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LABORATRIO DE BIOLOGIA MOLECULAR - NAT

ANA MARGARIDA BARREIRA NASCIMENTO

1. INTRODUO

Nos finais dos anos 90 a Tcnica Amplificao de cido Nuclico (NAT) tornou-se
comum nos laboratrios de biologia molecular, constituindo-se ento em um passo
essencial para a segurana transfusional.
A Portaria n262/2002 do Ministrio da Sade, de 05 de fevereiro de 2002, tornou
obrigatrio a incluso dos testes de amplificao e deteco de cidos nuclicos NAT,
em todas as amostras de sangue de doador. Com a implantao do NAT diminui-se o
risco de transmisso dos vrus da Hepatite C HCV e do Vrus da Imunodeficincia
Humana HIV, por transfuses de hemocomponetes, aumentando a segurana
transfusional (Ministrio da Sade, 2002). A partir daquela data, os testes so
obrigatrios, no mbito da Hemorrede Nacional, em todos os servios de hemoterapia
pblicos, filantrpicos e/ou privados contratados pelo SUS, e privados.
Alguns hemocentros, a exemplo do da Bahia, no possuem estrutura fsica adequada
para implantao da tcnica. O Hemoba estima a realizao de 1.000 testes por dia4,
que devero ser realizados em um laboratrio especialmente construdo para tal
finalidade.
O que esse trabalho pretende clarear idias, estabelecer critrios para a elaborao
do projeto do laboratrio. o esboo de um estudo a ser aprofundado.
NAT Nucleic Acid Amplification Test
HCV um vrus que infecta o fgado e resulta na doena de fgado, na falha do fgado e na morte. Mais
comum e mais infeccioso do que HIV-1, o vrus HCV afeta cerca de 170 milhes de pessoas no mundo.
O HCV transmitido de individuo a indivduo atravs dos lquidos de corpo, particularmente do sangue
e dos produtos do sangue.
3 O HIV o retrovirus que causa a Sindrome da Imunodeficiencia Adquirida (SIDA/AIDS). A AIDS foi
identificada pela primeira vez no Brasil em 1982. E desde o incio da epidemia, a faixa etria mais
atingida tem sido a de adultos entre 20 a 39 anos de idade. O ltimo Boletim Epidemiolgico da Aids,
publicao trimestral do Ministrio da Sade, j registrou 179.541 casos de Aids desde 1980. Deste
total, 4.077 so entre adolescentes na faixa etria dos 13 aos 19 anos.
1
2

4 Fonte: Hemoba.

2. O QUE O NAT?

Um sangue seguro aspirao de mdicos e doentes. Durante os anos 80 e 90 se


conseguiu uma segurana , ento considerada mxima, para os vrus HBV (Hepatite
B), HCV (Hepatite C) e HIV (Imunodeficincia Humana Adquirida), eliminando os
doadores de sangue com anticorpos contra qualquer desses vrus. No entanto, o
perodo de soroconverso de 22 dias para o HIV e de 50 a 60 dias para o HCV, em que
h viremia sem anticorpos, conhecida como fase da janela imunolgica, constituiu
um obstculo importante para se poder considerar uma transfuso como isenta de
riscos, embora as probabilidades de transmisso nesse perodo sejam raras (PINHO et
all, 2000).
Nos ltimos anos, tornou-se cada vez mais usual as tcnicas de biologia molecular com
amplificao do material gentico. Na dcada de 90, estas tcnicas comearam a ser

utilizadas na rotina para diagnstico e acompanhamento de doentes com Hepatite por


vrus B e C e, posteriormente, para HIV. Iniciou-se a prtica de vrias tcnicas de
amplificao dos cidos nuclicos (NAT): reao em cadeia da polimeraze (PCR),
amplificao baseada na seqncia de cidos nuclicos (NASBA), DNA ramificado
(bDNA).
As NAT foram desenvolvidas, na rea de rastreio das doaes de sangue, para deteco
da infeco no perodo que precede o desenvolvimento de anticorpos, durante a fase
inicial da mesma. Devido ao elevado nmero de amostras que tm de ser processadas
num curto perodo de tempo, estas provas devero ser realizadas em pool. o limiar
de sensibilidade das provas e o tamanho do pool 5 das amostras que ir influenciar a
eficcia destas tcnicas.
Para a utilizao de tais prticas, necessrio admitir e formar pessoal qualificado,
criar espaos e estruturas adequados, ter os equipamentos necessrios e criar rotinas.
Essas rotinas devero contemplar: 1) a coleta do material e sua conservao; 2)
transporte das amostras; 3) extrao do DNA; 4) preparao da amostra; 5)
amplificao do DNA/RNA; e, 5) armazenamento do plasma.
Pools so mistura de amostras, isto , o laboratrio rene o plasma de uma certa quantidade de
doadores, cujo nmero depende do equipamento, em um nico tubo e realiza os testes NAT para HIV e
HCV. Se o resultado for positivo, prepara-se uma nova mistura dos plasmas iniciais, dessa vez com uma
quantidade bem menor de doadores em cada tubo, e realiza novamente o teste. O tubo que apresentar
resultado positivo deve ser novamente dividido, agora em amostras individuais, e um novo teste ser
realizado.

3. O LABORATRIO

!
!
!
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3.1. Normas Especficas


Segundo a Portaria n1.312/MS, de 30 de novembro de 2000, o laboratrio de biologia
molecular, para fins de cadastramento no SUS, est classificado em Tipo II, com
capacidade instalada e tcnica apta a realizar procedimentos de histocompatibilidade
por meio de sorologia e biologia molecular de baixa e alta resoluo.
A mesma portaria, no item2.3, exige que as reas fsicas dos laboratrios se enquadrem
nos critrios e normas estabelecidos pela legislao em vigor . 6
3.2. Procedimentos a serem realizados
O procedimentos a seguir listados foram fornecidos pelo Hemoba, que se baseou nas
informaes e referencias bibliogrficas obtidas aps pesquisa e consulta junto a
algumas empresas, alm da RDC n50/2002:
receber amostras de doadores da Fundao Hemoba e outros Servios Hemoterpicos
conveniados;
fazer anlise e procedimentos laboratoriais na amostras com finalidade de diagnstico
e pesquisa;
fazer o preparo de reagentes/solues;
emitir laudo das anlises realizadas, em meio eletrnico;
Acondicionamento e pr-tratamento de resduos gerados;

Preparao da Plasmateca.
Para a realizao da tcnica NAT, a depender da marca dos equipamentos utilizados,
os procedimentos de anlise das amostras podero ser diferenciados:
a) Etapas para a marca Roche
preparao dos reagentes
preparao das amostras
fase de amplificao
fase de deteco.
citada a Portaria GM/MS n1.884, de 11 de novembro de 1994, atualmente
substituda pela RDC n50, de 21 de fevereiro de 2002.
6

b) Etapas para a marca Chiron


preparao dos reagentes
preparao das amostras
pipetagem das amostras, manual ou
automatizada
fase de pr-amplificao
fase de amplificao
ensaio de proteo da hibridao (deteco),

constando de hibridao, seleo e deteco.


3.3. Definio do Laboratrio
Um laboratrio para execuo do NAT, deve-se dispor de reas e espaos laboratoriais
bem delimitados para as diferentes etapas de execuo, desde a preparao de
amostras at a fase de deteco do produto amplificado. Da sua adequada concepo
depende a confiabilidade dos resultados e a preveno de contaminaes.
Segundo RDC n50/2002, o Laboratrio de Biologia Molecular classificado no
Nvel de Biossegurana 2 (NB-2), adequado para qualquer trabalho que envolva
sangue humano, lquidos corporais, tecidos ou linhas de clulas humanas primria
onde a presena de um agente infeccioso pode ser desconhecido. De acordo com a
citada Resoluo, os procedimentos que envolvem um alto potencial para produo de
salpicos ou aerossis que possam aumentar os riscos de exposio dos funcionrios,
devem ser conduzidos com um equipamento de conteno primria ou com
dispositivos como a Cabine de Segurana Biolgica ou os copos de segurana da
centrfuga, alm da utilizao de barreiras primrias , como os escudos para borrifos,
proteo facial, aventais e luvas.
As barreiras secundrias como pias para higienizao das mos e
instalaes para descontaminao de lixo devem existir com o objetivo
de reduzir a contaminao potencial do meio ambiente. (Ministrio
da Sade, 2002)
Obrigatoriamente um Laboratrio de Biologia Molecular deve-se dispor das seguintes
reas:

3.3.1. rea para Separao das Amostras


A depender da metodologia utilizada, poder compreender: rea de centrifugao, rea
de separao, rea de pooling (com necessidade de pipetador automtico).
3.3.2. rea de Preparao (Pr-amplificao)
As reas de preparao de amostras e reagentes podero estar localizadas no mesmo
laboratrio, desde que sejam respeitados os espaos definidos para cada uma delas. No
caso de utilizao de pools, estes espaos devero manter-se separados.
De Amostras: rea de extrao dos cidos nuclicos e adio do DNA reao de
PCR 7, utilizando equipamento automtico ou tcnica manual atravs de Cmara de
Segurana Biolgica Nvel 2 com Ultravioleta. A rea de preparo de amostras deve ser
mantida limpa, com uso de reagentes qumicos (p. ex.., HCI 1N) e/ou ultravioleta (UV).
Recomenda-se restrio de trfego de pessoas e utilizao de aventais exclusivos.
De Reagentes: rea destinada preparao da mistura de amplificao e/ou outros
reagentes (pr-mix) necessrios. Na rea de preparo de reagentes recomenda-se: o uso de
fluxo laminar com luz ultravioleta e nvel de biossegurana 2, congelador prprio para as
solues, restrio de trfego de pessoas e utilizao de aventais exclusivos.
3.3.3. rea de Amplificao e Deteco
Dever ser instalada em outro laboratrio, completamente separado das reas
anteriores, a fim de serem evitadas contaminaes. A rea de amplificao deve-se utilizar
tambm procedimentos qumicos(p. ex.., HCI 1N) e/ou ultravioleta (UV), para inativar
produtos amplificados. O termociclador pode ser mantido nesta rea, ou numa outra separada.
7 PCR (Polymerase Chain Reaction)

A Reao em Cadeia da Polimerase uma tcnica que amplifica o

nmero de molculas de DNA em uma amostra, possibilitando a deteco, com alta especificidade, de
concentraes extremamente baixas de um determinado organismo.

3.3.4. Laboratrio de Contingncia


Dever existir um laboratrio totalmente montado e equipado, que poder ser utilizado
em caso de interdio da rea de pr-amplificao, j que o processo no pode ser
interrompido.
3.4. Quadro de Pessoal
Esta rea deve dispor de pessoal especificamente qualificado, em quantidade
compatvel com o nmero de diversidade de amostradas analisadas. Segundo
orientao do Hemoba, a equipe tcnica mnima por turno, para anlise de 1.000
amostras/dia, dever constar de: 01 (um) Supervisor, 01 (um) Bioqumico e 03 (trs)
tcnicos, 01 (um) Funcionrio para Recepo, alm de 01 (um) Responsvel Tcnico.
3.5. Recomendaes Gerais
Todas as portas devem ser dimensionadas de forma a permitir a passagem dos
equipamentos.
As salas devero ser providas de lavatrios para mos e bancadas inox com cuba

para trabalho.
Nenhum material de acabamento e de revestimento ser poroso e todos devero
permitir a limpeza com hipoclorito de sdio, inclusive piso, parede e teto.
As bancadas devero ter dimenses que permitam a instalao dos equipamentos.
Temperatura ambiente adequada para a realizao de testes que exigem
temperaturas de 22C, permanentemente monitorada para assegurar que est dentro da faixa
aceitvel;
No deve haver comunicao entre a Sala de Amplificao e a de Deteco.
No caso de utilizao de sistema de ar condicionado central, no dever haver
comunicao entre a sala de pr e a de ps amplificao, nem circulao de ar entre as
mesmas.
Para o preparo de meios e solues necessria a utilizao de gua purificada,
cerca de 10ml por dia.
Utilizar lmpadas ultravioleta a cada 2,00m, nas salas de trabalho.
Rede eltrica estabilizada 110V ( 5%) e 230V ( 5%), com garantia de suprimento
contnuo de energia.
Sistema de interfaciamento.
As lmpadas devero possuir proteo acrlica.
O armazenamento, manipulao e dejeto de materiais orgnicos e radioativos
devem obedecer s normas vigentes.
3.6. Programa e Pr-dimensionamento
Recepo de Amostras
6,00m
Depsito de Material
6,00m
Sanitrio Feminino
4,00m
Sanitrio Masculino
4,00m
Depsito Temporrio de Resduos com Autoclave
6,00m
D.M.L.
2,00m
Sala Administrativa
8,00m
Sala de Laudos
6,00m
Sala de Separao de Amostras
9,00m
Laboratrio de Pr-amplificao com antecmara
20,00m
Extrao de cidos nuclicos
Preparao de amostras e reagentes
Estoque temporrio de DNA
Plasmateca
Sala de estoque de reagentes e materiais descartveis
Sala de amplificao com antecmara
Laboratrio de Contingncias com antecmara

6,00m
6,00m
20,00m
20,00m

Total

123,00m

LAUDOS

LABORATRIO DE
AMPLIFICAO

LABORATRIO DE
CONTIGNCIAS
ANTECAMARA

ANTECAMARA

LABORATRIO DE
PR-AMPLIFICAO
ANTECAMARA

SEPARAO DE
AMOSTRAS

RECEPO
DE AMOSTRAS

3.7. Fluxograma

FUNCIONRIO
AMOSTRA

3.8. Equipamentos
Para cada rea existem os equipamentos especficos, que sero relacionados nas
tabelas abaixo. A quantidade de equipamentos ser determinada em funo do
nmero de amostras a serem analisadas pelo laboratrio.
3.8.1. rea de separao de amostras:
EQUIPAMENTO
Geladeira Domstica
Centrfuga Refrigerada
Micro-Computador

Alt.
164
35
60

DIMENSES (cm)
Larg.*
Prof.
66
68
67
58
50
70

3.8.2. rea de Extrao de DNA:


EQUIPAMENTO
Agitador Eletrnico Vortex
Banho-maria
Centrfuga Refrigerada
Micro-Computador
Fluxo laminar com UV
Frezer (18C)
Geladeira Domstica
Microcentrfuga
Pipetador Automtico

Alt.
15
36
35
60
195
164
164
34
58

DIMENSES (cm)
Larg.
Prof.
15
25
60
42
67
58
50
70
109
75
66
68
66
68
29
50
150
73

3.8.3. rea de preparo de amostras:


EQUIPAMENTO
Agitador Eletrnico Vortex
Banho-maria
Micro-Computador
Fluxo laminar com UV
Frezer (18C)
Geladeira Domstica
Pipetador Automtico
Termociclador PCR

DIMENSES (cm)
Alt.
Larg.
Prof.
15
15
25
36
60
42
60
50
70
195
109
75
164
66
68
164
66
68
58
150
73
45
60
60

3.8.4. rea de Preparo de Reagentes:


EQUIPAMENTO
Agitador Eletrnico Vortex
Fluxo laminar com UV
Frezer (18C)

Alt.
15
195
164

DIMENSES (cm)
Larg.
Prof.
15
25
109
75
66
68

3.8.5. rea de Amplificao


EQUIPAMENTO
Agitador Eletrnico Vortex
Banho-maria
Micro-Computador
Frezer (18C)
Luminmetro
Impressora
Cobas Amplicor
Geladeira Domstica

Alt.
15
36
60
164
29
40
80
164

DIMENSES (cm)
Larg.
Prof.
15
25
60
42
50
70
66
68
60
50
50
40
100
70
66
68

4. CONSIDERAES FINAIS

Para a projetao de um laboratrio de biologia molecular, o arquiteto dever levar em


conta o nmero de amostras a serem analisadas e o tipo de tcnica a ser utilizada.
Consequentemente, poder obter a relao de equipamentos e nmero de funcionrios,
elaborar pr-dimensionamentos, fluxogramas e, finalmente, o leiaute do laboratrio.
Com uma metodologia de projeto correta, a possibilidade de erro na idealizao dos
espaos torna-se remota, o que no caso de uma laboratrio de biologia molecular,
resultar em fluxos que sero orientadores dos procedimentos.
5. BIBLIOGRAFIA

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prtica mdica: reviso da literatura. Disponvel em:
http://www.paho.org/portuguese/DBI/es/06-Brandao.pdf. Acesso em jul. 2002.
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Departamento de Normas Tcnicas. Resoluo RDC n50, de 21 de fevereiro de
2002. Dispe sobre o regulamento Tcnico para planejamento, programao,
elaborao e avaliao de projetos fsicos de estabelecimentos assistenciais de
sade. Braslia, 2002. Disponvel em
http://www.anvisa.gov.br/legis/resol/2002/50_02rdc.pdf. Acesso em: mar.2002.
_______. Ministrio da Sade. Portaria n1.313, de 30 de novembro de 2000.
Determina os laboratrios que podero ser cadastrados para realizao dos exames
de Histocompatibilidade relacionados na Portaria GM/MS n1.314, de 30 de
novembro de 2000. Disponvel em: http://www.saude.gov.br. Acesso em: abr. 2002.
_______. Ministrio da Sade. Portaria n262, de 5 de fevereiro de 2002. Torna
obrigatrio, no mbito da Hemorrede Nacional a incluso nos Servios de
Hemoterapia pblicos, filantrpicos e/ou privados contratados pelo SUS, e
privados, os testes de amplificao e deteco de cidos nuclicos - NAT, para HIV

e HCV, em todas as amostras de sangue de doadores. Disponvel em:


http://www.abto.com.br/legislacao/por262.htm . A c e s s o e m : m a r. 2 0 0 2 .
_______. Ministrio da Sade. Portaria n1.312, de 30 de novembro de 2000. Normas de
Cadastramento dos Laboratrios de Histocompatibilidade, no mbito do Sistema nico de
Sade SUS. Disponvel em: http://www.saude.gov.br. Acesso em: abr. 2002.
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PINHO, L; DIAS, F.; MONTEIRO, R. JUSTIA, B. O uso de tcnicas de


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VERLNCIA, Rosngela, BASSIT, Leda. Riscos da Tcnica de Reao em Cadeia
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