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Etude

de la croissance bactrienne en milieu non renouvel


Le responsable dune fromagerie produisant du camembert dcide deffectuer une tude des
paramtres de la croissance de la souche Hafnia alvei (bacille Gram -, impliqu dans laffinage du
fromage et ayant un impact positif sur la production de composs aromatiques).
Pour cela il doit tudier la croissance de la bactrie dans les conditions optimales, son laboratoire ne
lui permettant pas de faire de telles analyses, il vous demande de faire ce travail et de lui
communiquer les rsultats obtenus.

1. Principe :
La croissance se dfinit comme laccroissement ordonn de tous les composants dun organisme.
Chez les organismes pluricellulaires elle conduit une augmentation de taille ou de masse, chez les
organismes unicellulaires (bactries, levures par exemple) elle aboutit essentiellement une
augmentation du nombre dindividus.
La mesure de la croissance se fera par le suivi de labsorbance en fonction du temps et paralllement
par comptage en cellule de Thoma. La quantit de glucose consomme (substrat) en fonction du
temps, sera dose par mthode enzymatique.
10mL dune prculture frache de la nuit de la souche slectionne Hafnia alvei en bouillon cur-
cervelle (BCC) sont introduits dans un erlen contenant le mme milieu de culture dans les mmes
conditions de pH et de temprature. A partir de cet instant considr comme t0 des prlvements
striles sont effectus et les analyses microbiologiques et biochimiques sont ralises.

2. Etude prliminaire :
Q1 : Daprs le document 1, donner le nombre de bactries en une heure au bout de la troisime
gnration.
Q2 : Complter la phrase suivante : aprs n divisions, le nombre de bactrie est de
Q3 : Donner le taux de croissance horaire de cette culture bactrienne : r= et le temps de
gnration G =
Les paramtres de la croissance peuvent galement se dterminer graphiquement, en traant le
nombre de bactries N en fonction du temps on obtient le graphique prsent dans le document 2 a,
en prenant le log nprien du nombre N on obtient la courbe 2b.
Q4 : Le taux de croissance nprien (ou vitesse spcifique de croissance) : expo (x) ou Qexpo(x) et G : le
temps de gnration, sont dtermins grce la courbe ln A = f(t) et non par la courbe A = f(t), en
quoi est-ce plus judicieux dutiliser de ln A par rapport A = f(t) en regardant les documents 2a et
2b.
Paralllement la mesure de la croissance bactrienne vous allez dterminer la concentration de
glucose utilis au cours du temps, pour cela vous utiliserez le kit RTU dont le mode opratoire est
dcrit dans le document 4. Cest une mthode de dosage de substrat en point final.
Q5 : Retrouver la condition ncessaire ce type de dosage enzymatique
Q6 : Souligner le substrat doser en jaune, les enzymes en rouge et le chromogne incolore en bleu
et le chromophore qui absorbe en vert. Donner la raction principale et la raction indicatrice.
Q7: Retrouver la longueur donde laquelle les mesures seront effectues et le pH de la raction,
pourquoi a-t-on choisi ce pH ?

Q8 : Indiquer la liste du matriel utiliser et les conditions de scurit. Faire lorganigramme sous
forme de schmas de lensemble des manipulations effectues au cours de la sance.

3. Organisation de la sance :
Le travail a effectu se fera par groupe de quatre lves :
Chaque groupe dispose dun erlenmeyer contenant 90 mL de milieu strile BCC, dun erlen
de pr-culture dHafnia alvei
Il faudra 2 lves pour la partie biochimie et 2 lves pour la partie microbiologique puis vous
alternerez les postes la moiti de la sance.
Les analyses microbiologiques se feront en premier, puis les chantillons sont passs au fur
et mesure aux lves qui font lanalyse biochimique

4. Manipulations :
A : Partie microbiologique :
Les BCC striles et la prculture sont placs dans un bain-marie thermostat 37C sous
agitation.
Vrifier la strilit du milieu en faisant un tat frais et la puret de la pr-culture par un
Gram.
Faire un isolement sur GN pour le BCC strile et la pr-culture.
Vrifier le pH qui doit tre autour de 7,2 en prlevant strilement laide dun compte-
goutte strile un petit volume du milieu BCC, dposer dans un tube hmolyse, tremper le
papier pH dans le tube.
Un lve de chaque groupe devra prlever 10 mL de la pr-culture, laide de la pipette
usage unique strile de 10 mL et ensemencer lerlen contenant le BCC strile de la faon
suivante :
Bien homogniser la pr-culture avant de prlever
Verser les 10 mL le plus strilement possible dans lerlen contenant le BCC
Ds cet instant dclencher le chronomtre = t0
Homogniser lerlen de culture

Prlever 1 mL la pipette paille dans les conditions striles et le verser dans une cuve
spectrophotomtre= chantillon 0
Mettre la cuve immdiatement dans la glace pile pour arrter toute raction
Remettre le plus rapidement possible lerlen au bain-marie
A partir de lchantillon t0, un lve effectuera un dnombrement en cellule de Thoma (cf.
doc 3), lautre lira labsorbance 620 nm contre un blanc ractif =
Les autres prlvements seffectueront de la mme faon toutes les 10 minutes pendant la
premire heure puis toutes les 15 minutes ensuite.
Relever dans un tableau les diffrentes valeurs dabsorbance en fonction du temps ainsi que
le nombre de cellules comptes/mL.
Attention des dilutions seront ncessaires partir du moment o labsorbance lue dpasse
les limites du spectrophotomtre (voir selon lappareil) ou lorsque le nombre de bactries
est indnombrable en cellule de Thoma.
Le tracer de A = f(t) se fera en mme temps que les manipulations jusqu lobtention dun
plateau = phase stationnaire. Arrter alors les manipulations.
A la fin du TP, vrifier sil ny a pas eu de contamination en faisant un Gram et un isolement
sur GN.

Prcautions lors de la sance :

Eviter de contaminer lerlen en travaillant le plus proche possible du bec et en rebouchant


lerlen soigneusement aprs les prlvements.
Lerlen doit tre remis au bain-marie rapidement aprs les prlvements

B : Partie biochimique :
A partir des chantillons prlevs effectuer le dosage du glucose en fonction du temps selon
la fiche dutilisation du document 4.
Fin de sance : Rflchir sur vacuation des dchets, des milieux utiliss et des matriels.

5. Compte rendu :
Q1 : Tracer les courbes de croissance e A=f(t) ; N= f(t).
Q2 : Tracer la courbe ln A = f(t) en tenant compte quune unit dabsorbance = 5.108 cellules/mL
Q3 : Tracer ln N = f(t).
Q4 : Pour chaque courbe, indiquer titre, chelle, conditions .Comparer les courbes et choisir celle
vous permettant de dterminer les paramtres de la croissance Qexpo( Hafnia alvei) et G.
Q5 : Tracer (glucose ; milieu) = f(t) Indiquer (titre, chelle, conditions.) sous Excel
Lexploitation des courbes sera effectue en cours. Puis indiquer les paramtres de la croissance
dtermins sur la courbe qui a pu tre exxploite.
Q6 : Donner lintrt de placer lerlen contenant le milieu strile dans les mmes conditions que la
pr-culture.
Q7 : Trouver lintrt de conserver lagitation pendant la culture ainsi que la temprature.
Q8 : Analyser la composition du BCC ci-dessous et expliquer son classement dans la catgorie des
milieux riches.
Q9 : Retrouver le rle des peptones et du glucose dans la nutrition des bactries.
Composition en g/L du bouillon cur-cervelle BCC :

Peptones


Infusion de cervelle de veau
Infusion de cur de buf
NaCl


Glucose


Na2HPO4

10
12,5
5
5
2
2,5


DOCUMENT 1
Lors de la croissance bactrienne, il y a reproduction asexue par scission binaire ou de scissiparit
en l'absence de toute recombinaison gntique (pas de zygote). La bactrie est haplode ( possde
un chromosome) .

Chaque bactrie donne deux bactries filles chaque gnration, on dfinit deux paramtres de la
croissance :

Le temps de gnration (G) : le temps que met une bactrie mre pour se ddoubler en
deux bactries filles ou temps ncessaire au doublement de la population. G sexprime en
heure ou en minute
Le taux de croissance horaire (r) : le nombre de divisions par heure, r sexprime en h -1


DOCUMENT 2



DOCUMENT 2a








DOCUMENT 2b

Qx expo=(lnA2 lnA1) / (t2 t1) =


coefficient directeur de lnA = f(t)

DOCUMENT 3 : CELLULE DE THOMA


Compter les lments cellulaires
Avant de faire le comptage :
faire une observation lobjectif x10 non seulement pour
reprer le quadrillage mais aussi pour vrifier que les
cellules compter sont rparties de faon homogne
Passer lobjectif x40 pour effectuer le comptage
Pour les lments chevauchant les lignes, comptez tous
ceux qui chevauchent les lignes gauches et en haut. Ne
comptez aucun lment qui chevauche les lignes droite
et en bas.
Calcul du nombre de cellules par microlitre

Description
Le quadrillage total
volume : 0,1 l
ct : 1 mm
hauteur : 0,1 mm
Manipulation :
homogniser le liquide analyser (ou sa dilution),
lintroduire dans la cellule
Attendre au moins 4 min, la cellule bien lhorizontal, (les
lments cellulaires doivent sdimenter).
Si on prvoit un nombre lev de cellules : Diluer le liquide
analyser : 1/2 ou 1/5 ou 1/10 ou plus, dans du srum
physiologique.

Soit n le nombre dlments compts,


N le nombre dlments par microlitre (l),
V le volume de comptage.
Thoma : V = 0,1 l (totalit du quadrillage)

N = n / V donc N = n / 0,1
Si le comptage est effectu sur du liquide dilu : ne pas
oublier de multiplier le nombre dlments compts par
le taux de dilution.
Nettoyage aprs usage : cellule et lamelle plane :
immersion pendant 5 minutes dans un bain deau de
javel dilu,
rinage leau du robinet puis leau distille,
essuyage : linge fin ou papier absorbant non pelucheux
(genre Sopalin ) sans frotter,
laisser scher lair libre durant quelques minutes,
ranger labri des poussires.

DOCUMENT 4

KIT Glucose RTU


Dosage enzymatique du glucose
PRINCIPE :
Mthode utilisant une enzyme pour permettre le dosage de son substrat, lenzyme est ici un ractif,
son activit catalytique nest pas recherche.
Il est ncessaire que tout le substrat doser soit transform. Il faut pour cela que les ractions
soient totales et termines, certains ractifs sont ajouts en large excs pour dplacer les quilibres vers
la droite
La quantit de substrat transform est mesure par spectrophotomtrie. Une des molcules doit prsenter
une absorption caractristique.
Raction 1 :
Glucose oxydase
Glucose + O2

acide gluconique + H2O2

Leau oxygne forme est dose selon la raction de TRINDER (2).


Raction 2 :
Peroxydase
2H2O2 + phnol + amino-4 antipyrine

quinonimine+ 4 H2O

Lintensit de la coloration rouge (quinonimine), mesure 505 nm, est proportionnelle la quantit
de glucose prsente dans lchantillon.
MODE OPERATOIRE :






Prparation du ractif
Ractif prt lemploi.
Stabilit aprs ouverture, dans le flacon dorigine
2 mois 2-8C.
21 jours 20-25C.
Ralisation du test
Longueur donde : ____________ 505 nm (492 550 nm)
Zro de l'appareil : _____________________ blanc ractif
Blanc ractif

Etalon

Echantillon

Ractif

1ml


PRESENTATION ET COMPOSITION DU COFFRET
(Rf. 61 269 : 400 tests - Rf. 61 270 : 1000 tests)
Glucose RTU
Tampon phosphate pH 6,6
225 mmol/l
Amino-4-antipyrine
0,3 mmol/l
Phnol
8,5 mmol/l
EDTA
5 mmol/l
Peroxydase 300 U/l
Glucose oxydase 10 000 U/l

Etalon

Dosage

E1

E2

10l

10l

1ml

1ml

D1

10l

10l

1ml

1ml

Mlanger.
Photomtrer aprs une incubation de :
10 minutes 37C.
20 minutes 20-25C.
Stabilit de ltalonnage : Effectuer un talonnage chaque srie de dosages.
Stabilit de la coloration : 1 heure 20-25C.

CALCUL :

xn

Concentration de l'chantillon =
n = concentration de ltalon
Multiplier, si ncessaire, le rsultat obtenu par le facteur de dilution.
FACTEUR DE CONVERSION :

mmol/l x 0,180 = g/l

; g/l x 5 ,56 = mmol/l ;

D2