelar la presencia de ese
RFLP e indicar su posicin relativa. Este sistema es necesario porque el A.D.N. del RFLP est en poca
concentracin y no es posible visualizarlo directamente, se usa el sistema revelador de la sonda: radiactivo,
qumico o fotoqumico.
Agarosa: sustancia natural, gelificante, extrada de algas, semejante a la gelatina. En ella ponemos la
muestra de A.D.N. digerida con la enzima (RFLPs) para separar por electroforesis.
Electroforesis: tcnica para someter a un campo elctrico la muestra que est en la agarosa. Los
RFLPs ms livianos migrarn, dentro del gel, ms rpidamente que los ms grandes o pesados y todos
ocuparn una posicin caracterstica que ser visualizada y fotografiada.
Transferir: (Southern Blotting) pasar los RFLPs, despus de la electroforesis, de la agarosa a un
medio slido: nylon o celulosa. En este nuevo soporte es donde se hibridiza con la sonda marcada.
Revelar: poner a funcionar el sistema indicador, transportado por la sonda, para que indique el sitio
exacto donde quedaron las bandas paternas y maternasde los RFLPs analizados. Una vez revelados son
fotografiados para su estudio comparativo, con las otras muestras.
Concluye el Dr. Marn Rojas que En resumen, la tcnica de la huella gentica consiste en extraer el
ADN de la muestra: sangre fresca, tejido, mancha de sangre, manchas de semen o folculo piloso. La
extraccin se realiza mediante un mtodo orgnico o uno inorgnico. Despus de extrado el ADN se somete a
la digestin con al enzima de restriccin.
Una vez realizada la digestin, los RFLPs se separan mediante electroforesis en agarosa, despus de
lo cual se realiza la transferencia a membranas de nylon. Ya en este soporte se lleva a cabo la hibridizacin
con la sonda marcada para finalizar con el revelado y la fotografa.
Como podr verse, la metodologa es larga y bastante complicada por lo que se han diseado tcnicas
alternativas a la huella gentica. La ms utilizada el PCR: Reaccin en cadena de la polimerasa. Mediante
ella hacemos millones de copias del VNTR que nos interesa (con primers y polimerasa) y con esa cantidad
podemos visualizar directamente la posicin del fragmento del DNA, despus de la electroforesis, sin
necesidad de transferencia ni sondeo. Con ello, la metodologa se reduce a una etapa de extraccin, a otra de
copiado y a la separacin por electroforesis. Por ltimo fotografiamos las posiciones relativas de los RFLPs
directamente de la agarosa, mediante tincin directa.
Dada su ventaja, en cuanto a tiempo de trabajo y a que las sondas son muy difciles de conseguir,
porque estn muy protegidas con patentes, optamos por utilizar al PCR como tcnica a aplicar en el trabajo
forense rutinario. (23)
En la tcnica RFLP de Jeffreys, el llamado proceso de digestin del A.D.N. que ya reseamos -y que
detallaremos a continuacin- consiste en poner en contacto la cadena de ADN con un enzima de restriccin, la
cual acta cortando la doble cadena en puntos determinados.
As, una cadena determinada ser cortada tantas veces como secuencias especficas de reconocimiento
presente para una enzima determinada. ... las enzimas llamadas endonucleasas de restriccin son
aplicadas a las molculas de A.D.N. para cortar el ziper de A.D.N. en fragmentos. Estas enzimas
reconocen ciertas secuencias en pares de nucletidos, o dientes y cortan el ziper de ADN en el punto que
reconocen. El resultado son fragmentos del ADN diferentes en largo y nmero para cada individuo.(24)
Una enzima de restriccin particular cortar el A.D.N., solo si una secuencia especfica de bases est presente.
Esta secuencia es conocida como el sitio de restriccin para esa enzima.
Los fragmentos de ADN digeridos con una enzima de restriccin especfica van a generar fragmentos de
diferente tamao, con solo que una de las bases en el sitio de restriccin sea diferente. Estos cortes de ADN
que se observan despus del proceso de digestin producen los llamados fragmentos de restriccin de
longitud variable, en ingls, restriction fragment lenght polymorphisms o en su abreviatura (RFLP`s) ya
citados.
Muchos de estos fragmentos van a tener secuencias de bases repetidas, segn vimos; y estas
secuencias pueden rotularse con radioactividad para ser detectadas luego.
Las secuencias se llaman Sondas o Probes. Una sonda es un fragmento pequeo de ADN de una
nica hebra marcado con una molcula de referencia (marcado con radioactividad, por ejemplo) cuyas
secuencias de base sern conocidas. Cuando una de estas sondas se hbrida con un fragmento de ADN que
previamente ha sido desnaturalizado, la sonda va a adherirse a la secuencia de bases del A.D.N. que
contenga una secuencia de nucletidos complementarios a la suya, para as formar nuevamente la doble
hlice. Entonces la secuencia de nucletidos en el filamento podr ser identificada, con la referencia
radioactiva de la sonda con la cual se hibrid. (25)
Existen bsicamente dos tipos de sondas: las monolocus y las multilocus, as Single-locus: Las
unidades de repeticin de ciertos minisatlites son especficas de una regin particular (locus) y de un
determinado cromosoma. Las sondas que se combinan exclusivamente con estas regiones son denominadas
monolocus (single-locus). Estas sondas van a detectar un nico segmento del A.D.N. repetitivo en un sitio
especfico de un filamento separado de su complementario en los cromosomas.
En cada estudio aparecen, dos copias por individuo, correspondientes a los dos alelos que pueden ser
hipervariables entre s. Suelen estar compuestas por una larga secuencia de nucletidos, con mayor
variabilidad que los que componen los multilocus (vase ilustracin N 7, Pg.606).
-Multilocus: Este tipo de sondas se acoplan a minisatlites que estn presentes en varios locus de
diferentes cromosomas; suelen estar compuestas por unos 10-15 pares de bases que se repiten mltiples
veces. En cada estudio aparecen entre 10 y 20 bandas por persona (Vase ilustracin N 8, pg. 607).
Entonces la diferencia principal con las SINGLES- LOCUS es que las MULTI-LOCUS detectan
mltiples segmentos del ADN repetitivo, localizados en muchos cromosomas, entonces detectan en forma
simultnea fragmentos de ADN en mltiples regiones de de mltiples cromosomas. (Vase ilustraciones N 9 y
10, Pgs. 608 y 609).
En una comparacin de estos dos tipos de sondas, Gisbert Calabuig nos seala las siguientes
similitudes y diferencias:
1- Informacin aportada. Las sondas multilocus tienen una mayor capacidad discriminativa, al
aparecer mltiples bandas. Las monolocus, por otra parte, son ms sensibles, ya que al ser la
sonda ms larga se hibrida ms especficamente.
2- Cantidad y caracteres del D.N.A. necesario. Las multilocus necesitan aproximadamente 1 ng de
D.N.A. en perfecto estado, que no haya sido degradado. Las monolocus necesitan 100 ng de
D.N.A., pudiendo estar degradado, siempre que no se haya afectado el fragmento que hay que
hibridar por la sonda.
3- Especificidad. Las sondas multilocus permiten su uso sobre D.N.A. humano y de ciertos animales
superiores, mientras que las monolocus son exclusivamente para material humano.
4- Utilidad. Por sus caractersticas, las sondas multilocus son especialmente aptas para confirmar
una paternidad y una imputacin penal no suficientemente filiada, mientras que las monolocus
sirven para realizar estudios de paternidad en casos complejos en familias consanguneas, as
como para descartar una acusacin o resolver casos en los que el D.N.A. no est bien
conservado... (26)
El descubrimiento de Jeffreys, origin como es usual, al surgimiento de nuevos mtodos para aislar el
A.D.N. y obtener los mismos resultados empleando diversas tcnicas, siempre buscando todos, encontrar ese
patrn de bandas (que como dijimos es similar al de los productos comerciales) evidentemente, estos
diferentes procedimientos hacen variar los niveles de certeza y confiabilidad en los resultados.
Seccin d) MULLIS- REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA (O TCNICA DEL
P.C.R.).
Si el descubrimiento casual del Dr. Jeffreys marc un hito en la investigacin forense, la tcnica
desarrollada por Mullis, llamada en ingls The Polymerase Chain Reaction, o P.C.R. como se conoce en
abreviatura, no fue menos trascendente para la ciencia. La idea bsica del P.C.R. es producir grandes
cantidades a partir de un fragmento especfico de A.D.N., mediante la amplificacin selectiva de una simple
molcula de A.D.N. muchsimas veces y en unas pocas horas, lo que contrasta con el mtodo de RFLPs del
Dr. Jeffreys. ...El principio de PCR est basado en la amplificacin enzimtica de un fragmento de ADN que
es flanqueado por dos primers (son pequeos fragmentos de ADN, u oligonucletidos que han sido
sintetizados en el laboratorio) que hibridizan o se unen al ADN ya desnaturalizado, en cada una de las hebras
de la secuencia que nos interesa, por lo que proveen un sitio para que la enzima polimerasa inicie su labor.
Para esto, las secuencias de bases de ADN que precede y proceden inmediatamente a la regin que
pretendemos amplificar deben ser conocidas para poder sintetizar los primers. A este respecto resulta de
gran utilidad la labor que est realizando el Proyecto del Genoma Humano, cuyo objetivo bsico es
establecer un mapa gentico completo del ser humano.
Como venamos diciendo, la polimerasa empezar a trabajar en el final del primer y utilizando las
bases disponibles (A, C, T, G) ir atrayendo las que se necesiten para sintetizar copias complementarias de
cada uno de los filamentos. As, repetidos ciclos de desnaturalizacin, alineacin de los primers con sus
secuencias complementarias y extensin con la polimerasa da como resultado la amplificacin de un
segmento definido (Vase ilustraciones N 12 y 13, pg. 611 y 612).(27)
En lo referente al Proyecto del Genoma Humano, es prudente acotar que Simultneamente, el
National Center of Human Genome Research, oficina especficamente abocada al proyecto, ha anunciado la
concrecin de inversiones destinadas al anlisis biotico de las consecuencias ticas, legales y sociales que el
caudal de informacin a obtenerse acarrear, as como a sugerir lneas polticas en punto al manejo de tal
informacin.
El programa ha identificado tres grupos de cuestiones a dilucidar: los temas vinculados a la
integracin de nuevas pruebas genticas en la prctica mdica, que, ms all de las responsabilidades
legales que pudieran emerger de una realizacin deficiente de las mismas, no parece incidir demasiado en el
campo jurdico; los referidos a la necesidad de educacin y consejo a brindarse a los individuos sometidos a
pruebas genticas, as como a la correcta evaluacin de los resultados que impida a los afectados traumas
psicolgicos, estigmatizacin y discriminacin y, finalmente, los temas vinculados al acceso y al uso de los
resultados de las pruebas genticas por terceros, incluyendo en tal categora a las compaas de seguro, a los
investigadores biomdicos y a los empleadores.
A su vez, en el mbito europeo, el Consejo de Europa ha adoptado un programa especfico en salud
diagnstico gentico: anlisis del genoma humano, cuya redaccin definitiva fue aprobada en fecha 11 de
junio de 1990. En su presentacin se consigna que es una respuesta de Europa a los desafos
internacionales que representan los proyectos de investigacin biolgica de gran envergadura en EE.UU.
(cartografa y secuenciacin del genoma humano) y Japn (Programa Cientfico de Fronteras Humanas).
Aunque es un programa de investigacin precompetitiva bsica, puede dar lugar a nueva informacin y
nuevos materiales potencialmente comercializables, pudiendo desarrollarse tambin nuevos procesos
tecnolgicos. Este programa responder la mejora de la resolucin del mapa gentico humano (esto es, la
creacin de un mapa del genoma humano en base a marcadores del ADN para permitir a los investigadores
localizar fcil y rpidamente los genes); la coleccin de bibliotecas ordenadas de clones ( es decir,
colecciones de juegos ordenados de fragmentos de ADN que representan en su totalidad al ADN presente en
fragmento de ADN que se utiliza como molde, todo en un amortiguador adecuado. Los imprimidores se
disean para unirse a fragmentos complementarios de bandas opuestas del ADN molde, de manera que
definan la regin de inters llamado ADN objetivo.(31)
Se puede entonces, definir a la tcnica P.C.R. como un amplificacin o copia del A.D.N. in vitro.
Dado que este proceso ocurre en vivo, cada vez que las clulas se reproducen y deben previamente duplicar su
A.D.N. (cuando se forma el cigoto, se est duplicando el A.D.N.). De esta forma a travs del P.C.R. se copia el
A.D.N. in vitro por medios artificiales, con la ayuda de un aparato ad hoc.
El propsito del P.C.R. es amplificar pequeas cantidades de A.D.N. y producir mayores cantidades,
que permitan una mejor caracterizacin a posteriori.
... Si se conoce la secuencia de una cadena simple de ADN, se podr deducir cul es la secuencia de
la cadena complementaria y vamos a poder realizar una serie de tcnicas analticas que permitan poner de
manifiesto las caractersticas de la regiones del ADN que, para identificar a las personas, nos interesan.
(32)
d.2- MATERIALES Y PROCEDIMIENTOS NECESARIOS PARA LA TCNICA DEL P.C.R.
Lo primero que se necesita,- como sugiere la lgica- son muestras de A.D.N. dichas muestras,
dependern de la clase de investigacin que estemos ejecutando (paternidad, identificacin forense de un
cuerpo, de un presunto violador o de un homicida). Se requieren tantas muestras de A.D.N. como personas
estn relacionadas al caso. Como indicamos con antelacin, para casos de paternidad, normalmente se usan
tres muestras, del posible padre, la madre y el hijo. Para ello, lo ideal es la toma de sangre fresca directamente
de la persona. En la muestra de sangre, interesan slo los leucocitos o glbulos blancos, ya que son los nicos
que tienen ncleo y por ende, A.D.N. nuclear.
En casos de investigacin criminalstica de homicidios o violaciones, las muestras pueden obtenerse de
manchas de sangre o semen de las ropas o del suelo y paredes de la escena del crimen, trozos de piel
encontrados debajo de las uas, flujo vaginal, un diente, determinados huesos, e incluso saliva (con las
observaciones ya expresadas en secciones anteriores). Como principio, lo usual es que las cantidades de
A.D.N. sean muy reducidas en los elementos pilosos, semen o sangre encontrados. El A.D.N. se encuentra
principalmente en el ncleo de la clula(33), por lo que debe romperse la membrana citoplasmtica y la
membrana nuclear a fin de extraerlo, ello se logra mediante un mtodo llamado lisis, que emplea unos
reactivos capaces de romper las membranas pre-indicadas. Estas lisis, no alteran el A.D.N. pues slo rompen
protenas pero no cidos nucleicos. As se obtiene A.D.N. libre de protenas y de todos los fosfolpidos que
contienen las membranas. ... El ADN que se desea replicar (copiar) puede venir en estado puro o ser slo
una minscula porcin de alguna compleja mezcla de materiales biolgicos. Basta con una gota de sangre
disecada, un pelo, tejidos de algn cerebro momificado o extractos de semen hallados en el cuerpo de una
vctima violada. Todas son muestras vlidas para practicar el PCR y dar respuesta a problemas de
identidad.(34)
Aunque la prueba de P.C.R. se practica nicamente con A.D.N., es posible hacer una retro
transcripcin o cambio del A.R.N. a A.D.N. El proceso demanda mayor complejidad y excede los lmites de
nuestra pretensin.
Volviendo al P.C.R. Una vez extrada la sangre, se utiliza una centrfuga- mquina que da vueltas a
gran velocidad- para separar el plasma, los glbulos rojos y los blancos- slo se utilizan estos ltimos- los
leucocitos- que se pasan por una pipeta a un tubo plstico, donde se le agrega una solucin llamada lisis,
cuya funcin es romper la membrana del ncleo. As quedan liberados los 23 pares de cromososmas que
contiene cada clula y por ende, el ADN. Sin embargo, este no se encuentra an en estado puro, est
mezclado con restos de las membranas y las protenas. Para aislarlo, se usa fenol y alcohol cloroformo, dos
reactivos que solidifican las protenas. Luego de agitar el tubo, el fenol se va al fondo, las protenas quedan
en el centro y la solucin de lisis arriba, junto con el material gentico. El siguiente paso es separar esta
capa superior, pasarla a otro tubo y agregarle sal (acetato de sodio) y etanol absoluto, reactivos con los que
la molcula de ADN se precipitan en una especie de motita slida de color blanco. Esta se saca y se deja
secar; finalmente, queda como un papelito fino, que otra vez se pasa a estado lquido para aplicarle la
tcnica PCR. (35)
La rehidratacin del A.D.N. se hace mediante el uso de un buffer y se mide la concentracin de la
madeja de A.D.N. a travs de una espectrofotometra o de una espectro-fluorimetra.
Adems de la obtencin de las muestras y la obtencin del A.D.N. a partir de ellas como se rese, se
requieren los Desoxi-nucletidos trifosfatos o DNTPs (Deoxynucleotide triphosphates en ingls), que son las
bases qumicas que poseen una ribosa, un fosfato y una base nitrogenada. Slo que generados artificialmente
para poder unir y amplificar el A.D.N. nos referimos a los nucletidos que ya detallamos antes, adenina,
citosina, guanina y timina.
Luego, necesitamos la enzima polimerasa o Taq Polimerase, que es una enzima termoestable. Es
decir que soportar sin problemas las altas temperaturas que requiere la tcnica P.C.R. La taq polimerasa
proviene de una bacteria que vive en nacientes de agua caliente, se asla del llamado thermus aquaticus, con
ciertas tcnicas, las enzimas deban reponerse en cada ciclo, por no poder resistir las altas temperaturas, en
cambio la taq polimerasa es eficiente, ya que soporta todo el proceso P.C.R. y al final logra quedar con la
mitad de vida.
Los imprimidores o primers (en ingls), son los que dan el sitio de inicio, son una secuencia de bases
o grupo de oligonucletidos que se han fabricado artificialmente, en una mquina especial a la que se le indica
la secuencia deseada, por ejemplo, una A, G, T, A, A, T, G, etc. Puede ser hasta de 28 letras. Estas bases
nitrogenadas generadas artificialmente- van a encontrar su regin complementaria en el A.D.N., hasta que la
secuencia est pegada. Esto nos sirve para limitar la regin de inters, lo cual significa que se tiene que
conocer los bordes de sta, o sea., la secuencia en que se encuentran las cuatro letras (A,C,G,T) en los bordes
de la regin de inters y que sern los lmites o fronteras de la llamada target sequence que es la regin que
se quiere amplificar. ...Estos bordes van a ser conocidos, gracias a la investigacin, dada a la tarea de
secuenciar regiones del genoma humano, (sobre todo realizada en pases desarrollados como EE.UU.) y
publicaciones en Revistas que indican la existencia de una secuencia x en el cromosoma uno, por citar un
ejemplo, que va a limitar talregin. Sin embargo, existe un centro entre estas secuencias conocidas que no
se conoce, recurrimos entonces para averiguarlos al uso de marcadores genticos, que son partes de
secuencia que ya se han descifrado. El llamado Proyecto de genoma Humano es un proyecto gigantesco a
nivel mundial; que trata de secuenciar todo el genoma humano. En un cromosoma hay millones de esas
letras (A,C,G,T) y en la totalidad del genoma 3 mil millones de pares de bases. Se estn tratando de buscar
marcadores genticos de regiones conservadas en las cuales todos somos similares y se publican
mensualmente secuencias conocidas, las cuales van a ser fabricadas artificialmente para ser utilizadas como
Primers. (36)
El A.D.N. es una doble hlice que se separar en dos, al romper la clula, se encuentran los 23 pares
de cromosomas que todos tenemos (seres humanos) en cada una de las clulas. Obviamente al extraer el
A.D.N. se extraen muchas clulas. Cuando se extrae el A.D.N. , ste queda en un tubo con una solucin acuosa
y ah se le agregan los DNTPs, la enzima Taq Polimerasa, el buffer y los iniciadores. Los primers son los que
van a limitar la secuencia posndose especficamente en una regin de un cromosoma que es la que va a
amplificar. El iniciador va a pegarse con una secuencia complementaria, pero slo donde encuentre la
secuencia complementaria total. Esto es lo especfico del P.C.R. , pues donde existan esas 28 letras no van a
existir otras 28 letras iguales. En otra parte de ese A.D.N. y entonces los iniciadores van a saber donde
pegarse.
El agua es usada para diluir los reactivos, debe ser destilada tres veces, para que no contenga metal
alguno y as no sea dura y todo debe ser estril. El aceite se pone sobre la reaccin. El buffer es una
solucin utilizada en la reaccin como un regulador del PH. O sea del grado de acidez o salinidad del medio,
adecundolo a las necesidades de la enzima Taq Polimerasa, para que esta realice una labor eficiente.
Una vez que a la muestra de A.D.N. se le han agregado los componentes citados, ponemos todo en una
centrfuga, para que bajen los reactivos agregados y se colocan en un aparato el Termociclador, que produce
varias temperaturas (94, 60,y 72) en ciclos de aproximadamente un minuto, las veces que sea indicado.
...El PCR se inicia con un ADN total, que por sus condiciones qumicas normales siempre van a estar en
doble banda. Este ADN se va a abrir en dos cadenas simples de ADN, separando las uniones A-T y C- G
(como cadenas complementarias).
Al iniciar el PCR con un ADN en doble banda se programa el termociclador con temperaturas de
aproximadamente 94 C por 1 minuto, lo que va a romper los enlaces de hidrgeno y va a abrir el ADN en
dos bandas simples.(37)
El siguiente paso, se llama extensin y es realizado por la polimerasa y las cuatro bases agregadas.
La polimerasa inicia su actuacin en el borde de los iniciadores y usando las cuatro bases (A-T-G-C-) sintetiza
copias complementarias de cada uno de los dos filamentos del A.D.N. La temperatura de la extensin es de
70 a 72 , esa es la temperatura en la cual la polimerasa se pega al A.D.N. y va a empezar a extender la
cadena, produciendo as la replicacin. La enzima de polimerasa se ubica nicamente donde est el
imprimidor pegado formando regiones en doble banda. Como indicamos, la Taq Polimerasa en una enzima
termoestable, es decir no muere durante el proceso, sin embargo su nivel ptimo lo alcanza a los 72. En cada
ciclo del procedimiento se dobla la cantidad del A.D.N. presente al iniciarlo. Aunque se habla de la realizacin
de un promedio de 20 a 25 de replicacin, a efectos del P.C.R. En Costa Rica no resulta extrao hacer hasta
35 o 40 ciclos.
Al terminar los procedimientos anteriores, queda en el tubo una solucin acuosa, lo que corresponde es
determinar si la tcnica tuvo xito, es decir, si la amplificacin del A.D.N. funcion. Existen bsicamente tres
sistemas de verificacin, el ms usado en la deteccin del producto del P.C.R. es la Electroforesis, que consiste
en colocar el A.D.N. con ayuda de una pipeta en una matriz de gelatina (gel de agarosa o acrilamida) , que se
torna en una especie de cedazo por el que necesariamente tienen que pasar las molculas, las ms grandes
tardan ms en pasar, mientras que el A.D.N. pasa rpidamente por ser ms pequeo y queda abajo.
El gel se coloca sobre una fuente de poder con un voltaje especfico a un electrodo positivo (localizado
por lo general debajo de la bandeja) que es que atrae las molculas del A.D.N. por que stas tienen carga
negativa en razn de los fosfatos. Normalmente el A.D.N. no migrara pero va ser llamado por la carga
positiva. Se debe contar adems con un Marcador de Peso Molecular, que indica el peso que corresponde a
cada banda el nmero de bases de sta. El principio es que se van a separar las molculas por el peso
molecular (tamao o peso de cada una) y as se van a obtener las diferentes bandas, las cuales se pueden ver
con un transiluminador ultravioleta, colocado detrs de la agarosa. Posteriormente se tie el gel con un
reactivo especfico que se intercala entre las bases del A.D.N. La tincin puede ser con bromuro de etidio o de
plata, o bien utilizar la radioactividad a travs de un radioistopo (marcaje radioactivo) o bien otro marcaje de
tipo no- radioactivo, en razn del peligro de que los radioistopos generan cncer.
Adems de la electroforesis se puede hacer la verificacin del P.C.R. mediante otro sistema llamado
Secuenciacin que consiste en montar una reaccin de secuenciacin utilizando kits para tal efecto y se
realiza una electroforesis que no es agarosa, sino en acrilamida con otros reactivos y otro sistema. En vez de
un gel pequeo (minigel) se utiliza uno grande y vertical (maxigel), que lo que hace es separar las letras para
poder leer y as obtener una secuencia de la banda, no su tamao. La ventaja de este sistema de
secuenciacin es que es el mejor para detectar mutaciones, pues se identifica directamente el error que existe
en la secuencia de las bases de una regin de inters. El problema es que este sistema es ms costoso. Puede
hacerse el marcaje por mtodos radioactivos o no.
Otra posibilidad de verificacin es el sistema de hibridacin. Proceso que puede realizarse mediante
dos protocolos o formatos, el primero es que el producto de P.C.R. es colocado en membranas a las que se
aade una solucin con una sonda (dot blot) y el otro en que las sondas mismas son inmovilizadas en una
nica membrana y usadas para capturar producto P.C.R. complementario (dot blot reverso).
d.3 MEJORAS Y NUEVAS APLICACIONES DE LA TCNICA P.C.R.
A partir del modelo original de Mullis, se han derivado muchas modalidades de tcnica P.C.R., en la
actualidad hay ms de veinte tipos diferentes de P.C.R. como son: el anclado, el inverso, el de regiones
polimrficas, al azar (random) etc. Se utilizan diferentes clases de enzima, incluso existe una que produce
retranscripcin, es decir fabrica A.D.N. a partir de A.R.N. y otra que no slo va colocando nucletidos sino
que se encarga de verificar si el ltimo nucletido es el correcto.
Si bien las pruebas de P.C.R as como las de RFLPs de Jeffreys, se utilizaron primariamente en
pruebas de paternidad y casos penales, se han especializado y diversificado las pruebas del P.C.R. hacia otras
aplicaciones mayoritariamente coadyuvantes de las ciencias mdicas, a continuacin intentamos una
enumeracin de las mismas, informacin obtenida del trabajo de Hazzell Rodrguez Cambronero y Vanessa
Molina Incera, ya citado con antelacin:
En Investigacin Gentica:
1- Diagnstico prenatal de desrdenes genticos.
2- Diagnstico de mutaciones
3- Deteccin de portadores de genes especficos en familias y poblaciones.
4- Generacin de sondas para mapeo gentico.
5- Estudio de ligamentos de RFLPs.
6- Diagnstico prenatal del sexo.
7- Investigacin forense de restos e individuos.
En Investigacin Bsica en Biologa Molecular:
1- Sntesis de genes y modificacin gentica.
2- Estudios de expresin gnica.
3- Secuenciacin de A.D.N.
En Investigacin Clnica Mdica:
1- Deteccin y caracterizacin de patgenos.
2- Identificacin de oncogenes activados y caracterizacin de tumores.
3- Monitoreo de progresin de enfermedades.
4- Estudio de susceptibilidad y predisposicin a enfermedades.
A manera de ejemplo de las aplicaciones mdica, citamos dos casos. En lo relativo al Sndrome de
Down, se asocia dicho mal a la regin 21q que abarca la mayora del cromosoma 21. El S.I.D.A. puede ser
detectado amplificando una regin de la protena del virus y efectuar la comparacin con la muestra de la
persona.
d.4. INTERPRETACION BSICA DE LAS PRUEBAS P.C.R.
Para nuestros efectos, desde una perspectiva legal de interpretacin del P.C.R. cmo podemos utilizar
el resultado de las pruebas?. Siendo minimalistas en la explicacin, hemos de indicar que tanto el RFLP como
el PCR, se basan en comparaciones de muestras, a fin de determinar si los perfiles genticos visibles en las
placas hacen o no un match, es decir si coinciden o no entre s.
Los criterios que se manejan son de exclusin o inclusin. El 100% slo existe en exclusin, es decir es
posible descartar que un sospechoso sea el autor de una violacin o el padre de un nio. El problema deviene
en la inclusin, pese a que la prueba de P.C.R. se practica en los sitios polimrficos del A.D.N., es decir de alta
variabilidad de un individuo a otro (donde individuos no relacionados van a tener bandas diferentes o alelos
distintos para cada marcador), siempre queda la posibilidad de que existen individuos genticamente muy
similares. Por lo que las pruebas de P.C.R. solamente pueden establecer niveles de probabilidad de autora o
paternidad. Por eso, en un caso penal, en donde existan otras pruebas e indicios en contra del acusado,
obviamente, una prueba de P.C.R. que no lo excluya sino ms bien lo incluya en un porcentaje elevado, sera
suficiente para llegar a un convencimiento de la culpabilidad del imputado. No omitimos manifestar- tal y
como lo hemos dicho antes- que en el caso de gemelos homocigticos, es decir formados a partir de un mismo
vulo, esta prueba no permite descartar a uno a favor del otro, pues son perfiles genticamente idnticos. La
nica forma de identificar a los gemelos homocigotos, es mediante las huellas digitales, que siempre son
nicas en cada ser humano.
Como afirma la Dra. Sandra Silva del Centro de Investigacin en Biologa Celular y Molecular, se
corren primeramente cinco marcadores y si todos coinciden se corren tres ms; ya con ocho si las muestras
siguen coincidiendo, prcticamente se establecen resultados contundentes.
Es posible que en dos o tres marcadores exista similitud por coincidencia, pero ya corriendo ocho
marcadores es prcticamente imposible.
E insistimos en que si en alguno de ellos las muestras no concuerdan , se descarta la paternidad o
sospecha en un 100%; ya que en materia de exclusin con slo un marcador que no d igual (incluso al
repetirlo con la idea de evitar el error humano) se determina una exclusin libre de duda.(38)
En una conversacin reciente con la Dra. Silva (Mayo de 1999), ellas nos aclar que actualmente se
corren al menos entre 10 y 19 marcadores, a efectos de una mayor precisin en la identificacin.
Seccin e) ANLISIS COMPARATIVO ENTRE LAS PRUEBAS DE R.F.L.P. DE JEFFREYS Y
EL P.C.R. DE MULLIS.
El R.F.L.P. es altamente discriminatorio- Los loci R.F.L.P. son muy polimrficos, ello significa que la
posibilidad de que una muestra individual coincida con otra es muy baja. En los casos criminales, con correr
5 o 6 marcadores, se puede producir una probabilidad de coincidencia mayor de uno en un milln. La principal
deficiencia del R.F.L.P. es que requiere A.D.N. de alta calidad. La degradacin del A.D.N. en una muestra
forense puede llevar a resultados no concluyentes. La exposicin al medio ambiente, la descomposicin
bacteriana, exposicin vaginal o un inadecuado resguardo de la evidencia puede producir la degradacin del
A.D.N. que limite la aplicacin del R.F.L.P. en muchos casos, an con A.D.N. degradado es posible utilizar
los anlisis del P.C.R.
Para las pruebas R.F.L.P. las muestras pueden ser demasiado pequeas. El tamao de la muestra
mnima para este anlisis es una mancha de sangre de una moneda norteamericana de 25 centavos (quarter) y
una mancha de semen del tamao de una moneda de diez centavos (dime). Cuando la muestra es muy
pequea, el P.C.R. es mucho ms aconsejable.
El anlisis R.F.L.P. puede ser demasiado lento. Bajo las mejores circunstancias, el R.F.L.P. requiere de
tres a cuatro semanas de trabajo de laboratorio. Por ejemplo, en razn del atraso en muestreos pendientes, el
FBI. requiere de tras a cuatro meses. Como resultado, imputados inocentes pueden permanecer detenidos
innecesariamente.
La prueba de P.C.R. es mucho ms rpida y de menos costo que la de R.F.L.P. El anlisis de P.C.R.
requiere una muestra menor e incluso ms degradada de A.D.N. que el R.F.L.P. en razn de su extraordinaria
sensibilidad. Los resultados del P.C.R. pueden obtenerse de 48 a 72 horas.
Pese a las ostensibles facilidades de las pruebas de P.C.R. Las ventajas de la PCR tienen su precio. La
facilidad con que se amplifica el ADN exige evitar el peligro de contaminacin inherente al poder
multiplicador de la reaccin. Los que da a da utilizan la PCR, aseguran que un tubo en que se ha realizado
una reaccin contiene enormes cantidades de ADN, al abrir el tubo que sale caliente del termociclador el
vapor de agua alcanza el ambiente del laboratorio... (39)
Seccin f) EL CASO O. J. SIMPSON.
Este controversial caso de la justicia norteamericana, resulta muy ilustrativo acerca de los resultados de
pruebas de A.D.N. y su valoracin en un sistema de jueces de conciencia (jurado). Por ello quisimos researlo
a fin de ratificar la importancia de esta nueva tecnologa al servicio de la criminalstica.
La tarde del 12 de junio de 1994, O. J. Simpson y su ex esposa Nicole Brown asistieron a una
presentacin escolar de su hija. Posteriormente Nicole acompaada de sus dos hijos cen en un restaurante
cercano a su domicilio, olvid unos anteojos. Ronald Goldman, mesero y amigo de Nicole decidi llevrselos
a su casa. Cerca de las 10 de la noche, un automvil con las luces encendidas es observado frente a la casa de
Nicole. Esa noche, ella y Ronald Goldman mueren apualados. Posteriormente, (el 16 de junio, un testigo
afirma que el carro observado frente a la casa, coincide con el de Simpson).
A las 10:45 p.m. de esa misma noche, un chofer de servicio de limosinas recoge a O. J. Simpson en su
casa y lo lleva al aeropuerto, lo observa agitado y sudoroso. A las 11:45 pm . Simpson vuela a Chicago, es
observado durante el vuelo en actitud serena. El 13 de junio, da lunes, al ser las 12:10 a.m. los cuerpos de
Nicole y Goldman son hallados al final de unas gradas frente a la casa de Nicole. Simpson se registra en un
hotel de Chicago, y la polica de ese lugar encuentra posteriormente sangre en una toalla , sbanas y adems
un vaso quebrado.
O. J. Simpson regresa a Los ngeles donde es interrogado, su abogado defensor lanza la coartada,
alegando que Simpson estuvo en su casa a la hora de los homicidios. En la casa de Simpson la polica recoge
evidencias: unos zapatos deportivos y un guante ensangrentado. El da 14 se da a conocer el historial de
violencia domstica del ex jugador en contra de su ex mujer. Horward Weitzam renuncia a la defensa de
Simpson y el caso es asumido por Robert Shapiro. Simpson acude al funeral de Nicole. El 17 de junio, la
polica avisa a Shapiro su intencin de arrestar al sospechoso, Simpson estaba en casa de un amigo, Al
Cowlings. Cuando llegan Shapiro y cuatro doctores a dicha casa, ya Simpson y Cowlings se haban
marchado. Shapiro ofrece una conferencia de prensa en donde lee una carta en que Simpson se declara
inocente, el abogado teme que se vaya a suicidar.
Al hacer una llamada al 911, Simpson alega que quiere suicidarse y pide hablar con su madre, as se
inicia la televisada persecucin de Simpson en su Ford Bronco color blanco. Finalmente es persuadido de que
se entregue al llegar a su casa y es conducido a la estacin policial.
Nicole Brown fue hallada en posicin fetal con heridas de cuchillo y la garganta cortada, el cuerpo de
Goldman revela que fue apualado en repetidas ocasiones y se encuentran signos de un violento forcejeo.
Cerca de los cuerpos se encuentran los anteojos de la madre de Nicole, un guante de cuero ensangrentado y
una boina con cabello que a simple vista se asemeja al de O. J. Simpson. Tambin se encontr cabello en el
cuerpo de Goldman. La fiscala sostiene que O. J. mat a Goldman al verse sorprendido cuando asesinaba a
Nicole.
Se tomaron muestras de los cuerpos de las vctimas y en algunas reas de la escena del crimen, la
fiscala practic pruebas de A.D.N. a las muestras y demostr que algunas de las muestras de sangre, incluso
las dejadas por marcas de pisadas alejndose de los cuerpos coinciden con el perfil gentico de Simpson.
El guante ensangrentado encontrado en la casa de Simpson coincidi con su A.D.N. La defensa
asever que ste fue plantado en la escena del crimen por el detective de Los ngeles Mark Fuhrman, por
razones racistas. La sangre del vehculo Bronco fue objetada en razn de que no fue obtenida inmediatamente
y pudo ser manipulada. Mientras que la fiscala sostuvo que en el carro de Simpson se encontraron diez mil
dlares en efectivo y una barba y bigote postizo, lo que evidencia la actitud de un culpable, la defensa
argument que ese dinero era para los hijos de Simpson y que l iba a visitar la tumba de Nicole antes de
suicidarse, alegaron que los postizos los intent usar en un viaje a Disneylandia.
Todo el alegato de la defensa en cuanto a la aplastante coincidencia de las muestras con el A.D.N. del
ex futbolista, se bas en negarle valor a las mismas, alegando que no son precisas y que adems la evidencia
fue pobremente recolectada, cuando no alterada por los investigadores del caso.
Este era un caso promisorio para la prueba cientfica del A.D.N. el sistema de jurado, dificultaba la
comprensin de dicha probanza. Las bateras de la defensa se concentraron en cuanto a este tpico a sostener
dos grandes premisas:
-Que la comunidad cientfica no ha establecido un consenso en el clculo de coincidencias entre dos
muestras, es decir que no existe un parmetro de inclusin universalmente aceptado.
-Que no hay seguridad que no hayan ocurrido errores incriminatorios en los laboratorios de pruebas de
marcadores genticos.
Pese a que las primeras pruebas con P.C.R. en este caso, fueron de slo tres marcadores, lo que daba
una posibilidad de que al menos 100 personas de Los ngeles tuvieran ese perfil gentico, se repitieron con
cuatro marcadores ms, as las probabilidades de encontrar a alguien similar a O. J. Simpson eran de uno en
100 millones, es decir a lo sumo 3 personas en todos los EE.UU. pese a ello O. J. Simpson fue absuelto. Pese
a que en California , como en todas las cortes estadounidenses, la prueba del P.C.R. es admitida y
generalmente un resultado incriminatorio de la misma termina en condena para el implicado. O. J. Simpson
fue absuelto en razn de que no hubo consenso del jurado, pues se requiere unanimidad en el veredicto
condenatorio. Se ha dicho en los medios de prensa, que los honorarios de peritos y abogados defensores, hizo
que el O. J. Simpson perdiera la mayor parte de su hasta entonces vasta fortuna.
Una de las aristas difciles de comprender para nuestra formacin romano-germnica fue la reciente
condena en sede civil de O. J. Simpson acerca de los mismos hechos, lo que denota la culpabilidad que haba
evidenciado la prueba del P.C.R. sin embargo, O. J. Simpson est en libertad y no existe posibilidad legal de
confinarlo en prisin, ya que la fiscala perdi la nica oportunidad que tuvo a esos efectos. Parece ser que el
sistema selectivo del derecho penal denota una vez ms su injusto planteamiento, y as bancarrota- O. J.
Simpson aunque homicida, juega golf por las tardes soleadas de California.
TITULO II.- ESTADSTICAS COSTARRICENSES EN PRUEBAS DE P.C.R.
CAPITULO 1.- ANLISIS ESTADISTICOS DE LAS PRUEBAS DE P.C.R EN CASOS DE
PATERNIDAD Y CASOS PENALES DURANTE 1998 Y 1999.
Seccin a) PRUEBAS DE P.C.R. EN LA UNIDAD DE A.D.N. SECCIN DE BIOQUMICA
DEL DEPARTAMENTO DE LABORATORIO DE CIENCIAS FORENSES DEL ORGANISMO DE
INVESTIGACIN JUDICIAL DURANTE EL AO DE 1999.
Hace apenas unos ocho meses, la Dra. Marta Espinoza, concluy su maestra en Biologa Molecular
con nfasis en A.D.N. en la Universidad de Costa Rica. Se reintegr al Poder Judicial asumiendo la jefatura
de la Unidad de A.D.N. Apenas en Enero de este ao, se comenz a llevar un registro completo de las pruebas
de P.C.R. en razn de que con antelacin, se hacan pruebas de antgenos tradicionales en combinacin con el
P.C.R. en algunos casos. Con la llegada de la Doctora Espinoza, se logr una mayor uniformidad en las
pruebas de P.C.R. y un eficiente manejo estadstico. Esa es la razn por la que no se pudo obtener una
estadstica confiable de pruebas de P.C.R. efectuadas durante 1998. As informaremos de las pruebas citadas,
efectuadas y salidas (resueltas) de P.C.R. de enero a abril de 1999.
La Doctora Espinoza nos manifest que en pruebas de P.C.R. para paternidad se dan unas 75 citas
mensuales, y a mayo de 1999, hay unos casos de filiacin que esperan el otorgamiento de una cita.
Recientemente la Unidad de A.D.N. le solicit al Consejo Superior del Poder Judicial, quince millones de
colones para compra de reactivos y una plaza para secretaria, que estara dedicada exclusivamente a esta
unidad, con el propsito de podar brindar hasta 128 citas mensuales.
A continuacin expondremos grficamente el nmero de pruebas P.C.R. de Paternidad de enero a abril de
1999. Indicaremos las citas conferidas, el ingreso completo de muestras y los casos resueltos.
En enero de 1999, no hubo citas, 82 en febrero, 83 marzo y 59 en abril. De las citas conferidas solo se
presentaron y se obtuvieron muestras completas, 12 en enero, 12 en febrero, 25 en marzo y 21 en abril de
1999. De las muestras completas, salieron resueltas, 9 casos en enero, 30 en febrero, 51 en marzo y 51 en
abril de 1999.
De las pruebas de P.C.R. en casos penales, no se recibi ninguna muestra en Enero de 1999,
pero se resolvieron 10 casos, 8 de violacin/ violacin y homicidio; 2 de personas desaparecidas.
En febrero de 1999, ingresaron 2 casos de violacin y 2 de sustraccin de menor. Se resolvi 1 caso de
intento de homicidio/ homicidio.
En Marzo de 1999, se recibieron 5 casos de violacin/ violacin y homicidio. Se resolvieron 2 de
estupro; 6 de violacin y violacin y homicidio y 2 de homicidio/ intento de homicidio.
En abril de 1999, ingresaron 1 caso de incesto y 1 de homicidio/intento de homicidio. Fueron resueltos
3 casos de violacin/ violacin y homicidio ; y 2 de sustraccin de menor.
Grficamente, los casos ingresados por delitos y meses son:
hijo. La razn de este dficit obedece a la inasistencia principalmente del supuesto padre. En el 90% de las
pruebas practicadas de P.C.R. no se excluy al presunto padre, ello en razn de que- segn explic la Dra.
Silva- generalmente las madres saben quien es el padre de su hijo, aunque no necesariamente.
Grficamente esto se puede expresar as.
En materia penal, el Centro coadyuv en 3 casos nicamente durante 1998. Por ser de inters los
resumiremos: Cuando apareci el cuerpo de Ciro Monge, en el mismo sitio aparecieron otros restos seos. Un
joven presuntamente narcotraficante fue detenido en Gupiles para esas fechas, en una celda del OLJ. de esa
localidad se encontr una mancha de sangre que corresponda a esa persona, se obtuvo dicha conclusin a raz
de que se hizo el P.C.R. a los padres del muchacho y se compar con la muestra sangunea. Ello demostr que
esa persona al menos estuvo detenida en el sitio. Al comparar la sangre con los restos seos, se determin que
correspondan a la misma persona.
El segundo caso, se refiere al cuerpo de una mujer hallada sin vida en las cercanas de la Universidad
para la Paz en Ciudad Coln; la polica judicial sospechaba del esposo, y mediante el uso de una sustancia
llamada luminol que detecta las peroxidasas presentes en la sangre, es posible encontrar sta aunque se lave el
lugar donde se encuentra. El problema radica en que las peroxidasas tambin se encuentran en los jugos de las
frutas. En la alfombra de un microbus Volskwagen, propiedad del marido de la vctima, se encontr usando
luminol- peroxidasas. Las pruebas de P.C.R. no detectaron A.D.N. por lo que se enviaron las muestras a
Santiago de Compostela en Espaa, a fin de hacer pruebas en un prestigioso laboratorio, pero con A.D.N.
mitocondrial y los resultados fueron negativos. Por lo que las peroxidasas encontradas en el vehculo o no eran
de sangre o estaba excesivamente degradada como para permitir una prueba incriminante.
El ltimo caso tiene relacin con el taxista pirata que presuntamente mataba hombres jvenes
nicaraguenses y tiraba los cuerpos en el Parque Braulio Carrillo. La investigacin del A.D.N. en las muestras
de sangre enviada, no continu ya que el Ministerio Pblico decidi prescindir de esta prueba indiciaria,
aparentemente por la existencia de elementos probatorios de mayor contundencia.
CONCLUSIONES:
a).Es evidente que dentro del programa de las Universidades pblicas o privadas, a nivel de
Licenciatura en derecho no existe una ctedra integral de criminologa. Mucho menos es dable esperar que se
estudien las implicaciones del A.D.N. en la investigacin criminalstica. Esta situacin debe ser modificada.
b).El tema del A.D.N. en general, suscita enorme polmica en la sociedad, las implicaciones ticas
de este campo cientfico son enormes. Particularmente lo relativo al diseo a nivel industrial de hombres y
mujeres con caractersticas especficas.
c).El Proyecto Internacional del Genoma Humano permitir un mapeo gentico del ser humano, es
decir del conjunto de los cromosomas y genes distribuidos en zonas localizables del A.D.N. Cuando esta
empresa sea concluida, la ingeniera gentica experimentar un boom sin precedentes. Esto permitir la
prevencin de enfermedades y malformaciones, como el Sndrome de Down y la Enfermedad Maniaco-
Costa Rica.
Vicente Crdoba, Carlos. Biologa Celular y Molecular. H. Blume Ediciones , Madrid, Espaa, 1979.
Watson, James. Biologa Molecular del Gen. Fondo Educativo Interamericano. Mxico, 1983.
NOTAS:
(1) Annimo: Mendel y la Gentica: Los Chcharos del Monge. En Semanario Universidad. Suplemento Crisol, 6 de abril de 1990,
p.2.
(2) Avers, Charlotte. Biologa Celular. Grupo Editorial Iberoamrica. Mxico, 1983, 2 edicin, p.285.
(3) Nelson, Gideon. Conceptos Fundamentales de Biologa. Editorial Limusa, Mxico, 1980, p.23.
(4) Frankel, Edward. D.N.A.El Proceso de la Vida. Siglo XXI Ediciones, Mxico, 1984. 13edicin, pp.16-17.
(5) Frankel, Edward. Op. Cit. p. 42.
(6) Watson, James. Biologa Molecular del Gen. Fondo Educativo Interamericano. Mxico, 1983, pp. 53-54.
(7) Vicente Crdoba, Carlos. Biologa Celular y Molecular. H. Blume Ediciones, Madrid, Espaa, 1979, P. 175.
(8) Frankel, Edward. Op. Cit. p. 7.
(9) Rodrguez Gamboa, Tatiana. Reaccin en Cadena con Polimerasa (PCR). Escuela de Qumica, Universidad de Costa Rica. 1994,
p.9.
(10) Borras Povedano, Guiselle y otros. La Prueba de los Marcadores Genticos y su Aplicacin en Materia Criminal. Tesis para
optar por el grado de Licenciatura en Derecho, Facultad de Derecho, Universidad de Costa Rica, San Jos, Costa Rica, 1992, p.107.
(11) Junqueira, L.C. Biologa Celular. Ediciones Cientficas, La Prensa Mexicana S.A. Mxico, 1984, p.56.
(12) Sin embargo, segn entrevista que sostuvimos con la Doctora Marta Espinoza, encargada del Laboratorio de A.D.N. del O.I.J. ,
el da 22 de abril de 1999, en el Circuito Judicial de San Joaqun de Flores, en el caso de gemelos idnticos o monocigticos, los
marcadores de A.D.N. revelan que la secuencia es igual en ambos, lo que contrara la premisa enunciada en el texto.
(13) Borras Povedano, Guiselle y otros. Op. Cit. p. 113.
(14) Frankel, Edward. Op. Cit. pp. 58-59
(15) Maris Martnez, Stella. Manipulacin Gentica y Derecho Penal. Editorial Universidad, Buenos Aires, 1994, p.33.
(16) Maris Martnez, Stella. Op.Cit. p.33.
(17) Maris Martnez,Stella. Op.Cit. p.p.33 y 34.
(18) Borras Povedano, Guiselle y otros. Op Cit. pp. 116-117.
(19) Molina Maricell y Lutz Giselle. Laboratorio de Criminalstica, Tomo II, Pruebas de Marcadores Genticos. Universidad Estatal
a Distancia, 1995, pp. 59 y 60.
(20) Entrevista, Op.Cit.22 de abril de 1999.
(21) Marn Rojas, Rafael. La Huella Gentica (La Tecnologa del ADN). Revista de Medicina Legal, Diciembre de 1993 -Mayo de
1994, p.55.