Regulacin de las Uniones Estrechas en el Epitelio de la Va Respiratoria Superior

Abstracto
La barrera de la mucosa del tracto respiratorio superior incluyendo la cavidad nasal, que es el
primer sitio de la exposicin a antgenos inhalados, juega un papel importante en la defensa del
husped en trminos de la inmunidad innata y est regulado en gran parte por uniones
estrechas de clulas epiteliales. Molculas de unin estrecha se expresan tanto en las clulas M
y clulas dendrticas, as como clulas epiteliales de la va area superior. Varios antgenos son
probados, transportados y entregados a los linfocitos a travs de las clulas en la mucosa
nasal, mientras mantienen la integridad de la barrera. La expresin de molculas de unin
estrecha y la funcin de barrera en las clulas normales humanos nasales epiteliales (HNECs)
se ven afectados por diversos estmulos incluyendo el factor de crecimiento, ligando TLR, y
citoquinas. Adems, la linfopoyetina epitelial estromal tmica (TSLP), que es un interruptor
principal para las enfermedades inflamatorias alrgicas incluyendo rinitis alrgica, mejora la
funcin de barrera junto con un aumento de las molculas de unin estrecha en HNECs.
Adems, la infeccin por el virus respiratorio sincitial en HNECs in vitro induce la expresin de
molculas de unin estrecha y la funcin de barrera junto con la liberacin de citoquinas
proinflamatorias. Este documento resume los recientes avances en nuestra comprensin de la
regulacin de las uniones estrechas en el epitelio de las vas respiratorias superiores en
condiciones normales, alrgicas, e infectados por VRS.

1. Introduccin
El epitelio en el tracto respiratorio superior consiste en clulas epiteliales ciliadas cilndricas
pseudoestratificadas, incluyendo las clulas M (clulas membranosas o micropliegues), que son
especializadas para captacin de antgenos y forman una barrera continua contra una amplia variedad
de antgenos exgenos, y dendrticas clulas (DC), que ocupan antgenos transportados a travs de las
clulas M y antgenos presentes para clulas T CD4 +, mientras que mantienen la integridad de la
barrera epitelial de las vas respiratorias. El epitelio juega un papel crucial como una interfaz de
respuestas de adaptacin y las respuestas innatas a travs de las uniones estrechas para evitar la
invasin de agentes ambientales inhalados, como los alrgenos y patgenos. Adems, en la mucosa
nasal humana de la rinitis alrgica o la infeccin por virus, se han conocido cambios dinmicos de
uniones estrechas.
Figura 1
Esquema de los espacios intercelulares de sellado putativos por las molculas de unin estrecha en el
epitelio de la va area superior, incluyendo clulas epiteliales, clulas M y clulas dendrticas.

2. Uniones estrechas en el epitelio

El epitelio de la va area de la mucosa del tracto respiratorio superior humano acta como la primera
barrera fsica que protege contra las sustancias y agentes patgenos. El epitelio es una barrera
altamente regulada e impermeable formada exclusivamente por uniones estrechas.

Las uniones estrechas, el complejo localizado en el extremo ms apical de la unin intercelular, inhibe
el soluto y el flujo de agua a travs del espacio paracelular (llamada funcin "barrera").
Tambin separan el extremo apical de los dominios de la superficie celular basolateral para establecer
la polaridad celular (llamada funcin "valla"). Las ltimas investigaciones sugieren que las uniones
estrechas tambin participan en mecanismos de transduccin de seales que regulan la proliferacin
de clulas epiteliales, la expresin gnica, la diferenciacin y la morfognesis.
Las uniones estrechas se forman no slo las protenas de membrana claudinas, ocludinas, y JAMs,
tambin muchas protenas de membrana perifricas integrales, incluyendo las PDZ, protena de la
Zonula Ocludens (ZO) -1, ZO-2, ZO-3, multi-PDZ molculas de protena-1 dominio (MUPP1), y
asociada a la membrana guanilato quinasa con orientacin invertida-1 (MAGI) -1, MAGI-2, MAGI-3, y
molculas celulares polares ASIP / PAR-3, PAR-6, PALS-1 y PALS-1 asociados unin estrecha (PATJ),
y las protenas no-PDZ, Cingulin, symplekin, ZONAB, GEF-H1, aPKC, PP2A, unin Rab3b, Rab13,
PTEN, y 7 H6. Zonula occludens-1 (ZO-1), ZO-2, y ZO-3 son miembros de la membrana asociada
guanilato quinasa (MAGUK), familia de protenas con una caracterstica multidominio estructural
formada por SH3, guanilato quinasa (GUK), y mltiple PDZ (PSD95-Dlg-ZO1) dominios. ZO-1 y ZO-2
tambin estn estrechamente relacionados con la polimerizacin de las claudinas. La primera clula
que se identifica en contactos tricelulares (donde hay tres clulas epiteliales) es la Tricelulina, donde
adems se muestra una barrera funcional. Despus, el receptor de lipoprotena de liplisis estimulada
(LSR) se encuentra como una protena de membrana asociada a la unin estrecha tricelular y utiliza
Tricelulina en las uniones estrechas tricelulares.
La familia de la claudina, que consta de al menos 27 miembros, es la nica responsable para la
formacin de hebras de unin estrecha, tiene cuatro dominios transmembrana y dos bucles
extracelulares. El primer bucle extracelular es el correceptor del virus de la hepatitis C e influye en la
selectividad de las cargas paracelulares, y el segundo bucle extracelular es el receptor de
la enterotoxina del Clostridium perfringens (CPE).
Adems, como la claudina-4 es tambin un receptor de alta afinidad de CPE, el CPE de longitud
completa con un efecto citotxico directo, y el dominio de unin a receptor C-terminal de CPE (C-CPE)
sin un efecto citotxico se emplean para el tratamiento selectivo y la administracin de frmacos contra
claudina-4 que expresan las clulas.
Ocludina, la primera protena de membrana integral descubierta de uniones estrechas, es expresada
ms ubicuamente en el extremo ms apical de las membranas basolaterales y es el marcador
inmunohistoqumico ms fiable para uniones estrechas.
La sobreexpresin de ocludina aumenta la funcin de barrera, indicada como un aumento de la
resistencia elctrica transepitelial (TER) aumento de las clulas epiteliales de mamferos. Sin embargo,
las hebras TJ se pueden formar sin ocludina en algunos tipos de clulas, incluyendo clulas madre
embrionarias deficientes de ocludina.
Adems, un modelo de ratn deficiente de ocludina no muestra una perturbacin de la funcin de
barrera del epitelio, aunque un complejo fenotipo fisiopatolgico se observa con retraso en el
crecimiento, la inflamacin crnica y la hiperplasia del epitelio gstrico, la calcificacin en el cerebro,

atrofia testicular, prdida de grnulos citoplasmticos en clulas de los conductos estriados de la

glndula salival, y adelgazamiento del hueso compacto.
JAMs (JAM-A, -B, -C, -4) son protenas de la superfamilia de inmunoglobulinas expresadas en uniones
de las clulas epiteliales y clulas endoteliales, as como en las superficies de los leucocitos, plaquetas
y eritrocitos. Ellos son importantes para una variedad de procesos celulares, incluyendo el montaje de
la unin estrecha, la transmigracin de leucocitos, la activacin de las plaquetas, la angiognesis y la
unin adenovirus. La evidencia actual indica que la dimerizacin de JAM-A es necesaria para la
regulacin funcional de la barrera.

3. Expresin y localizacin de las molculas Tight Junction y su funcin en el

epitelio de las vas respiratorias superiores in vivo e in vitro
Se investig la expresin y localizacin de molculas de unin estrecha y su funcin en el epitelio de
las vas respiratorias superiores in vivo e in vitro.
Figura 2
Imagen SEM (a), la inmunotincin (b) para ocludina, imagen claudina-1 y Tricelulina, y congelar-fractura
(c) en la mucosa nasal humana in vivo.Microscopa electrnica de barrido (SEM) de la imagen (d), de
contraste de fase (e), la inmunotincin (f) para ocludina, claudina-1 y Tricelulina,...
Figura 3
RT-PCR (a) para mRNAs de molculas de unin estrecha en mucosa nasal humana in vivo y dos tipos
de clulas epiteliales nasales humanas in vitro (primaria y hTERT-HNECs). M, 100-bp escalera
marcador de ADN; Oc, ocludina; CL, claudina. SEM imagen (b) y la inmunotincin para...
En la mucosa nasal humana in vivo donde se observ muchos cilios en la superficie, mRNAs de
ocludina, JAM-A, ZO-1, ZO-2, claudina-1, -4, -7, -8, -12, -13 , -14, y Tricelulina. Ocludina, JAM-A, y ZO1 fueron encontrados en la capa ms alta.
Se observ Claudina-1 en las capas superiores y basales del epitelio. Se observaron Claudina-4 -7 en
a travs del epitelio. En las rplicas de criofractura, lneas continuas de filamentos de unin estrecha
formaron redes bien desarrolladas en las membranas subapicales.
Se sabe que la proliferacin y el almacenamiento de las clulas epiteliales en los cultivos primarios son
muy limitadas. Introdujimos el componente cataltico de la telomerasa, el gen hTERT, en cultivos de
clulas epiteliales nasales humanas primarios. La expresin ectpica de hTERT en las clulas
epiteliales dio como resultado un mayor potencial de crecimiento y una vida til ms larga de las
clulas. Las clulas tenan una pequea apariencia de adoquines en las imgenes de contraste de
fase.
Las estructuras ciliadas, un marcador diferencial de las clulas epiteliales nasales, se observaron en la
superficie de las clulas transfectadas con hTERT (Figura 1). Las propiedades del pasaje para las
clulas hTERT-transfectadas fueron similares a los de las clulas en cultivos primarios.
Investigamos uniones estrechas de hTERT-HNECs en comparacin con las clulas de cultivo
primario. Tanto en hTERT-HNECs y clulas cultivadas primarias , mRNAs de claudina-1, -2, -4, -5, -6,

-7, -8, -9, y -12, ocludina, y JAM-A fueron detectaron. Se observaron Claudina-1, -4, ocludina y JAM-A
en clulas fronterizas. Las lneas continuas de filamentos de unin estrecha formaron redes bien
desarrolladas en las membranas subapicales.
En HNECs in vitro utilizando cultivos primarios y nuestros sistemas de cultivo establecidos, molculas
de unin estrecha y la funcin de barrera se sobreregula por diversos estmulos (Tabla 1). Las clulas
nasales humanas hTERT-transfectadas epiteliales (hTERT-HNECs) se pueden utilizar como un modelo
indispensable y estable para el estudio de la regulacin de uniones estrechas en el epitelio nasal
humano.
Tabla 1
Los cambios de las protenas de unin estrecha y funcin de barrera en HNECs in vitro.

4. Uniones estrechas de clulas M en el epitelio de las vas respiratorias

superiores
Clulas M (clulas membranosas o micropliegues) se conocen como clulas epiteliales especializadas
del epitelio del folculo-asociado (FAE), y su rol parece ser la rpida captacin de antgenos y
microorganismos particulares a las clulas inmunes del folculo linfoide para inducir una efectiva
respuesta inmune. La estructura y peculiaridades funcionales de las clulas M se observan en las
diferentes especies y en diferentes sitios del tejido linfoide a lo largo del tracto digestivo y
respiratorio. Las clulas M respiratorias actan como un tejido linfoide asociado a la nasofaringe en el
tracto respiratorio superior. Adems, claudina-1, -3, y ZO-1 son detectadas en las clulas M del epitelio
folculo-asociado intestinal del ratn (FAE).
El epitelio de las adenoides, incluyendo las clulas M, que estn especializadas en la captacin de
antgenos, forma una barrera continua contra una amplia variedad de antgenos exgenos.
Se han propuesto varios marcadores como histoqumica de lectinas y la inmunorreactividad a la
vimentina, citoqueratinas, y anexina-V para identificar las clulas M en el ratn, rata, hmster, conejo,
cerdo y.
En la amgdala nasofarngea del caballo, GS-1 lectina B4 (Griffonia simplicifolia 1 isolectina B4) se ha
utilizado como un marcador para las clulas M. Se inform que cytokeratin20 (CK20) podra servir
como un marcador de clulas M de conejo amgdalas palatinas. En los seres humanos, la clusterina se
expresa en las clulas M y clulas dendrticas foliculares en los sitios inductivos de tejido linfoide
asociado a la mucosa humana. Beta-tubulina de clase II es un marcador histoqumico especfico para
las clulas de las amgdalas M humanos y clulas dendrticas foliculares. Sin embargo, an no se han
establecido marcadores universales para clulas M humanos.
Se identificaron clulas parecidas a la M utilizando un anticuerpo anti-CK20 en los tejidos adenoidal
humanos in vivo e in vitro y se investig la expresin de las uniones estrechas (Figura 3). En el epitelio
adenoidal humano in vivo, algunas clulas-M parecidas, caracterizados por microvellosidades
irregulares, se observaron en la superficie. Algunas clulas CK20 positivas se observaron al azar en el
epitelio y aparecieron como estructuras en forma de bolsillo. En ambas clulas CK20-positivas y
negativas del epitelio adenoidal in vivo, se observaron ocludina, ZO-1, claudina-1, y -7. En los cultivos

primarios, las clulas CK20 positivas tomaron las micropartculas fluorescentes in vitro. En ambas
clulas CK20-positivos y negativos de los cultivos primarios in vitro, fueron observados claramente en
los bordes de celda ocludina, ZO-1, claudina-1, y -7. Estos resultados indican que las clulas M en las
adenoides podra tomar antgenos manteniendo una barrera continua.

5. Uniones estrechas de clulas dendrticas en el epitelio de las vas respiratorias

superiores
Esta funcin requiere controladores de dominio, las clulas presentadoras de antgeno profesionales
que actan como centinelas perifricas especializadas en la captacin, procesamiento y presentacin
de material antignico.
Rescigno et al. Descubri un nuevo mecanismo para la captacin de patgenos en la mucosa por el
cual los DCs abren las uniones estrechas entre las clulas epiteliales y envan dendritas fuera del
epitelio directamente el patgeno. DCs expresan protenas de unin estrecha tales como ocludina,
claudina-1, y ZO-1 para preservar la integridad de la barrera epitelial.
La poblacin DC epitelial expresa altos niveles de la clula de Langerhans (LC) marcador de langerina
y las protenas de uniones estrechas claudina-1, -7, y ZO-2. Se detecta claudina-1 en CD207 + CL que
residan en la epidermis, pero no en otros DCs de la piel. En humanos, THP-1 monocitos, mRNAs de
ocludina, Tricelulina, JAM-A, ZO-1, ZO-2, y claudina -4, -7, -8 y -9 pueden ser detectadas. En DCs
maduras que tienen dendritas alargadas por el tratamiento con IL-4, GM-CSF, TNF-, e ionomicina,
ARNm y la protena de JAM-A se aument significativamente en comparacin con los
monocitos. Hemos informado anteriormente de que en el ratn XS52 DCs, claudina-1, -3, -4, -6, -7, -8,
y ocludina, se detectan y se induce la claudina-7 a travs de una ruta de NF- B por linfopoyetina
estromal tmica ( TSLP) y ligandos de Toll-like receptor 2 (TLR2), TLR4, o TLR7 / 8.
En la mucosa nasal humana de la rinitis alrgica, HLA-DR, y CD11c positivo DCs expresan la protena
de unin apretada claudina-1 y penetran ms all del extremo apical de la unin estrecha para
minimizar el aumento de la permeabilidad de la barrera epitelial (Figura 3).

6. TLR3 ligando reducido uniones estrechas en el epitelio de las vas respiratorias

superiores
TLRs son un componente del sistema inmune innato. Permiten al anfitrin reconocer un gran nmero
de patrones moleculares asociados a patgenos tales como los de lipopolisacridos bacterianos (LPS),
ARN viral, que contiene CpG de ADN, y la flagelina, entre otros.
TLRs tambin se expresan en el epitelio de las vas respiratorias superiores y pueden desempear un
papel vital en los resultados inmunolgicos en estos tejidos, que producen citocinas proinflamatorias y
quimiocinas sobre ligadura.
En el epitelio nasal humano in vivo e in vitro, los mRNAs para todos los 10 TLRs humanos conocidos
son detectados in vivo e in vitro. TLR3 reconoce un virus de doble cadena (dsRNA) y su cido

poliinosnico policitidlico anlogo sinttico (poli (I: C)) y estimula la respuesta inmune innata. En
cultivos primarios de clulas epiteliales humanas adenoideales que expresa mRNAs de TLR1, 2, 3, 4,
6, 7, y 10, la estimulacin por el TLR3 ligando poli (I: C), induce la produccin de no slo TNF y IL-8
sino que tambin reduce la expresin de JAM-A. Los cambios fueron regulados a travs de distintas
vas de transduccin de seales.
El control de las vas de sealizacin mediadas por TLR3 en el epitelio nasal humano puede ser
importante no slo en la infeccin viral por dsRNA sino tambin en las enfermedades autoinmunes
causadas por dsRNA endgeno liberado de las clulas necrticas.

7. TSLP inducida uniones estrechas en el epitelio de las vas respiratorias

superiores
El factor derivado epitelial de TSLP es parecida a una citocina IL-7 que induce potentemente la
desregulacin de las respuestas Th2, una caracterstica distintiva de enfermedades inflamatorias
alrgicas tales como asma, dermatitis atpica, y rinitis alrgica. TSLP estimulado CD11c + DCs induce
a las clulas T CD4 + a diferenciarse en clulas Th2 que producen IL-4, IL-5, IL-13, y TNF-.
Encontramos una alta expresin de TSLP en el epitelio de los pacientes con rinitis alrgica con el
reclutamiento y la infiltracin de CD11c + DCs.
In vitro, TSLP se produjo significativamente en HNECs mediante tratamiento con un ligando Pam 3 de
TLR2 (Lys) 4 y una mezcla de IL-1 y TNF-. El tratamiento con TSLP potenciar rpidamente la
funcin de barrera de HNECs cultivadas junto con un aumento de las protenas de unin estrecha
claudina-1, -4, -7, y ocludina.
La TSLP epitelial derivado nasal no slo activa DCs, tambin conserva la barrera epitelial a travs de la
sobre regulacin de las protenas de unin estrecha para regular la sensibilizacin de antgeno durante
la etapa temprana de la rinitis alrgica.

8. Los efectos de linfocitos en barrera de uniones estrechas de las vas

respiratorias superiores
La rinosinusitis crnica (CRS) se caracteriza por la inflamacin de la mucosa que involucra tanto la
cavidad nasal y senos paranasales. Los pacientes con rinosinusitis crnica y plipos nasales tienen un
predominio de Th2 en la inflamacin.
El epitelio fugas est presente in vivo e in vitro en pacientes con baja regulacin de claudina-4 y
ocludina mRNA en las muestras de biopsia.
Adems, la funcin de barrera en las clulas epiteliales primarias humanas sinonasales se ve
disminuido por la citoquina IFN- Th1 y Th2 de citoquinas IL-4, mientras que Th17 citoquina no tiene
ningn efecto.

Por otro lado, los linfocitos B que son responsables de la produccin de IgE juegan un papel crucial
alrgico e inflamatorio en las vas respiratorias superiores e inferiores. Los plipos nasales han
incrementado el nmero de eosinfilos activados, mastocitos, e IgE. El endotelio plipo nasal a partir
de muestras de tejido humano ha reducido claudina-1 a lo largo del aspecto basal de la capa de la
mucosa, mientras que la ocludina se reduce en las zonas epiteliales apicales y basales. Sin embargo,
la relacin cercana entre las clulas B y la barrera de unin estrecha permanece todava desconocida.

9. RSV inducida uniones estrechas en el epitelio de las vas respiratorias

superiores
El epitelio de la va area, que tiene una barrera bien desarrollado regulado por uniones estrechas, es
la primera lnea de defensa durante la infeccin por virus respiratorio. Adems, tambin se sabe que
las uniones estrechas incluyen objetivos o receptores de virus tales como claudina-1 y ocludina como
correceptores de HCV, JAM como un receptor de retrovirus, y CAR como un coxsackievirus y
adenovirus receptor. En las clulas epiteliales nasales humanas, la infeccin por rinovirus disminuye la
expresin de molculas de unin estrecha ZO-1, ocludina y claudina-1 y la reduccin de la funcin de
barrera utilizando cultivos primarios.
Por otra parte, el virus sincitial respiratorio (RSV) es la principal causa de la bronquitis, el asma y la
enfermedad del tracto respiratorio inferior grave en lactantes y nios pequeos. Para investigar los
mecanismos detallados de la replicacin y la gemacin de RSV en clulas humanas epiteliales nasales
(HNECs) y las respuestas de las clulas epiteliales incluyendo uniones estrechas, se estableci un
modelo de RSV infectadas usando hTERT-transfectadas HNECs.
Cuando los HNECs fueron infectadas con RSV en MOI 1, la expresin de RSV / protenas G fue
detectada en la mayora de las clulas por inmunocitoqumica usando un anticuerpo especfico (Figura
4). Hemos encontrado que la expresin, la estructura y la funcin de barrera de molculas de unin
estrecha Claudina-4 y ocludina se indujeron marcadamente junto con la produccin de citocinas
proinflamatorias IL-8 y TNF en HNECs despus de la infeccin RSV, y la induccin de molculas de
unin estrecha posiblemente contribuy a brotacin de VRS (Figura 4). Sin embargo, la cada de
claudina-4 y ocludina por siRNAs no afect a la replicacin de RSV. La replicacin y la brotacin de
VRS y las respuestas de las clulas epiteliales en HNECs fueron regulados a travs de un PKC / HIF1 / NF- B va. El control de esta va en HNECs puede ser til no slo para la prevencin de la
replicacin y la gemacin de RSV, sino tambin en la terapia para la patognesis respiratoria inducida
por VRS.
Figura 4
(A) contraste de fase, la inmunotincin para RSV / G-protena y claudina-4, y la imagen de criofractura
en las clulas epiteliales nasales humanas in vitro (hTERT-HNECs) 24 h despus de la infeccin por el
VRS. Las barras de escala: barras blancas = 20 m, barras negras...

10. Efectos de la C-CPE va Claudina en el epitelio de las vas respiratorias

superiores

Medio fragmento terminal COOH de CPE (C-CPE) es una molcula no txica que interrumpe la funcin
de barrera de unin estrecha y mejora la absorcin celular. Ms recientemente, mediante la ocultacin
de cegadores de claudina de una muestra de C-CPE mutante usando baculovirus brotado de claudina,
un mutante C-CPE llamado M19, que une a claudina-1, -2, -4, y -5, est hecho. En nuestro estudio
reciente, cuando HNECs fueron tratados con m19 de C-CPE, la funcin de barrera se redujo
notablemente a la concentracin txica de C-CPE y se recuper sin C-CPE.

11. Conclusiones
La barrera de la unin estrecha epitelial del epitelio de la va area superior, incluyendo las clulas M y
DCS, se mantiene de forma estable a travs de la regulacin de las molculas de unin estrecha
expresadas en las clulas epiteliales, clulas M, y DCS. Varios antgenos se muestran, transportados y
entregados a los linfocitos a travs de las clulas mientras se mantiene la integridad de la barrera
(Figura 1).
Claudina-4 se conoce como un gen especfico de las clulas de roedores M y la alta capacidad
transcittica de las clulas M es un objetivo atractivo para vacunas y terapias.
Adems, C-CPE que es una pequea molcula no txica que interrumpe apretado funcin de barrera
de unin se puede utilizar como vehculo para otras sustancias a claudina-positivo clulas especficos.
Estos pueden promover el desarrollo de una nueva estrategia para el sistema de administracin de
frmacos a travs de claudina dirigidos en el epitelio de la va area superior.
Uniones estrechas tricelular se forman en la convergencia de las uniones estrechas bicelular donde
tres clulas epiteliales se renen en epitelios polarizados, y Tricelulina fue el primer marcador de la
unin estrecha tricelular identificado en clulas epiteliales. En varios DCs, incluidas las clulas
humanas THP-1, clulas XS52 de ratn, y CL epidrmicas, tambin se detecta Tricelulina. La unin
estrecha tricelular puede ser un buen punto de penetracin para los DCs en el epitelio. Ms
recientemente, se ha informado que Shigella apunta uniones tricelulares incluyendo Tricelulina para
difundir entre las clulas a travs de una va no cannica dependiente de clatrina endoctica. Por lo
tanto, el estudio adicional de Tricelulina en las clulas epiteliales y DCS de epitelio de la va area
superior puede ser importante para prevenir la invasin de agentes ambientales tales como los
alrgenos inhalados y patgenos.
Tomados en conjunto, estos estudios de uniones estrechas en el epitelio de la va area superior, se
deben proporcionar nuevos conocimientos no slo en condiciones patolgicas, sino tambin en el
contexto de las nuevas vacunas y terapias contra enfermedades infecciosas e inflamatorias de la
mucosa en las vas respiratorias superiores.