Mtodos para la obtencin de animales transgnicos

El impacto que los animales transgnicos y genoprivos

o knockout han tenido en las biociencias es innegable, en particular
para el estudio de la funcin y la regulacin de los genes, y para la
simulacin de enfermedades humanas, con la consiguiente bsqueda
de
nuevas
teraputicas.
En la actualidad, su uso excede ampliamente el de la investigacin
biomdica y el fruto de las investigaciones que los tuvieron como
centro de atencin ya se reflejan en la produccin de protenas
recombinantes de alto valor biolgico en la leche de animales
transgnicos y en su uso como eventual fuente de rganos para
xenotrasplantes. A continuacin se comentar algunas de las tcnicas
ms comnmente utilizadas para la generacin de animales
transgnicos y animales genoprivos o Knock-out.
Microinyeccin
En este mtodo de obtencin de animales trangnicos se aplica a una
gran variedad de animales, esta metodologa de produccin se
induce la sobreovulacin de las hembras, los vulos son
fecundados in vitro, se inyecta el gen extrao en el ncleo del vulo y
posteriormente los mismos son introducidos nuevamente en el cuerpo
de las hembras, dando lugar finalmente a cras que contienen el
nuevo gen, esto es, cras transgnicas.
Hace ya 30 aos, Gordon y cols. Describieron una tcnica en la cual
un ADN (cido desoxirribonucleico) forneo se microinyectaba en el
proncleo de un ovocito de ratn recientemente fertilizado, que luego
era
transferido
a
una
hembra
receptora.
Bsicamente, primero se produce una construccin en donde el
gen de inters se coloca bajo el control de un promotor de quien
depender la cronoespecificidad y la histoespecificidad de la
expresin del gen. Si se desea, se puede evaluar esta expresin
temporoespacial del gen mediante el uso de "genes reporteros" bajo
el control del mismo promotor. Un gen reportero es aquel que al
expresarse, transforma al organismo que lo porta en fcilmente
identificable (por cambiar de color frente a un sustrato en el medio,
por
presentar
fluorescencia,
etc.).
Una vez obtenida esta construccin con el gen de inters (regin
codificante y regin reguladora), sta se microinyecta en el proncleo
de un ovocito fertilizado. El ADN extrao se insertar al azar, y
generalmente en varias copias, en el ADN del ovocito. Este ovocito

fertilizado, que ya lleva la nueva informacin gentica, se transfiere a

una hembra receptora.
Si efectivamente el embrin se halla en el estado de una clula, la
integracin temprana del transgn har que el ratn que nazca
exprese el gen de inters en todas sus clulas somticas y en la lnea
germinal, de modo que puede heredarse en la descendencia de estos
animales transgnicos.
Si la insercin del transgn se produce luego de la primera divisin
celular, se obtendrn animales fundadores que presentan dos o ms
poblaciones celulares cuyas composiciones genticas difieren y que
tambin pueden transmitir el transgn a su descendencia, pero a una
frecuencia menor. La mayor complicacin de esta tcnica de
generacin de animales transgnicos es la de no poder determinar el
sitio de insercin ni el nmero de copias del transgn, ya que se
producen al azar.
Algunos efectos posicionales pueden alterar la expresin del
transgn, pero, a su vez, la insercin de este gen forneo puede
afectar posicionalmente la expresin de algn gen endgeno, pues se
sabe que la posicin de un gen influye sobre su propia actividad y la
de los genes circundantes. Esta tcnica ha permitido crear no slo
ratones transgnicos, sino tambin conejos, ovejas, cerdos, cabras y
vacas transgnicas productoras de protenas de alto valor biolgico.

Electroporacin de cigoto

La electroporacin es una tcnica que se basa en la aplicacin de un

elevado voltaje a las clulas durante un periodo de tiempo muy corto.
Durante ese tiempo las clulas (en este caso los cigotos) despolarizan
sus membranas y se forman pequeos orificios por los que penetran
las molculas de ADN que se encuentran alrededor. La ventaja de
esta tcnica es que se aplica a varios cigotos a la vez y habitualmente
se obtienen eficiencias de entrada del ADN del 100%. Es una tcnica
que requiere su ajuste fino para cada tipo celular, a fin de determinar
las condiciones ptimas de duracin y potencia del pulso. Se busca
siempre el mejor equilibrio entre las condiciones que aseguran la
entrada en la clula y las que maximizan la viabilidad celular. La
eficiencia de la transfeccin por electroporacin esta mediada por una
serie de factores como la magnitud del campo elctrico aplicado, la
duracin del pulso elctrico, la temperatura, la concentracin, el tipo
de ADN y la composicin inica del medio (Fig. 1.6).

La electroporacin se ha usado para transferir ADN forneo a

espermatozoides bovinos para su uso en transgnesis mediante
inseminacin artificial. A partir de 1986, la electroporacin se ha
empleado como el mtodo de eleccin para la transfeccin de clulas
embrionarias totipotentes (embryonic stem cells ES) tanto en
experimentos de gene knock-out, como de reemplazamiento allico y
recombinacin de homlogos.
En trminos generales la mayor desventaja de la electroporacin es
su costo, ya que la mayora de los equipos comercialmente
disponibles (electroporadores) y los accesorios como cubetas y
adaptadores tienen un precio elevado (Fig. 1.7).

Fig 1.7

Fig 1.6

Biolstica

Es un mtodo de transferencia directa de genes en una clula, con el

objetivo de crear organismos transgnicos. Es el mtodo de

transferencia directa ms utilizado para transformar las clulas

vegetales. Consiste en propulsar los genes de inters dentro de
las clulas con la ayuda de un can de ADN, con lo cual se modifica
el ADN de las clulas.
Esta tcnica fue propuesta por Sanford en 1987, para introducir
material gentico en el genoma nuclear de plantas superiores. En los
ltimos aos se ha usado para transformar bacterias, protozoos,
hongos, algas, insectos y tejidos animales. La biobalstica, utiliza
microproyectiles a alta velocidad, para introducir cidos nucleicos y
otras molculas en clulas y tejidos.
Este proceso tambin se conoce con los nombres de bombardeo con
microproyectiles, gen gun (pistola gnica), aceleracin de
partculas, etc. Se utilizan micropartculas de 0,2 a 4 m de
dimetro, cubiertas con secuencias de cidos nucleicos, aceleradas a
velocidades superiores a los 1500 km/h. Estas partculas (de oro
tungsteno) penetran la pared y la membrana plasmtica, alojndose
aleatoriamente en los organoides celulares. Posteriormente, el ADN se
libera de las partculas y se integra en el genoma nuclear del
organismo receptor. Se han desarrollado varios mecanismos para
lograr la aceleracin de las micropartculas, entre los que se destaca
uno que funciona mediante la descarga de helio de alta presin.
En la Figura 3 se aprecia un esquema de una pistola gnica.

Segn las especies, el perodo que ha de transcurrir antes de obtener

una raza transgnica estable puede variar de algunos das a varios
meses. Este mtodo se utiliza tambin para efectuar la
transformacin
de
los
genomas

de orgnulos, cloroplastos o mitocondrias. La transformacin por

biolstica es una alternativa interesante a la transformacin de las
plantas por Agrobacterium tumefaciens, ya que no requiere
secuencias exgenas para permitir la integracin del fragmento de
ADN.

Pginas de referencia:
http://www.bioero.com/biotecnologia/como-se-obtienen-los-animalestransgenicos.htm
http://www.scielo.org.ar/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S032500752010000500010