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Dpartement fdral de l'conomie,

de la formation et de la recherche DEFR


Secrtariat d'Etat l'conomie SECO
Service d'accrditation suisse SAS

Guide pour la validation de mthodes


dessais microbiologiques et lvaluation de
leur incertitude de mesure dans les domaines
de la microbiologie alimentaire et de
lenvironnement
Document N 328.fw
Edition avril 2013, rv. 03

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SAS: Mthodes dessais microbiologiques et valuation incertitude de mesure dans la microbiologie alimentaire et lenvironnement

Prface
Le texte de cette directive a t rdig par un groupe dexperts de la Confdration, des laboratoires cantonaux et du secteur priv qui a travaill sous la direction du Service daccrditation suisse (SAS).
Il est bas sur les documents EA-04/10 (1), les normes EN ISO 16140 (2), ISO 7218 (3), AOAC International Committee Guidelines (4, 5) et dautres publications (6-31).

Groupe de travail :
A. BAUMGARTNER, Bundesamt fr Gesundheit, 3003 Bern
T. BISCHOFBERGER, UFAG Laboratorien AG, 6310 Sursee
B. BISSIG-CHOISAT, Bundesamt fr Veterinrwesen, 3003 Bern
M. DALLA TORRE, Agroscope Liebefeld-Posieux, 3003 Bern
H. EMCH, SAS, 3003 Bern
J.-L. GAFNER, Agroscope Liebefeld-Posieux, 1725 Posieux
Ph. HBNER, Kantonales Laboratorium Basel Stadt, 4012 Basel
R. MEYER, NESTEC SA., 1350 Orbe
Ch. MLLER, Kantonales Laboratorium, 5000 Aarau
P. SCHEFFELDT, SAS, 3003 Bern
U. SPAHR, Bundesamt fr Gesundheit, 3003 Bern
R. STEPHAN, Institut fr Lebensmittelsicherheit und -hygiene, 8057 Zrich
U. WSPI, COOP Zentrallabor, 4133 Pratteln

Rvision 03 par :
A. BAUMGARTNER, Bundesamt fr Gesundheit, 3003 Bern
J.-L. GAFNER, Agroscope Liebefeld-Posieux, 1725 Posieux
J. HUMMERJOHANN, Agroscope Liebefeld-Posieux, 3003 Bern
Ch. MLLER, Amt fr Verbraucherschutz, 5000 Aarau
B. PLASCHY, Schweizerische Akkreditierungsstelle, 3003 Bern
U. WSPI, Suisselab AG, 3052 Zollikofen

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TABLE DES MATIERES


1.
2.
2.1.
2.2.
2.3.
2.4.
2.5.
2.6.
2.6.1.
2.6.2.
2.6.3.
2.7.
2.8.
2.9.
2.10.
2.10.1.
2.10.2.
3.
3.1.
3.1.1.
3.1.2.
3.2.
3.3.
4.
5.

Introduction
4
Validation
4
Remarques prliminaires ................................................................................................................. 4
Critres de validation ....................................................................................................................... 5
Domaine dapplication ...................................................................................................................... 7
Spcificit / spcificit relative ......................................................................................................... 7
Sensibilit / sensibilit relative ......................................................................................................... 8
Exactitude / exactitude relative ........................................................................................................ 8
Dtermination laide dune deuxime mthode ............................................................................. 8
Dtermination laide de contamination artificielle (dopage) .......................................................... 8
Dtermination laide de matriel de rfrence .............................................................................. 9
Rptabilit ...................................................................................................................................... 9
Limite de dtection ......................................................................................................................... 10
Limite de dtermination .................................................................................................................. 10
Concordance statistique................................................................................................................. 10
Mthodes qualitatives .................................................................................................................... 10
Mthodes quantitatives .................................................................................................................. 11
Incertitude de mesure
12
Estimation de lincertitude de mesure de mthodes microbiologiques qualitatives ....................... 12
Taux de faux-positifs ...................................................................................................................... 12
Taux de faux-ngatifs..................................................................................................................... 12
Estimation de lincertitude de mesure de mthodes microbiologiques quantitatives..................... 13
Indication de lincertitude de mesure ............................................................................................. 13
Bibliographie
14
Key words
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1.

Introduction
Toute mesure obtenue exprimentalement comporte une incertitude qui fixe les limites de la validit de chaque mthode. La validation analyse et caractrise les mthodes dessai par rapport ces
limites de performance. En tenant compte des incertitudes, elle dmontre quune mthode dessai
est approprie pour remplir les conditions dune tche fixe.
Ce guide dcrit la marche suivre pour la validation et lvaluation de lincertitude de mesure des
mthodes microbiologiques.
En rgle gnrale, les analyses microbiologiques comportent les 7 tapes suivantes :
1. chantillonnage
2. transport, entreposage
partie pr-analytique
3. prparation de lchantillon (p. ex. choix de la fraction analyser,
homognisation, dilution)
4. pr-enrichissement et enrichissement (analyses qualitatives) dilutions
partie analytique
dcimales (analyses quantitatives)
5. isolation, dnombrement
6. confirmation
7. valuation
Le but de la partie pr-analytique est de prlever de manire reprsentative, de conserver et de
prparer le matriel analyser de telle manire que les teneurs microbiennes dterminer ne
soient pas fausses, et que la fraction analyse soit caractristique de lensemble du matriel
examiner. Les variations lies cette partie pr-analytique sont difficiles estimer quantitativement. Dans la majorit des cas, lincertitude lie lchantillonnage est importante.
Le prsent guide ne concerne que la partie analytique; pour ce qui est de la partie pr-analytique,
se rfrer la littrature [p. ex. chantillonnages spcifiques aux produits et quantit du matriel
analyser : Codex alimentarius (18), ICSMF (19), MSDA (20), et pour leau de bains publics (21,
22), SAS (34)]. Il dcrit la marche suivre pour la validation de mthodes dessais microbiologiques et de lvaluation de lincertitude de mesure pour un laboratoire unique (7).

2.

Validation
Selon la norme ISO/IEC 17025 (6), la validation est la confirmation par examen et apport de
preuves tangibles que les exigences particulires pour un usage spcifique prvu sont satisfaites.

2.1.

Remarques prliminaires
Le but de la validation dune mthode dessai est de dmontrer avec traabilit quelle permet de
raliser sa fonction spcifique prescrite.
Au premier plan dune mthode microbiologique se trouvent la spcificit et la sensibilit. En outre,
des indications concernant la robustesse par rapport aux influences externes, aux effets de matrice, de mme que linfluence des diffrents oprateurs (prcision intra laboratoire) sont ncessaires. La validation nest pas un processus unique et dfinitif. Le travail de validation dtaill ciaprs remplit les exigences de laccrditation pour une mthode danalyse microbiologique, mais
doit tre considr comme tant un minimum. Plus les consquences dun rsultat sont importantes, plus leffort pour en assurer la qualit doit tre important.

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Le choix des matrices et lampleur de la validation (nombre dchantillons, effort pour les critres
individuels de validation) sont dtermins par consquent par le but de lanalyse. Une validation
doit tenir compte des matrices analyser, de mme quune dclaration aussi prcise que possible
sur les objectifs souhaits (p. ex. le respect dune spcification). Si les objectifs de lanalyse sont
modifis (p. ex. autres matrices, nouvelles spcifications), la validation doit tre complte.
Lintroduction de mthodes existantes dj amplement valides au laboratoire peut, selon les cas,
tre ralise laide dune procdure de validation simplifie. Cela ncessite toutefois une exprience approprie du personnel du laboratoire. De mme, lorsque des modes opratoires normaliss (p. ex. ISO, EN, MSDA, DIN, AOAC) peuvent tre considrs comme valids, un laboratoire
doit dmontrer que la mthode est matrise en interne. Les trousses commerciales doivent comporter les documents de validation tablis par les fabricants (AFNOR, documentation interne de
lentreprise) (1).
Lampleur dune validation est aussi dtermine par la question de base que pose la mthode.
A.) Analyse qualitative (dcision oui/non)
Lors danalyses qualitatives (p. ex. dtection de micro-organismes pathognes), la question est de
savoir si un organisme est prsent dans une matrice donne ou non.
B.) Analyse quantitative (en lien avec une limite fixe)
Pour les mthodes destines vrifier les limites (limites lgales, spcifications), leffort de validation se concentre au voisinage de la limite en question. Leffort de validation le plus grand est ncessaire pour des mthodes couvrant la teneur dun micro-organisme sur un vaste domaine (par
exemple le monitoring microbien dans lenvironnement).

2.2.

Critres de validation
Lors de la validation de mthodes microbiologiques de dtection, il convient de distinguer les mthodes nouvelles, pour lesquelles il nexiste pas de mthodes normalises (mthodes standardises ou de rfrence), des mthodes alternatives, celles qui peuvent tre appliques la place
des mthodes de rfrence existantes (p. ex. tests rapides).
Les mthodes alternatives se valident en principe par comparaison de mthodes. Selon larticle 6
de lOrdonnance sur lhygine (11), dautres mthodes danalyse sont autorises pour autant
quelles soient valides selon des protocoles reconnus au niveau international et que leurs rsultats conduisent aux mmes jugements que ceux des mthodes de rfrence.

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Pour la comparaison des mthodes qualitatives, on procde le plus souvent selon le tableau 4
champs (29) (Figure 1).
Figure 1. Tableau 4 champs (29)
+

a+b

c+d

a+c

b+d

a+b+c+d = n

Mthode de rfrence

Mthode
valider

Interprtation du schma 4 champs


+:
- :
a:
b:
c:
d:
n:

dtection ou jugement positif


dtection ou jugement ngatif
nombre de rsultats positifs pour les deux mthodes
nombre de rsultats faux-ngatifs par rapport la mthode de rfrence
nombre de rsultats faux-positifs par rapport la mthode de rfrence
nombre de rsultats ngatifs pour les deux mthodes
nombre total de rsultats danalyse

Lors de la validation de mthodes, il faut distinguer entre les mthodes qualitatives et quantitatives.
En gnral, la validation complte dune mthode et lvaluation de son incertitude de mesure doit
comporter les paramtres suivants :
Tableau 1. Critres de validation et dincertitude de mesure
mthode qualitative
Paramtre de validation (chapitre)

mthode quantitative

alternative

nouvelle

alternative

nouvelle

Domaine dapplication (2.3)

Spcificit (2.4)

Sensibilit (2.5)

Exactitude (2.6)

Exactitude relative (2.6)

Rptabilit (2.7)

Limite de dtection (2.8)

Limite de dtermination (2.9)


Conformit statistique (2.10)

Taux de faux-positifs (3.1.1)

Taux de faux-ngatifs (3.1.2)

Incertitude de mesure (3.2)

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X
X

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Si certains paramtres ne sont pas traits lors de la validation, il faut le justifier par crit et sy conformer (p. ex. le domaine dapplication loign de la limite de dtection, renvoi des valeurs exprimentales obtenues lors de tests daptitude ou danalyses en chane).

2.3.

Domaine dapplication
Selon le domaine dapplication prvu, les examens doivent tre effectus sur une ou plusieurs catgories de produits ou de denres alimentaires (matrices). Si la mthode ne concerne la dtection
de microorganismes que dans un seul produit (p. ex. leau potable), on utilisera cette matrice pour
les examens. Sil sagit dune mthode horizontale, (p. ex. dtection dans toutes les denres alimentaires), les examens devront tre effectus au minimum dans 4 diffrents produits ou denres
alimentaires.
Pour une comparaison de mthodes, par produit ou denre alimentaire il faudra analyser plus de
20 chantillons diffrents contamins naturellement et plus de 20 chantillons diffrents non contamins, aussi bien avec la mthode alternative valider quavec la mthode de rfrence. Sil
nest pas possible de rassembler un nombre suffisant dchantillons contamins naturellement, il
est permis deffectuer une contamination artificielle. La marche suivre des contaminations artificielles doit tre dcrite avec exactitude.
Pour des mthodes nouvelles, il faudra analyser, par produit ou denre alimentaire, au moins 20
chantillons diffrents contamins avec des souches diffrentes du microorganisme cible et au
moins 20 chantillons contamins non pas avec le microorganisme cible, mais avec dautres microorganismes. La teneur doit se situer au moins au dcuple de la limite de dtection (mthodes
qualitatives), respectivement de la limite de dtermination (mthodes quantitatives). Les chantillons artificiellement contamins doivent recouvrir le spectre de la flore microbienne naturelle.
Les catgories de denres alimentaires sont indiques dans les annexes des directives AOAC (4,
5) et dans la norme ISO 16140 (2). Lors du choix des catgories spcifiques de denres alimentaires pour la validation dune mthode microbiologique, il faut tenir compte des connaissances de
la prvalence du microorganisme en question dans ces groupes spcifiques daliments, de mme
que de leur signification pour la sant humaine.

2.4.

Spcificit / spcificit relative


La spcificit dune mthode dcrit la mesure des influences sur la mthode par dautres microorganismes (micro-organismes non cibles) prsents dans un chantillon.
Pour une mthode qualitative, la spcificit se mesure par [d/(c+d)] 100 % et donne le pourcentage
de tous les chantillons ngatifs qui sont reconnus comme ngatifs (voir Figure 1).
Pour une mthode quantitative, la spcificit dsigne la facult de mesurer prcisment la teneur
en micro-organismes cibles dans lchantillon sans interfrence avec dautres micro-organismes ou
avec la matrice.
Cette spcificit dsigne la mme facult dune mthode valider, en comparaison avec la mthode de rfrence, de ne pas dtecter lorganisme cible lorsquil nest pas dtect par la mthode
de rfrence (spcificit relative).

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2.5.

Sensibilit / sensibilit relative


La sensibilit dsigne la facult dune mthode dtecter, dans une mme matrice, de faibles variations dans le nombre de micro-organismes prsents.
Pour une mthode qualitative, la sensibilit se calcule par [a/(a+b)] 100 % et donne le pourcentage
de tous les chantillons positifs qui sont reconnus comme positifs (voir Figure 1).
Pour une mthode quantitative, la sensibilit dsigne la variation minimale dans le nombre de micro-organismes qui produit une variation significative dans leur dnombrement.
Cette sensibilit dsigne la mme facult dune mthode valider, en comparaison avec la mthode de rfrence, de dtecter lorganisme cible lorsquil est aussi dtect par la mthode de rfrence (sensibilit relative).

2.6.

Exactitude / exactitude relative


Lexactitude est la mesure de lcart entre la valeur obtenue et la valeur vraie , et prend en
compte lerreur systmatique (anglais : trueness, cart de mesure : bias = lack of trueness). Dans
le cadre dune validation, lexactitude est le paramtre dincertitude dune mthode le plus difficile
dterminer. Les raisons de cette difficult reposent par exemple sur le manque de connaissances
au sujet de la capacit de multiplication (viabilit) et de la rpartition des micro-organismes dans la
matrice. Lexactitude nest en rgle gnrale pas dterminable exprimentalement pour les mthodes microbiologiques, on parle alors dexactitude relative. Pour cela, la mesure de lexactitude
est trs souvent tire de lcart la moyenne robuste dans les tests daptitude (proficiency tests)
ou les analyses en chane.

2.6.1.

Dtermination laide dune deuxime mthode


La dtermination de lexactitude relative peut sobtenir par lutilisation dune seconde mthode valide, si possible une mthode de rfrence. Lexactitude relative exprime le degr de concordance
des rsultats obtenus laide de la mthode valider et de la mthode de rfrence pour au moins
20 chantillons.
Pour des mthodes qualitatives, lexactitude relative est calcule par [(a+d)/n] 100 % et donne la
probabilit que les deux mthodes de comparaison donnent les mmes rsultats (voir Figure 1).
Pour des mthodes quantitatives alternatives, on calcule la moyenne de toutes les diffrences ( d )
entre les rsultats de la mthode de rfrence ( x R) et ceux de la mthode alternative ( x A) . Ce
rsultat ne doit pas tre significativement diffrent de zro.

2.6.2.

Dtermination laide de contamination artificielle (dopage)


En absence de matriel de rfrence certifi et sil nexiste pas de deuxime mthode, lexactitude
est dtermine laide de contaminations artificielles (dopage). On ajoute le micro-organisme dterminer au minimum 10 chantillons. Puis les teneurs des chantillons ventuellement naturellement contamins et ceux artificiellement contamins sont dtermines.
Pour les mthodes qualitatives nouvelles, lexactitude relative se calcule galement par la formule
[(a+d)/n] 100 % et donne la probabilit avec laquelle la nouvelle mthode valider dtermine la
contamination relle de lchantillon (voir Figure 1).
Pour des mthodes quantitatives alternatives, on calcule la moyenne de toutes les diffrences ( d )
entre les valeurs des chantillons rellement contamins et les rsultats de la nouvelle mthode
(voir Tabeau 3). Ce rsultat ne doit pas tre significativement diffrent de zro (voir 2.10.2).

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2.6.3.

Dtermination laide de matriel de rfrence


Lexactitude relative peut aussi tre calcule laide de matriel de rfrence certifi. En rgle gnrale, 6 10 dterminations suffisent. Lorsquil ny a pas de matriel de rfrence certifi disponible, mais quil existe un matriel bien dcrit (p. ex. chantillons dune analyse en chane ou dun
test daptitude), lexactitude peut tre dtermine partir de ce matriel (la plupart du temps, il ne
sagit pas de denre alimentaire).

2.7.

Rptabilit
La prcision dcrit les carts alatoires des valeurs autour dune moyenne. On distingue la prcision de rptabilit, de laboratoire et de reproductibilit.
Par prcision de rptabilit, on comprend la comparaison de rsultats provenant de mesures rptes du mme chantillon homognis (aprs Stomacher) dans les mmes conditions (mmes
personnes, laboratoires, quipements, ractifs, conditions denvironnement). La limite de rptabilit ( repeatability limit) est abrge r (petit r).
Pour estimer la rptabilit, on choisit pour chaque matrice un ou plusieurs chantillons contenant
une teneur en micro-organismes cibles proche de la limite de dtection (mthodes qualitatives),
respectivement proche de la limite de dtermination (mthodes quantitatives), que lon contamine
artificiellement et que lon analyse au moins 5 fois dans les mmes conditions.
x
Pour les mthodes qualitatives, on calcule r =

x = nombre de rsultats concordants dans des conditions de rptabilit


n = nombre de mesures
Pour les mthodes quantitatives, on calcule r = 2.8 sr ; sr est lcart type des rsultats obtenus dans
des conditions de rptabilit. Le facteur 2.8 se rfre 2 2 ; 2 tant issu de la distribution normale (avec un intervalle de confiance de 95 %) ; la racine de 2 repose sur le fait que r se base sur
la diffrence entre 2 sries de mesures (12).
Remarque 1:
Idalement, pour lcart type, la distribution de Poisson = n sapplique au nombre de colonies
comptes sur une bote de milieu de culture. En pratique toutefois, des carts-types allant jusquau
double sont acceptables (9). Des essais en laboratoire ont montr pour les mthodes microbiologiques quantitatives, quavec 50 % 70 %, la part la plus importante de la variance totale est constitue de la composante chantillon (mot cl : inhomognit de lchantillon). La variance lie
la mthode excute par du personnel entran ne reprsente que 4 % 10 %. Celle lie la variance invitable de lensemencement selon la distribution statistique de Poisson est de 25 % (13).
En gnral, la limite de rptabilit est plus petite que la limite de reproductibilit (R, reproducibility limit). En lieu et place de la dtermination exprimentale de la rptabilit, on peut, lors de la validation de mthodes microbiologiques quantitatives, utiliser lcart type de 0.5 log10 appliqu au
calcul du z-score lors de tests daptitude internationaux.
Remarque 2:
La limite de reproductibilit R (reproducibility limit) est obtenue partir dtudes de comparaisons
de mthodes. Lorsque de telles donnes sont disponibles partir danalyses en chane ou de tests
daptitude, elles doivent tre mentionnes dans les documents de validation. Comme cette reproductibilit ne peut tre value que lorsque plusieurs laboratoires sont impliqus, elle ne fait donc
pas partie de ce guide.

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2.8.

Limite de dtection
La limite de dtection de mthodes qualitatives dcrit le plus petit nombre de microorganismes
cibles qui peut tre mis en vidence avec une assurance statistique donne. Pour lestimation de la
limite de dtection de mthodes qualitatives, il faut tester pour chaque matrice au minimum trois
concentrations de 4 souches diffrentes du microorganisme cible (teneur basse : de 1 10 UFC,
teneur moyenne : de 10 100 UFC, teneur leve : plus de 100 UFC). Les diffrentes matrices
sont contamines artificiellement, puis analyses laide de la mthode valider. Un contrle ngatif doit tre analys en parallle.
Les rsultats obtenus de lanalyse des chantillons contamins artificiellement sont compars avec
la contamination relle. La limite de dtection est la valeur la plus basse pour laquelle, avec une
probabilit de 50% (LOD50) la teneur de lchantillon est reconnue, c.--d. la concentration pour laquelle la moiti des rsultats sont positifs (8, 9, 10, 33).

2.9.

Limite de dtermination
La limite de dtermination est le nombre de microorganismes qui peut tre mesur quantitativement avec une exactitude et une prcision donnes.
Pour valuer la limite de dtermination, il faut tester par matrice des dilutions dcimales dau moins
trois concentrations diffrentes laide de 4 souches distinctes du microorganisme cible. Les diffrentes matrices sont contamines artificiellement, puis sont analyses laide de la mthode valider. Un contrle ngatif par matrice doit tre analys en parallle.
Les rsultats des analyses des chantillons contamins artificiellement sont compars avec la contamination relle. La limite de dtermination est la valeur la plus basse pour laquelle lexactitude relative et la rptabilit se trouvent dans les limites fixes.
La norme ISO 7218 (3) donne des indications fondamentales selon les densits microbiennes totales et spcifiques, sur la manire dobtenir des valuations numriques statistiquement assures
pour une mthode microbiologique. Un rsultat numrique nest accept gnralement que lorsquau moins 10 colonies sont dnombres ( lexception de produits danalyse non dilus comme
des eaux potables ou du lait).
Selon AOAC, la limite de dtermination pour les mthodes quantitatives par talement en surface
se situe entre 2000 et 3000 UFC/g (4).

2.10.

Concordance statistique

2.10.1.

Mthodes qualitatives
Pour la comparaison de mthodes qualitatives on dispose pour lvaluation statistique de mthodes dites non paramtriques comme le test des 4 champs (par exemple : le test 2 selon
McNemar) ou de la dtermination de lindice de concordance kappa. Comme dans lapplication du
test du 2 selon McNemar, la somme des rsultats non concordants doit tre au minimum 8 (voir
Figure 1, b+c), le calcul de lindice de concordance kappa pour la validation de mthodes microbiologiques est propos comme alternative au test 2. En effet, la dtection de bactries pathognes
ncessite un grand nombre dchantillons analyser et/ou des diffrences nettes dans la sensibilit des deux mthodes.
Lindex de concordance kappa est une mesure de la concordance de deux mthodes pour une caractristique analytique et se calcule de la manire suivante :
Kappa = 2 (ad bc) / [(a + c)(c + d) + (a + b) (b + d)] (voir Figure 1).

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La concordance est value suivant la valeur kappa daprs le tableau suivant :


Tableau 2. Evaluation du degr de concordance kappa (29)
kappa
< 0.10
0.10 0.40
0.40 0.60
0.60 0.80
0.81 1.00
2.10.2.

concordance
aucune
faible
nette
forte
presque complte

Mthodes quantitatives
La comparaison de mthodes quantitatives se fait statistiquement laide de tests paramtriques,
non-paramtriques, respectivement robustes. Il sagit de tests pour la comparaison de deux chantillons dpendants, respectivement pour la comparaison de paires dobservations (p. ex. t-test, test
de rang de Wilcoxon). Le critre dacceptation est la non-signification avec une probabilit derreur
= 0.05 (c..d. valeur p>0.05)
Lorsque le nombre des microorganismes mesurs dpasse 100 UFC/g, il doit tre transform sous
forme logarithmique avant lvaluation statistique..
Lorsque la mthode valider donne des rsultats identiques la mthode de rfrence ou est conforme la contamination relle, la moyenne ( d ) des diffrences des deux mthodes est zro.
Tableau 3. valuation de mthodes quantitatives

chantillon
1

n
moyennes

Paires de valeurs dpendantes


(rsultats)
Mthode de rfrence, resp. Mthode valider (A)
contamination relle (R)
xR1
xA1

Diffrence
(mthodes A-R)
d1

xRi

xAi

di

xRn

xAn

dn

xR

xA

d sd

xRi : i-me valeur obtenue avec la mthode de rfrence


xAi: i-me valeur obtenue avec la mthode alternative

On peut tester laide de lintervalle de confiance de manire quivalente au t-test : la moyenne


calcule des diffrences ( d ) est vrifie en calculant lintervalle de confiance de 95% et sa comparaison avec la valeur thorique zro :
Si

d <

t crit sd

, alors il nexiste pas de diffrence significative entre les deux sries de mesures.

tcrit dsigne la valeur critique des tableaux du test de Student pour un degr de libert de n-1 (intervalle de confiance 95 % ; tdfn-1 ; 0.975), sd est lcart-type des diffrences mesures et n le nombre de
paires de valeurs.
Pour estimer la corrlation entre deux mthodes, on peut aussi, laide des dnombrements obtenus, effectuer une analyse de rgression linaire. La reprsentation graphique des rsultats obtenus pour chaque chantillon par la mthode de rfrence et la mthode alternative, en utilisant
labscisse pour la mthode de rfrence et lordonne pour la mthode alternative, permet de d-

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celer des valeurs aberrantes. Outre le graphique, le test des valeurs aberrantes de Cochran, le test
de Dixon ou le test de Grubbs peuvent tre appliqus (2, 10, 30, 33). Les deux mthodes sont
quivalentes si lquation de rgression ne diffre pas significativement de la droite thorique
x=y . Pour un intervalle de confiance de 95 %, la pente m de la droite de rgression vaut 1.
Si m 1 < t crit s m , alors la pente m de la droite de rgression nest pas statistiquement diffrente de 1. Dans ce cas, tcrit dsigne la valeur critique des tableaux du test de Student pour un degr de libert de n-2 (intervalle de confiance 95 % ; tdfn-2 ; 0.975), sm dsigne lcart-type de la pente
de la droite de rgression.

3.

Incertitude de mesure
Lincertitude de mesure est un paramtre li au rsultat dune mesure, qui dcrit le degr de variation des valeurs qui peuvent tre raisonnablement associe la grandeur mesure (23).
Lincertitude de mesure rsulte dincertitudes dtermines exprimentalement et/ou dincertitudes
estimes. Elle doit tenir compte de lensemble du processus de la mthode. Si le rsultat provient
dun chantillon homognis, lincertitude de mesure ne concerne que la partie analytique. Dans
les autres cas, la partie pr-analytique doit aussi tre prise en compte. Le rapport dessai doit spcifier quoi lincertitude de mesure se rapporte.
Linvestissement ncessaire la dtermination de lincertitude de mesure dpend du problme
analytique pos (24-29).

3.1.

Estimation de lincertitude de mesure de mthodes microbiologiques qualitatives


Le concept de lincertitude ci-dessus ne peut pas tre appliqu directement aux rsultats de mthodes qualitatives, comme p. ex. lors de tests de dtection ou lors de la dtermination de caractres/critres ncessaires une identification. Des sources individuelles dincertitudes, comme p.
ex. linoculum, ltat des ractifs, les effets de matrice ou linterprtation de lanalyste doivent toutefois tre identifies, et il faut dmontrer que ces lments sont matriss. Les taux de faux-positifs
et faux-ngatifs procurent des indications importantes.

3.1.1.

Taux de faux-positifs
Le taux de faux-positifs se calcule par le quotient du nombre de rsultats faux-positifs sur le
nombre de rsultats ngatifs obtenus par la mthode de rfrence, ou du nombre des chantillons
non contamins artificiellement avec le microorganisme cible.
Pour les mthodes qualitatives, le taux de faux-positifs se calcule par [c/c+d] 100 % et donne le
pourcentage des chantillons qui ont t considrs faussement positifs avec la mthode alternative (voir Figure 1).
Les rsultats faux-positifs doivent absolument tre confirms par des caractrisations supplmentaires des microorganismes.

3.1.2.

Taux de faux-ngatifs
Le taux de faux-ngatifs se calcule par le quotient du nombre de rsultats faux-ngatifs sur le
nombre de rsultats positifs obtenus par la mthode de rfrence, respectivement le nombre
dchantillons contamins artificiellement avec le microorganisme cible.
Pour les mthodes qualitatives, le taux de faux-ngatifs se calcule par [b/a+b] 100 % et donne le
pourcentage des chantillons qui ont t considrs faussement ngatifs avec la mthode alternative (voir Figure 1).

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3.2.

Estimation de lincertitude de mesure de mthodes microbiologiques quantitatives


Selon le Guide EA-04/10 (1), les analyses microbiologiques se classent gnralement dans la catgorie dessais qui exclut le calcul de mtrologie et de statistique rigoureux de lincertitude des
mesures. En gnral, il est appropri de baser lestimation de lincertitude seulement sur les donnes de rptabilit et de reproductibilit (si disponibles). Idalement lexactitude (cart systmatique, biais) devrait prendre en compte p.ex. les donnes tires des rsultats dun plan dun test
daptitude (dans le cas o les matrices sont des denres alimentaires !).
Les composantes individuelles de lestimation de lincertitude doivent tre identifies, et la dmonstration quelles sont sous contrle doit tre faite, de mme que leur contribution la variabilit des
rsultats doit tre value. Certaines composantes (p. ex. le pipetage, la pese et les effets de la
dilution) peuvent tre mesures demble et facilement values dans la dmonstration quelles
ont une part ngligeable dans lincertitude globale. Dautres composantes (p. ex. la stabilit de
lchantillon, la prparation de lchantillon) ne peuvent pas tre mesures directement et leur contribution ne peut pas tre value dune manire statistique, mais leur importance dans la variabilit des rsultats devrait aussi tre prise en compte.
Toutes les mthodes danalyse, donc galement les mthodes microbiologiques, sont accompagnes dune incertitude de mesure. Sur la base dexpriences provenant de tests daptitude, on
peut estimer lincertitude de mesure pour les mthodes en botes de petri (bote coule, inoculation
en surface, technique par goutte). Cette incertitude de mesure quivaut en rgle gnrale une
demi puissance de 10.
Selon le MSDA 1402 (14), on compte pour les analyses microbiologiques quantitatives sur une incertitude de mesure de 0.5 log UFC/g. Selon le MSDA 1402 (14), cette incertitude de mesure est
incluse dans les critres microbiologiques qui figurent dans lOrdonnance sur lhygine (11). Si des
valeurs limites ou de tolrance sont dpasses lors de contrles officiels, des mesures lgales du
droit alimentaire sont obligatoirement appliques.

3.3.

Indication de lincertitude de mesure


Lincertitude de mesure doit tre indique sur le rapport dessai conformment la norme ISO
17025 (6) lorsque :
elle est importante pour la validit ou lapplication du rsultat danalyse
elle est exige par le client
elle pose la question du respect dune limite donne.
Si lincertitude de mesure est communique, le rapport dessai doit mentionner sur quoi elle repose.
Exemple dindication dune incertitude de mesure avec un intervalle de confiance de 95% :

Germes totaux arobies msophiles dans le lait cru : (3.4 0.5) log UFC /ml*
* Lincertitude indique sur la partie homognise de lchantillon couvre un intervalle de confiance de 95 %

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4.

Bibliographie
Validation
1.

EA-04/10 G: 2002 (July 2002 rev.02) Accreditation for Microbiological Laboratories.


http://www.european-accreditation.org/publications

2.

ISO 16140: 2003 Microbiologie des aliments -- Protocole pour la validation des mthodes alternatives

3.

ISO 7218: 2007 Microbiologie des aliments -- Exigences gnrales et recommandations

4.

AOAC INTERNATIONAL Qualitative and Quantitative Microbiology Guidelines for Methods


Validation, J. AOAC Int. 82: 402-415 (1999).

5.

Feldsine, P., Abeyta, C. and Andrews, W. H.: AOAC INTERNATIONAL Methods Committee
Guidelines for Validation of Qualitative and Quantitative Food Microbiological Official Methods
of Analysis. J. AOAC Int. 85: 1187-1200 (2002).
http://www.aoac.org/Official_Methods/Food_Micro_Validation_Guidelines.pdf

6.

ISO/IEC 17025 Exigences gnrales concernant la comptence des laboratoires d'talonnages et d'essais (ISO/IEC 17025: 2005).

7.

Hbner, P., Gautsch, S. and Jemmi, Th.: In House validation (Single Laboratory Validation) of
Microbiological Methods. Mitt. Lebensm. Hyg. 93: 118-139 (2002).
http://www.bag.admin.ch/dokumentation/publikationen/02212/index.html?lang=de

8.

MicroVal Rules and Certification Scheme Version 7 (October 2012).


http://www.microval.org/rules.html

9.

Protocole de Validation d'une mthode alternative commerciale par rapport une mthode de
rfrence Rvision 1 Adopte par AFNOR Certification le 10 mai 2010. http://www.afnorvalidation.org/pdf/Protocole-General-Validation_Rev1.pdf

10. NordVal Validation: Protocol for the validation of alternative microbiological methods (2009).
http://www.nmkl.org/NordVal/NordValprotocolmarch2009.pdf
11. Ordonnance du DFI sur lhygine (OHyg) du 23 novembre 2005 (Etat le 1er novembre 2010)
SR 817.024.1. http://www.admin.ch/ch/f/rs/817_024_1/index.html
12. SLMB 1629.1, Planung und statistische Auswertung von Ringversuchen zur Methodenvalidierung. http://www.slmb.bag.admin.ch/slmb/index.html
13. Berg, C., Dahms, S., Hildebrandt, G., Klatwchka, S. und Weiss, H.: Microbiological collaborative studies for quality control in food laboratories: Reference material and evaluation of analysts errors. Int. J. Food Microbiology 24, 41-52 (1994).
14. SLMB 1402 Technische Erluterungen zur Hygieneverordnung des EDI (HyV) vom 23. November 2005. http://www.slmb.bag.admin.ch/slmb/index.html
15. JCGM 200: 2012, International vocabulary of metrology Basic and general concepts and associated terms (VIM). http://www.bipm.org/en/publications/guides/

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16. ISO 13843: 2000, Water quality Guidance on validation of microbiological methods.
17. ISO 9000: 2005, Quality management systems Fundamentals and vocabulary.

Echantillonage
18. Codex Alimentarius CAC/GL 50-2004: General Guidelines on Sampling.
http://www.codexalimentarius.org/standards/list-of-standards/en/
19. International Commission on Microbiological Specifications for Foods (ICMSF): Microorganisms in Foods 2 Sampling for microbiological analysis: Principles and specific applications.
Second edition, 1986. University of Toronto Press, Toronto, Canada.
http://www.icmsf.org/pdf/icmsf2.pdf
20. MSDA 884.1 Guide pratique pour la partie pranalytique de l'analyse microbiologique dans le
domaine de la production alimentaire.
http://www.slmb.bag.admin.ch/slmb/methoden/index.html
21. Empfehlungen fr die hygienische Beurteilung von See- und Flussbdern, Jan. 1991,
Herausgeber: Bundesamt fr Gesundheit, Bundesamt fr Umwelt, Wald und Landschaft, Verband der Kantonschemiker der Schweiz, Verband der Kantonsrzte der Schweiz.
http://www.bafu.admin.ch/publikationen/publikation/00725/index.html?lang=de
22. SIA-Norm 385/9, Wasser und Wasseraufbereitungsanlagen in Gemeinschaftsbdern, 2011.

Incertitude de mesure
23. JCGM 100: 2008, Evaluation of measurement data - Guide to the expression of uncertainty
in measurement (GUM), 2008. http://www.bipm.org/en/publications/guides/
24. EURACHEM / CITAC Guide. Quantifying Uncertainty in Analytical Measurement, second edition (QUAM:2000.P1). http://www.measurementuncertainty.org/pdf/QUAM2000-1.pdf.
EURACHEM / CITAC Leitfaden Ermittlung der Messunsicherheit bei analytischen Messungen, Zweite Auflage, (2. Entwurf), Stand: Mai 2003, http://www.iswa.unistuttgart.de/ch/aqs/pdf/quam2000de_v2.pdf
25. SN ENV 13005 Leitfaden zur Angabe der Unsicherheit beim Messen (Ausgabe 2000-05).
26. ISO/TS 19036: 2006/Amd 1: 2009: Microbiology of food and animal feeding stuffs Guide on
estimation of measurement uncertainty for quantitative determinations (December 2004).
27. Niemel, S.I.: Uncertainty of quantitative determinations derived by cultivation of microorganisms. Advisory Commission for Metrology, MIKES Publication J4/2003.
http://www.mikes.fi/documents/upload/J4_2003.pdf
28. CCFRA. Microbiological measurement uncertainty: a practical guide. Guideline G47 (2004).
29. EA-4/16 G:2003 (rev.00). EA Guidelines on the Expression of Uncertainty in Quantitative Testing. http://www.european-accreditation.org/publications

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Littrature complmentaire
30. Sachs, L.: Angewandte Statistik. Springer Verlag, Berlin, 13. Auflage 2009.
31. Pichhardt, Klaus: Lebensmittelmikrobiologie Grundlagen fr die Praxis. Springer-Verlag, Berlin-Heidelberg-New York, 4. berarb. Aufl. (1998).
32. International Commission on Microbiological Specifications for Foods (ICMSF): Microorganisms in Foods 7 Microbiological testing in food safety management. Kluwer Academic / Plenum Publishers, Dordrecht, Norwell MA, New York, London 2002.
33. Stavros Kromidas: Handbuch der Validierung in der Analytik; Wiley Verlag, 2. Auflage 2011
34. SAS Guide pour le traitement appropri de la partie pr-analytique des analyses microbiologiques dans le domaine de la production de denres alimentaires SAS Document 333.f; 2010.
http://www.seco.admin.ch/sas/00032/00069/00175/index.html?lang=fr

35. ISO 17043: valuation de la conformit -- Exigences gnrales concernant les essais d'aptitude (ISO/IEC 17043:2010)

5.

Key words
Guideline, microbiological testing, food-stuffs, validation, measurement uncertainty

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