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CRISTALIZAO DE MACROMOLCULAS
BIOLGICAS
2004
ndice
1. Introduo.......................................................................................................
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1. Introduo
A vida a reao qumica mais complexa da natureza e neste cenrio as
protenas desempenham o papel principal. O estudo estrutural de protenas
forneceu a base para comearmos a entender a vida em termos moleculares. Desde
da resoluo da primeira estrutura de protena em 1959 at os dias de hoje, onde
quase trinta mil estruturas de macromolculas biolgicas tiveram sua estrutura
tridimensional determinada e suas coordenadas atmicas esto depositadas no
banco de dados de estruturas (Protein Data Bank)( www.rcsb.org/pdb/), um
grande desenvolvimento nos mtodos de resoluo de estruturas tem permitido
que o tempo de resoluo de estruturas fosse reduzido de anos para meses e em
alguns casos dias e at mesmo horas. A principal tcnica para resoluo da
estrutura tridimensional de macromolculas biolgicas como um todo tem sido a
cristalografia por difrao de raios X, e at hoje a tcnica principal para
investigao da estrutura tridimensional de macromolculas biolgicas (Blundell
and Johnson, 1976; Drenth, 1994). Os principais passos na resoluo de estruturas
por cristalografia de difrao de raios X esto descritos na figura 1.
Entre os principais passos da resoluo de protenas descreveremos a
cristalizao no presente texto. O principal objetivo da cristalizao de uma
macromolcula biolgica, tal como protena, cido nuclico ou vrus, o estudo
estrutural destas macromolculas, por mtodos de difrao de raios X. Tal estudo
estrutural fundamental para o entendimento molecular de vrios mecanismos
biolgicos.
Os cristais de macromolculas biolgicas so diferentes dos cristais de
pequenas molculas em vrios aspectos. Eles diferem em tamanho, cristais de
macromolculas so, normalmente bem menores, dificilmente excedem 1mm3 em
volume. Uma outra diferena que cristais de macromolculas biolgicas so bem
mais frgeis e possuem um alto contedo de solvente. A fragilidade dos cristais de
macromolculas biolgicas uma conseqncia das fracas interaes entre as
(4)
racional
de
experimentos
de
crescimento
de
cristais
de
macromolculas biolgicas.
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5. Salting-in e salting-out
A dependncia da solubilidade da protena com a concentrao salina foi
estudada em termos dos fenmenos de salting-in e salting-out (Green, 1932). O
aumento da solubilidade de uma macromolcula biolgica a baixa concentrao
salina (<0,5M) chamada salting-in. Este fenmeno explicado pelas interaes
eletrostticas no especficas entre a macromolcula carregada e as espcies inicas
do sal. Segundo a teoria de Debye-Hckel para solues inicas, um aumento na
fora inica reduz a atividade dos ons em soluo e aumenta a solubilidade do
composto inico. Uma forma alternativa de se tratar este fenmeno considerar o
salting-in como o resultado da competio entre grupos carregados na superfcie da
macromolcula e os ons em soluo. Na ausncia de ons de solvente a
macromolcula precipita devido atrao de eletrosttica entre cargas opostas em
diferentes partes da macromolcula. Se os ons so adicionados soluo eles
blindam os grupos carregados na macromolcula e aumentam a sua solubilidade
(figura 2).
Outra forma de precipitar uma macromolcula pela adio de sal (saltingout), este serve para imobilizar as molculas de gua, desta forma aumentando a
concentrao efetiva da macromolcula, ou seja, diminuindo a sua solubilidade.
No fenmeno de salting-out a solubilidade da macromolcula biolgica
governada principalmente por efeitos hidrofbicos. De acordo com a equao
linear emprica de Cohn-Green a solubilidade da macromolcula numa situao de
salting-out decresce da seguinte forma:
log S = - KS m, ou log S = - KS
(1)
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(4)
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No-Volteis
Sais
MPD
PEG 400
PEG 4000
PEG 8000
Tartarato de Na,K
Fosfato de NH4
Sulfato de NH4
Acetato de Na
Sulfato de Li
Formiato de Na
Fosfato de Na,K
Citrato de Na
Formiato de Mg
2-Propanol
Mistura
Sulfato de NH4 + PEG
2-Propanol + PEG
Faixa de pH:
4,6; 5,6; 6,5; 7,5 e 8,5
Aditivos: Cloreto de Ca, Citrato de Na, Cloreto de Mg, Acetato de NH4, Sulfato de NH4, Acetato de
Mg, Acetato de Zn e Acetato de Ca.
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semana aps ter-se preparado o primeiro experimento de cristalizao usandose as condies descritas anteriormente (seo 8), aumente a concentrao do
precipitante no reservatrio de todas as gotas que no apresentaram cristais
nem precipitado. Isto deve ser feito em passos de 5% a cada trs dias, ou seja,
aumenta-se a concentrao do precipitante no reservatrio 5% acima da
concentrao anterior a cada trs dias, at que se consiga cristais ou precipitado
amorfo. O aumento da concentrao de precipitante no reservatrio causa uma
quebra do equilbrio termodinmico que foi provavelmente atingido aps uma
semana de feito o experimento de cristalizao. Tal procedimento pode levar a
macromolcula biolgica condio de supersaturao e nucleao.
b) O procedimento de Esperar e Ver funciona melhor que o procedimento Use
todo o material (macromolcula biolgica) agora, porque no primeiro
procedimento voc obtm um retorno do primeiro experimento de cristalizao
o que permite o uso de menores quantidades de material nos prximos
experimentos. Por esta razo sempre espere uma semana antes de fazer um
outro experimento de cristalizao com a mesma macromolcula biolgica.
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b) h presena de sujeiras.
c) h presena de microcristais.
Passo 5) Confira as gotas diariamente por uma semana, fazendo as mesmas
anotaes do passo 4. E verifique tambm o surgimento de algum bom cristal.
importante verificar como a macromolcula biolgica se comporta com o tempo
em cada gota de cristalizao.
Passo 6) Supondo que pequenos cristais se formaram em uma ou mais gotas do
experimento inicial de cristalizao, deve-se concentrar esforos nos melhores
cristais e tentar a melhoria das condies de cristalizao dos mesmos. Os
procedimentos para a melhoria das condies de cristalizao sero mostrados a
seguir.
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Placa Linbro;
PNP (De Azevedo et al., 2003) a 12mg/mL em tampo fosfato de potssio a
10 mM, pH 7,1 (soluo A);
40 % de sulfato de amnio em tampo citrato de sdio a 0,05 M, pH 5,3 (soluo
B);
Microfiltro de 0,22 m;
Graxa de vcuo;
Lamnula.
Mtodo:
1. Prepare a solues estoques de 40 % de sulfato de amnio em tampo
citrato de sdio a 0,05 M, pH 5,3 e PNP a 12mg/mL em tampo fosfato de
potssio a 10 mM, pH 7,1. Filtre a soluo com um microfiltro de 0,22 m;
2. Prepare uma placa Linbro;
3. Abastea os reservatrios da fileira A da placa Linbro com soluo B
variando de 15-40 % em passos de 5 %;
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Placa Linbro;
lisozima 40mg/mL em acetato a 50 mM, pH 4,5;
NaCl 3 M ;
Microfiltro de 0,22 m;
Graxa de vcuo;
Lamnula.
Mtodo:
1. Prepare as solues estoques de NaCl a 3 M e lisozima a 40 mg/mL (2,74
mM) em acetato a 50 mM, pH 4,5. Filtre todas as solues com um
microfiltro de 0,22 m;
2. Prepare uma placa Linbro;
3. Abastea os reservatrios da fileira A com solues de NaCl variando de
0,5-1,5M em passos de 0,2 M;
4. Em uma lamnula, misture 4 L da soluo estoque com 4 L do
reservatrio. Rpido e em srie, engraxe a borda dos reservatrios e cubra
com a lamnula;
5. Abastea os reservatrios da fileira B com soluo de NaCl variando de 0,81,8 M em passos de 0,2 M. Repita o experimento na fileira B depois de diluir
a soluo estoque de protena metade para obter uma nova concentrao
de 20 mg/mL (1,37 mM);
6. Abastea os reservatrios da fileira C com solues de NaCl variando de
1,5-2,5 M em passo de 0,2 M. Repita o experimento depois de diluir a
soluo estoque de protena pela metade;
7. Use a fileira D para duplicar ou testar parmetros particulares (por
exemplo, volume da gota para observar se h influncia nos efeitos cinticos
ou no crescimento);
8. Mantenha os experimentos a 18 C;
9. Observe os experimentos durante 2 dias;
Resultados:
Os cristais de lisozima apareceram aps 24 horas e apresentam dimenses
aproximadas de 0,5x0,5x0,5mm.
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McPherson, A., Koszelak, S., Axelrod, H., Day, J., Williams, R., Robinson, L.,
McGrath, M., and Cascio, D. (1986). J. Biol. Chem., 261, 1969.
Ris-Kautt, M. M. and Ducruix, A. (1989). J. Biol. Chem., 264, 745.
Ris-Kautt, M. M. and Ducruix, A. (1991). J. Crystal Growth, 110, 20.
Usha, R., Johnson, J. E., Moras, D., Thierry, J. -C., Fourme, R., and Kahn, R. (1984).
J. Appl. Cryst., 17, 147.
von Hippel, P. H. and Schleich, T. (1969). Accounts of Chemical Research, 2, 257.