SHP-1 es un objetivo de regorafenib en el cncer colorrectal

Regorafenib es un inhibidor de mltiples protenas quinasas que ejerce actividades

antitumorales y antimetastticas en el cncer colorrectal metastsico (CRC). SH2 que
contiene el dominio fosfatasa 1 (SHP-1) se informa que tiene potencial de supresin de
tumores, ya que acta como un regulador negativo de la sealizacin de p-STAT3Tyr705. Sin
embargo, poco se sabe sobre el mecanismo respecto regorafenib afecta SHP-1 actividad
tirosina fosfatasa y conduce a la apoptosis y la supresin tumoral en el CCR. Aqu,
encontramos que regorafenib desencadena la muerte celular apopttica y mejorado
significativamente SHP-1 actividad, que se redujo drsticamente la forma fosforilada de
STAT3 en Tyr705 (p-STAT3Tyr705). Es importante destacar que, regorafenib aumentada SHP1 actividad por la ruptura directa de la asociacin entre la N-SH2 y el dominio cataltico de
PTP SHP-1. La delecin del dominio N-SH2 (dN1) o mutacin puntual (D61A) de SHP-1
bloqueaba el efecto de SHP-1 inducida por la actividad regorafenib-, inhibicin del
crecimiento y una disminucin de la expresin de p-STAT3Tyr705, lo que sugiere que
regorafenib desencadena un cambio conformacional en SHP-1 mediante el alivio de su
autoinhibition. En ensayo in vivo mostr que el crecimiento de xenoinjerto de regorafenib
inhibi significativamente la disminucin de la expresin y p-STAT3Tyr705 pero indujo mayor
SHP-1 actividad. Colectivamente, regorafenib es una novela SHP-1 agonista ejerce efectos
antitumorales superiores mediante la mejora de SHP-1 actividad que se dirige directamente
a p-STAT3Tyr705. Pequea molcula de mejora de la SHP-1 actividad puede ser un enfoque
teraputico prometedor para el tratamiento CRC.

INTRODUCCIN
El cncer colorrectal (CCR) es un tumor maligno que lleva todo el mundo. En general, la incidencia de CCR es mayor en
los pases econmicamente desarrollados que en los pases en desarrollo [1]. Etapa temprana CRC generalmente se trata con
ciruga, con frecuencia en combinacin con la quimioterapia adyuvante. Regorafenib es un nuevo inhibidor oral de multicinasa
ambas quinasas de receptores de tirosina-intracelulares y unidas a la membrana (RTK), que participan en las vas de sealizacin
relacionadas con la angiognesis tumoral, la oncognesis, microambiente tumoral y el crecimiento tumoral / proliferacin [2, 3].
En estudios preclnicos, regorafenib exhibi actividad antitumoral en varios xenoinjertos de tumor [2]. Recientemente,
regorafenib demostr beneficios generales de supervivencia en pacientes con CCR metastsico y, posteriormente, se convirti en
el primer frmaco teraputico aprobado para la enfermedad [3]. Regorafenib se ha informado que no slo ejercer efectos
antitumorales mediante la inhibicin de la proliferacin celular y la supresin marcadamente el crecimiento de xenoinjerto, sino
tambin mostrar actividades antiangiognicas y antimetastsicas en el CCR [4].
Regorafenib (fluoro-sorafenib) es estructuralmente muy similar a sorafenib, pero regorafenib contiene un tomo de flor
en lugar de un tomo de hidrgeno en el anillo aromtico central. Sorafenib es tambin un inhibidor del crecimiento multiquinasa y es la primera terapia oral aprobado por la FDA para el carcinoma hepatocelular (HCC) [5]. Recientemente, se ha
demostrado que sorafenib y sus derivados mejorar directamente la actividad de Src regin de homologa 2 (SH2) que contiene el
dominio fosfatasa-1 (SHP-1) y que disminuye especficamente la forma fosforilada de STAT3 en Tyr705 (p-STAT3 Tyr705) Y,
finalmente, conduce a la apoptosis y el cncer tumorogenicidad suprimida [6, 7]. SHP-1 se identific por primera vez en las
clulas hematopoyticas y se expresa predominantemente en clulas hematopoyticas y epiteliales [8-10]. SHP-1 pertenece a una
familia de no receptores protena tirosina fosfatasas (PTP), que participa en los procesos de sealizacin hematopoyticas y
tambin ha sido reportado para funcionar como un supresor de tumor durante la progresin tumoral [11-14]. SHP-1 contiene dos
dominios SH2, un dominio cataltico de PTP y un C-terminal de la cola [11]. En particular, su actividad fosfatasa es altamente
dependiente de su variabilidad estructural. Por ejemplo, la estructura qumica de forma cerrada de SHP-1 es montado por el
dominio N-SH2 y sobresale en el dominio cataltico para bloquear directamente la entrada en el sitio activo, y se cree que el
dominio C-SH2 altamente mvil para actuar como una antena para buscar el activador de fosfopptidos [15-19]. Otros informes
tambin indican que el dominio cataltico de PTP se activa debido a la flexibilidad del bucle WPD, que contiene el residuo del
sitio activo, Asp421 [11, 15, 16, 20].
Nuestro trabajo reciente ha demostrado de manera mecnica que SHP-1 actividad sorafenib-mejorado es debido a la
posibilidad de acoplamiento de sorafenib, que interrumpe directamente la asociacin entre la N-SH2 y el dominio PTP cataltica
de SHP-1 y alivia ms de SHP-1 autoinhibition [6, 7]. Es importante destacar que, nuestros estudios anteriores han demostrado
claramente que SHP-1 es un regulador negativo de p-STAT3 Tyr705 [6, 21-24] que est altamente expresado en las clulas
cancerosas y es crucial para el crecimiento, la supervivencia y metstasis de las clulas cancerosas durante la progresin del
cncer. Por lo tanto, aclaremos si el regorafenib analgico sorafenib (fluoro-sorafenib) acta como un potenciador directo de
SHP-1 por lo que mejor SHP-1 actividad downregulates directamente p-STAT3 Tyr705 y, finalmente, contribuye a la apoptosis en
el CCR. La comprensin del mecanismo de la va de supresin tumoral activada por regorafenib puede proporcionar una nueva
estrategia teraputica a travs del cual abolir la sealizacin oncognica STAT3. Este estudio es objetivo de obtener una mayor

comprensin de los mecanismos moleculares mediante los cuales regorafenib induce apoptosis in vitro, as suprime la
tumorigenicidad in vivo. Hasta donde sabemos, este es el primer estudio que informa de que regorafenib es una novela SHP- 1
agonista que perjudica directamente la interaccin entre el dominio N-SH2 y el dominio cataltico de PTP SHP-1, y adems
alivia la autoinhibition de SHP-1 . Nuestro estudio revela el nuevo mecanismo molecular mediante el cual regorafenib
desencadena una va supresora SHP-1 tumor para ejercer efectos anti-tumorales superiores mediante la promocin de SHPactividad de la fosfatasa de la tirosina 1 que se dirige a la expresin oncognica de p-STAT3 Tyr 705 directamente.

RESULTADOS
Regorafenib mostr una inhibicin de crecimiento superior y la apoptosis inducida significativamente en
lneas celulares de cncer de colon
En primer lugar, se investig el efecto biolgico de regorafenib en la inhibicin del crecimiento en un panel de lneas celulares
de CRC 4 humano (HCT-15, DLD1, HT-29 y HCT-116). Dos das despus del tratamiento con regorafenib a dosis de ms de 5
M, la viabilidad celular se redujo drsticamente (Figura 1A) y la apoptosis se indujo significativamente (Figura 1B) en estas
lneas celulares de CRC. Adems, 24 horas despus las clulas fueron tratadas con regorafenib, marcada muerte celular
apopttica y aument la actividad especfica de la caspasa-3 se produjo de una manera dependiente de la dosis (Figura 1C). Estos
hallazgos sugieren que regorafenib ejerce un efecto anti-cncer mediante la induccin de la muerte celular apopttica en clulas
de CRC.

Expresin downregulated de p-STAT3Tyr705 se asoci con la apoptosis efecto de regorafenib

La forma fosforilada de STAT3 en Tyr705 (P-STAT3Tyr705) Ha sido informado de que se expresa
constitutivamente en CRC y estar involucrado en la regulacin de proliferacin [25]. Por lo tanto, el
prximo examin si p-STAT3Tyr705 la expresin est implicado en la apoptosis inducida por regorafenib.
El tratamiento de clulas con CRC regorafenib durante 24 horas disminuy gradualmente la expresin
de p-STAT3Tyr705 y su supervivencia relacionada se dirige aguas abajo de ciclina D1 y Mcl-1 de una
manera dependiente de la dosis (Figura 2A). Tambin se encontr que las clulas HCT-15 y DLD1
tratados con regorafenib en 5M suprimidas gradualmente la expresin activa de p-STAT3 Tyr705 pero
aument notablemente los indicadores de apoptosis de las expresiones de PARP escindida y exfoliados
caspasa-9 de una manera dependiente del tiempo (Figura 2B). En particular, la sobreexpresin de
STAT3 obviamente restaurado p-STAT3Tyr705 expresin y inhibe la apoptosis inducida por el tratamiento
con regorafenib durante 24 horas (Figura 2C), lo que sugiere que la apoptosis activada por regorafenib
est mediada por la inactivacin STAT3.
Figura 1: Regorafenib disminuy drsticamente la viabilidad celular y la apoptosis
inducida significativamente en lneas celulares de cncer de colon. (A) ensayo de MTT se realiz
para medir la viabilidad celular en las lneas celulares de cncer de colon 2 das despus del tratamiento con
regorafenib de una manera dependiente de la dosis. Se utiliz el anlisis (B) Sub-G1 para detectar la apoptosis en
las clulas 2 das despus del tratamiento con regorafenib de una manera dependiente de la dosis. (C) 24 horas
despus de las clulas fueron tratadas con regorafenib, la muerte celular apopttica y la caspasa-3 actividad
fueron inducidos de manera significativa en una forma dependiente de la dosis. Columnas, significan; bares, SD. *
P <0,05, ** P <0,01, *** p <0,001.

Figura 2: Efectos de regorafenib Sensibilizar se asociaron con p-STAT3 (Tyr 705) regulacin a la baja. (A) Western Blot de
p-STAT3Tyr705 y sus marcadores de supervivencia relacionados ciclina D1 y MCL-1 en las clulas 24 horas despus del tratamiento con
regorafenib. -actina se utiliz como control de carga. (B) p-STAT3 Tyr705, STAT3, los fragmentos escindidos de PARP y los fragmentos
escindidos de caspasa-9 se midieron por el Western Blot en los tiempos indicados despus de las clulas HCT-15 y DLD1 fueron tratados con
regorafenib a 5 mM. -actina se utiliz como control de carga. Los fragmentos escindidos de PARP y los fragmentos escindidos de caspasa-9
se indican mediante flechas. (C) La sobreexpresin de STAT3 rescat inducida por el tratamiento con regorafenib a 5 mM durante 24 horas
apoptosis. Columnas, significan; bares, SD. * P <0,05.

Regorafenib aument SHP-1 actividad directamente

Amplia evidencia ha demostrado que la actividad de la fosfatasa de la tirosina de SHP-1 regula a la baja de manera
significativa p-STAT3Tyr705 expresin e induce la apoptosis en diferentes tipos de cncer [6, 21-25]. Por lo tanto, se evalu si SHP1 actividad es crucial para la desfosforilacin de STAT3 en Tyr 705 inducida por regorafenib. Hemos encontrado que regorafenib
aument significativamente SHP-1 actividad de la fosfatasa de la tirosina en las clulas DLD1 (Figura 3A) y HCT-116. Adems,
SHP-1 regorafenib actividad mejorada se observ en SHP-1-que contiene extracto de IP en 5 M (Figura 3B). En particular,
hemos verificado an ms regorafenib aumentamos SHP-1 actividad por incubacin con SHP-1 purificada de protenas libre de
clulas (Figura 3C). Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que regorafenib es una novela SHP-1 agonista que aumenta
SHP-1 actividad en el CCR. Con el fin de saber si la inhibicin del crecimiento inducida regorafenib-se depende de SHP-1, que
por lo tanto, utilizamos-1 inhibidor SHP-fosfatasa especfica (PTPIII) para inhibir la SHP-1 actividad y encontramos que la

inhibicin del crecimiento inducida regorafenib-en lneas celulares CRC fueron rescatado significativamente por el tratamiento
con SHP-1 inhibidor (Figura 3D). Adems, mediada por siRNA SHP-1 agotamiento en lneas celulares de CRC tambin redujo
significativamente los efectos de regorafenib en la inhibicin del crecimiento y p-STAT3 Tyr705 la expresin (Figura 3E). Estos
resultados sugieren que SHP-1 era crucial para la inhibicin del crecimiento inducida regorafenib-en las clulas de CRC.

Regorafenib mejorado SHP-1 actividad de la fosfatasa de la tirosina por alterar directamente la interaccin
entre los dominios catalticos N-SH2 y PTP de SHP-1
A continuacin, con el fin de comprender el mecanismo a travs del cual regorafenib SHP-1 regula la actividad tirosina
fosfatasa, proporcionamos un fundamento molecular para el modelo de acoplamiento que Regorafenib muelles en la interfaz de
N-SH2 y el dominio PTP que es crucial para SHP-1 de activacin. El sitio de acoplamiento de molcula pequea (por
CDOCKER), que est marcado por un crculo rojo transparente, es de alrededor del dominio N-SH2 y residuos C-terminales.
Regorafenib forma un enlace de hidrgeno (mostrado en lneas de puntos verdes) con Gln527. La energa de interaccin
-CDOCKER (CDOCKER puntaje de acoplamiento) es 40,38. (Figura 4, izquierda). Por lo tanto, posteriormente transfectadas
clulas HCT-116 con los de tipo salvaje o mutantes SHP-1 y dN1 D61A, y adems se analiz SHP-1 actividad, as como la
susceptibilidad a STAT3 desfosforilacin en Tyr705. Nos centramos sobre todo en la inhibicin intramolecular (puente de sal)
entre Asp61 (D61) en el dominio N-SH2, y Lys362 contenida en el dominio cataltico de PTP SHP-1 (Figura 4, derecha). Los
mutantes D61A imita la conformacin abierta de SHP-1 y dN1 es la supresin del dominio N-SH2 de SHP-1, y ambos sirven
como activadores constitutivos.
De hecho, dN1 y mutante D61A SHP-1-clulas que sobreexpresan mostraron la relativamente mayor
SHP-1 actividad (Figura 4B), pero muestran la viabilidad relativamente ms baja (Figura 4D) y una
disminucin de la expresin de p-STAT3, en comparacin con el tipo salvaje SHP- 1 expresadas-clulas
(Figura 4C, izquierda). Notablemente, regorafenib significativamente mayor SHP-1 en la actividad de
tipo salvaje clulas SHP-1 transfectadas, pero no en D61A o DN1 clulas mutantes transfectadas con
SHP-1 (Figura 4B), lo que sugiere que regorafenib aumenta SHP-1 actividad por la ruptura directa de la
asociacin entre el dominio N-SH2 y el dominio cataltico de PTP. Tambin observamos downregulated
drsticamente p-STAT3Tyr705 expresin y la inhibicin significativa del crecimiento en regorafenib
tratados de tipo salvaje clulas que expresan SHP-1, pero no significativa p-STAT3 Tyr705 expresin, ya
sea en D61A o clulas mutantes transfectadas DN1-SHP-1 despus del tratamiento con regorafenib
(Figura 4C, la derecha y D). En conjunto, estos resultados demuestran que regorafenib afecta a SHP-1
actividad por su potencial para atracar el dominio inhibidor N-SH2 y el dominio cataltico de PTP SHP1. Regorafenib, por lo tanto, parece ser una novela SHP-1 agonista que no slo directamente alivia la
autoinhibition de SHP-1, pero aumenta an ms especficamente susceptibilidad a STAT3
desfosforilacin en Tyr705 por SHP-1 regorafenib actividad mejorada.
Figura 3: mayor-Regorafenib SHP-1 actividad tirosina fosfatasa fue crucial para la
inhibicin del crecimiento inducida por regorafenib. (A) SHP-1 Se midi la actividad en las clulas 24
horas despus del tratamiento con o sin regorafenib. (B) Regorafenib aument la actividad SHP-1 en IP-SHP-1extracto de clulas que contiene. (C) Regorafenib aument directamente la actividad SHP-1 en protena
recombinante SHP-1 purificada. Inhibicin del crecimiento inducida Regorafenib-se dependa de SHP- 1 evaluado
mediante el uso de 20 nM de SHP-1-inhibidor de fosfatasa especfica (PTPIII) (D) y 25 nM de ARNsi empobrecido
especficamente SHP-1 (E). Columnas, significan; bares, SD. * P <0,05.

El efecto supresor de regorafenib en la formacin de tumores in vivo

Para investigar si regorafenib tiene un efecto teraputico sobre la tumorignesis in vivo, se inyectaron
por va subcutnea clulas HCT-116 (2 106) En el flanco posterior de ratones desnudos y despus los
tratados con o sin regorafenib a 10 mg / kg / da cuando los tumores se hicieron palpables y crecieron
rpidamente. El tamao del tumor de los tumores regorafenib- y tratados con vehculo se midieron los
das 0, 4, 7, 11, 14, 18, 21, 24 y 25 y se encontr que los tumores tratados con Regorafenib crecieron
lentamente en comparacin con los tumores tratados con vehculo ( Figura 5A). En el da 25 despus
del tratamiento con regorafenib, los tumores primarios se extirparon y se midieron. Los tumores
tratados con el vehculo fueron ms pesados que los tumores tratados con regorafenib (Figura 5B), lo
que sugiere que regorafenib tuvo un efecto supresor sobre la formacin de tumores. Notablemente,
los tumores tratados con Regorafenib mostraron una expresin relativamente menor de p-STAT3 Tyr705
(Figura 5C), pero una significativamente mayor SHP-1 actividad tirosina fosfatasa, en comparacin con
los tumores tratados con vehculo (Figura 5d), lo que sugiere que la supresin de tumorigenicidad por
regorafenib in vivo se debe a su mejora de SHP-1 actividad que directamente p dirigido STAT3 Tyr705
expresin. Tincin inmunohistoqumica de SHP-1 y p-STAT3Tyr705 en dos pacientes con CCR tambin
mostr que la clnica CRC paciente # 1 con una fuerte expresin positiva de p-STAT3 Tyr705 tenido dbil
expresin positiva de SHP-1. En contraste, los pacientes # 2 con una dbil expresin positiva de p-

STAT3Tyr705 tenido una fuerte expresin positiva de SHP-1 (Figura 5E). Sin embargo, si existe una
correlacin inversa entre SHP-1 y p-STAT3 Tyr705 en CRC necesitarn muestras para llevar a cabo los
experimentos en un mayor nmero de pacientes. Por lo tanto, se requiere un nuevo examen de la
funcin de SHP-1 en un gran nmero de tejidos de CRC. En conjunto, nuestros resultados establecen
una novela papel de regorafenib como un agonista de la actividad tirosina fosfatasa SHP-1 por la
ruptura directa de la asociacin entre la N-SH2 y el dominio cataltico de PTP SHP-1 y luego la
regulacin negativa de la expresin de p-STAT3Tyr705 y sus factores de supervivencia relacionadas, como
la ciclina D1 y MCL-1, por lo tanto, la induccin de apoptosis en desencadenantes CRC (Figura 6).
Figura 4: Regorafenib relevado potentemente la autoinhibition de SHP-1 y contribuy a la inhibicin del crecimiento. (A)
Izquierda: Siguiendo el modelo de acoplamiento de regorafenib en el sitio N-SH2 de SHP-1 (cdigo pdb: 3PS5). El dominio N-SH2 fue en oro,
el dominio C-SH2 estaba en la marina, el dominio PTP estaba en rosas fuertes, y los engarces entre ellos eran de color gris. El sitio de molcula
pequea de acoplamiento (por CDOCKER), que fue marcado por un crculo rojo transparente, era alrededor del dominio N-SH2 y residuos Cterminales. Regorafenib forma un enlace de hidrgeno (mostrado en lneas de puntos verdes) con Gln527. La energa de interaccin
-CDOCKER (CDOCKER puntuacin docking) fue 40.38. Derecha: Una representacin esquemtica de tipo salvaje y mutante SHP-1 (D61A,
un nico punto de mutacin, y dN1 con una delecin del dominio inhibidor N-terminal). (B) Dos das despus las clulas se trataron con
regorafenib a 5 M, SHP-1 actividad se increment en potentemente de tipo salvaje SHP-1-expresando pero no en dN1 o mutante D61A clulas
SHP-1-expresin. Columnas, significan; bares, SD. * P <0,05 (C). Izquierda: dN1 y D61A mutante SHP-1 con relativamente mayor SHP-1
mostraron actividad relativamente menor expresin de p-STAT3 Tyr705 en comparacin con el tipo salvaje SHP-1. Derecha: dN1 y D61A mutante
SHP-1 bloquearon los efectos de regorafenib en reducida p-STAT3 Tyr705 inhibicin de la expresin y el crecimiento. (D). Ensayo de MTT se
realiz para medir la viabilidad celular. Columnas, significan; bares, SD. * P <0,05

DISCUSIN
Regorafenib es un inhibidor multiquinasa novela que se ha convertido recientemente en el primer tratamiento aprobado
para CRC [2, 3]. Aqu, le hemos proporcionado una mayor comprensin de los mecanismos moleculares mediante los cuales
regorafenib induce la apoptosis en clulas de forma potente CRC in vitro y suprime la tumorigenicidad in vivo. Tambin
proporcionamos la primera evidencia que demuestra que regorafenib es una novela potenciador de la actividad fosfatasa SHP-1
tirosina, lo que disminuye drsticamente p-STAT3 Tyr705 expresin. Amplia evidencia sugiere que la SHP-1 funciona como un
supresor tumoral que se dirige directamente a la expresin oncognica de p-STAT3 Tyr705 que es crucial para la supervivencia del
tumor y la proliferacin celular [6, 21-24]. Nuestro estudio demostr por primera vez que Regorafenib activa una SHP-1 va de
supresin tumoral mediante la mejora directamente SHP-1 actividad, e indujo la apoptosis y la supresin tumoral en el CCR.
SHP-1 se expresa predominantemente en clulas hematopoyticas y epiteliales [8-10] y su actividad de la fosfatasa es altamente
dependiente de su variabilidad estructural, como se evidencia por su estructura qumica abierto y de forma cerrada [15-19]. La
estructura cristalina de-ligando libre SHP-1 participa en auto-inhibicin debido a la interaccin intramolecular entre su dominio
N-SH2 y el dominio cataltico de PTP. En particular, el residuo especfico, D61, forma un puente salino crtico que resulta en una
"cerrado" dominio cataltico de PTP. Nuestro estudio demostr que la SHP-1 actividad regorafenib mejorada se observ
significativamente en las clulas CRC y tambin fue visto en SHP-1 extracto de IP que contenga al 5 M. Purificado protenas
libre de clulas SHP-1 verificado an ms el aumento significativamente la actividad de SHP-1 directamente realzado por
regorafenib. Es importante destacar que tambin se observ la induccin significativa de SHP-1 la actividad mediante la
sobreexpresin de tipo salvaje SHP-1 en las clulas de CRC. Esta induccin no se observ en D61A y dN1 mutante SHP-1clulas que expresan CRC, lo que indica que SHP-1-regorafenib actividad mejorada es debido a su potencial de acoplamiento
entre el dominio N-SH2 inhibitoria y el dominio cataltico de la PTP SHP-1, que alivia directamente el autoinhibition de SHP-1.
Tambin observamos regorafenib downregulated dramticamente p-STAT3 Tyr705 expresin y supresin significativa del
crecimiento de tipo salvaje SHP-1-clulas que expresan CRC, pero no en D61A y dN1 mutante SHP-1-clulas que expresan
CRC, lo que sugiere que la mayor susceptibilidad a STAT3 desfosforilacin en Tyr705 se debe a regorafenib mejorada SHP
actividad -1.
En este estudio, hemos validado el papel de SHP-1 sobre el efecto in vitro de regorafenib utilizando SHP-1 fosfatasa y
desmontables su expresin, respectivamente. Ambos de los cuales redujo significativamente los efectos de regorafenib en la
inhibicin del crecimiento en clulas de CRC, lo que indica que SHP-1 no slo como un jugador crucial de la inhibicin del
crecimiento inducida regorafenib-, sino tambin como un objetivo directo de regorafenib por el cual aumenta SHP-1 tirosina
fosfatasa actividad downregulated p-STAT3Tyr705 directamente. Aunque hemos validado el papel de SHP-1 en la apoptosis o la
inhibicin del crecimiento regorafenib-desencaden in vitro, los datos suficientes de estudio en animales en vivo es an carecen.
Para generar los lentivirus que producen ARN especficos de horquilla corta (ARNhc) dirigidos a SHP-1, que ser un buen
enfoque para validar an ms el papel de SHP-1 sobre el efecto anti-tumor de regorafenib in vivo.
Para nuestro conocimiento, este es el primer estudio para revelar el papel de regorafenib como una novela SHP-1 agonista
en un modelo preclnico de CRC. Tambin descubrimos que la supresin SHP-1 tumor apoptosis mediada va y la actividad antitumoral se activan de manera significativa por regorafenib. Nuestros estudios sugieren que SHP-1 puede ser un biomarcador til
para predecir la eficacia del tratamiento en pacientes con CRC regorafenib.

MTODOS
Cultivo celular

Lneas celulares de cncer colorrectal (CRC) HCT-15, DLD1, HT-29 y HCT-116 se mantuvieron en medio RPMI 1640
suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS) y 100 unidades / ml de penicilina y estreptomicina (Invitrogen, Carlsbad,
CA, EE.UU.). Las clulas se incubaron a continuacin a 37 C en un humidificado 5% de CO2atmsfera.

Reactivos, plsmido y kit de ensayo

Regorafenib fue proporcionado amablemente por Bayer HealthCare Pharmaceuticals. Para los estudios basados en clulas,
regorafenib a diversas concentraciones se disolvi en DMSO y despus se aadi a las clulas mantenidas en medio RPMI 1640
con o sin FBS. SHP-1 inhibidor (PTP III) se adquiri de Calbiochem. Smart-piscina siRNA, incluyendo el control (D-00181010), SHP-1 (PTPN6, L-009778-00-0005) fueron todos adquiridos de Dharmacon Inc. (Chicago, IL). Los plsmidos de tipo
salvaje humana STAT3 y SHP-1 (PTPN6) fueron codificadas por pCMV6 vector con etiqueta myc. Por tipo mutante SHP-1 de
expresin, hemos generado dos plsmidos, designado dN1 y D61A, que trunca el dominio N-SH2 / PTP y cambi cido
asprtico en 61 a un residuo de alanina, respectivamente. Ambos plsmidos fueron clonados en el vector pCMV6-Entry. Estos
plsmidos o siRNA fueron transfectadas posteriormente en las clulas mediante el uso de reactivo Lipofectamine 2000
(Invitrogene, CA). La muerte celular apopttica se determin utilizando la Deteccin de Muerte Celular ELISA PLUS kit (Roche
Ciencias Aplicadas, Alemania). La caspasa-3 actividad se midi utilizando el Kit de Ensayo de Caspasa 3 (Abcam, Cambrige,
MA). Tanto de los ensayos se llevaron a cabo de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Ensayo de proliferacin celular

Despus del tratamiento con regorafenib a las dosis indicadas durante 2 das, la proliferacin celular se midi utilizando un 3- (4,
5-dimetiltiazol-2-il) -2, bromuro de 5-difeniltetrazolio (MTT). Las clulas se contaron y se sembraron en placas de 96 pocillos, y
despus se incubaron a 37 C en un humidificado 5% de CO 2atmsfera. Veinte microlitros de reactivo MTT (5 mg / ml, Sigma,
St Louis, MO, EE.UU.) se aadi a cada pocillo en el final de la incubacin, a continuacin, 4 horas ms tarde el medio se
descart y 150 l de dimetilsulfxido (DMSO) se aadi a cada bien para disolver el cristal prpura. Entonces se midi la
absorbancia a 490 nm. Los experimentos se realizaron tres veces por duplicado.

Deteccin de la apoptosis por anlisis de sub-G1

Para el anlisis de la apoptosis, se recogieron tanto las clulas flotantes y unidas y se centrifugaron antes de ser lavada con
solucin salina tamponada con fosfato fra (PBS), y despus se fijaron en etanol al 70% fro durante la noche a -20 C. Tincin
con yoduro de propidio se realiz despus de la incubacin de las clulas con 50 g / ml de yoduro de propidio y 20 mg / ml
RNasa A en la oscuridad a temperatura ambiente durante 30 min, que despus se analizaron por citometra de flujo (BD
Biosciences, San Jose, CA, EE.UU.).

Western Blot
Lisados de clulas enteras se resolvieron por electroforesis en gel de poliacrilamida dodecil sulfato
sdico (SDS-PAGE). Las protenas se transfirieron a una membrana de difluoruro de polivinilideno
(Millipore, Billerica, MA, EE.UU.) y se incubaron con el anticuerpo primario, y despus se incubaron con
peroxidasa de rbano conjugada con anticuerpos secundarios. Las protenas especficas se detectaron
utilizando el reactivo aumento de quimioluminiscencia (ECL). Los anticuerpos primarios utilizados para
la transferencia de western, incluyendo ciclina D1 y PARP se adquirieron de Santa Cruz Biotechnology
(San Diego, CA); p-STAT3, STAT3, MCL-1 y caspasa-9 fueron adquiridos de Sealizacin Celular
(Danvers, MA); SHP- 1 y -actina fueron adquiridos de Abcam (Cambrige, MA).

Actividad de la fosfatasa SHP-1

Despus del tratamiento con regorafenib, extractos de protenas de clulas se incubaron con anti-SHP-1 anticuerpo en el
tampn de inmunoprecipitacin (Tris-HCl 20 (pH 7,5), NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, 1% NP-40, y 1% de desoxicolato de sodio)
durante la noche. Protena G-Sepharose 4 Fast flujo (GE Healthcare Bio-Science, NJ) se aadi a cada muestra, seguido de
incubacin durante 3 horas a 4 C con rotacin. Un RediPlate 96 EnzChekR Tirosina Fosfatasa Assay Kit (R-22067) fue
utilizado para SHP-1 ensayo de actividad (Molecular Probes, Invitrogen, CA).

El crecimiento del tumor de xenoinjerto

Se inyectaron por va subcutnea clulas HCT-116 (2 10 6) En el flanco posterior de ratones desnudos y despus los
tratados con o sin regorafenib a 10 mg / kg / da cuando los tumores se hicieron palpables y crecieron rpidamente. El tamao
del tumor de los tumores regorafenib- o tratados con vehculo se midi en los das 0, 4, 7, 11, 14, 18, 21, 24 y 25 En el da 25 los
pesos de los tumores se midieron despus de la escisin del tumor.

La inmunohistoqumica
Las muestras fijadas en 10% formalina tamponada fueron incluidos en parafina y se seccionaron a continuacin. El anlisis
inmunohistoqumico de las secciones de parafina se realiz utilizando el anticuerpo primario durante SHP-1 y p-STAT3; las

secciones se incubaron a continuacin con inmunoglobulina anti-ratn / conejo G-peroxidasa de rbano picante conjugado
anticuerpo secundario. La seal fue detectada mediante un kit (Aminoetil Carbazol Kit sustrato; Zymed Laboratories Inc., San
Francisco, CA, EE.UU.). Las secciones fueron contrastadas con hematoxilina.
Figura 5: Regorafenib tena un efecto supresor sobre la formacin de tumores in vivo. (A) tamaos de los tumores se midieron
en los tiempos indicados despus del tratamiento con o sin regorafenib a 10 mg / kg / da. Puntos, media (n = 10); bares, SE. * P <0,05, ** P
<0,01. Peso (B) del tumor se midi en el da 25 despus de la escisin del tumor. Columnas, significan; bares, SD. * P <0,05 (C) Los niveles de
p-STAT3Tyr705 y STAT3 se midieron por el Western Blot en el da 25 despus de la extirpacin de los tumores con vehculo y regorafenib
tratados. -actina se utiliz como control de carga. (D) SHP-1 se midi la actividad en los tumores con vehculo y regorafenib tratados en el da
25 despus de la extirpacin del tumor. Columnas, significan; bares, SD. * P <0,05. (E) SHP-1. y p-STAT3 Tyr705 tincin inmunohistoqumica en
dos muestras de CRC clnicos.

Figura 6: Una representacin de alivio del dominio N-SH2 inhibitorio de SHP-1 por
regorafenib y su contribucin a la apoptosis en el CCR. Regorafenib mejorado SHP-1 tirosina
fosfatasa actividad por su potencial para atracar al dominio inhibidor N-SH2 y el dominio cataltico de PTP SHP-1,
por lo tanto, contribuir a la ayuda directa de autoinhibition en SHP-1, pero ms especficamente el aumento de la
susceptibilidad a STAT3 desfosforilacin en Tyr705 regulacin negativa de este modo la activacin transcripcional
de genes de supervivencia, tales como la ciclina D1 y Mcl-1, en consecuencia, conduce a la aparicin de la
apoptosis en CRC.