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13/3/2015

CoursenzymecomplexesubstratetattransitionstereospecificitecatalyseEnseignementrecherchebiochimieenzymologiebioinformatiqueEmma

ENZYMOLOGIE
Historique - site actif - complexe enzyme/substrat - tat de transition - protases
Jaime

41

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1.Historique
5.Leseffetsdelasurpopulation
intracellulairedesmacromolcules
("Macromolecular crowding effects")

2.Spcificitdel'association[protineligand]Notion
desiteactifClassesd'enzymes(E.C. X.X.X.X)
3.Lecomplexeenzymesubstrat
4.Etatdetransition,nergielibred'activationetnergie
libredelaractionenzymatique

6.Illustrationdesprotases
a.Gnralits

b.Lesprotasessrine

a.Gnralits
b.Facteursquiexpliquentlepassagedela
structuredusubstratdansl'tatdetransition
etl'acclrationdelaractionpar
franchissementdelabarrired'activation.

7.Mcanismecatalytiquedesprotases
srine
Annexe:distinctionentreconcentrations

l'quilibreetl'tatstationnaire

c.voir une animation

1. Historique.

Lesorganismesvivantssontlesiged'ungrand nombre de ractions biochimiquestrsdiverses.


Cesractionss'effectuentdansdesconditionso,normalement,ellesnepourraientsefaire.Sielles
ontlieu,c'estparcequ'ellessontcatalysespardesmacromolculesbiologiques:lesenzymes.
Lepouvoirdecatalysedesenzymesestli,entreautre,latrs haute spcificit de reconnaissancedes
molculessurlesquellesellesagissent.
L'enzymologie est la partie de la biochimie qui tudie les proprits structurales et fonctionnelles des
enzymes(relation structure - fonction).

Enparticulier,elles'appliquedcrire la vitesse des ractions catalyses par les enzymes.


Ilestdifficiledesituerexactementladcouvertedelanotiond'enzymeetsurtoutd'enzymeentant
queseulcatalyseurdesractionschimiquesquisedroulentdanslesorganismesvivants.
1783:Lazzaro Spallanzaniarapportquelaviandeestliqufieparunextraitgastrique.Ilanot
galementquelatempratureaungrandeffet.
1814:Constantin Kirchhoffobservaqu'uncomposant"glutineux"(commeill'aappell'poque)debl
convertitl'amidonensucre.
1833:Lapremiredcouverted'uneenzymeestd'habitudeattribueAnselme PayenetJean-Franois
Persoz[Payen A & Perzoz J (1833) "Mmoire sur la diastase, les principaux produits de ses ractions et
leurs applications aux arts industriels" Annales de la chimie et de la physique 53, 73-92].
Ilsonttraitunextraitaqueuxdemaltl'thanolpuisprcipitunesubstancelabilelachaleurqui
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hydrolysel'amidon.Ilsontappelcettefraction"diastase"("sparation"enGrec)puisquecettefraction
sparelesucresolubledel'amidoninsoluble.Onsaitmaintenantquecetteprparationtaitune
solutionnonpurified'amylase.
1834:Theodor Schwannaobtenulepremierunagentactifd'origineanimale(lapepsine)qu'ila
partiellementpurifieentraitantlaparoistomacaleparl'acide.
Ilestimportantdesoulignerqu'l'poquelespremiresobservationsd'activitenzymatiqueont
prcdunenotionclaireetprcisedelacatalyse.Leconceptdecatalyseprovientdel'observationde
l'actiondeladiastaseetdelapepsineparalllementcelledelalevurependantlafermentation:dans
touslescas,une"substance tait change en une autre"sousl'influenced'unagentactif:lecatalyseur.
Al'poque,lalevuren'taitpasencoreconsidrecommeunecellulevivante.
1838:Charles Cagniard de Latourmontraqueleprocessusdefermentationestddesorganismes
vivants.
18581871:LestravauxdeLouis Pasteurconfirmrentcetteide.Pasteurmitl'hypothse
rvolutionnairequeleschangementschimiqueslorsdelafermentationrsultaientdesprocessusdela
viedesmicroorganismesimpliqusdanslafermentation.
Al'oppos,Justus von Liebigprivilgiaitunethoriepurementchimique:un"ferment"taitune
substancechimiqueproduiteparunorganismeendcompositionetlesatomesdecefermenttaient
suppossenmouvementincessant.Cettatd'agitationlevtaittransmisauxatomesdelamolcule
desucre(substratduferment)dontleslmentsdevaienttremaintenuspardesforcesfaibles.Ilen
rsultaitunescissiondusucreenCO2etthanoldontlesliaisonstaientplusfortes.
1860:Marcellin Berthelotfitmacrerdelalevureetobtintunefractionprcipitablel'alcoolcapable
deconvertirlesucroseenglucoseplusfructose.Ilconclutquel'invertase(nomqu'ildonnal'agent
actifdecetextrait)taitl'undesmultiplesfermentsprsentsdanslalevure.L'invertaseestla
fructofuranosidase(E.C. 3.2.1.26).
18761877:Wilhelm Khneadcouvertlatrypsinedansleliquidepancratiquedel'intestindeboeuf
aucoursdesestudessurladigestionintermdiairedesprotinesdansletractusgastrointestinal.Il
aconcluquelatrypsinetaitinitialementinactivepuisconvertieensaformeactive.Cetteobservation
estlabasedelanotiondeprcurseurinactifdesprotasesquel'onappellezymogneetde
l'activationdecezymognepar(auto)protolyse.
1878:Wilhelm Khneproposalenomd'enzyme("En-"et"zum",signifiant"dans le levain")pour
qualifiercesferments.L'additiondussuffixe"ase"aunomdusubstratd'uneenzymepour
dnommercetteenzymeftproposparEmile Duclauxen1898.
1896:Unchimisteallemand,Martin Hahn,tentaitd'isolerdesprotinesdelevure(Saccharomyces
cerevisiae)enbroyant ces levuresdansunmortieravecdusablefinetdeterredediatomes.
Cependant,cetteprparationd'extraitdelevureseconservaitmal.
Hans BuchneretEduard Buchners'intressaientaussiauxextraitsdelevuredansunbutthrapeutique.

Cesextraitstantdestinsl'hommenepouvaientcontenirdesbactricides.Sesouvenantquele
sucrepermetdeconserverlesfruits,Hans Buchner,proposad'ajouterdusaccharosel'extraitde
levurepourleconserver.
Eduard Buchnerobservaquel'adjonctiondesucreentranaitlaformationdebullesdanslemlange.Il
conclutlafermentation,processusdcritparLouis Pasteurcomme"la vie l'abris de l'air".
Enpubliantsesobservations,Eduard Buchnerconcluait:"La complexit de la levure n'est pas

indispensable au droulement de ce processus. Le ferment actif du jus n'est probablement qu'une substance
dissoute, sans aucun doute uneprotine : nous la baptiserons zymase".Pourcettedcouverte,Eduard
BuchnerreutlePrix Nobel en 1907.

Onsaitmaintenantquela"zymase"desextraitsdelevureestenfaitunmlanged'enzymesdont
l'ensemblecatalyselesractionsdelaglycolyse.
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1897:Lammeanne,Gabriel Bertrandobservaquecertainesenzymesrequirentdesfacteurs
dialysablespourleuractivit.Illesnommacoenzymes.
Audbutdu20sicle,degrostravauxfurententreprispourpurifier des enzymesetsurtoutdcrire
leuractivit catalytique en termes mathmatiques.
1902:Victor HenrietAdrian Brownsuggrrentindpendammentquelaformationd'un complexe
enzyme - substrat est un intermdiaire obligatoiredelaractionenzymatique.
Cettesuggestions'appuyaitsurlaformedelacourbeobtenuequandonreportelavitesse
initialedelaractionenfonctiondelaconcentrationensubstrat.AdrianBrownavaittudila
vitessed'hydrolysedusucroseparla-fructofuranosidase,l'invertasedelalevure.
Depluscettesuggestiontaitenaccordavecleconceptdereconnaissance enzyme - substrat du
type "cl - serrure"proposparEmil Fisheren1894.
Victor Henriftdonclepremierdcrirel'quationmathmatiquereliantl'effetdelaconcentration du
substrat la vitesse de catalyse.

Article:V. Henri (1902) "Thorie gnrale de l'action de quelques diastases" C. R. Hebd. Sances Acad.
Sci. 135, 916 - 919

1913:Entudiantlespropritscatalytiquesdel'invertase(sucrose==>fructose+glucose),Maud
MentenetLeonor Michaelisredcouvrirentl'quationdeVictor Henriettablirentlarelationconnue
souslenomd'quation de Henri - Michaelis - Menten.Ilseninterprtrentcorrectementlasignification
desconstantes.
Lepointimportantestquel'obtentiondecettequationreposesurl'hypothsequ'ils'tablitun
quilibre rapide entre les concentrations de l'enzyme, du substrat et du complexe enzyme - substrat(E+S
<==>ES).
Articles:
Michaelis & Menten (1913) "Die Kinetik der Invertinwirkung" Biochemische Zeitschrift 49, 333 - 369
Johnson & Goody (2011) "The Original Michaelis Constant: Translation of the 1913 Michaelis-Menten
Paper" Biochemistry 50, 8264 - 8269

1925:George BriggsetJohn Haldanegnralisrentl'quationprcdenteenintroduisantleconcept


d'tat stationnairepourlaconcentrationducomplexeenzymesubstrat.
Article:Briggs & Haldane (1925) "A note on the kinetics of enzyme action" Biochem J. 19, 338 - 339
Lefaitquelesenzymes sont des protinesneftacceptqu'partirdelafindesannes20.
Denouvelles techniques chimiques et physiquesfurentemployespouranalyserlastructuredes
protines.
1926:James Sumner(PrixNobelen1946)cristallistl'urase.
Annes30:John Northrop(PrixNobelen1946)etsescollaborateurscristallisrentlepepsinogne,la
pepsineetplusieursisoformesdelatrypsineetdelachymotrypsineetdmontrrentlapuretdes
cristauxobtenus.
Annes40et50:Descentainesd'enzymesfurentpurifiesetcristallisespermettantainsil'lucidation
de dizaines de voies mtaboliques.
1955:Frdric Sanger(1erPrixNobelen1958)publialasquencecomplteenacidesaminsd'une
petiteprotine:l'insuline(massemolaire6000Da).
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1957:Lapremire structure cristallographique d'une protine(lamyoglobine),dduitedeladiffractiondes


rayonsX,ftobtenueparJohn Kendrew(PrixNobelen1962avecMax Perutz).
Annes60:Lapremiresquenced'uneenzyme(laribonuclase,massemolaire13700Da)ft
publieen1960etlapremiresynthsechimique(galementdelaribonuclase)ftobtenueen1969.
Lesbiochimistesfocalisrentalorssurlemcanismedel'activitenzymatiqueetsonmodede
rgulation.
1958:Daniel Koshlandaproposlemodle de l'ajustement induit.Lesubstratinduitunchangement
conformationneldusiteactifdel'enzyme.
1961:Christian Anfinsen(PrixNobelen1972)etsescollaborateursontmontrque,pourungrand
nombredeprotines,c'estlasquence en acides amins qui dtermine le repliement de la chane
polypeptidiquedanssonunique conformation native donc active.Cetteconformationestlaplusstable
parcequ'elleaunenergielibreminimale.
1963:William Wallace Clelandproposauneprocdureclaireetuniformepourcrirelesquationsdes
cintiquesdessystmesenzymatiquesplusieurssubstrats.
1965:Jacques Monod(PrixNobelen1965),JeffriesWymanetJeanPierreChangeuxproposrentun
modle cintique (modle MWC)pourlesenzymes allostriques(enzymesdontlacourbedevitesseen
fonctiondelaconcentrationensubstratestunesigmodaleetnonunehyperbole).
1966:Daniel Koshland,Georges NemethyetD. Filmergnralisrentlemodleprcdent(modle KNF)en
incluantlanotiond'ajustementinduitproposparKoshland.
Annes80nosjours:
L'hypothsedeChritian Anfinsen,vrifiepourungrandnombredeprotines(notammentdites
"globulaires")estrestelongtempsl'undesdogmesdelabiologie.
Cependant,partirdesannes1980,2autresprocessusonttmisenvidence:
lesprotines chaperones(RonLaskey1978JohnEllis1987)aidentaurepliementdecertaines
protinesoulesmaintiennentdanslaconformationnativequandlacelluleestsoumisecertains
stress.Parmileschaperonnes,onpeutciter:
lesprotines de choc thermique("Heat Shock Protein"HSP)
leschaperonines
lesprotines LEA("Late Abundant Embryogenesis")
lesprotinesintrinsquement non structures:ellesn'ontpasdestructuretridimensionnellel'tat
libreetn'acquireleurstructurereplie,doncfonctionnelle,quequandellesinteragissentavecleurs
partenairescellulaires.
Desapprochesplusrcentessontvenuescomplterlesconnaissancesacquisespendantplusd'un
sicle:
ledveloppementdediversmodles du repliementdelachanepolypeptidique(exemple:"molten
globule"Wada&Ohgushi,1983).
enparallle,lesmoyensinformatiquesdeplusenpluspuissantsontpermisdedvelopperdes
simulationsutilisantlamodlisationmolculaire,lamcaniquemolculaireouladynamique
molculaire(GROMACS,mthode de Monte-Carlo,mthodeab-initio,...).
denouveauxrepliementsonttdcouvertsetvrifisxprimentalement(dmarche"de novo
protein design"Rosetta)etdesprotines"artificielles"onttcres(exemple:TOP72003).
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desdisciplinesrcentespermettentdecomplterlesconnaissancesacquisesenenzymologie:la
gnomiquestructurale,lagnomique fonctionnelle,laprotomique,lamtabolomique.
ledveloppementd'Internet,lacrationdebases de donnesdeplusenpluscomplteset
spcialises,labioinformatiquesontdesoutilsmodernespourl'enzymologie.
Enzyme Nomenclature
ExPASy (Expert Protein Analysis System)
ENZYME - Enzyme nomenclature database
UniProt

Quelques bases de donnes ddies aux enzymes

Protein Data Bank


BRENDA
ExplorEnz - The Enzyme Database
KEGG LIGAND Database

2. Spcificit de l'association [protine - ligand] - Notion de site actif


a. Toutes les protines(sauflesprotinesintrinsquementnonstructures)se replient dans une
conformation dite native et c'est dans cette conformation qu'elles acquirent leur activit biologique(leur

pouvoirdecatalyseurdanslecasdesenzymes).

Cerepliementaboutitunestructuretridimensionnellefonctionnelleuniquedelaprotine.
b.Cettestructureglobaledelamacromolculepermetunergionparticulire,le site actif(souvent
enfouiauseindelaprotine),d'adopterelleaussiunestructurespatialequiestreconnueparle ligand
spcifique de la protine(et,lecaschant,parunpetitnombredemolculesdontlastructureest

prochedecelleduligand).

Onpeutciterdiverstypesd'associationentreuneprotineetunligand:
lescomplexesenzymesubstrat
enzymergulateur(inhibiteur,activateur,coenzymes,...)
antigneanticorps
histonesADN
rcepteurshormones
hmoglobine - oxgne

Sielleestrversible,l'associationprotineligandcorrespondl'quilibresuivant:
*k1etk1sontdesconstantesdevitesse(constantes
microscopiques).
k1
PL<====>P+L
k1

*k1:constantedevitessedusecondordre(ractionbimolculaire).
Units:mol.L1.s1ouM.s1
*k1:constantedevitessedupremierordre(raction
monomolculaire).Units:s1

Ondfinitlaconstantede

[P]x[L]k11

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dissociation(constante
macroscopique)quiliela
concentrationdescomposs
impliqusdanslaraction:

Kdissociation===

[PL]k1
Kassociation

L'nergie libre de Gibbsdeformationdescomplexesesttrsvariablecommelemontreletableau


suivant:
Protine

Ligand

Kdissociation (M)

G(kcal.mol1)

Carboxypeptidase

phnylpropionate

5103

3,2

Trypsine

butylamine

103

4,2

adnosinediphosphate(ADP)

1032105

4,26,5

Homosrinedshydrognase

NADPH

3107

MthionineARNt synthtase

mthionyladnylate

2109

12

Histone

ADN

1011

15

Apohmoglobine

hme

1013

18

Phosphofructokinase(2

conformations)

Source : "Biochimie" Chapeville, Clauser et al. (1974) Ed. Hermann

c.Lesite actifestconstitud'un petit


nombre d'acides aminsquileplussouventne

sontpascontigusdansl'enchanementdela
chanepolypeptidique.
Cesacidesaminssontcaractrissparune
chane latraledontlafoislanature
chimique(groupementionisableou
polarisable)etlastructure(encombrement
strique)sontspcifiquementadaptsla
reconnaissancedu(oudes)ligand(s).
Lastrochimiequirsultedecet
agencementuniquedesacidesaminsqui
constituentlesite actifestlacausedela
strospcificit de reconnaissanceentreces
acidesaminsetle(oules)ligand(s).

Source : Enzyme Mechanisms


d.Lesenzymesnefixentpasseulementunligand(quidanscecass'appelleunsubstrat).Ellesle
transformentenunproduitlorsd'uneractionchimique.Certainsacidesaminsdusiteactifontpour

fonction,nonpasdefixerlesubstrat,maisdefournirlesgroupementschimiquesncessairesla
ractioncatalyseparl'enzyme.
Danslecasdesenzymes,ondistinguedoncauseindusite actif:
lesacidesaminsquiconstituentlesite de fixation(cesacidesaminsn'ontpasdefonction
chimiqueimpliquesdanslaraction)
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lesacidesaminsquiconstituentlesite catalytique

Les diffrentes classes d'enzymes

Laclassificationtablieparlacommissiondesenzymesdel'UnionInternationaledeBiochimieetde
BiologieMolculaire(sigleanglais"IUBMB")attabliesurdescritresdespcificit.
Lanomenclaturedesenzymess'critdemaniregnralesouslaforme:E.C. X.X.X.X(E.C.:
"Enzyme Commission").
Lalistedetouteslesenzymes,leurnomenclatureetleuridentifiantECestdisponibledanslabasede
donnes: Enzyme Nomenclature and Classification of Enzyme-Catalysed Reactions

1erX

Ractioncatalyse

exempledecoenzyme
impliqu

X=1:oxydorductases(E.
oxydorduction
NAD(P)+
C.1.X.X.X)
Lepremier
X=2:transfrases(E.C.
transfertdegroupes
phosphatedepyridoxal
"X"
2.X.X.X)
correspond
X=3:hydrolases(E.C.
aux6typesde
hydrolyse
aucun
3.X.X.X)
ractions
X=4:lyases(E.C.
additiondegroupedesatomes
pyrophosphatede
catalysespar
4.X.X.X)
engagsdansdesdoublesliaisons
thiamine
lesenzymes.
X=5:isomrases(E.C.
isomrisation(depositionde
phosphatedepyridoxal
5.X.X.X)
groupeoudefonction)
X=6:ligases(E.C.
condensationdedeuxmolcules
ATP
6.X.X.X)
Remarque : dans les banques de donnes, on trouve une catgorie "Autres" exemples : kinases,
phosphoprotines, "Mutator transposons".

2meX
Considronslegroupe 1 des
oxydorductases:
le2me"X"permetunclassement
supplmentaireenfonctiondela
naturedugroupedudonneur
d'lectronssurlequell'enzymeagit.

Considronslegroupe1.4des
oxydorductasesquiagissentsurle
groupeCHNH2dudonneur
d'lectrons:
le3me"X"permetunclassement
supplmentaireenfonctiondela
naturedugroupeaccepteur
d'lectronssurlequell'enzymeagit.

X=1:E.C.1.1.X.X
X=2:E.C.1.2.X.X
X=3:E.C.1.3.X.X

l'enzymeagitsur:
legroupeCHOHdudonneur
d'lectrons
lafonctionaldhydeouoxodu
donneurd'lectrons
legroupeCHCHdudonneur
d'lectrons
etc...

X=19:E.C.1.19.X.X

laflavodoxinerduite

X=97:E.C.1.97.X.X

autresoxydorductases

3meX

l'accepteurd'lectronsest:

X=1:E.C.1.4.1.X

NAD+ouNADP+

X=2:E.C.1.4.2.X

uncytochrome

X=3:E.C.1.4.3.X

l'oxygne

X=4:E.C.1.4.4.X

ungroupedisulfure

X=7:E.C.1.4.7.X

uneprotinefersoufre

X=99:E.C.1.4.99.X

autresaccepteurs

Remarque : il n'y a pas de classe E. C. 1.4.5.X et E. C. 1.4.6.X


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Considronslegroupe1.4.1des
oxydorductasesquiutilisentle
NAD+ouleNADP+comme
accepteurd'lectrons:
le4me"X"permetunclassement
supplmentaireenfonctiondu
substratsurlequell'enzymeagit.

4meX

Nomdel'enzyme

X=1:E.C.1.4.1.1

alaninedshydrognase

X=2:E.C.1.4.1.2
X=3:E.C.1.4.1.3
X=4:E.C.1.4.1.4

glutamatedshydrognase
glutamatedshydrognase
(NAD(P)+)
glutamatedshydrognase
(NAD(P)+)
etc...

X=19:E.C.1.4.1.19

tryptophanedshydrognase

X=20:E.C.1.4.1.20

phnylalaninedshydrognase

L'exempledelaglutamate dshydrognase(E.C.1.4.1.2,E.C.1.4.1.3etE.C.1.4.1.4)metenvidencela
notiond'isoenzymesoud'isoformesdela"mme"enzyme.
Voirlabasededonnes:ExplorEnz - The Enzyme Database
Voirl'article:Sorokina et al. (2014) "Profiling the orphan enzymes" Biology Direct 9, 10

3. Le complexe enzyme - substrat

Laformationinitialed'uncomplexe [enzyme - substrat] ES ou complexe de Michaelis-Menten-Henri,


NON covalent,ftsuggred'aprslesobservationssuivantes:
Lehautdegrdespcificit de la reconnaissance d'un substrat par le site actif d'une enzyme.Pour
l'expliquer,Emil Fishersuggraen1894quecettereconnaissancersulted'unetrsforte
complmentaritdesstructures(maisaussidelanaturechimiquedesgroupements
ractionnels)dusubstratetdel'enzymequilefixe,commelesontunecletlaserruredans
laquelleelleentre.
La forme de la courbe dite de saturation(voirhistoriquecidessus:VictorHenri,1902etAdrian

Brown,1902):vitesseinitialedelaractionenzymatiqueenfonctiondelaconcentrationen
substratouvi=f([S]).
Lefaitquelessubstratsprotgentsouventlesenzymesdel'inactivation(O'Sullivan&
Tompson,1890).
L'hypothse"clserrure",bienqu'extrmementsatisfaisante,ne peut rendre compte de certaines
observations:

Parexemple,certainscompossquiressemblentchimiquementunsubstratmaisquiontdes
groupementsmoinsvolumineuxnesontpascatalyss,bienqu'ilsdoiventencoremieuxs'insrer
danslesiteactif.
Ilexisteunmcanismeenzymatiquedeuxsubstratsappel"fixation ordonne"pourlequelun
substratBnepeutsefixerquesilesubstratAl'estdj.Or,selonl'hypothse"clserrure",le
substratBdevraitsefixerd'emble.
Nature des forces dans les associations [enzyme - substrat]
forces d'interactions lectrostatiques:entreatomesougroupesd'atomesquipossdentune

chargelectriquepermanente.Interactionsentre2ions,1ionet1dipleouentre2diples
permanents.
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forces d'induction:rsultentdel'inductiond'undipledansungroupenonpolairesoumisau

champlectrostatiqued'unechargepermanente.Ondistinguelesinteractionsentreunionetun
dipleinduitouentreundiplepermanentetundipleinduit.Cesinteractionssontclasses
danslesinteractionsdeVanderWaalsoudanslesinteractionslectrostatiques.
interactions lectrocintiques ou forces de dispersion de London:interactionsentregroupesnon
polairesduesl'inductionmutuelledediplesquifluctuent.
rpulsions courtes distances:rpulsionslectrostatiquesentreleslectronsparsuitedu
recouvrementdesnuageslectroniquesde2atomes.
liaisons hydrogne:seformententre2atomeslectrongatifsrelisparunatomed'hydrogne.
Ellessontdenaturelectrostatique.
interactions hydrophobes:interactionsentregroupementsnonpolairesdansl'eau.Ellesrsultent
delarorganisationdelastructuredel'eauenprsenced'uncomposnonpolaire.Les
molculesd'eauautourd'uncomposnonpolairesontorganisesdemaniretablir le
maximum de liaisons hydrogneautourd'elles.L'accroissementd'entropiedladsorganisation
delastructuredurseaudemolculesd'eauconstituelacontributionmajeurel'nergiedes
interactionshydrophobes.
liaison covalente:partaged'unepaired'lectronsentre2atomes.Cetypedeliaisonestparfois
impliqudanslescomplexes[enzymesubstrat](exemples:acyl-enzymeouphosphorylenzyme)
:elleintervientalorsdansunetapeconscutivelaformationducomplexedeMichaelis
MentenHenriquiestnoncovalent.

SiKS est la constante de dissociationducomplexe


[enzymesubstrat],l'nergielibredeGibbsde
formationducomplexeest:G=RTLn(1/KS).
LesvaleursdeGpourlaformation du complexe de
Michaelis-Menten-Henrisontgnralementassezfaibles
ettoujoursngatives.
End'autrestermes,laformationdupremiercomplexe
s'accompagned'unediminutiondel'nergielibrede
Gibbsdusystme:c'estdoncunprocessusspontan.

Exemples de valeurs de paramtres thermodynamiques de l'association [enzyme - substrat] ou [enzyme inhibiteur]

Enzyme

Substratouinhibiteur

Chymotrypsine

mthylhydrocinnamate
benzoylLtyrosinethylester
benzoylLtyrosine

G(kcal.mol1) H(kcal.mol1)

S(u.e.)

1,9
3,3
0,9

5,3
8,4
9,9

11,4
17,1
30,0

carboxybenzoxyLtryptophane
carboxybenzoxyglycylL
Carboxypeptidase
phnylalanine
carboxybenzoxyglycylL
tryptophane

3,4
2,5
3,4

5
0,4
0

28,0
7,0
11,5

carboxybenzoxyLglutamylL
tyrosinethylester

4,7

1,4

20,6

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Pepsine

carboxybenzoxyLglutamylL
tyrosine

4,3

3,0

24,4

Urase

ure

3,2

2,9

0,9

ATPase

ATP

7,5

52

Source : "Enzymologie molculaire et cellulaire" J. Yon-Kahn & G. Herv (2005) Coll. Grenoble Sciences
(EDP Sciences)

Lavariationd'entropiersultede3 contributions:
laformationd'unemolcule(lecomplexe)partirde2molcules(enzymeetsubstratou
enzymeetinhibiteur)quis'accompagned'unediminutiond'entropie(S1<0)
l'exclusiondusolvantautourdesmolculesdesubstratetdusiteactifdel'enzymelorsde
l'association.Lesmolculesd'eaupassentd'untatstructuruntatmoinsstructurdans
l'eauenvironnante(S2>0)
les2facteursprcdentssontinsuffisantspourrendrecomptedesvariationsd'entropie
observes.La3mecontributionestlieauxvariationsdelaconformationdelaprotinelorsde
l'associationaveclesubstrat(S3<0ouS3>0)
Diverses thoriesonttproposespourexpliquerlesmodificationsstructuralesdusubstratet/oude

l'enzymelorsdeleurassociation.

a. Henry EyringetRufus Lumry(1954)ontproposle modle appel "rack"(traduction:chevaletde

torturetourmenter).

C'estlesubstrat qui subit un changement conformationnel,lastructuredel'enzymetantconsidre


commerigide.
Lersultatestunaccroissementdelalabilitdesliaisonsrompredanslamolculedesubstrat
puisqueceluici,bienquefixdemanirelche,subitdestensionsdanssesliaisonsquil'amnent
dansuneconfigurationprochedecelledel'tatdetransition.
b.En1958,Daniel Koshlandaproposlemodle dynamique de l'ajustement induit("induced fit").

Lesubstratinduit un changement conformationnel du site actifdel'enzyme.Lesorbitalesdes


groupementscatalytiquesetdugroupementractionneldusubstratsontalignesdemanireoptimale
pourl'actecatalytique.
Al'inverse,desmolculesquiontunestructureanaloguecelledusubstratpeuventsefixermais
l'orientationspatialedesgroupementsnepermetpasl'actecatalytique.
Article:Koshland D.E. (1958) "Application of a Theory of Enzyme Specificity to Protein Synthesis" PNAS
44, 98.

Danslemodledel'ajustementinduit(figure ci-contre):
E:formeinactivedel'enzyme
E':formeactiveprdominante en prsence du substrat
maisnonsignificativementexistanteensonabsence
K1<<1etK4>>1doncK2>K3c'estdireG2>
G3.
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Puisque:K1.K2=K3.K4alorsK4>K1.
Conclusion:enprsencedesubstratlaformeE'Sest
favorise.
Figureadaptede"Enzymologie molculaire et cellulaire" Yon-

Kahn & Herv (2005)

Exemplesenfaveurdechangementsconformationnelsdel'enzymeconscutiveslafixationdu
substrat:
Danslecasd'unmcanisme ordonn 2 substrats,lafixationdupremierinduitunchangement
deconformationquirvlelesitedefixationdusecondsubstrat.Parexemple,l'hexokinasede
levuresereplieendeuxdomainesstructurauxrelisparunergionflexibleappele
"charnire".Cetteenzymecatalyselaphosphorylation(parl'ATP)duglucoseenglucose6
phosphate.Quandellefixeleglucose,l'hexokinasesubitunprofondchangementde
conformation:lesdeuxdomainesserapprochentl'undel'autreparunmouvementd'environ
12,cequiaugmentel'hydrophobicitdusiteactifetprvientl'hydrolysedel'ATP.
L'inhibition non comptitive:uninhibiteurnoncomptitifnesefixepassurlesiteactifdoncle
complexe[enzymeinhibiteur]nedevraitpasperdresonactivitsil'enzymenechangeaitpas
deconformation.
c.En1966,Williams Jenksaproposlemodleappel"strain"(tensiondformation).

C'estunecombinaisondesdeuxthoriesquiprcdent.Leschangementsdeconformationdel'enzyme
entranentdescontraintesdanslastructuredusubstrat.
d. Ajustement induit ou slection induite ?

Unequestioncentraleestdesavoir:
sileligandinduitlechangementdeconformationdel'enzyme("induced-fit")aprss'trefix
ousileligandstabilise/favorise(enlaslectionnant)uneconformationdel'enzyme
complmentaireduligandparmiunensembled'tatsfondamentauxetexcitsdel'enzymeprexistants("selected-fit"ou"conformational selection")

Lafigure ci-contreillustrelesdeuxmodles:
Enabsencedeligand:E1estlaconformationdel'tat
fondamentaldel'enzymeetE2estlaconformationde
l'tatexcit
QuandleligandLestfix:E2Lestlaconformationde
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l'tatfondamentaletE1Lestlaconformationdel'tat
excit
Modle"induced-fit":leligandsefixesurla
conformationdel'tatfondamentalE1
Modle"selected-fit":leligandsefixesurla
conformationdel'tatexcitE2
Ku:Kunbound
Kb:Kbound

Source :Weikl & Deuster (2009) Proteins


75, 104-110

4. Etat de transition, nergie libre d'activation et nergie libre de la raction enzymatiquevoir une
animation
a. Gnralit

Commetoutesmolcules,unsubstratetunproduitd'uneractionenzymatiquesontcaractrisspar
desliaisons chimiques.
Aucoursd'uneraction,deschangesd'nergieaveclemilieuenvironnantontlieu:certainesliaisons
dusubstratsontrompuesenabsorbantdel'nergieetlesliaisonsduproduitsontformesenlibrant
del'nergie.
Danslecasd'uneractionexergonique,l'nergiencessairepourromprelesliaisonsdusubstratest
infrieurel'nergielibrelorsdelaformationdesliaisonsduproduit.L'nergierequisepourque
laractionaitlieu(l'nergiencessairepourquelesliaisonsdusubstratsoientrompues)s'appelle
l'nergie libre d'activation : G#.
Lorsdel'absorptiondecettenergie,lavitessedesmolculesdesubstratsaugmenteetdoncla
frquenceetlenombredecollisionsentremolculesdesubstratsetd'enzymeaugmententaussi.
Paralllement,l'augmentationdel'agitationthermiquefragiliselesliaisonsquisontdoncplusfaciles
rompre.
Eyring a propos la thorie de l'tat de transitionen1935:quandtoutel'nergied'activationest

absorbe,lamolculedesubstratestdansl'tatdetransition(lesanglesetleslongueursdesliaisons
chimiquesdusubstratsontdistordues).C'estl'tat le plus nergtique, donc le plus instable.La
ractionvoluespontanmentversuntatnergtiqueplusfaible,laformationduproduitdela
raction.
Poursapart,ladiffrenced'nergielibredeGibbsentrelesproduitsetlessubstratsestlavariation
d'nergie libre de Gibbs de la raction:Graction.
Ilfautnoterquemmedanslecasd'uneractionexergonique,lessubstratsdoiventfranchirla
barrired'activation.Cettebarrireestessentiellepourlavie:sanselle,lesmacromolcules
(protines,acidesnucliques...)fortpotentielnergtiquesedcomposeraientspontanment.
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Danslesconditionsdelaviecellulaire,peudemolculepeuventfranchirlabarrired'activationdans
unlapsdetempscompatibleaveclesprocessusbiologiques.Parexemple,ledemitempsde
dsaminationdel'adnosine20CetpH7estd'environ20.000ans!
Seulel'interventiond'uncatalyseurbiologique,uneenzyme,lepermet.
Uneenzyme augmente la vitesse de la raction en abaissant l'nergie d'activation:lamme
temprature,lessubstratsfranchissentplusfacilementetdoncplusfrquemmentlabarrire
d'activation.
Enconclusion:
lesenzymesne modifient pas la variation d'nergie libre de Gibbsdelaraction:laconstante
d'quilibrededissociation(Kdissociation)d'uneractionn'estpasmodifie.
enrevanche,lesconstantes de vitessemicroscopiques(k1etk1)sontmodifiesdanslemme
rapport.
b. Facteurs qui expliquent le passage de la structure du substrat dans l'tat de transition et l'acclration
de la raction par franchissement de la barrire d'activation.

Voiruntrsboncours:Enzyme Mechanisms
L'tatdetransitionestunarrangementdeliaisonschimiquesentraindeseformeretdeserompre
puisquec'estunestructureintermdiaireentrecelledusubstratdontilestissuetcelleduproduit
qu'ilvaformer.
L'tatdetransitionestdoncunestructurehautementnergtiquedoncinstable.Surleplan
thermodynamique,l'undesfacteursessentielsdel'efficacitcatalytiqueestlacomplmentaritde
l'enzymepourl'tatdetransitiondusubstratetnonpoursontatfondamental.
Parailleurs,lavitessed'uneractionenzymatiquedpenddel'efficacit de la rencontre / collision
entrelesmolculesquivontformerl'tatdetransition.
Cetteefficacitdpendlafois:
del'orientationdesmolculesl'uneparrapportl'autre
d'unenergieminimalerequiseappelenergie d'activation
1er facteur : les deux grands types chimiques de mcanismes catalytiques

.La catalyse acide-base gnrale:c'estlemcanismelepluscourantdelacatalyseenzymatique.


L'acclration de la ractionrsultedutransfert d'un proton.
Parexemple,ceprotonpeutprovenirducouple[imidazole/imidazolium]delachanelatralede
l'histidinepuisqu'elleaunpKasituentre6et7etconstitueaupHphysiologiqueungroupe[donneur
/accepteur]deproton.
L'activitcatalytiquedesenzymesdecetypeestlargementinfluence par le pH.
Exemplesdegroupesfonctionnelsd'acides aminsquipeuventagirentantquecatalyseuracide/base:
groupementimidazoledelachainelatraledeHis
groupementamin
groupementcarboxylique
groupementthioldeCys
groupementcarboxyliquedeGluetAsp
groupementamindeLys
groupementphnoldeTyr
groupementguanidinodeArg
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.La catalyse par covalence(aussiappelecatalysenuclophile):elleconcerneessentiellementles


ractionsenzymatiquesoplusieurssubstratssontimpliqus(environ20%desenzymesettoutesles
enzymesquicatalysentunmcanisme2 substratsdetype"ping-pong").
Unepartiedupremiersubstratesttransfrel'enzymevialaformationd'uneliaison covalentepuis
cettepartiedusubstratesttransfreausecondsubstrat.

2me facteur : l'effet de


voisinage

Lafixationd'unemolculede
substratausiteactifd'une
enzymeaugmentela
concentrationeffectivedu
substratparrapportsa
concentrationl'tatlibreen
solution.
Lesmolculesnesontplus
assujettiesauhasardde
collisionssuffisamment
nergtiques.
Cetaccroissementde
concentrationaugmente la
frquence de formation de
l'tat de transition.

3me facteur : la
fixation
prfrentielle de
l'tat de
transition

L'enzyme fixe

plus fortement
l'tat de
transitionquele

substratoule
produitpour
desraisonsde

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contrainteoude
distorsion.
L'tatde
transition
s'ajustemieux
ettablit
davantagede
contactsavecles
rsidusd'acides
aminsdusite
actif.
C'esttrs
probablement
l'enzymequi
subitdes
changementsde
conformation
(voirajustement
induit)carilest
peuprobable
qu'ilyait
suffisament
d'nergiedans
lafixationdu
substratpouren
contraindrela
structure.

4me facteur : la stabilisation de l'tat de transition

Quandlecomplexe[enzymesubstrat]estform,ilestenquilibreavecsaformeactive,c'estdire
lecomplexe[enzymetatdetransition]ouES#.
Lastabilisationdel'tatdetransitiondplacel'quilibreenfaveurdeES#etenmmetempsabaisse
l'nergied'activation.
Ilestimportantdenoterquecephnomneexigeunefixation lche du substrat(attention:pasune
fixationlchedel'tatdetransition)l'enzymecarunefixationtropforteiraitl'encontredela
catalyse.
L'enzymedoitdoncmaintenirlesubstratenplacetantquel'tatdetransitionn'estpasatteintmais
sansl'immobiliser.Siteltaitlecas,lecomplexeESformseraittropstablepouratteindresa
configurationdel'tatdetransition(ES#).
5me facteur : la catalyse lectrostatique

Uneprotinepossdedenombreuseschargesainsiquedesdiplesquicrentdeschamps
lectrostatiquesdontl'intensitesttrsvariableselonlesendroitsdelaprotine.Depluscescharges
fluctuentenfonctiondeschangementsdeconformationdelaprotine.
Quandlesubstratsefixel'enzyme,lesmolculesd'eausontdemaniregnrale"exclues"dusite
actif(effetdedsolvatation).
Laconstantedilectrique"locale"estdoncabaissecequiaccroitlesforcesd'interaction
lectrostatiquesauniveaudusiteactif.
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Cetteexclusionprotgelesgroupementsractifsderactionsparalllesavecl'eau.
Ainsi,leschampslectrostatiquescrsparlaprotineauniveaudusiteactifsontcomplmentaires
deladistributiondeschargesdusubstratdansl'tatdetransition.
Uncas particulierestl'eauquiagitcommesubstrat(exempledesprotases srine).
L'ensembledecesfacteursrendcomptedesvaleurs d'acclrationcourammentobservesavecles
enzymescommel'indiqueletableausuivant:
Vitesse non enzymatique (s-

Enzyme

1)

Vitesse enzymatique (s-1)

Facteur
d'accroissement

Chymotrypsine

4109

4102

107

Lysozyme

3109

5101

2108

Triose phosphate isomrase

6107

2103

3109

Fumarase

2108

2103

1011

Urase

31010

3104

1014

Dsaminased'adnosine

1012

102

1014

Phosphatasealcaline

1015

102

1017

Source : "Principes de Biochimie" Horton, Moran, Ochs, Rawn, Scrimgeour (1994), Ed. DeBoecK Universits

5. Les effets de la sur-population intracellulaire des macromolcules ("Macromolecular crowding effects")

Lesconditions"idales"d'tudedescintiquesenzymatiquesnerefltentpaslaralitcellulaire.
Lemilieuintracellulairen'estpasrempliqued'eauetd'ions:ilcontientunetrsgrandevaritde
petitesmolculesetdemacromolcules(protines,acidesnucliques,oligosaccharides,acidesgras,
mtabolites,...).
Laconcentrationdesmacromolculespeutvarierde
200400mg/mlselonl'organismeetlestypesde
cellules:
chezEscherichia coli,laconcentration
intracellulairedesmtabolitesestvalue300
mM(100millionsdemolculesde
mtabolites/cellule)
laconcentrationdelaprotinecristallineatteint
500mg/mldanslescellulesdelalentille
laconcentrationdel'hmoglobinedansles
hmatiesestenviron350mg/ml
lespolysaccharidescontribuentgalementcet
encombrement,enparticulierdanslamatrice
extracellulaire
Source : McGuffee & Elcock (2010)

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Sionconsidreuncubede100nmd'arte,levolumeducytoplasmedeEscherichia colicorrespond
600cubesdecettetaille.
Dansundecescubes,coexistent:30ribosomesavecplusde100facteursprotiques,30aminoacylARNt synthtases,340ARNdetransfert,23ARNmessagers,6ARNpolymrases,330protines
(dont130enzymesdelaglycolyseet100enzymesducycle de Krebs),300autresmolcules,30.000
petitesmolcules(H20,cofacteurs,prcurseursetmtabolites)et50.000ions.
ChezlesEucaryotes,lemilieuintracellulairecontientenplusl'ensembledesprotinesquiconstituent
lecytosquelette.
Dansuneexpriencein vitro,cemmecubenecontientqu'une molcule d'enzyme, les sels du tampon et
les molcules d'eau.
Leseffets de la sur-population intracellulaire sont non linaires:pluslamacromolculeaunemasse
(doncbiensouventunetaille)importante,pluselleensubitleseffets.Ceseffetssontdoncnettement
moinsimportantspourlespetitsmtabolitesetlesions.
Aucuneespcemacromolculairen'estprsenteforteconcentrationindividuellement.Mais,
ensemble,lesmacromolculesoccupentunefractionimportanteduvolumetotal:de 20 30 %.
Cettefractionduvolumeintracellulairen'estdoncphysiquementpasdisponiblepourd'autres
molcules.Cetteexclusion striqueadesconsquencesconsidrablesdupointdevuenergtique:
laconcentrationeffectivedesmacromolcules(plusprcismentleuractivit chimique)est
augmente:celmodifieconsidrablementlesvitessesdesractions,donclesconstantes
d'quilibredesractionsin vivo.
lasurpopulationintracellulairefavoriselerepliement des protines,l'autoassociationde
monomres(ladimrisationestaugmented'unfacteur840pourunmonomrede40kDa)et
lesassociations[protinesprotines]et[protinesautrescomposantsdelacellule].
l'augmentationdesinteractionsentreprotinesaune incidencesurlaconformationdesenzymes
etdoncsurleuractivit enzymatique.
l'augmentationdelastabilitdesprotinesdansdesconditionsdesurpopulationdes
macromolculesrsulted'unediminutiondel'entropiedeladnaturationdesprotinessans
changementassocidel'enthalpie.
uneautreconsquencecapitaledelasurpopulationintracellulaireestlaforte limitation(d'un
facteur1020,enmoyenne)deladiffusiondesmolcules:in vivo,ilfaut2suneprotinede
160kDapourparcourirunedistancede10nmalorsqu'ilneluifautque2nsdansunesolution
homogne.
Effets de la sur-population intracellulaire sur l'activit enzymatique

Lemilieuintracellulairediffredoncconsidrablementd'unesolutionhomogne(conditionsin vitro)
danslaquellelesmacromolculesbiologiquessontdisperses(trsdilues):lesconcentrations des
enzymesin vivosontdel'ordrede105104M,valeurs trs suprieuresauxconcentrationsdesenzymes
in vitro(del'ordrede1010107M).
UnetudedumtabolomedeEscherichia coliamontrquelaconcentrationdesmtabolitesest
suprieurelavaleurdeleurKMpourlagrandemajoritdesenzymes.

Exemples d'effets de la sur-population intracellulaire sur les paramtres cintiques de la catalyse par
quelques enzymes

Lasurpopulationintracellulaireestsimulein vitroparl'addition,danslemilieudemesurede
l'activitenzymatique,d'agentstelsquelepolythylne glycol(PEG),leFicoll,ledextranoul'albumine
de srum bovin(BSA).
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L'activitenzymatiqueaugmentepuisdiminueavec
l'augmentationdelaconcentrationenprotines.
L'activitenzymatiquediminuedefaonmonotoneavec
l'augmentationdelaconcentrationdepolymres.
L'activitspcifiquedel'uraseaugmentejusqu'10foisen
prsenced'uneconcentrationd'hmoglobinede30%(en
L'additiondePEG400020.000:
poids).
augmentel'activitdelaDNase
LePEG6000augmentel'activitdel'enzymeAspPde
I(KMn'estpasmodifipas
Escherichia coli:uneconcentrationdePEG50mg/mL
diminueKMd'unfacteur4etaugmenteVMaxd'unfacteur6.
VMaxestaugmented'un
facteur20)etdelanuclaseS1
Ledextran70.000,leFicoll70.000oulePEG6000augmente
l'activitenzymatiquedel'isochorismatesynthase:une
nemodifiepassignificativement
concentrationde25%del'undecesadditifs,diminueKM
l'activitdel'exonuclaseIII
d'unfacteur23.
L'activitspcifiquedel'hexokinasediminuedes
concentrationslevesdeBSA:uneconcentrationdeBSA
de250mg/mLdiminuekcatde33%etdiminueKMde25
%.

diminuel'activitde
l'exonuclaseI

Leseffetsdespetitsosmolytesetdesconcentrationsleves
deBSAsurl'activitdel'hexokinasesontadditifs.

6. Illustration des protases


Voir un cours sur les protases.
a. Gnralits

Lesprotinesoulespeptidessonthydrolyses enfragmentspeptidiquespardesprotases.Ilenexiste
plusieursfamillesconstituesd'untrsgrandnombred'enzymes:

protases srine

trypsine(EC
3.4.21.4)

LysC

thrombine

chymotrypsine
lastase

mtallo-protases

aminopeptidasesA,
B,N,O
carboxypeptidases
A1A6,B,E,M,N,
U

aspartyl-protases

pepsinesA,
A4,A5
retropepsines
dede
rtrovirus
chymosine
rnine
cathepsines
D,E

subtilisine
cathepsine
angiotensinkallikrine
converting-enzyme 2
prostasine
peptidases
granzyme
(hydrolysede
facteursVIIa,
peptidestelsquedes
IXa,Xaet
neurotransmetteurs) etbiend'autres...
XIIadela

etbiend'autres...
coagulation
etbiend'autres...
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protases
cystine

cathepsines
B,F,H,K,
L,O,S,V,
W,X
calpanes1
15
caspases1
10
ubiquitinyl
hydrolases

protases
thronine

sous-units
catalytiques
du
protasome

taspase

asparaginase

ubiquitinyl
spcifiques etbiend'autres
peptidases ...
154
secernine
etbiend'autres

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...

Touteslesinformationsfonctionnelles(spcificitdessubstrats,inhibiteurs,squencesetautres)et
structuralessontrecensesdansdesbasesdedonnestellesque:
The Proteolysis Map
The MEROPS database
b. Les protases srine

Lesdeuxfamillesdeprotases srine("chymotrypsin-like"et"subtilisin-like")contiennententreautres
:latrypsine,lachymotrypsine,l'lastase,lasubtilisine(voir tableau ci-dessus).
Chymotrypsine:en1901,H.M.Vernonaproposquelesprparationsdepancrascontiennentun
activateurintrinsquesespropresenzymes.Cetteideneftacceptequ'en1934quandMoses
KunitzetJohn Howard Northropontconfirmlaprsenced'uneenzymeenplusdelatrypsine:ilsl'ont

nommechymotrypsine.Ilsl'ontcristallisedemmequesonprcurseurinactif,le
chymotrypsinogne.

En1938,M.Kunitzaisoldiffrentesformesactivesdelachymotrypsineenlesappelantalpha,bta
etgamma.En1947,Jacobsenaidentifidesformessupplmentairesdelachymotrypsineenles
appelantdeltaetpi.
LedomaineprotiqueappelKunitz(oudomaineinhibiteurdeprotasesdetypeKunitz)estun
domainequiinhibelesprotases.Ilestrelativementpetit(5060acidesamins).Exemple:
l'aprotinineouinhibiteurdelatrypsinepancratiquebovine(BPTI).
En1954,lapremirepreuvedumcanismecatalytiqueen3tapesdel'hydrolysedesubstratsamide
etesterparlachymotrypsineatapporteparBrian HartleyetB. Kilby.Ilsontmisl'hypothse
d'uneformeacylenzymeintermdiaire,cequifutdmontrultrieurementparHendersonen1970.
Lachymotrypsinesuitunmcanisme gnral de type "ping-pong".
En1955,Michael Laskowski Jr.aobtenuunedeuximeformecristallineduchymotrypsinogne
(chymotrypsinogneB).
Trypsine:en18761877,Wilhelm Khneadcouvertlatrypsinedansleliquidepancratiquede

l'intestindeboeufaucoursdesestudessurladigestionintermdiairedesprotinesdansletractus
gastrointestinal.Ilaconcluquelatrypsinetaitinitialementinactivepuisconvertieensaforme
active.Cetteobservationestlabasedelanotiondeprcurseurinactifdesprotasesquel'onappelle
zymogneetdel'activationdecezymognepar(auto)protolyse.
En1931,J.H.NorthropetM.Kunitzontcristallislatrypsineaprslapremirepurificationdela
pepsineen1930.
En1974lastructuretridimensionnelledelatrypsineatdtermineetaservideprototypepourla
familledesendopeptidases srine de type S1laquellelatrypsineappartient.
De19871992,destudesdemutagnsedirige(trypsinerecombinante)ontpermisdedterminer
lerled'acidesaminsparticulier.
Latrypsineestutilisedanslesprotocolesdeculturesdecellulesetdetissus,dansl'identificationdes
protinesparsquenagedepeptides(protomique et spectromtrie de masse).Latrypsineestune
protasetrstudiedansdiversdomainesmdicaux:lamutationR117Hempchesonautolyseet
provoquelapancratite.Latrypsineatutilisepourmodliserladcompositionducartilage
articulairedansl'ostoarthrite.
Elastase:onattribueChristiaan Eijkmanlespremirestudesdel'lastaseen1904,commeproduitdes
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bactries.IlafalluattendrelestudesdeJ. BaloetI. Bangaen1949pourdmontrerqu'elleestune


enzymeprotolytiquedupancrascommelatrypsineetlachymotrypsine.
En1968,David ShottonetBrian Hartleyontobtenulespremierscristauxd'lastaseporcine.Lerlede
l'lastasedansl'emphysme,l'athrosclroseetlapancratiteaiguhmorragiqueattudientre
1968et1974.
En1974,W.Ardeltadcouvertundeuximetyped'lastaseappelelastasepancratiqueII.
Lesprotases srinesontprobablementlesenzymes les plus tudiestantdupointdevuedu
mcanismecatalytique(voir ci-dessous)avecuntrsgrandnombred'inhibiteursdetoutessortes,que
dupointdevuestructural.Parexemple,ondnombreplusde900 structures cristallographiqueslies
latrypsine(trypsine,trypsinogne,Kunitz trypsin inhibitor,...).
Lesprotases srine:
sontbiosynthtisessourformed'unprcurseurinactif,lezymogne,quiestactivparcoupure
protolytiquepardesprotasessrine.
sontessentiellementdesendopeptidases.
hydrolysentlaliaisonpeptidiqueenfonctiondelanaturedecertainsacidesamins.
Parexemple,latrypsinehydrolysela
liaison peptidiqueaprs(ctC
terminal)lesacidesaminslysineet
argininesaufsicesacidesaminssont
suivisparuneproline.
Cependantlesprotases srine
peuventavoirunespcificit trs
complexe.
Voirlelogiciel"PeptideCutter"Expasy.
Allerlapage"MS-Digest"dulogiciel"Prospector".Cliquersur"perform digest"pouravoirun
aperud'unrsultatd'hydrolysein silicod'uneprotine.
Voirlalistedecertainesprotasesetleurspcificit:"Expasy".
c. Les acides amins du site catalytique des protases srine : la "triade" catalytique

Lesprotases srinepossdentunesrine 195 ractivedansleursiteactif.


Deuxautresacidesaminssontimpliqusdanslacatalyseparlesprotases srine:l'histidine 57et
l'aspartate 102.
Lesprotases srineutilisentlesdeux types de catalyse:
l'histidine 57sertdecatalyseur acide-base.Onestimequelesacidesaminsmisenjeudansla
catalyseacidebaseacclrentde10 100 foislesractionsenzymatiquesparrapportla
vitessedelammeractionnoncatalyseparuneenzyme.
lasrine 195sertdecatalyseur par covalenceavecuncarbonedelaliaisonpeptidiquequivatre
clive.L'acclrationparlacatalysecovalenteestdu mme ordre de grandeur.

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Figure cicontre:les

3acides
amins
His57,
Asp102et
Ser195
formentla
triade
catalytique.
Source :E.
Jaspard
(2011) Image
ralise
avec
CHIMERA
- UCSF

YoudonothaveJavaappletsenabledinyourwebbrowser,oryour
browserisblockingthisapplet.
Checkthewarningmessagefromyourbrowserand/orenableJava
appletsin
yourwebbrowserpreferences,orinstalltheJavaRuntimeEnvironment
fromwww.java.com

Visualisation de la triade
catalytique dans la forme
acyl-enzyme de l'lastase
pancratique une rsolution
de 0,95 .

CodePDB:1GVK
Pourfaireapparatrede
multiplesfonctionsdumenu
Jmol:
clicsur"Jmol"(Mac)
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clicdroitsur"Jmol"
(PC)

Rotation
Nterm
His57
Asp102
Ser195
Cterm
Enveloppeelectrostatique
Moleculesd'eau

7. Mcanisme catalytique des protases srine

Voiruntrsboncours:Enzyme Mechanisms

1ere tape : formation du complexe


enzyme-substrat (ES)

Laprotasefixelesubstrat
(protineoupeptide)dontelle
hydrolyselaliaison peptidiqueau
niveaud'acidesaminsspcifiques
de la protase considre.
LachanelatraleR1del'acide
aminimpliqudansl'hydrolyse
delaliaisonpeptidiqueestde
naturearomatique ou encombrante
(danslecasdelatrypsine)mais
detouteautrenaturepour
d'autrestypesdeprotases.
Cettechanelatralesefixedans
unendroitparticulierdusiteactif
delaprotaseappelepoche de
spcificit("specificity pocket")de
caractrehydrophobe.
Cettefixationoptimise l'orientation
strochimiquedelaliaison
peptidiqueafinqu'ellesoit
hydrolyseductC-terminal
(carboxyle)dursidud'acide
amin.
Lesquelettecarbondu
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polypeptidesubstratformeun
court feuillet aveclesquelette
carbondel'enzymeauniveaudu
siteactif(non montr dans la
figure).
L'oxygnedugroupement
carbonyledusubstratformeune
liaisonhydrogneavecun
groupementNH(amide)du
squelettecarbondel'enzyme
(non montr dans la figure).
Lecomplexeenzyme-substrat (ES)
estainsiform.

2me tape : acylation / formation


du premier intermdiaire
ttrahdrique

L'oxygnedugroupementOHde
laSer 195 du site actifestactiv
enformantuneliaison
hydrogneavecl'azoteN:du
noyauimidazoledel'His 57.His
57agitcommeunaccepteurde
protondeSer195,selonun
mcanismedecatalyse base
gnrale,etdevientHis-H+.
Enmmetemps,l'oxygneSerO
devientnuclophileetattaqueleC
dugroupementcarbonyledela
liaisonpetidiquehydrolyser.
Uneliaisoncovalenteestainsi
formeselonlemcanismede
catalyse par covalence.
Asp 102apourrlelemaintien

d'unarrangement
strospcifiqueidaldurseau
deliaisonshydrognetablies
entreHis57etSer195.Il
stabiliseaussilaformeHisH+
parinteractionlectrostatique,
cequifaciliteletransfertdu
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proton.
Lersultatdecettetapedite
d'acylationestlaformationdu
premierintermdiaire
ttrahdriquedontlastructureest
probablementsemblablecelle
del'tat de transition(ES#)avec
unoxygnecarbonylengatif
appell'oxyanion.Lesite actif
fixe plus fortement l'oxyanionqu'il
nefixelegroupementcarbonyle
originaldusubstrat:l'tatde
transitionestainsistabilis.
Uneautreliaisonhydrogneest
tablieentrel'oxyanionetun
groupementNHdusquelette
carbondel'enzyme(auniveau
deGly 193)situdansunergion
appele"trou oxyanion".

3me tape : acylation (formation de


l'acyl-enzyme) / libration du
produit P1

Laliaisonpeptidiqueoriginelleest
clive:HisH+cdeunprotonla
moiti"amino"dusubstrat
d'origineetagitselonun
mcanismedecatalyse acide
gnrale.
Cettepartieamineestdissocie
dusiteactifetleproduit P1 (R2NH2) est libr.
L'oxyanionredevientC=Oqui
resteattachdemanirecovalente
Ser 195.
C'estl'intermdiaireacyl-enzyme
fixparuneliaisonesterentrela
moiti"carbonyle"dusubstrat
d'origineetl'oxygnedela
fonctionalcooldeSer 195.
4me tape : dsacylation /
formation du second
intermdiaire ttrahdrique
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Lesecondsubstrat,la
molcule d'eau,formeune
liaisonhydrogneavecHis
N:etHis57agitde
nouveauselonun
mcanismedecatalyse base
gnrale,etdevientHis-H+.
L'oxygnedel'eauest
activcequilerend
nuclophile:ilattaqueleC
dugroupecarbonylede
l'acylenzyme(catalyse par
covalence).
Asp 102apourrlele

maintiend'unarrangement
strospcifiqueidaldu
rseaudeliaisons
hydrognetabliesentre
His57etSer195.Il
stabiliseaussilaformeHis
H+parinteraction
lectrostatiquecequi
faciliteletransfertdu
proton.
Lersultatdecettetape
estlaformationdusecond
intermdiaire ttrahdrique

(groupementOHaulieu
d'ungroupementamide
danslecasdupremier)
dontlastructureest
probablementsemblable
celledel'tat de transition
(ES#)avecunoxygne
carbonylengatif
(oxyanion).
Lesite actif fixe plus
fortement l'oxyanionqu'ilne
fixelegroupement
carbonyleoriginaldu
substrat:l'tatde
transitionestainsistabilis.
Denouveau,uneautre
liaisonhydrogneest
tablieentrel'oxyanionet
ungroupementNHdeGly
193situdansle"trou
oxyanion".

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5me tape : dsacylation /


libration de P2 /
reformation de E
His-H+redonnesonproton

l'oxygnedelafonction
alcooldeSer 195 del'acylenzyme.
Laliaisonesterestclive,
librantleproduit P2:R1COOHquicorrespondla
partieN-terminaledu
substratd'origine.
Les3acidesaminsdela
triade catalytique

retrouventleurtatinitial.
L'enzymeestdenouveau
souslaformeE:elleest
prtecatalyserde
nouveaularaction.

Schmas raliss avec ChemBioDraw.

Figure ci-contre:
mcanismes
d'inhibitionpar

diffrents
compossqui
formentun
intermdiaire
ttrahdrique.

Cescompossont
permisd'identifier
lasrine195du
siteactifdes
protasessrine.

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