3.

Tcnicas Experimentais

Muito do nosso atual conhecimento acerca da estrutura da matria baseado

em investigaes espectroscpicas. Informaes sobre a estrutura molecular e
sobre a interao de molculas com seus vizinhos podem ser derivadas de
diversos modos a partir dos espectros de emisso e absoro gerados quando a
radiao interage com os tomos ou molculas da matria. Apresentamos aqui
uma breve descrio sobre os processos de absoro e de fluorescncia sob

PUC-Rio - Certificao Digital N 0321568/CA

condies foto-estacionrias (excitao com uma fonte contnua).

3.1
Conceitos bsicos
A luz, em seu aspecto ondulatrio, uma onda eletromagntica, que
consiste de campo eltrico e magntico mutuamente perpendiculares que oscilam
senoidalmente. Quando uma onda deste tipo encontra uma molcula, ela pode ser
espalhada (sua direo de propagao muda) ou absorvida (sua energia
transferida molcula). A probabilidade relativa de cada processo uma
propriedade da molcula particular encontrada. Se a energia eletromagntica da
luz absorvida, a molcula passa a um estado excitado. Uma molcula ou sua
parte que pode ser excitada por absoro chamada cromforo. Esta energia de
excitao usualmente convertida em calor (energia cintica) pela coliso da
molcula excitada com outra molcula (molcula do solvente). Em algumas
molculas re-emitida em fluorescncia. Em ambos casos, a intensidade da luz
transmitida por um conjunto de cromforos menor que a intensidade da luz
incidente.
Uma molcula possui um conjunto de quantidades discretas (quanta) de
energia, descritas pelas leis da mecnica quntica. Estas quantidades so
chamadas nveis de energia da molcula. Os nveis principais de energias so
determinados pelas possveis distribuies espaciais dos eltrons e so chamados
nveis eletrnicos de energia; sobre estes esto superpostos nveis vibracionais,

37

que indicam os vrios modos de vibrao da molcula. H ainda subdivises

menores chamados nveis rotacionais. O nvel eletrnico mais baixo chamado

PUC-Rio - Certificao Digital N 0321568/CA

estado fundamental e os outros so os estados excitados (Freifelder, 1982).

Figure 3.1

Esquemas para as probabilidades de transio de uma molcula

envolvendo os estados vibracionais de dois estados eletrnicos, sendo R a distncia

internuclear. O mnimo de energia corresponde distncia de equilbrio em cada estado
eletrnico (www.chemkeys.com).

Espectro molecular

Podemos expressar a energia total de excitao de uma molcula, com boa

aproximao, como a soma das energias de excitaes parciais dos nveis
eletrnico, vibracional e rotacional mencionadas acima:
E = Eel + Evib + Erot

(3),

onde os subscritos el, vib e rot significam eletrnica, vibracional e

rotacional, respectivamente.
As Figuras 3.1 e 3. ilustram os nveis vibracionais e rotacionais em dois
estados eletrnicos de uma molcula, I e II, e as possveis transies entre eles.

PUC-Rio - Certificao Digital N 0321568/CA

38

Figure 3.2

Nveis vibracionais (v) e rotacionais (J) de dois estados eletrnicos de

uma molcula denotados por I e II. As trs setas indicam (da esquerda para a direita)
transies rotacional, vibracional e eletrnica da molcula (Alcantara Jr., 2002).

As transies obedecem a regras de seleo que satisfazem o princpio de

Franck-Condon e podemos distinguir entre trs tipos de espectros pticos:
Espectros rotacionais: so transies entre os nveis rotacionais de um
dado nvel vibracional em um estado eletrnico particular. Somente o nmero
quntico rotacional J muda nessas transies. Estes espectros esto na regio de
microondas ou no infravermelho distante. Eles consistem tipicamente de um
grande nmero de linhas espectrais aproximadamente eqidistantes. Os espectros
rotacionais tambm podem ser observados por meio de espectroscopia Raman.
Espectros rotacionais-vibracionais consistem de transies dos nveis
rotacionais de um certo estado vibracional para os nveis rotacionais de um outro
estado vibracional no mesmo termo eletrnico. O estado de excitao eletrnica,
assim, permanece inalterado. Mudam os nmeros qunticos J e v, onde v
caracteriza os nveis vibracionais quantizados. Estes espectros se encontram na
regio do infravermelho. Eles consistem de um nmero de "bandas" que so
grupos de linhas estreitamente espaadas, denominadas de linhas de banda. Eles

39

podem ser observados com espectroscopia Raman, assim como espectroscopia

infravermelha.
Espectros eletrnicos consistem de transies entre os nveis rotacionais
dos vrios nveis vibracionais de um estado eletrnico e os nveis rotacionais e
vibracionais de um outro estado eletrnico. Isto chamado de sistemas de bandas.
Ele contm todas as bandas vibracionais da transio eletrnica em observao,
cada uma das quais com sua estrutura rotacional. Em geral todos trs nmeros
qunticos mudam nessas transies: J e v, e mais aquele que caracteriza o estado
eletrnico (n, l, ml ou j e mj) (Alcantara, 2002).

3.2
Espectroscopia de Absoro

PUC-Rio - Certificao Digital N 0321568/CA

O intervalo de energia entre os estados rotacionais-vibracionais mais baixos

do estado eletrnico fundamental e do primeiro estado eletrnico de uma molcula
simples , tipicamente, de 3,5 eV (~80 kcal/mol). Esta energia muito maior do
que a energia trmica temperatura ambiente, de 0,025 eV (0,6 kcal/mol).
Conseqentemente, para toda finalidade prtica, na ausncia de radiao que
possa excitar uma transio, todas as molculas numa soluo esto no estado
eletrnico fundamental. O intervalo de energia entre nveis vibracionais da
ordem de 0,4 eV (~10 kcal/mol). Esta energia tambm maior que a energia
trmica. Assim, ao menos aproximadamente, podemos considerar que somente o
nvel vibracional mais baixo est apreciavelmente povoado. Entretanto, diferenas
entre energias rotacionais so somente de 0,04 eV (1 kcal/mol) ou menos e,
conseqentemente, muitos nveis rotacionais so povoados (Cantor e Schimmel,
1998).
A absoro de radiao visvel ou ultravioleta (UV) prximo corresponde
excitao dos eltrons mais externos. Existem trs tipos de transio eletrnica
que podem ser considerados:
a.

Transies envolvendo eltrons n, e

Absoro de radiao visvel e ultravioleta em molculas orgnicas restrita

a certos grupos funcionais da molcula que contm eltrons de valncia de baixa
energia de excitao.

40

Transies

Um eltron num orbital ligante excitado ao correspondente orbital

antiligante . A energia requerida grande. Por exemplo, o metano (que tem
somente ligaes C-H e pode somente se submeter a transies ) mostra
um mximo de absorbncia em 125 nm. O pico de absoro, devido a estas
transies, no visto no espectro tpico do ultravioleta e visvel (200-700 nm).
Transies n

Compostos saturados contendo tomos com pares solitrios (eltrons no

ligantes) so capazes de transies n . Estas transies usualmente
necessitam menos energia que as transies . Podem ser iniciadas pela luz
cujos comprimentos de ondas esto no intervalo 150-250 nm. O nmero de grupos

PUC-Rio - Certificao Digital N 0321568/CA

funcionais orgnicos com picos n na regio ultravioleta pequeno.

Transies n e

A maioria da espectroscopia de absoro de compostos orgnicos baseada

em transies de eltrons n ou para o estado excitado . Isto se deve a que os
picos de absoro para estas transies caem numa regio experimentalmente
conveniente do espectro (200 700 nm). Estas transies necessitam um grupo
insaturado na molcula para fornecer os eltrons . As absores molares de
transies n so relativamente baixas e esto em intervalos de 10 a 100
M1cm1. Transies normalmente do absores molares entre 103 a 104
M1cm1.

Figura 3.3

Esquema de energias correspondentes a transies eletrnicas (SHU -

School of Science and Mathematics: www.shu.ac.uk/schools/sci/chem/tutorials/).

41

O solvente no qual os cromforos so dissolvidos tm tambm um efeito no

espectro das espcies. Os picos resultantes das transies n so deslocados
a comprimentos de ondas mais curtos ("blue shift") com o incremento da
polaridade do solvente. Isto se origina da solvatao incrementada do par solitrio,
que abaixa a energia do orbital n. Freqentemente, mas no sempre, o reverso
("red shift") visto para transies . Isto causado por foras atrativas de
polarizao entre o solvente e o cromforo, que abaixam os nveis de energia dos
estados excitados e no excitados. Este efeito maior para o estado excitado, e
assim a diferena de energia entre o estado no excitado e o excitado fortemente
reduzida - tendo por resultado um

"red shift" pequeno. Este efeito tambm

influencia transies n mas sobrepujado pelo "blue shift" resultante da

solvatao dos pares solitrios.

PUC-Rio - Certificao Digital N 0321568/CA

b.

Transies envolvendo eltrons por transferncia de carga.

Muitas espcies orgnicas mostram absoro por transferncia de carga e

so chamados complexos de transferncia de carga. Para um complexo
demonstrar comportamento de transferncia de carga, um de seus componentes
deve ter propriedades de doador e o outro aceptor de eltrons. Absoro de
radiao ento envolve a transferncia de um eltron do doador a um orbital
associado a um aceptor.
Absores molares associadas a transferncia de carga so grandes (maiores
que 104 M1cm1) (S.H.U. School of Science and Mathematics: www.shu.ac.uk/
schools/sci/chem/tutorials/).
Em condies normais de temperatura (ambiente ou prxima dela) as
molculas esto no estado vibracional de menor energia do estado fundamental
eletrnico. Deste modo, a absoro do fton de radiao ir excitar as molculas
para um estado eletrnico maior e para os diversos nveis vibracionais e
rotacionais deste estado eletrnico. O espectro de absoro ser, portanto,
composto por um conjunto de bandas, associadas s diversas transies
vibracionais e rotacionais possveis dos dois estados eletrnicos envolvidos na
transio, e depender das regras de seleo espectroscpicas vlidas para cada
caso. J que o espaamento entre os estados rotacionais muito pequeno,
normalmente estas transies no aparecem em forma de bandas resolvidas.

42

3.2.1
Intensidade de absoro
Se a luz da intensidade I0 passa atravs de uma substncia de espessura b
(em cm) e concentrao molar c (M ou mol.L1), a intensidade I da luz transmitida
obedece lei de Beer-Lambert:
I = I o 10 b c

ou

log(I o / I ) = c b

Onde o coeficiente de absoro molar. Os dados de absoro so

reportados como transmitncia ( T = I / I o 100% ) ou, mais usualmente, como a
absorbncia, A = log(I o I ) . Quando b = 1 cm, A chamado de densidade ptica,
OD. A densidade ptica mais conveniente porque igual a c.
O coeficiente de absoro molar caracterstico de uma substncia em

PUC-Rio - Certificao Digital N 0321568/CA

condies definidas de comprimento de onda, solvente e temperatura. Tem

unidades M1cm1.
A lei de Beer-Lambert tende a sofrer limitaes devidas a certos desvios.
Desvios qumicos, que so resultados de alteraes qumicas associadas
com a mudana de concentrao, j que em solues relativamente concentradas
(> 0,01 M) a distncia mdia entre as molculas diminui e as interaes entre as
mesmas comeam a afetar as distribuies de cargas. Isto pode alterar a habilidade
das espcies absorverem num dado comprimento de onda e em alguns casos,
quando c alto, aparece ser uma funo de c. Muitas molculas, em algumas
solues, formam dmeros ou polmeros maiores medida que a concentrao
aumenta, ocasionando certos problemas j que o espectro dos dmeros pode diferir
daquele dos monmeros. Outro efeito em concentraes altas a agregao; isto
conduz freqentemente ao espalhamento da luz, decrescendo a quantidade de luz
transmitida. Outra causa do desvio da lei de Beer a desnaturao de protenas em
baixas concentraes.
Desvios e limitaes instrumentais: dependem do equipamento e da forma
como a medio feita.

43

3.2.2
Espectrofotmetro
Um espectrofotmetro formado por um conjunto de componentes do
seguinte tipo:
Fontes de radiao.
So lmpadas que emitem feixes de radiao eletromagntica na regio do
espectro denominado ptico. Uma fonte ideal aquela que apresenta uma
intensidade aproximadamente constante em toda faixa de comprimento de onda de
operao, com pouco rudo e longo perodo de estabilidade. As fontes mais
comuns nos espectrofotmetros que operam na regio espectral do UV-Visvel
so: as lmpadas de deutrio (tempo de vida: 1 000 h) para excitao na regio do
ultravioleta ( < 350 nm) e de tungstnio ou tungstnio-halognio ( > 350 nm;
PUC-Rio - Certificao Digital N 0321568/CA

tempo de vida 10 000 h) para excitao na regio do visvel e infravermelho

prximo.
Componentes pticos.
Dependendo do tipo de componentes pticos, os espectrofotmetros so
classificados em: dispersivos e interferomtricos. Elementos dispersivos so
aqueles que difratam a luz, como os prismas e grades de difrao. Elementos
interferomtricos so aqueles que produzem processos de interferncia da
radiao eletromagntica, como por exemplo o interfermetro de Michelson.
No caso dos espectrofotmetros de absoro na regio Ultravioleta Visvel - Infravermelho prximo, os instrumentos so sempre dispersivos e
normalmente so grades de difrao. A grade um componente ptico que
contm uma srie de ranhuras, que so os elementos responsveis pela difrao da
radiao eletromagntica baseada na lei de difrao de Bragg. Dependendo do
nmero de ranhuras por milmetro, haver maior ou menor resoluo dos
espectros.
Detectores

Duas grandes classes de espectrofotmetros esto disponveis: os que

utilizam como sistema de deteco um tubo fotomultiplicador e os que utilizam
arranjo de diodos.

44

Um tubo fotomultiplicador constitudo por um tubo de vidro ou de quartzo

sob vcuo, no qual existe um conjunto de placas metlicas interligadas. Quando a
radiao incide sobre estas placas metlicas elas induzem uma corrente eltrica,
segundo a teoria do efeito fotoeltrico proposto por Einstein. A qualidade do
material do catodo determina a sensibilidade espectral do tubo.
O segundo tipo de detector comum mais usado o arranjo de diodos. Um
arranjo de diodos consiste em uma srie de fotodiodos detectores posicionados
lado a lado num cristal de silcio de modo que cada comprimento de onda
difratado pela grade atinge um ponto deste arranjo, e conseqentemente um
detector. Este detector permite que a absorbncia de uma amostra em todos os
comprimentos de onda seja

determinada de modo simultneo. Outro fator

importante para estes detectores que tm sensibilidades diferentes para

diferentes comprimento de onda, de modo que necessrio que se especifique em
PUC-Rio - Certificao Digital N 0321568/CA

que regio do espectro se vai trabalhar, mas a resoluo espectral depende do tipo
e do nmero de diodos que compe o arranjo (de Andrade e Custodio, 1996).

Figura 3.4

Esquema ptico de um espectrofotmetro de duplo feixe

(www.chemkeys.com).

Os parmetros geralmente medidos na espectroscopia de absoro so a

densidade ptica ou e o comprimento de onda correspondente ao pico de
absoro chamado MAX, e neste comprimento que geralmente medido.

45

Algumas das bandas de absoro consistem de picos mltiplos e os comprimentos

de onda correspondentes aos picos que tm coeficientes de absoro molar
menores so freqentemente registrados. Por exemplo:

Aminocido

MAX (nm)

103 (M1 cm1)

Triptofano

280

5,6

219

47

274

1,4

222

8,0

193

48

257

0,2

206

9,3

188

60

Histidina

211

5,9

Cistena

250

0,3

Tirosina

PUC-Rio - Certificao Digital N 0321568/CA

Fenilalanina

O espectro de absoro dum cromforo principalmente determinado pela

estrutura qumica da molcula. Entretanto, um nmero grande de fatores
ambientais produz mudanas detectveis em MAX e . As caractersticas gerais
destes efeitos ambientais so os seguintes:
Efeitos de pH. O pH do solvente determina o estado de ionizao dos
cromforos ionizveis.
Efeitos de polaridade. Para cromforos polares, o valor de MAX para
transies n ocorre em comprimentos de onda mais curtos em solventes
polares (gua, lcoois) do que em solventes no polares. Esta mudana d-se em
direo a comprimentos de onda maiores para transies . Esta ltima
transio a mais comum para molculas biolgicas. Excees so os
aminocidos que so geralmente usados em anlises de conformao (Freifelder,
1982).

46

3.3
Espectroscopia de Emisso
A fluorescncia um tipo de luminescncia que consiste no processo de
emisso envolvendo estados eletrnicos de mesma multiplicidade de spin (estados
eletrnicos singletes). Tais transies na mecnica quntica so "permitidas" e as
taxas emisso so tipicamente perto de 108 seg1. Estas altas taxas de emisso do
como resultado um tempo de meia-vida de fluorescncia perto a 108 s ou 10 ns.
Certas substncias que apresentam fluorescncia significativa, como por exemplo
a antroil-ouabana (Figura 2.11), geralmente tm eltrons deslocalizados presentes
nas ligaes duplas conjugadas.
O diagrama sugerido por A. Jablonski para os nveis de energia ilustra o

PUC-Rio - Certificao Digital N 0321568/CA

processo de absoro e emisso de luz (Figura 3.5).

Figura 3.5

Diagrama de Jablonski para o sistema de nveis de energia para a

molcula de benzeno (www.chemkeys.com).

Na Figura 3.5, os diferentes tipos de processos para a desativao molecular

dos estados eletrnicos e vibracionais excitados, esto representados por:
transies radiativas permitidas por multiplicidade de spin (setas contnuas,
);
transies radiativas proibidas por multiplicidade de spin (setas tracejadas,  ); as
transies no radiativas (setas onduladas,
), como no processo de relaxao

47

vibracional, que ocorrem dentro de um mesmo nvel eletrnico e envolvem a

desativao por liberao de calor atravs dos modos normais de vibrao. Alm
destas transies outras podem ocorrer na molcula como: cruzamento
intersistemas, que representa transies no radiativas, isoenergticas, envolvendo
estados de multiplicidades de spin diferentes; converso interna, associada a
transies isoenergticas que ocorrem em 1012 s envolvendo estados de mesma
multiplicidade de spin (Atvars e Martelli, 2002).
No processo de absoro de luz h uma transio eletrnica que ocorre em
1015 s, tempo demasiado curto para um deslocamento significativo do ncleo
(princpio Franck-Condon); isto devido a que a massa de um ncleo muito
maior do que a do eltron. Por isso que na Figura 3.5 as transies entre os
vrios nveis eletrnicos so verticais.

PUC-Rio - Certificao Digital N 0321568/CA

Uma diferena entre os espectros de absoro e emisso que o espectro de

absoro reflete os nveis vibracionais dos estados excitados eletronicamente e o
espectro de emisso reflete os nveis vibracionais do estado eletrnico
fundamental (Lakowicz, 1983).
3.3.1
Espectrofluormetros
Existem duas classes de espectrofluormetros: os fotoestacionrios e os
pulsados. Os espectrofluormetros que operam em condies fotoestacionrias
excitam as espcies em modo contnuo, obtendo-se os espectros eletrnicos de
emisso e de excitao. Os espectrofluormetros pulsados excitam as espcies por
meio de pulsos de radiao, obtendo-se os tempos de decaimento do estado
eletrnico excitado e os espectros resolvidos no tempo.
O espectrofluormetro utilizado em nosso trabalho um espectrofluormetro
fotoestacionrio, j que tem uma fonte de excitao que emite de modo contnuo e
conseqentemente origina uma populao constante de espcies no estado
eletrnico excitado.
Os espectrofluormetros estacionrios

Um espectrofluormetro geralmente composto por dois monocromadores,

um de excitao e um de emisso, um sistema de excitao e um sistema de
deteco.

PUC-Rio - Certificao Digital N 0321568/CA

48

Figura 3.6

Esquema ptico de um espectrofluormetro modelo SLM-500 Aminco

(www.chemkeys.com).

Um espectrofluormetro se diferencia de um espectrofotmetro nos

seguintes elementos :
Monocromador: composto por um arranjo ptico no qual uma fonte de luz
policromtica incidente se descompe em seus diferentes comprimentos de onda
atravs de uma grade de difrao. Os comprimentos de onda para a excitao da
amostra so selecionados pelo monocromador de excitao, e a radiao emitida
analisada pelo monocromador de emisso, sendo a intensidade da radiao
emitida determinada pelo tubo fotomultiplicador, como nos espectrofotmetros.
Fontes de radiao: nos instrumentos comerciais mais comuns a fonte de
radiao uma lmpada de emisso contnua, que pode ser de xennio e mercrio.
A lmpada de xennio emite praticamente em toda a regio visvel e ultravioleta
(250 nm< <800 nm) e a de mercrio emite, nesta mesma regio, na forma de
linhas. A lmpada de xennio oferece maior nmero de comprimentos de onda
possveis para a excitao da amostra, enquanto que a lmpada de mercrio
oferece maior intensidade nos comprimentos de onda que emite.
Um detalhe importante no espectrofluormetro que a radiao emitida pela
amostra focalizada na entrada do monocromador de emisso em um ngulo de

49

90 em relao radiao incidente. Esta geometria diferente daquela de um

espectrofotmetro de absoro no qual a luz que emerge da amostra e vai para o
detector tem a mesma direo da luz incidente. Isto se deve ao fato de que a
intensidade de emisso muito menor do que a intensidade da radiao de
excitao, e conseqentemente o sinal de emisso, se analisado na mesma direo
da excitao, ficaria mascarado (Atvars e Martelli, 2002).
3.3.2
Fluorescncia em protenas
Quase todas as protenas contm fluorforos naturais, j que os aminocidos
aromticos tirosina, triptofano e fenilalanina so fluorescentes e contribuem
fluorescncia (ultravioleta). A fluorescncia intrnseca de protena geralmente

PUC-Rio - Certificao Digital N 0321568/CA

excitada na mxima absoro perto de 280 nm, ou em comprimentos de ondas

maiores. A fenilalanina no excitada na maioria de situaes experimentais.
Alm disto, o rendimento quntico da fenilalanina em protenas pequeno.
A absoro de protenas em 280 nm devida a resduos de tirosina e triptofano. Em comprimentos de ondas maiores do que 295 nm, a absoro devida
principalmente ao triptofano. A emisso da tirosina em gua ocorre em 303 nm e
relativamente insensvel polaridade do solvente. O pico de emisso do triptofano
em gua ocorre em 348 nm e muito dependente da polaridade (Lakowicz, 1983).
Algumas regras empricas para interpretar o espectro de fluorescncia de
protenas:
1. Toda a fluorescncia de uma protena devida ao triptofano, tirosina e
fenilalanina, a menos que a protena contenha outro componente
fluorescente.
2. O MAX de emisso do espectro de fluorescncia do triptofano muda
para comprimentos de ondas mais curtos e a intensidade de MAX
incrementa medida que a polaridade do solvente decresce.
a. Se MAX mudado a comprimentos de onda mais curtos quando a
protena est num solvente polar, o triptofano deve estar num
ambiente interno e no polar.
b. Se MAX mudado a comprimentos de ondas mais curtos quando a
protena esta num meio no polar, o triptofano est na superfcie da

50

protena ou o solvente induz uma mudana de conformao que o

leva superfcie.
3.

Se uma substncia conhecida como supressor (suprime a fluorescncia

do aminocido livre), tal como o iodeto, nitrato, ou ons de csio,
suprime a fluorescncia da tirosina ou do triptofano, o aminocido deve
estar na superfcie da protena. Se no fizer assim, existem varias razes:
a. O aminocido pode estar no interior.
b. O aminocido pode estar numa fenda cujas dimenses so muitas
pequenas para que o supressor entre.
c. O aminocido pode estar numa regio altamente carregada e a carga
pode repelir o supressor.

4. Se uma substncia que no afeta o rendimento quntico do aminocido

afeta a fluorescncia de uma protena, ela deve produzir uma mudana
PUC-Rio - Certificao Digital N 0321568/CA

conformacional na protena (Freifelder, 1982).

3.3.3
Fluorescncia em membranas
As propriedades de membranas comumente estudadas por tcnicas de
fluorescncia incluem aspectos dinmicos, estruturais e organizacionais. Aspectos
dinmicos incluem a taxa de movimento das cadeias lipdicas, a regio da cabea
polar dos fosfolipdios e outros componentes lipdicos e protenas de membranas.
Aspectos organizacionais incluem a distribuio de lipdios em ambos lados da
membrana, no plano da membrana (separaes de fase) e atravs da bicamada
(assimetria na composio de fosfolipdios), assim como distncias da superfcie
ou profundidade na bicamada. Finalmente, existem propriedades das membranas
que pertencem superfcie tal como a carga superficial e as propriedades
dieltricas. Tcnicas de fluorescncia tm sido amplamente usadas em estudos de
membranas principalmente j que a escala de tempo de tempo vida de
fluorescncia coincide com a escala de tempo de interesse para o movimento do
lipdio e j que existe um amplo nmero de sondas fluorescentes disponveis, que
podem ser usadas para produzir informao especfica sobre propriedades da
membrana.
Um nmero de estudos tem tirado vantagem do fato que protenas de
membranas contm um ou mais resduos de triptofano, cuja fluorescncia pode ser

51

usada para determinar a conformao da protena ou sua posio na membrana.

Por suposto, a informao limitada pelo nmero de resduos de triptofano e pelo
fato de que um triptofano no pode ser posicionado na regio de interesse da
protena (Lakowicz, 1983).

3.4
Associao de ligantes a macromolculas
Um evento comum nos sistemas vivos a ligao no covalente de uma ou
mais molculas a uma macromolcula simples. Uma molcula ligada a uma
macromolcula chamada ligante. Existem muitos tipos de ligao. Por exemplo,
uma molcula pode ter s um stio de ligao simples ou pode haver muitos stios.
Os stios podem ser idnticos ou diferentes e eles podem ser apenas para uma

PUC-Rio - Certificao Digital N 0321568/CA

classe de molculas ou diversas molculas distintas. Alm disso, mltiplos stios

podem ser interdependentes, no sentido em que a ocupao de um stio por uma
molcula ligante pode afetar a afinidade de outros stios para seus ligantes.
3.4.1
Macromolculas com um stio de ligao
Considera-se uma molcula P que tem um stio de ligao para uma
molcula A. Na saturao, um mol de P combina-se com um mol de A para formar
um complexo PA.
P + A PA

(1)

A constante de dissociao KD para essa reao definida como:

KD =

[ P ][ A]
[ PA]

(2)

Definindo-se r como o nmero de moles de molculas ligadas a um mol de

macromolculas, ento:

r=

[ A] LIGADA
[ PA]
=
[ P]TOTAL
[ P] + [ PA]

(3)

A maioria das equaes que descrevem ligao so expressas em termos de

KD e r. Para avaliar r, uma concentrao particular [A] de ligantes somado a

uma conhecida concentrao [P] das macromolculas e ento a concentrao de

52

ligantes ligados [PA] ou de ligantes no ligados [A] so medidos. Onde: [A] = [A]
+ [PA] e [P] = [P] + [PA] . Combinando as equaes 2 e 3:
1 KD
=
+1
r [ A]

(4)

Usando esta equao, o grfico de 1/r contra a 1/[A] uma linha reta cujo
coeficiente angular KD.

3.4.2
Macromolculas com vrios stios de ligao.
Muitas macromolculas biolgicas tm mais de um stio de ligao. Por
exemplo, uma tpica molcula de protena pode algumas vezes ligar vrios centros
de ons de H+. Ademais, os stios de ligao no sempre so idnticos.

PUC-Rio - Certificao Digital N 0321568/CA

Mltiplos stios de ligao podem ser independentes ou interativos, no caso

em que a ocupao de um stio influi na ligao de um segundo stio.
Discutiremos aqui stios de ligaes independentes.
Ligaes fortes

No caso de ligaes firmes, assume-se que cada molcula ligante est ligada
se o nmero total de molculas ligantes adicionadas for menor que o nmero total
de stios de ligaes na soluo. Tambm, se a quantidade de ligante adicionado
excede ao nmero n de stios de ligao na soluo, cada um dos stios n
ocupado e os ligantes adicionais permanecem sem ligar. A partir da concentrao
de ligante na qual algumas molculas ficam sem ligar, o nmero de stios de
ligao pode ser medido, isto , a concentrao na qual a quantidade de molculas
ligadas alcana um mximo.
Ligaes fracas
Stios de ligao fracos independentes e idnticos:

Se todos os stios so idnticos e independentes

vamos ter a seguinte

equao:

1 1 KD
= +
r n n [ A]

(5)

na qual KD uma constante de dissociao mdia. Quando a equao (5)

usada, um grfico 1/r em funo de 1/[A] nos d uma linha reta. Se os stios de

53

ligao no so idnticos e independentes nos dar uma curva.

Macromolculas com stios de ligao diferentes mas independentes para o
mesmo ligante:

Muitas macromolculas tm distintos stios para o mesmo ligante e,

freqentemente, cada um tem uma constante de ligao diferente.
Se os stios de ligaes so independentes, o tratamento terico simples;
entretanto, a extrao de informao dos experimentos dificultosa, a menos que
o nmero de classes de stios de ligao seja pequeno e os valores de KD difiram
grandemente para cada classe.
Considera-se uma molcula tendo vrias classes de stios de ligaes
denotadas por 1, 2, 3, .... Quando um ligante adicionado, a ligao pode ocorrer
a qualquer stio, e aqueles stios com maior afinidade para o ligante sero

PUC-Rio - Certificao Digital N 0321568/CA

preenchidos primeiro. Para qualquer concentrao particular de ligantes, cada

classe ter um valor particular de r (r1, r2, ..) que ser determinado pela constante
de dissociao para essa classe. Experimentalmente r, o nmero mdio de
molculas ligantes por macromolcula, medido e igual a r1 + r2 + r3 + ...rn.
Se existem nx stios de classe x, e assim por diante:

r=

n1[ A]
n 2 [ A]
+
+ ...
K D,1 + [ A] K D,2 + [ A]

(6)

3.4.3
Mtodos experimentais para determinao da constante de ligao
Para medida da constante de ligao se usa o mtodo indireto, no qual a
ligao se pode medir observando uma mudana na propriedade fsica da
macromolcula ou do ligante, isto , induzida pela ligao, como por exemplo
mudanas espectrais. Procedimentos espectroscpicos so executados facilmente
sempre que o espectro da macromolcula ou do ligante mude significativamente.
A mudana espectral pode ser um deslocamento no mximo de absoro, um
incremento ou decrescimento na absorbncia, uma mudana na intensidade de
fluorescncia. Se o espectro na ausncia de ligao e o espectro em saturao so
conhecidos, e se a mudana espectral linear com a concentrao do ligante, o
grau de ligao em estgios intermedirios podem ser medidos (Freifelder, 1982).