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- Euroforum, Paris le 12 octobre 2004

Analyse des antioxydants naturels dans


les matires premires et les produits
mthodes globales (type spectrophotomtre)
contre les mthodes fines (type HPLC) :
pour quelles applications les choisir ?
progrs analytiques rcents
Tl. : 02 35 07 91 80
Fax : 02 35 07 91 90
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M. Yvon Gervaise
Directeur SGS Multilab
Expert franais auprs de lOCDE

A - Dosage des polyphnols totaux


B - Quantification des fractions actives de polyphnols
stratgie analytique
exemples concrets
retour dexprience

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A - Dosage des polyphnols totaux

1. Principe
2. Dveloppement de la mthode et optimisation de la mise
en uvre
3. Choix des conditions de mthodes optimises
extraction
raction avec le ractif
courbe de calibration

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A - Dosage des polyphnols totaux


Principe :
bas sur loxydo-rduction
ractif de Folin-Ciocalteu : acide de couleur jaune, constitu de
polyhtrocycles acides contenant du molybdne et tungstne
Raction :
oxydation des phnolates

rduction des polyhtrocycles

formation dun complexe molybdne-tungstne bleu mesur


au spectro-photomtre
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Mise en oeuvre de la mthode Folin Ciocalteu


Extraction par des alcools :
stratgie des extractions
Paramtre :
solvant (thanol, mthanol dilus dans leau)
temprature
temps
en fonction de la matrice :
chocolat, th vert, vigne rouge, complment alimentaire, graine de soja
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choix des conditions de mthodes optimises


extraction
raction avec le ractif
dosage spectrophotomtrique ( 765 nm)
courbe de calibration

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courbe d'talonnage

Absorbance

1,4
1,2

y = 0,0123x
R2 = 0,9978

1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0

20

40

60

80

100

120

concentration (ppm)

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Expression des rsultats :

Rsultats des essais raliss sur les diffrentes matrices 20C


Poids de la
prise dessai (g)

Absorbance

Concentration en
polyphnols
(mg/g)

Chocolat 1848 86%


1
2

1,03407
1,03804

0,112
0,107

18,2033
17,3242

Th vert
1
2

1,05605
1,04778

0,276
0,291

219,6229
233,3866

0,079
0,08

(mg/2comprims)
13,2773
13,4454

0,248
0,239

(mg/L GAE)
1042,0168
1004,2017

Glules Juvamine
1
2
Cocktail de fruits
rouges
1
2

2 comprims
2 comprims
Dilution 1/50
Dilution 1/50

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Les rsultats sont exprims en acide gallique (polyphnol)

Echantillons

B - Quantification de la fraction active des polyphnols

Progrs rcents en analyses :


3 exemples :
- en fonction de la matrice :
ths, extrait de raisin, chocolat, graine de soja

- en fonction polyphnols quantifis :

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Polyphnols

Acides phnoliques

Flavonodes

Drivs acide benzoque


Ex: acide gallique
Drivs acide cinnamique
Ex: acide cafique

Stilbnes

Lignanes

Saponines

Phytostrols/ Phytostanols

Resvratrol

Matairsinol

Glycosides
triterpniques

Campestrol
Stigmastrol

OH
HO

OH

CH3CO
OH

OH

CH2OAc

COOH

HO

OH

O
O

OH

OH

OMe

OH

HO

CH2OH HO
HO

OH
Matairsinol

HO

OH

CH2OH

OH

OH

OH
O

OH

COOH
Acide gallique

OH

OH
HO

OH

HO

Tanins
Polymres de
flavonodes

Saponine de soja

OH
Tanin condens

HO

OH

Campestrol

Trans- resveratrol

HO

Flavones

Flavonols

Isoflavones

Dihydroflavonols

Apignine
Chrysine
Lutoline

Kaempferol
Myrictine
Querctine

Gnistine
Daidzine
Gnistine
Daidzine

Dihydroquerctine

Naringnine
Hesprtine
Taxifoline

Flavanols

Cyanidine
Ponidine

Catchine
Epicatchine
OH

OH

HO

Flavanones Anthocyanidines

OH

HO

HO
OH

OH O
Chrysine

OH

OH

Gnistine

OH

OH

OH
HO

OH
OH

O
Querctine

OH
OH

Dihydroquerctine

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OH

OH

OH

OH

Naringnine

HO

HO

OH
Catchine

OH
OH
Cyanidine

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Exemple 1 de protocole dextraction et de


quantification des isoflavones (technique de Wang et Murphy)
chantillon
( labri de la lumire directe)

Peser m = 200 mg

Actonitrile 10 ml
+ HCI 0,1 M (2 ml)
+ H20 (5 ml)

Extraction durant 2 heures par agitation


Filtration

Quantification
des
isoflavones
grce la
gamme
dtalonnage

Injection en HPLC de 10
l
dtection 260 nm
Eluant : eau 0,1 %
dacide actique
Eluant : actonitrile
0,1 % dacide actique

Evaporation du filtrat
au rotavapor
Reprise du rsidu sec dans
10 ml mthane 80 %
Filtration sur membrane de
0,45 m

Les diffrentes formes de ces composs sont additionnes afin de dterminer la


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quantit totale en isoflavones dans lchantillon

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Isoflavones

daidzine

gnistine

daidzine
gnistine

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Exemple 2 : cas du th vert et du chocolat

EpiGalloCathchineGallate (EGCG) :
prpondrant dans le th vert
Catchine et picatchine :
prpondrant dans le chocolat

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Broyage de lchantillon

Dgraissage :

- prendre une prise dessai (5g)


- ajouter 50ml dther de ptrole
- mlanger pendant 30 mn et
centrifuger
- liminer le surnageant et scher
peser mg dchantillon
ajouter 2 / 3 de solution
dextraction

injecter dans lHPLC


filtrer sur Millex

laisser refroidir et
complter avec de
la solution
dextraction

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passer aux ultra-son


pendant 15 mn
passer les fioles au bain marie
60 C pdt 30 mn en agitant
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Catchines

Epicatchines

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Exemple 3 : les phytostrols


Structures

Dfinition : hydrocarbures
polycycliques se trouvant dans
la fraction lipidique des plantes
campesterol

HO

stigmastrol
HO

Sources :
huiles vgtales
noix
lgumineuses
lgumes

HO

sitostrol

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Extraction
purification sur CCM
drivation
dosage CPG / FID
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Progrs rcent des volutions de


techniques analytiques

suivant des mthodes sparatives :


- HPLC
- GC / MS / MS
diffrents types de dtection :
- barrettes de diode
- UV
- MS / MS
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Le dosage des polyphnols est un cas particulier

Des antioxydants naturels :


- les carotnodes (Btacarotne = provitamine A, lycopne)
- les tocophrols (vitamine E)
- la vitamine C

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Autres antioxydants naturels

Les tocophrols ou vitamine E


CH3
CH3

HO
CH3

CH3

CH3
CH3

CH3

CH3

Cest un antioxydant liposoluble que lon trouve, entre autres, ltat


naturel dans la sauge et le romarin, lhuile de germe de bl, dolive, de
tournesol, de carthame.
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Autres antioxydants naturels


Les carotnodes : btacarotne, lycopne, lutine (pigments)
CH3

CH3

CH3

CH3

H3C

carotne

CH3

CH3

CH3

CH3

CH3

CH3

CH3

CH3

CH3

H3C
CH3
CH3

lycopne
CH3

CH3

CH3

Ce sont des antioxydants liposolubles que lon retrouve dans des


lgumes comme les carottes, le brocoli, la tomate, la citrouille...
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Autres antioxydants naturels


Les anthocyanes :
pigments qui donnent une coloration rouge-violet bleu
principalement prsent dans les baies et les fruits rouges (cassis,
myrtilles, raisin noir)
Les tanins condenss :
ce sont des substances phnoliques ayant des proprits de
fixation aux protines
principalement prsents dans le vin et le th o les tanins condenss
sont essentiellement forms partir de monomres telle que la
catchine
Les oligo-lments tels que le zinc et le slnium
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Autres polyphnols
Les flavonodes reprsentent un groupe de polyphnols complexes
dont la structure comprend deux noyaux aromatiques et un
htrocycle oxygn
Les principales sources naturelles sont la fraise, le th noir et vert, les
pinards, le raisin noir...
Les 4 oxo-flavonodes sont :
les flavonols
les citroflavonodes
les isoflavones
Ce sont des pigments de couleur jaune variable, trs abondants
dans les lgumes feuilles, ou le soja pour les isoflavones
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Autres antioxydants : principales sources

Vitamine C

Agrume kiwi, fraise, papaye, melon, brocoli, chou de Bruxelles,


chou-fleur

Vitamine E

Germe de bl, noix, graines et huiles vgtales tires de ces


aliments, galement olive et tournesol

Btacarotne

Soja, baies et fruits rouges, th, vin

Slnium

Crales, viandes, volailles et poissons

Zinc

Foie, viandes, lgumineuses, produits laitiers, noix et graines

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Lycopne : mthode danalyse


Peser m = 20 g

chantillon
( labri de la lumire directe)

Saponification de
lchantillon pour
1 solution de potasse
thandique

Extraction du lycopne par lther de ptrole (3 fois)


Evaporation de lther de ptrole et reprise du
rsidu dans la phase mobile
(CH3CN / MeOH / THF 55 : 35 : 10)
Calcul de la teneur en lycopne
par comparaison dune gamme
talon injecte dans les mmes
conditions
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Injection en HPLC / visible (

= 473nm)

Traitement des donnes


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Lycopene

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Le dosage des polyphnols est un cas particulier

Lanalyse permet de dterminer des teneurs en polyphnols de


lordre de 0,1 %
Pour la quantification, ncessit dun talon de rfrence
Exemple :
OPC (Oligomre Procyanidolique), difficult dobtenir CRM
(Certified Reference Material)

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Vitamine E
Peser m = 20 mg

chantillon

Calcul de la
teneur en
Vitamine E par
comparaison
avec une
gamme talon
injecte dans
les mmes
conditions

Saponification de
lchantillon par 1
solution de potasse
thalonique

Extraction de la vitamine E par lther de ptrole


Evaporation de lther de
ptrole et reprise dans un
volume prcis dhxane
Traitement
des
donnes

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Injection en HPLC phase normale avec


dtection fluorimtrie, phase mobile :
trimthylpentane / isopropanol 99/1
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Des sources plus ou moins riches en polyphnols


Les polyphnols sont les antioxydants les plus abondants.
LHomme en ingre avec ses aliments environ 1g / jour.

Vin rouge (1 verre)


100 400 mg (Catchine et drivs)

Jus dorange (1 verre)


100 2 000 mg (Hesprtine, naringnine)

Tomate (100g frais)


85 130 mg
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Oignon (100g frais)


100 2 000 mg (Querctine)

Caf (1 tasse)
100 - 300mg

Th (1 tasse)
150 200 mg
(Gallate dpigallocatchine EGCG)
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Des sources plus ou moins riches en polyphnols


Les polyphnols sont les antioxydants les plus abondants.
LHomme en ingre avec ses aliments environ 1g / jour.

Baies (100 g frais)


50 - 1 200 mg
Pomme (frais)
30 - 300 mg (Acide chlorognique)
Lgumes secs (100g secs)
30 - 1 700 mg

Bire (1 verre) 20 - 30 mg
Source: L. Bravo [Nutr. Rev. 1998, 56: 317- 33]
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Vin blanc (1 verre)


20 30 mg ( Resvratrol)
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Conclusion
Possder un protocole dextraction adapt lantioxydant
recherch. Celui-ci doit tre soluble dans le solvant
dextraction (ex : Btacarotne soluble dans lther)
Prendre en compte les proprits de lantioxydant : la plupart
sont photosensibles, il faut donc travailler labri de la lumire
directe
Possder les solutions de rfrence adquates (talons)
Dterminer la dtection adquate (UV, visible, fluorimtrie)
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Conclusion

Polyphnols : teneurs et allgations


Riches en catchine, source de polyphnols, ils ne sont
pourtant pas encore autoriss ce jour

Lanalyse quantitative permet des progrs dans ce sens.

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Yvon GERVAISE
yvon.gervaise@sgs.com
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