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Elments de BIOCHIMIE

Notions denzymologie
Hubert Becker
IBMC, Laboratoire 337, 3me tage
h.becker@ibmc.u-strasbg.fr
http://www-ibmc.u-strasbg.fr/arn/enseignement/Hubert.html

I. Introduction
1. Caractristiques des enzymes
Toutes les enzymes sont des protines (presque toutesribozymes)
Les protines enzymatiques sont des catalyseurs: concentrations trs
petites augmentent la vitesse des ractions chimiques, sans en
modifier le rsultat.
A la fin de la raction la structure de lenzyme se retrouve inchange.
Une enzyme donne est spcifique dune raction: elle catalyse
toujours la mme transformation, se produisant sur les mmes
corps chimiques initiaux.

http://www.brenda.uni-koeln.de/

I. Introduction
1. Caractristiques des enzymes
Lanhydrase carbonique (une chane de 264
acides amins; 29000 daltons), catalyse la
raction daddition dune molcule deau sur
une molcule de gaz carbonique pour donner
lacide carbonique qui se dissocie au pH
physiologique en un ion bicarbonate et un
proton. Cette raction est rversible et aboutit
un tat dquilibre.

Gaz carbonique

La prsence dun atome de Zinc est ncessaire son activit= cofacteur

Bicarbonate

I. Introduction
2. La raction enzymatique
Les cofacteurs sont des atomes ou
des molcules qui interviennent dans
la raction enzymatique, mais ne sont
pas transforms dfinitivement la fin
de cette raction.
Ils interviennent:
- transport du substrat
- rception du produit
- participation la structure de
lenzyme.
La protine enzymatique reconnat
spcifiquement les cofacteurs dont
elle a besoin.

I. Introduction
2. La raction enzymatique
Ligand
Corps chimique ayant une liaison spcifique avec
une protine.
Toutes les molcules ayant une liaison spcifique
avec une protine sont appeles ligands
Pour chaque ligand, il existe au moins un site de
fixation sur la protine qui le reoit.
Cofacteur
Corps chimique intervenant obligatoirement dans une
raction enzymatique.
Les cofacteurs peuvent tre:
- des ions
- petites molcules minrales (eau, etc)
Certains cofacteurs sont des molcules complexes
synthtises par la cellule : coenzymes

I. Introduction
2. La raction enzymatique
Coenzyme
Les coenzymes sont indispensables la catalyse
enzymatique.
Les coenzymes sont des molcules biologiques.
Lorsque cette molcule nest pas synthtise par
lorganisme, tout ou partie de la molcule du
coenzyme doit tre apport par lalimentation =
vitamine.
Coenzymes libres: se dissocient de lenzyme
chaque raction catalyse. Ils sont lis lenzyme
par des liaisons de type lectrostatique ou plus
faiblement encore, cette liaison est renouvele
chaque raction effectue
la concentration des coenzymes est du mme
ordre de grandeur que celle du substrat =
stoechiomtrie

I. Introduction
2. La raction enzymatique
coenzymes lis: ne se dissocient pas de lenzyme.
coenzymes lis aux enzymes par des liaisons fortes
de type covalente leur concentration est la mme
que celle de lenzyme: trs faible (catalytique)

II. Cintique
3. Effet de la concentration de l enzyme
a. Vitesse de la raction
Activit dune raction enzymatique (un
substrat et un produit)
Dans un milieu dfini, on observe les
concentrations du substrat ou du produit, qui
sont des fonctions du temps coul : la
concentration du substrat dcrot au cours du
temps, celle du produit croit au cours du temps.

Vitesse de la raction = rapport moins dS sur dt, qui est gal


au rapport dP sur dt. La vitesse de raction reprsente le
nombre de moles de substrat transformes en moles de
produit, dans un volume donn et dans un temps donn

II. Cintique
3. Effet de la concentration de l enzyme
b. Phases de la raction
n

Chaque molcule denzyme va se


lier une molcule de substrat. Ce
complexe ES peut se re-dissocier.

o
p

q
r

tuvw

Leffet catalytique de lenzyme


transforme alors le complexe
enzyme-substrat en complexe enzymeproduit EP
Dans un dernier temps, le complexe
enzyme-produit peut se dissocier(E+P).

II. Cintique
3. Effet de la concentration de l enzyme
b. Phases de la raction

Au temps 0 (que des molcules de lenzyme


et du substrat) la raction est non uniforme.

p
o
n

premire phase trs brve n: la vitesse de la


raction est croissante. Durant cette phase,
les molcules de substrat (S) se lient avec
lenzyme (E) la concentration du complexe
enzyme-substrat [ES] augmente.
Lorsque toutes les molcules de lenzyme
sont occupes par des molcules du substrat
(ES) la vitesse de la raction est maximum et
reste constante tant que la concentration du
substrat est grande et celle du produit petite o.
Lorsque la concentration du produit augmente,
la raction inverse commence concurrencer
celle quon mesurait : la vitesse diminue p.

Dernire phase tardive: la vitesse de la transformation inverse devient gale celle


de dpart : les concentrations ne changent plus = quilibre q.

II. Cintique
3. Effet de la concentration de l enzyme
c. Vitesse initiale
Durant la phase stationnaireo, la vitesse est constante :
vitesse initiale.
Cest une phase de la raction o un nombre maximum
des molcules de lenzyme sont lies des molcules de
substrat: Le rapport enzyme li sur enzyme total est
maximum.
Dans ces conditions, lefficacit catalytique de lenzyme
est la plus grande la vitesse initiale est la plus grande
de toutes les vitesses quon peut mesurer en fonction des
phases de la raction.

II. Cintique
3. Effet de la concentration de l enzyme
d. Concentration de lenzyme
Lorsque la concentration de lenzyme est
grande [E3] la vitesse initiale est plus
grande que lorsque la concentration de
lenzyme est petite [E1].
Laugmentation de la concentration de
lenzyme augmentation de la Vi
Lorsquune enzyme existe la fois sous
une forme active/forme inactive: la
concentration efficace de lenzyme est
celle de la forme active seule.
Les modifications de la structure
(postrieures la synthse de lenzyme):
passage de lenzyme de la forme inactive
la forme active augmentation de la
concentration efficace de lenzyme et donc
la vitesse de la raction

II. Cintique
3. Effet de la concentration de l enzyme
Ces modifications peuvent tre:
Hydrolyse (Protolyse) dun fragment de la chane dacides amins: activation
des zymognes en enzymes actives au cours de la digestion, activation des
facteurs de la coagulation du sang.
Phosphorylation, dphosphorylation (Srine Thronine, Tyrosine) : des
enzymes pour augmenter le taux de glucose dans le sang, dphosphorylation
des enzymes pour diminuer le taux de glucose dans le sang
Liaison avec un cofacteur ou un coenzyme li = groupement prosthtique :
Ion mtallique: Zinc sur les dshydrognases NAD Flavine: flavoprotines
Hme: cytochromes
Acylation, alkylation: Myristyl, Granyl, Farnsyl: transfert de radicaux Acylou Alkyl- sur des acides amins de lenzyme.

II. Cintique
3. Effet de la concentration de l enzyme
e. Dosage enzymatique
Vitesses initiales en fonction des
concentrations E1, E2 et E3 de
lenzyme

Les vitesses mesures (Vi) sont linairement


proportionnelles aux concentrations de lenzyme
utilises.
Dosage enzymatique : la vitesse initiale dune
raction enzymatique dans un milieu o la
concentration de lenzyme est inconnue est
proportionnelle cette concentration. En
comparant cette vitesse initiale (appelle
dosage enzymatique) celles dautres milieux
de concentration en enzyme connues, on peut
valuer la concentration en enzyme.
Ces dosages enzymatiques sont des mesures
dactivits catalytiques
Activit enzymatique exprime en Katal (SI):
unit qui reprsente une quantit denzyme
capable de catalyser la transformation dune
mole de substrat en une seconde.

II. Cintique
4. Effet de la concentration de substrat
a. Concentration de substrat
Evolution de la raction en fonction de
la concentration en substrat.
La concentration du produit en fonction du
temps est diffrente pour chacune des
concentrations de substrat
Lorsque la concentration du substrat est grande
(par exemple [S10]) la vitesse initiale est plus
grande que lorsque la concentration du substrat
est petite (par exemple [S1]). On peut
mesurer ces vitesses initiales en calculant la
diffrence de concentration de produit au cours
dun temps donn, pour chaque concentration
du substrat.

II. Cintique
4. Effet de la concentration de substrat
b. Cintique Michalienne
Vitesses initiales en fonction des
concentrations du substrat

Les vitesses mesures croissent en fonction


des concentrations du substrat. le graphe de
cette fonction est une hyperbole.
Lorsque la concentration du substratest nulle la
vitesse est 0, donc lhyperbole passe par
lorigine du graphe.
Lorsque la concentration du substrat tend vers
linfini, lhyperbole tend vers lasymptote.
Lasymptote correspond la vitesse initiale
quon observerait si la concentration du substrat
tait infinie (vitesse maximum possible).
La constante de Michaelis: Labscisse du
point de la courbe pour lequel lordonne est
gale la moiti de celle de lasymptote =
concentration de substrat pour laquelle on peut
mesurer une vitesse initiale gale la moiti de
la vitesse maximum.

II. Cintique
4. Effet de la concentration de substrat
c. Vitesse maximale
La vitesse maximale = une vitesse initiale, mais on ne peut pas lobserver
puisquil est impossible de raliser dans le milieu une concentration infinie de
substrat.

d. Constante de Michaelis
Concentration de substrat pour laquelle la vitesse initiale
dune raction enzymatique atteint la moiti de la vitesse
maximum

II. Cintique
4. Effet de la concentration de substrat
e. Etablissement de lquation de Michaelis-Menten

II. Cintique
4. Effet de la concentration de substrat
e. Etablissement de lquation de Michaelis-Menten

II. Cintique
4. Effet de la concentration de substrat
e. Etablissement de lquation de Michaelis-Menten

II. Cintique
4. Effet de la concentration de substrat
e. Etablissement de lquation de Michaelis-Menten

II. Cintique
4. Effet de la concentration de substrat
e. Etablissement de lquation de Michaelis-Menten

II. Cintique
4. Effet de la concentration de substrat
e. Etablissement de lquation de Michaelis-Menten

II. Cintique
4. Effet de la concentration de substrat
f. Hyperbole de Michaelis-Menten
Le graphe reprsentant cette fonction confirme
les conclusions mathmatiques. Le calcul de la
vitesse initiale partir de concentrations de
substrat gales des multiples entiers de Km
aboutit des fractions entires de la vitesse
maximale.
On trace une hyperbole partir des points
obtenus paramtres gomtriques Km et
Vmax.
Vmax: vitesse initiale que la raction aurait si la
concentration du substrat tait infinie.
Km: concentration du substrat pour laquelle on
observe une vitesse gale la moiti de la
vitesse maximale.

II. Cintique
4. Effet de la concentration de substrat
g. La reprsentation de Lineweaver et Burk

II. Cintique
4. Effet de la concentration de substrat
f. La reprsentation de Lineweaver et Burk
Le graphe reprsentant cette fonction linaire
est appel graphe en double inverse (les deux
variables sont respectivement les inverses des
variables de lhyperbole prcdente).
Sur laxe des x: les concentrations croissantes
du substrat ont des inverses qui diminuent de
sorte que: le croisement des axes reprsente
linverse dune concentration infinie du substrat,
alors que la plus petite concentration voit son
inverse (2 / Km) repouss lextrmit de laxe.
De mme sur laxe des y, les inverses des
vitesses les plus lentes sont les plus haut situs.
Cette extrapolation permet de
dterminer graphiquement les
constantes Vmax et Km.

Lordonne lorigine est gale linverse de la


vitesse maximum.
Le double de cette ordonne correspond
linverse de la moiti de la vitesse maximum et
par consquent labscisse du point de la droite
qui a cette ordonne estlinverse du Km.

II. Cintique
5. Inhibition comptitive
Linverse de la vitesse maximum augmente
avec la concentration de linhibiteur de mme
que la pente de la droite. Pour chacune de ces
droites, le point qui a pour ordonne le double
de lordonne lorigine (losanges) correspond
toujours la mme abscisse qui est linverse
du Km.
Le point commun de toutes ces droites est situ
gauche de laxe des y, dans une partie
du graphe qui na pas de sens physique
puisquon est au-del dune concentration infinie
du substrat ! Mais le calcul de cette abscisse
montre quelle est de - 1/Km ce qui permet une
dtermination graphique facile de cette
constante.
La rencontre de toutes les droites en ce point de
laxe des x est caractristique des graphes en
double inverse en prsence de diffrentes
concentrations dun inhibiteur non comptitif.