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Revue et prolongement du modle michaelien

Modle cintique un substrat :


k1

k2

E + S ES E + P
k-1
- o E, S, ES et P symbolisent l'enzyme, le substrat, le complexe enzymesubstrat, et les produits respectivement.
Selon ce modle, lorsque la concentration de substrat devient suffisamment
importante afin de capter tout enzyme sous forme ES, la deuxime tape de la
raction est limitante et la raction globale devient insensible aux augmentations
supplmentaires en concentration de substrat.

vitesse

Saturation

10

[S]
- Dans une raction enzymatique, le taux de catalyse (v) est dpendent de la
concentration du produit final par unit de temps.
- La vitesse de la raction est donc reprsente par :
v=

d[P]
d[S]
== k 2 [ ES ]
dt
dt

- La vitesse de production de ES est la diffrence entre les vitesses des deux


ractions lmentaires dcrivant la formation de ES et sa disparition:
d [ ES ]
= k 1 [ E ] [ S ] - k -1 [ ES ] - k 2 [ ES ]
dt

- Cette quation diffrentielle ne peut pas tre intgre de faon explicite


pour tous les cas sans des approximations qui la simplifient.
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1. quilibre rapide
En 1913, Lonure Michaelis et Maud Menten ont assum que k -1 >> k2 pour
que la premire tape de la raction soit toujours en quilibre. Donc Ks = k-1
/ k1 = [E][S] / [ES] qui est la constante dissociation du substrat de l'enzyme.
Le complexe non-covalent ES entre enzyme et substrat est connu par le nom
de complexe Michaelis.
2. tat stationnaire
La concentration d'ES est relativement constante pendant la raction si [S]
>> [E]. Donc, la vitesse de production de ES doit tre gale sa disparition
pour la plupart de la raction. Par consquent, si [ES] est relativement
constant, d[ES]/dt = 0. Dsignation comme sous forme d'approximation de
l'tat stationnaire propos d'abord par Briggs et Haldane en 1925.
Points noter dans des approximations Michaelis-Menten et Briggs-Haldane
1) La formation du produit est proportionnelle la concentration du complexe
enzyme-substrat (ES)
2) Dcomposition du complexe central reprsente l'tape limitante
3) Condition de mesure de vitesse doit minimiser la raction du retour
E + P EP ES
4) Imposition de la notion de la vitesse initiale; autrement la solution est
difficile aborder.

Traitement Briggs-Haldane; tat stationnaire


L'approximation de l'quilibre rapide nest pas approprie dans les systmes
biochimiques, et ce, pour plusieurs raisons :
1) Les intermdiaires enzymatiques sont chimiquement plus ractifs par rapport
la notion de dcomposition du ES lente vers le produit.
2) Le temps disponible pour une raction d'atteindre son quilibre dans les
tapes prcdentes de l'tape limitante est trs souvent insuffisant; donc, pas
d'quilibre vritable entre des complexes intermdiaires.
3) Les systmes biochimiques reprsentent frquemment des squences de
ractions conscutives o le produit devient le substrat de la raction subsquente, pas d'quilibre vritable possible.

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Lapproximation simplifie permet la drivation mathmatique dune


relation explicite entre la vitesse dune raction catalyse enzymatiquement (v) et
la concentration du substrat (S); cette relation est connue sous le nom de
Michaelis-Menten.

quation Michaelis-Menten

Reprsentation graphique
Vmax

Vmax [ S ]
K M [S ]

Vmax/2

Vitesse

Courbe
hyperbolique

KM
0

10

[S]
o

Vmax k2 [ E ]T et K M

k1 k2
k1

Donc kcat = Vmax / [E]T

Les paramtres VMAX et KM permettent de cerner trois aspects de


la catalyse :
1) Caractrisation de la spcificit enzymatique.
2) Type de mcanisme : tat stationnaire ou quilibre rapide .
3) Rle mtabolique de l'enzyme.

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1) Spcificit
Si la vitesse enzymatique est dcrite par :

kcat [ E ]T [ S ]
K M [S ]

alors quand Km >> [S], [E]T [E]; donc

k cat
[ E ][ S ]
KM

o kcat / Km reprsentent une constante apparente de deuxime ordre qui dcrit la


raction entre un enzyme libre et un substrat libre - spcificit.
- sil y a deux substrats, S1 et S2, qui sont utiliss par le mme enzyme.

vS 1 (

k cat
)S [ E ] [ S 1 ]
KM 1

vS 2 (

k cat
KM

)S 2 [ E ] [ S 2 ]

- donc au mme [S],

vS1
vS2

k cat

KM

k cat

KM

S1

S2

- Ce rapport de vitesses peut tre utilis afin dvaluer la spcificit de l'enzyme


Exemple : fumarate hydratase
Substrat

kcat/Km (M-1 s-1)

fumarate
fluorofumarate
chlorofumarate
bromofumarate

1.6 x 108
9.8 x 107
2.0 x 105
2.5 x 104

- Lenzyme est hautement spcifique pour le fumarate et le driv fluoro.

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2) Type de mcanisme
Si k2 > k-1 (forme extrme de l tat stationnaire )
Km = k2/k1 et puisque kcat = k2
kcat/Km = k1 qui est la constante de vitesse d'association entre enzyme et
substrat
Lassociation entre enzyme et substrat est limite par diffusion, donc k1 ne
peut pas dpasser la valeur de la constante de diffusion du substrat ~ 109 M-1 s-1.
si kcat/Km sont de cet ordre de valeur, le mcanisme tat stationnaire est
applicable.
Enzyme

kcat/Km (M-1s-1)

fumarate hydratase
catalase
triosephosphate isomrase

1.6 X 108
4 x 107
2.4 x 108

si kcat/Km est plus petit, le mcanisme de type "quilibre rapide" sapplique.

3) Rle mtabolique
Le rle de l'enzyme dans le mtabolisme peut tre valu en comparaison
avec son KM et la concentration in vivo du substrat;
o Par exemple, l'isozyme IV de la glucokinase provenant du foie possde un
KM 10mM tandis que les isozymes I - III (qui se retrouvent partout dans
le corps) ont tous des KM ~ 40 M.
o Chez un individu jeun, les niveaux de glucose sanguins sont ~
5mM. A cette concentration, les isozymes I-III fonctionnent "
planche" tandis que lisozyme IV est seulement ~25% activ. Aprs
un repas dhydrates de carbone, la concentration de glucose sanguin
monte 10mM et isozyme IV fonctionnera Vmax/2
o cause du Km lev de l'isozyme IV, le foie est capable de grer le glucose
supplmentaire en glucose-6-P
o cette raction reprsente la premire tape de glycolyse.

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Prolongement du modle
i) raction rversible

k1

k2

E + S ES|EP E + P
k-1

k-2

La condition de conservation de masse pour la raction avec une


intermdiaire est [E]T = [E] + [ES] et en utilisant la condition du rgime
stationnaire de
d [ ES ]
= k 1 [ E ] [ S ] + k -2 [ E ] [ P ] - k -1 [ ES ] - k 2 [ ES ] = 0
dt

qui simplifie

[ E ] =(

k -1 + k 2
) [ ES ]
k 1 [ S ] + k -2 [ P ]

En faisant la substitution pour [E]= [E]T - [ES]

[ E ]T = (

k -1 + k 2
+ 1) [ ES ]
k 1 [ S ] + k -2 [ P ]

La vitesse de la raction sexprime par

v= -

d[S]
= k 1 [ E ] [ S ] - k -1 [ ES ]
dt

qui se simplifie en utilisant lexpression pour [E]

v=(

k 1 [ S ] ( k -1 + k 2 )
- k -1 ) [ ES ]
k 1 [ S ] + k -2 [ P ]

et en combinant avec la relation entre [E]T et [ES] on obtient

v=(

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k 1 k 2 [ S ] - k -1 k - 2 [ P ]
) [ E ]T
k -1 + k 2 + k 1 [ S ] + k - 2 [ P ]

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La division par (k-1 + k2) dans le numrateur et dnominateur donne ensuite


k1
k -2
[ S ] - k -1
[P]
k
k
-1 + k 2
-1 + k 2
v=(
) [ E ]T
k1
k -2
1+
[ S ]+
[P]
k -1 + k 2
k -1 + k 2
k2

Si on dfinit les termes suivants :


V fmax = k2[E]T ; V rmax = k-1[E] T ;
K SM = (k-1 + k2) / k1 ; K PM = (k-1 + k2) / k-2
on obtient la relation de Michaelis-Menten pour une raction rversible avec un
intermdiaire
f

V MAX [ S ] - V MAX [ P ]
S
P
K
K
M
M
v=
[S] [P]
1+ S + P
KM
KM
Par exemple, lorsque [P] = 0, v = v0, la vitesse initiale, et lquation devient
identique celle de Michaelis-Menten.

Relation Haldane
lquilibre, v = 0, et la relation ci-haut peut tre rsolu et donne
f
P
[ P ] V MAX
K
M
=
K eq =
[ S ] V rMAX K SM

o par cette relation on dmontre que les paramtres cintiques dune


raction rversible catalyse de faon enzymatique ne sont pas
indpendants lun de lautre,
o les paramtres cintiques sont en effet relis travers la constante
dquilibre de la raction globale qui est indpendante de la prsence de
lenzyme

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ii) Plus qu'un intermdiaire

k1

k2

k3

k-1

k-2

k-3

E + S ES ES E + P

o ES reprsente un intermdiaire activ


En appliquant les quations tat stationnaire , on obtient la mme forme
d'quation que celle de M-M rversible sauf que l'interprtation des Vmax et Km
pour les ractions en avant et de retour seront plus compliques puisquils
reprsentent des fonctions de six paramtres cintiques k1, k2, k3, k-1, k-2, et k-3.
- ceci est galement juste sil sagit de trois ou plus intermdiaires
Il nest pas possible de caractriser une raction de plus quun seul
intermdiaire partir des quatre paramtres cintiques : V fmax , V rmax , KSM , et
KPM,
Les mesures cintiques faites en rgime stationnaire fournissent une
description phnomnologique du comportement de lenzyme et laissent la nature
des intermdiaires indtermine. Les intermdiaires doivent tre caractriss par
dautres moyens, par exemple la spectroscopie.
Une analyse en rgime stationnaire ne peut pas dmontrer de faon non
quivoque le mcanisme dune raction. Cependant si les paramtres
cintiques ne sont pas cohrents avec un mcanisme, ce mcanisme doit tre
rejet.
iii) Inhibition par substrat
- Dcroissance de la vitesse v hautes concentrations de substrats.
Dans la reprsentation double rciproque, ceci signifie une courbure croissante la
valeur 1/[S] faible.
o Une explication possible est la liaison avec un 2e site de substrat de
faible affinit qui inhibe l'activit

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Inhibition par excs de substrat

Cas particulier de linhibition incomptitive : 2 molcules de S peuvent se lier E, mais ne


peuvent tre transformes en P (autorgulation de lactivit enzymatique).

Exemple de lexcs dactylcholine vs actylcholinestrase :


PDB 2HA4

ES
KS

kcat

E + P

+
S
KI
ESS

Site allostrique

inactif

Site actif

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Bourne et al., J. Biol. Chem. 2006, 281, 29256

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Inhibition par excs de substrat (suite)

Ki

[ES][S]
[E][S]
Km
[ESS]
[ES]

Vo Vmax

[E]T = [E] + [ES] + [ESS]

[S]
[S]
K m [S]
Ki

Vo = kcat[ES]

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Effet du pH sur les ractions enzymatiques


Le changement de pH peut avoir plusieurs effets directs sur des ractions
catalyses de faon enzymatique :
1) inactivation de l'enzyme
2) changement dans l'tat d'ionisation du substrat
3) changement dans l'quilibre d'une raction
o par exemple :
Cratine + MgATP2- Phosphocratine + MgADP2-+ H+
Laugmentation du pH favorise la synthse de phosphocratine.
a) Drivation du profil pH
Leffet indirect est celui du changement de l'tat d'ionisation des chanes
latrales des acides amins, et qui sont essentiels pour l'expression de l'activit
catalytique. L'effet du pH sur la vitesse d'un enzyme peut tre complexe puisque
Vmax et Km sont la fois perturbs.
Considrant le cas o il y aurait deux chanes latrales dont l'tat d'ionisation
modifie l'activit de l'enzyme

E-

ES-

KE2

KES2
EH + S

k1
k-1

KE1
EH2+

k2
ESH

E + P

KES1
ESH2+

La comprhension rside dans le fait que la protonation et la dprotonation


soient parmi les ractions les plus rapides et par consquent, ils sont toujours en
quilibre rapide avec lenzyme. On peut donc rsumer la rpartition des
intermdiaires enzymatiques en fonction des constantes dquilibres.
Par exemple, dans la raction avec lenzyme libre ci-haut pour les tapes:

EH + H+ EH2+ et E- + H+ EH
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Les constantes dquilibre (dissociation) sont dfinies par KE1 =


[H ][EH]/[EH2+] et KE2 = [H+][E-]/[EH] (une pareille relation dfinie les autres
constantes dquilibres - KES1, KES2).
+

La condition de conservation de lenzyme exige, o [E]T reprsente la


concentration de lenzyme totale, que :
[E]T = [ESH]T + [EH]T
Les deux termes [ESH]T et [EH]T peuvent tre rcrit en fonction des
constants dquilibres en dfinissant :
[EH]T = [EH+2] + [EH] + [E-]

qui devient

[ E H ]T = [ E H ] (

[ H+ ]
K E1

+ 1 + K E2+ ) = [ E H ] f 1
[H ]

de faon similaire, [ESH]T = [ESH+2] + [ESH] + [ES-] et qui devient

[ +]
[ E S H ] T = [ E S H ] ( H + 1 + K ES2
) = [E S H ] f 2
[ H+ ]
K ES1
En utilisant la notion du rgime stationnaire,

d [ ESH ]
k1[ EH ][S ] k1[ ESH ] k2 [ ESH ] 0 .
dt
Cette relation est rsolue dans la mme faon comme le prcdent et aprs la
mme dmarche quavant on obtient

k2 [ E [ S ]
]T
f2
v = k 2 [E S H] =
f
K M ( 1 )+ [ S ]
f2
Avec

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En dfinissant des valeurs apparentes de KM et Vmax par


KM = KM (f1 / f2) et

VMAX = VMAX / f2

ceci dfinit alors une relation Michaelis-Menten modifie pour les effets de pH

V MAX [ S ]
=
v0
KM + [ S ]
Cette relation nous informe que :
1. Le changement en VMAX reflte l'tat d'ionisation d'enzyme-substrat f2.
2. Le changement en VMAX / KM reflte l'tat d'ionisation de l'enzyme libre
f1.
3. Le changement en KM reflte l'tat d'ionisation de l'enzyme libre et son
complexe enzyme-substrat f1/f2.
La vitesse initiale de beaucoup
d'enzymes dmontre en fonction du pH
un profil ressemblant une cloche prdit
par une telle relation
- par exemple : la cintique
daldolase de muscle de lapin
Il nest pas toujours possible
dobserver tout le profil de pH, de faon
exprimentale, dus aux constantes
dionisation qui sont soit trop acides ou

Native
ESH2+

ES-

basiques
Mutant

voir comportement du mutant


Glu187Gln de laldolase de lapin.

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Rappel : Seulement EH et ESH contribuent la valeur catalytique et


lchange des protons est implicite dans le rgime de lquilibre rapide.
Ceci est raisonnable puisque la constante de deuxime ordre pour lchange
d'un proton est rapide ~ 109 M-1 s-1.
L'change rapide des populations fait en sorte que les espces EH et ESH,
possdant de la comptence catalytique, sont rduites par des facteurs f1 et
f2 .
L'analyse des pKa
Ltude des profils de pH de lenzyme consiste analyser les paramtres
cintiques, Vmax et KM, dtermins des pH diffrents, en fonction des constantes
d'ionisation, KE1, KE2, KES1, et KES2.
La variation de VMAX en pH, dcrite par la fonction f2, dpend uniquement
des valeurs de KES1 et KES2.
La variation du rapport Vmax/KM en pH, dcrite par la fonction f1, informe
uniquement sur les valeurs de KE1 et KE2.
La dtermination mathmatique des valeurs KEi et KESi est faite par des
mthodes destimation non-linaire disponibles sous forme logicielle.
Cependant, partir dinspection visuelle des graphiques, soit VMAX vs pH
ou Vmax/KM vs pH, il est possible dobtenir des estimations approximatives.
Les pKa (log KEi ou log KESi) fournissent des indices importants sur l'identit
des acides amins au site actif.
Rappel : pKE1 = - logKE1, pKE2 = - logKE2, pKES1 = - logKES1, et pKES2 = logKES2
Alors,
1. Les pKEi informent sur lidentit des acides amins impliqus dans
linteraction de lenzyme avec le substrat
2. Les pKESi informent sur lidentit des acides amins impliqus dans la
catalyse.
pK ~ 4 suggre quun rsidu Asp ou Glu soit essentiel pour l'activit
de l'enzyme.
Des valeurs pK ~ 6 ou ~ 10 indiquent des rsidus His ou Lys.

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Cependant, les pKa des acides amins peuvent tre modifis au sein du site actif
de plusieurs faons importantes.
1. Le groupement carboxylate d'un rsidu Asp en pont salin (lectrostatique) avec
un groupement Lys est stabilis par la charge positive de Lys et possde un pKa
plus bas (plus difficile protoner).
H

N
H
Lys

pKa

C
H

O
Asp

2. Inversement un groupement amin dans une rgion peu polaire est moins
basique que dans une rgion polaire. Dans ce cas, il sagit du fait quun rsidu
charg est toujours plus difficile stabiliser dans une rgion hydrophobe que sa
forme neutre correspondante.

NH3

NH2

Micro-environnement
hydrophobique
pKa

3. galement, il existe la possibilit que deux acides amins voisins (distance ~ 34 pont hydrogne) possdant la mme charge qui dstabilisera une des deux
charges en le rendant neutre.

NH3

NH3

NH3

NH2
pKa

Donc il faut tre prudent dans l'identification des groupements essentiels


pour l'activit catalytique.
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