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GUIA DE LABORATRIO DE MICROBIOLOGIA

Programa de Biologia
Martha Lily Ocampo
Maryeimy Varon Lopez
PRCTICA 3: MEDIOS DE CULTIVO Y TECNICAS DE SIEMBRA
Introduccin
Se puede decir que el impresionante trabajo de investigacin y estudio de las bacterias, realizado
principalmente por Pasteur y Koch, dio como resultado el nacimiento de la microbiologa. Fue en
1876 cuando Koch fue capaz de propagar una bacteria patgena (Bacillus anthracis) en cultivo
puro, en 1881 utilizando medio lquido, lo solidific con gelatina y desarroll los mtodos de rayado
y siembra en placa para aislamiento de bacterias. El siguiente paso lo dio Hesse, en 1891, al
utilizar como agente solidificante un producto denominado agar, extrado de las algas rojas, el cual
era muy superior a la gelatina, ya que era resistente a la digestin microbiana y a la licuefaccin,
posteriormente los medios fueron mejorando, aumentando su enriquecimiento con extractos de
carne e infusiones, de tal forma, que la composicin de los cultivos fuera similar a la fuente original.
Hoy en da el aislamiento en cultivo puro se mantiene, con una mejora constante en las tcnicas
de cultivo, aislamiento y crecimiento microbiano.
Medios de cultivo
El propsito de los medios de cultivo es favorecer el desarrollo de los microorganismos, adems de
ser la matriz donde se establecen las colonias con caractersticas morfolgicas y microscpicas
tpicas de cada especie, las cuales pueden variar de acuerdo a la composicin del medio.
Igualmente, los medios de cultivo se pueden utilizar para demostrar otras caractersticas
metablicas de los microorganismos, por ejemplo: produccin de cidos y gases en medios de
fermentacin de hidratos de carbono.
Clasificacin de medios de cultivo:
Se podran hacer varias clasificaciones de los medios de cultivo:
1. Segn su estado fsico: a. Slidos b. Semislidos c. Lquidos.
a. Slidos: presentan en su composicin un agente solidificante, el agar, en una proporcin
de 12 a 15 gramos por litro. Tambin contener gelatina o albmina.
b. Semislidos: presentan agar en su composicin, pero en una proporcin mucho menor
que en los medios de cultivo slidos. Por ejemplo, el medio de SIM, utilizado para
determinar la movilidad de los grmenes, estudiar la produccin de Indol, contiene su
composicin 2.5 gramos de agar por litro.
c. Lquidos: no contiene ninguna agente solidificante.
2. Segn su composicin: a. Empricos o naturales b. Sintticos c. Semisintticos
a) Empricos: en su composicin aparecen sustancias orgnicas.
b) Sintticos: en su composicin aparecen sustancias qumicas definidas.
c) Semisintticos: en su composicin aparecen molculas naturales hidrolizadas
3. Segn el uso a que se destinan: a. Medios enriquecidos, b. Medios diferenciales o de
aislamiento, c. Medios selectivos e inhibidores, d. Medios de transporte y mantenimiento, e.Medios
de uso general y f. Medios para filtracin de membrana.

a) Medios enriquecidos: suele ser medios con nutriente simple que presentan
enriquecedores, tales como la sangre de carnero, la sangre de Caballo, etc. son medios
destinados a desarrollar microorganismos muy exigentes.
b) Medios diferenciales o de aislamiento: contienen colorantes, azcares e indicadores,
concebidos para provocar una respuesta bioqumica conocida, generalmente el color.
c) Medios selectivos e inhibidores: adems de contar en su composicin con los mismos
productos que los medios diferenciales, presentan una serie de agentes que sirven para
inhibir la flora acompaante de la muestra a estudiar, y aislar, de sta forma el
microorganismo que se busca.
d) Medios de transporte y mantenimiento: se utilizan en la recogida, transporte y
conservacin de muestras microbiolgicas. Esencialmente, son medios no nutrientes,
semislidos muy reductores, que inhiben las reacciones enzimticas autodestructivas
dentro de las clulas y evitan los efectos letales de la oxidacin. Son medios que no deben
potenciar el crecimiento lujurioso.
e) Medios de uso general: son medios que soportan el crecimiento de una amplia variedad
de microorganismos fastidiosos, sin exigencias nutritivas especiales.
f) Medios para filtros de membrana: las tcnicas de filtracin de membrana se han
impuesto en microbiologa, por las ventajas que presentan. Son tcnicas que permiten el
examen de grandes volmenes de lquido con una poblacin muy baja de
microorganismos, la separacin de los microorganismos del medio de cultivo e incluso su
cambio de un medio de cultivo a otro sin interrumpir su ciclo de crecimiento.
Composicin de los medios
Los constituyentes ms utilizados en la composicin de los medios de cultivo son:
1. Agar: comercialmente se presenta en grnulos y en polvo. La concentracin en la que aparece
en los medios de cultivo depende del propsito para el que est destinado el medio.
2. Peptona: producto de composicin variable, obtenido mediante la hidrlisis cida o enzimtica
de protena animal o vegetal, a partir de materiales como por ejemplo: hgado,msculo, sangre,
leche, etc. la composicin depender del material utilizado y del mtodo de fabricacin.
3. Carne: el corazn del buey, el msculo y el hgado son utilizados frecuentemente, pero el
cerebro, el vaso y la placenta de ternera pueden ser utilizados tambin en la preparacin de
medios de cultivo.
4. Extracto de carne: contiene bases orgnicas solubles, productos de degradacin de las
protenas, vitaminas y minerales.
5. Extracto de levadura: se consigue a partir de levadura de pan o de cerveza y es una fuente rica
en aminocidos y vitaminas de complejo B.
6. Sangre: debe ser libre de agentes antimicrobianos, para no inhibir crecimientos. La sangre ms
utilizada es la de carnero y caballo aunque tambin se utilizan la sangre de conejo y la sangre
humana. La sangre se utiliza para las distintas hemlisis de estreptococos y estafilococos. Debe
comprobarse siempre la esterilidad, as como la ausencia de citratos, pues stos podran inhibir a
los estafilococos.
7. Plasma: se utiliza para demostrar la actividad coagulasa. Normalmente, se utiliza plasma
humano y de conejo.
8. Suero: se prepara a partir de la sangre recolectada sin adicin de anticoagulante, eliminando el
lquido que se separa cuando se contrae el cogulo.
9. Bilis: contiene varios cidos biliares como compuestos conjugados con aminocidos. Tambin
contiene pigmentos, como bilirrubina y biliverdina.
10. Sales biliares: son extradas de la bilis, inhiben el crecimiento de organismos gran positivos y
bacilos en forma de esporas, sin afectar al desarrollo de los bacilos entricos Gram negativos.
11. Gelatina: protena obtenida mediante extraccin de material colgeno a partir de tejidos
animales. Para los medios de cultivo se utiliza una gelatina de calidad farmacutica.

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12. Carbohidratos: llamados colectivamente azcares, se utiliza normalmente para enriquecer


medios, para promover el crecimiento o la pigmentacin y para determinar si los organismos
pueden producir cido y gas a partir de ellos.
13. Indicadores: se incorpora en algunos medios de cultivo para dar prueba visual del pH y otros
cambios producidos durante el crecimiento de la bacteria. Los indicadores para este propsito
deben ser no txicos a la concentracin usada. Los indicadores del potencial REDOX tiene un uso
limitado en medios de cultivo, por ejemplo: el azul de metileno o resazurina en medio tioglicolato.
Tcnicas de siembra
Sembrar o inocular es introducir artificialmente una porcin de muestra (inculo) en un medio
adecuado, con el fin de iniciar un cultivo microbiano, para su desarrollo y multiplicacin. Una vez
sembrado, el medio de cultivo se incuba a una temperatura adecuada para el crecimiento del
microorganismo objeto de estudio.El xito en el proceso de siembra depende de los cuidados
tenidos durante la actividad, donde se incluyen que todos los materiales estn adecuadamente
esterilizados y que toda manipulacin sea cuidadosa para evitar la contaminacin, e ser posible
utilizando un mechero o bien una cmara de Flujo laminar.
Existen diferentes tipos de siembra de acuerdo al medio utilizado y los requerimientos del
microorganismo a estudiar.
Siembra en medio slido dispuesto en caja de Petri (Ver figura 3)
Siembra por Agotamiento:
Se toma la caja de Petri en la palma de la mano izquierda ligeramente inclinada; con la mano
derecho se maneja el asa previamente esterilizada y con ella se recoge el material de cultivo o en
el caso de usar escobilln se inocula en una pequea rea de la caja (cuadrante 1); se quema el
asa o el escobilln ; se hace girar la caja en el cuadrante 2 se hacen estras en la misma forma
hasta la mitad de la superficie libre tocando una pequea parte del cuadrante 1, se quema
nuevamente el asa y se hace girar la caja, se continua en los cuadrantes 3 y 4 trazando estras
perpendiculares a las anteriormente practicadas, en el cuadrante 4 tener la precaucin NO de tocar
las estras del cuadrante 1.
Siembra por pelcula o masiva:
En una cepa inoculada en caldo y con buen crecimiento, se introduce un escobilln estril y se
difumina la muestra por toda la superficie del agar.
Siembra por difusin:
A partir de una muestra en medio liquido se toma una alcuota de 1 ml, la cual se coloca en una
caja de Petri estril y se le adiciona aproximadamente 15-18 ml de un medio liquido estril el cual
debe estar a una temperatura de 50C (licuado), se realizan movimientos circulares a la caja con el
fin de homogenizar la alcuota adicionada.
Siembra por difusin en superficie
Desde una muestra en medio liquido se toma una alcuota de 0.1 ml, se adicionaen la superficie
del medio de cultivo solidificado y usando un asa de jockey la muestra es completamente
homogenizada sobre la superficie del agar.
Siembra por estra simple y tcnica en cuadrantes
La muestra es colocada en un extremo de la caja de petri y se realiza el rayado en una sola
direccin, tambin puede haber variacin de este procedimiento y usar la tcnica de cuadrantes, la
cual consiste en dividir la caja de Petri en cuatro cuadrantes, inicialmente se toma el inoculo y se
inicia el rayado de la superficie del agar, en cuatro cuadrantes consecutivos (sin esterilizar el asa

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posteriormente o tomar nuevamente inculo). Posteriormente las cajas sembradas, se incuban a


temperatura adecuada para la bacteria.
Siembra por exposicin:
Se abre la caja con el agar en el sitio de inters, por un tiempo definido. Se tapa la caja y se lleva a
incubacin a la temperatura deseada, por 24-48 horas.
Siembra por puncin
Este tipo de siembra es comnmente utilizado para observar la morfologa de los hongos, una
porcin de la muestra a estudiar es colocada en el centro del medio de cultivo con la caja de Petri
invertida usando palillos o asas fngicas estriles.

Estra

Agotamiento

Masiva

Puncin

Figura 3. Tipos de siembra en medio solido dispuestas en cajas de Petri


Siembra en medio slido dispuesto en caja Tubo (Ver figura 4)
Para la siembra en tubo, este se debe mantener inclinado el tubo que contiene el cultivo que se va
a transferir de modo que se pueda introducir el asa con el inoculo (Ver figura 4)
Siembra Mixta: Se realiza sobre medios inclinados, haciendo un picadura hasta el fondo del tubo
con un asa recta y luego haciendo un siembra en estra sobre la superficie expuesta del agar,
deslizando el asa por la superficie inclinada marcando las estras; de tal manera que, con el asa
cargada se realizan dos tipos de siembra y sin retirarla del tubo.
Siembra en estra: Se siembra el material en la superficie de el agar inclinado en un tubo de
ensayo, all se extiende por toda la superficie con el asa bacteriolgica, previamente esterilizada y
cargada con el material a sembrar, haciendo estras no muy amplias, pero tampoco muy estrechas.
Se inicia por la parte ms profunda de la superficie inclinada y se termina la estra en la parte ms
cerca de la boca del tubo.
Siembra en picadura o puncin: Se utiliza un asa recta y en tubos con medios slidos y
semislidos generalmente sin inclinar. Se realiza introduciendo el asa argollada con el
microorganismo al medio de cultivo por el centro de la superficie y llegando con el extremo del asa
al fondo del tubo.
Siembra en medio Lquido: Se toma el tubo de ensayo con medio lquido, como el caldo simple. Se
toma el material a diluir y se siembra en el tubo con el uso del asa cargada con el material
bacteriolgico, se agita, con movimientos moderados.

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Estra
simple

Siembra
mixta
picadura y
Estra

Picadura
agar
Inclinado

Picadura
agar
Recto

Con asa
Bacteriolgica
en medio
lquido

Figura 4.Tipos de siembra en tubos


Objetivos:
Entender y aprender el procedimiento de preparacin de los medios de cultivo en el
laboratorio de microbiologa
Conocer la clasificacin de los diferentes medios de cultivo y los fundamentos de su
utilizacin para el crecimiento de microorganismos.
Conocer las diferentes tcnicas de siembra segn el medio y el objetivo propuesto
Metodologa
Preparacin de medios de cultivo
Despus de definir el medio que se desea preparar y realizar los clculos correspondientes, si este
es preparado a partir de sus componentes o de sus medios deshidratados (ver envase del medio e
instrucciones) se debe pesar en la balanza la cantidad requerida. Si es a partir de un medio
comercial, se debe colocar el polvo deshidratado en el interior de un erlenmeyer y verter all la
cantidad de agua correspondiente. A continuacin, debe ser mezclado y calentado hasta
homogenizarlo. Si el medio es para servir en placas de petri, se puede dejar en el Erlenmeyer
hasta el siguiente paso y si es para colocar en tubos, estos deben ser envasados con 5, 7.5, o 10
ml. Posteriormente si el medio requiere de esterilizacin, debe ser autoclavado a la temperatura y
tiempo que sea indicado por la casa comercial, habitualmente es 121C, 15 lb de presin durante
15 minutos, seguido este proceso el medio de cultivo debe ser vertido en las placas de petri (de 1520ml) teniendo todas las medidas de asepsia correspondientes.
En algunos casos los medios de cultivo requieren que sean adicionados otros componentes antes
de ser servidos, tal es el caso de los medios, Baird Parker, agar sangre o chocolate, agar OGY,
medio actinomicetos, Agar Mossel para Cereus, Agar selectivo para Campylobacter entre otros.
Los medios se pueden utilizar inmediatamente o se pueden conservar en refrigeracin(Los
periodos no deben ser mayores a 1 semana por el peligro de contaminacin).
Cuando el medio de cultivo no es de casa comercial se puede preparar en el laboratorio, por ejemplo:
Agar papa dextrosa agar, (PDA), a partir de un extracto o infusin de papa. Frmula para 1 litro.

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Pelar papas y pesar 200 g. Coloque a hervir por 15 minutos en 1 litro de agua. Cuando ste tibio
mida el volumen en el cilindro graduado y adicin de agua hasta completar 1 litro.Adicione glucosa al
1% y agar al 1 .5%, luego se debe mezclar bien hasta homogenizar. Hierva el medio.
Sirva 8 tubos de ensayo (6 ml cada uno) tpelos y colquelos en la canastilla o en recipiente plstico
(esterilizable). stos servirn para preparar los tubos con medio inclinado o en una cua, coloque el
tapn de gasa y algodn al resto del medio del Erlenmeyer y as esterilizar en autoclave durante 15
minutos a 121C.Una vez esterilizados a los medios saque los recipientes y deje enfriar hasta unos
45-50C (el calor del recipiente debe ser tolerable al tacto), posteriormente, sirva las cajas de Petri.
Se abren estas cerca del mechero a unos 10 cm de distancia y vierta el medio (el que con un
espesor menor de 2 mm, aprox. 12-15 ml).

Figura 5. Proceso de preparacin de medios de cultivo, semislido y lquido.


Tcnicas de siembra
La transferencia de las bacterias desde los productos patolgicos a un medio de cultivo se
denomina siembra; la transferencia de un cultivo a otro subcultivo o comnmente repique.Las
siembras se practican por medio de un escobilln, asa bacteriolgica recta o redonda, asa de jokey
o drigalsky.
Los cuidados generales que debe tener para realizar el procedimiento de siembra son:
1. Mantener el mechero entre los medios y usted creando de esta manera una barrera
2. No olvidar esterilizar el asa antes y despus de cada siembra.
2. Las siembras practicadas a partir de medios slidos deben hacerse tomando de una sola
colonia, empezando por los tubos con agar y continuar con el tubo en caldo.
3. La siembra puede ser realizada como fue descrito en la parte inicial del texto (Figura 3 y 4),
acorde con el tipo de medio de cultivo y la necesidad del proceso.
4. Marque por debajo de la caja de Petri (no en la etapa) o alrededor de la misma: Medio. Fecha.
Grupo, nmero de referencia o muestra.
5. Incube las cajas de Petri en posicin invertida por 24-48h 37C si son bacterias

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Ejercicios de metodologa relacionados con la prctica


1. Describa la metodologa general en un diagrama de flujo teniendo en cuenta las tcnicas de
siembra en los diferentes medios de cultivo slido, semislido y lquido desarrollados en el
laboratorio.
2. Complete la tabla abajo, registrando la cantidad que requiere para cada tipo de medio,
calculando la cantidad de agar para el volumen que desea preparar y determinando la cantidad de
cajas o tubos que pueden ser preparados con el volumen establecido, adems en las
observaciones debe incluir si este medio requiere alguna caracterstica especial en cuanto a
esterilizacin o aditivo.
Medio de cultivo Cantidad
Vol. A
gr
# Caja
# Tubo/
Observaciones
Agar/L
preparar
agar.
vol (15vol
(requiere autoclavar, es
(ml)
20ml)
(5ml)
necesario algn aditivo o
componente adicional)
Agar nutritivo
180
Agar TSI:

250

* Caldo bilis
verde brillante

300

Agar chocolate

500

Agar sangre

600

Agar citrato

300

Caldo triptona

800

3. Completar la siguiente tabla, describiendo el fundamento y la interpretacin del medio despus


de este ser inoculado, puede ampliar la informacin con dibujos o fotografas.
Medio de cultivo Fundamento
Clasificacin
Interpretacin
1
Agar Nutritivo
2
Tripticasa Soya Agar
3
Agar SS
4
Caldo Triptona
5
Agar Baird Parker
6
Agar OGY
7
Caldo BHI
8
Caldo Bilis Verde Brillante
(Brila)
9
Agar EMB
10 Agar SPS
11 Agar Cetrimide
12 Caldo Asparagina
13 Agar sangre
14 Agar Saboraud
15 Agar Mueller Hinton
16 Agar Mac Conckey
17 Agar Chocolate

15

18
19
20
21
22

Agar PDA
Agar SIM
LIA (Lisina-Hierro-Agar)
ENDO
UREA

Resultados
En la siguiente tabla encontrara la morfologa de las colonias bacterianas obtenidas en medio
solido sembradas en tubo y caja, el posible crecimiento en medio semislido y en medio lquido,
informacin necesaria para completar los resultados referentes a la prctica de medios de cultivo y
tipos de siembra. Para mostrar los resultados de esta prctica elabore un cuadro resumen similar
al propuesto en la figura 2 (prctica 2), donde incluya: medio de cultivo utilizado, tipo de siembra,
morfologa de las colonias observadas y tipo de crecimiento segn sea el caso, guindose por la
figura 6.

Figura 6: Tipo de crecimiento y morfologa de las colonias en medios de cultivo en estado slido
dispuestas en caja de Petri y tubo de ensayo, semislidas y lquidas en tubos de ensayo.

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Discusin: relacione los medios de cultivo, la composicin y tipo de siembra con los
microorganismos inoculados.
Adicionalmente responda las siguientes preguntas:
1. Consulte la composicin de los medios de cultivo empleados y regstrelos en su informe.
2. Encontr Usted alguna relacin entre el medio de cultivo y algn tipo de microorganismos
predominante?
3. Indique las caractersticas y nombres empleados para la descripcin macroscpica de colonias
segn el tipo de microorganismos.
4. Proponga variaciones u otros tratamientos a este tipo de ensayos.

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