de
la
croissance
bactrienne
en
milieu
non
renouvel
Le
responsable
dune
fromagerie
produisant
du
camembert
dcide
deffectuer
une
tude
des
paramtres
de
la
croissance
de
la
souche
Hafnia
alvei
(bacille
Gram
-,
impliqu
dans
laffinage
du
fromage
et
ayant
un
impact
positif
sur
la
production
de
composs
aromatiques).
Pour
cela
il
doit
tudier
la
croissance
de
la
bactrie
dans
les
conditions
optimales,
son
laboratoire
ne
lui
permettant
pas
de
faire
de
telles
analyses,
il
vous
demande
de
faire
ce
travail
et
de
lui
communiquer
les
rsultats
obtenus.
1. Principe
:
La
croissance
se
dfinit
comme
laccroissement
ordonn
de
tous
les
composants
dun
organisme.
Chez
les
organismes
pluricellulaires
elle
conduit
une
augmentation
de
taille
ou
de
masse,
chez
les
organismes
unicellulaires
(bactries,
levures
par
exemple)
elle
aboutit
essentiellement
une
augmentation
du
nombre
dindividus.
La
mesure
de
la
croissance
se
fera
par
le
suivi
de
labsorbance
en
fonction
du
temps
et
paralllement
par
comptage
en
cellule
de
Thoma.
La
quantit
de
glucose
consomme
(substrat)
en
fonction
du
temps,
sera
dose
par
mthode
enzymatique.
10mL
dune
prculture
frache
de
la
nuit
de
la
souche
slectionne
Hafnia
alvei
en
bouillon
cur- cervelle
(BCC)
sont
introduits
dans
un
erlen
contenant
le
mme
milieu
de
culture
dans
les
mmes
conditions
de
pH
et
de
temprature.
A
partir
de
cet
instant
considr
comme
t0
des
prlvements
striles
sont
effectus
et
les
analyses
microbiologiques
et
biochimiques
sont
ralises.
2. Etude
prliminaire
:
Q1
:
Daprs
le
document
1,
donner
le
nombre
de
bactries
en
une
heure
au
bout
de
la
troisime
gnration.
Q2
:
Complter
la
phrase
suivante
:
aprs
n
divisions,
le
nombre
de
bactrie
est
de
Q3
:
Donner
le
taux
de
croissance
horaire
de
cette
culture
bactrienne
:
r=
et
le
temps
de
gnration
G
=
Les
paramtres
de
la
croissance
peuvent
galement
se
dterminer
graphiquement,
en
traant
le
nombre
de
bactries
N
en
fonction
du
temps
on
obtient
le
graphique
prsent
dans
le
document
2
a,
en
prenant
le
log
nprien
du
nombre
N
on
obtient
la
courbe
2b.
Q4
:
Le
taux
de
croissance
nprien
(ou
vitesse
spcifique
de
croissance)
:
expo
(x)
ou
Qexpo(x)
et
G
:
le
temps
de
gnration,
sont
dtermins
grce
la
courbe
ln
A
=
f(t)
et
non
par
la
courbe
A
=
f(t),
en
quoi
est-ce
plus
judicieux
dutiliser
de
ln
A
par
rapport
A
=
f(t)
en
regardant
les
documents
2a
et
2b.
Paralllement
la
mesure
de
la
croissance
bactrienne
vous
allez
dterminer
la
concentration
de
glucose
utilis
au
cours
du
temps,
pour
cela
vous
utiliserez
le
kit
RTU
dont
le
mode
opratoire
est
dcrit
dans
le
document
4.
Cest
une
mthode
de
dosage
de
substrat
en
point
final.
Q5
:
Retrouver
la
condition
ncessaire
ce
type
de
dosage
enzymatique
Q6
:
Souligner
le
substrat
doser
en
jaune,
les
enzymes
en
rouge
et
le
chromogne
incolore
en
bleu
et
le
chromophore
qui
absorbe
en
vert.
Donner
la
raction
principale
et
la
raction
indicatrice.
Q7:
Retrouver
la
longueur
donde
laquelle
les
mesures
seront
effectues
et
le
pH
de
la
raction,
pourquoi
a-t-on
choisi
ce
pH
?
Q8
:
Indiquer
la
liste
du
matriel
utiliser
et
les
conditions
de
scurit.
Faire
lorganigramme
sous
forme
de
schmas
de
lensemble
des
manipulations
effectues
au
cours
de
la
sance.
3. Organisation
de
la
sance
:
Le
travail
a
effectu
se
fera
par
groupe
de
quatre
lves
:
Chaque
groupe
dispose
dun
erlenmeyer
contenant
90
mL
de
milieu
strile
BCC,
dun
erlen
de
pr-culture
dHafnia
alvei
Il
faudra
2
lves
pour
la
partie
biochimie
et
2
lves
pour
la
partie
microbiologique
puis
vous
alternerez
les
postes
la
moiti
de
la
sance.
Les
analyses
microbiologiques
se
feront
en
premier,
puis
les
chantillons
sont
passs
au
fur
et
mesure
aux
lves
qui
font
lanalyse
biochimique
4. Manipulations
:
A
:
Partie
microbiologique
:
Les
BCC
striles
et
la
prculture
sont
placs
dans
un
bain-marie
thermostat
37C
sous
agitation.
Vrifier
la
strilit
du
milieu
en
faisant
un
tat
frais
et
la
puret
de
la
pr-culture
par
un
Gram.
Faire
un
isolement
sur
GN
pour
le
BCC
strile
et
la
pr-culture.
Vrifier
le
pH
qui
doit
tre
autour
de
7,2
en
prlevant
strilement
laide
dun
compte- goutte
strile
un
petit
volume
du
milieu
BCC,
dposer
dans
un
tube
hmolyse,
tremper
le
papier
pH
dans
le
tube.
Un
lve
de
chaque
groupe
devra
prlever
10
mL
de
la
pr-culture,
laide
de
la
pipette
usage
unique
strile
de
10
mL
et
ensemencer
lerlen
contenant
le
BCC
strile
de
la
faon
suivante
:
Bien
homogniser
la
pr-culture
avant
de
prlever
Verser
les
10
mL
le
plus
strilement
possible
dans
lerlen
contenant
le
BCC
Ds
cet
instant
dclencher
le
chronomtre
=
t0
Homogniser
lerlen
de
culture
Prlever
1
mL
la
pipette
paille
dans
les
conditions
striles
et
le
verser
dans
une
cuve
spectrophotomtre=
chantillon
0
Mettre
la
cuve
immdiatement
dans
la
glace
pile
pour
arrter
toute
raction
Remettre
le
plus
rapidement
possible
lerlen
au
bain-marie
A
partir
de
lchantillon
t0,
un
lve
effectuera
un
dnombrement
en
cellule
de
Thoma
(cf.
doc
3),
lautre
lira
labsorbance
620
nm
contre
un
blanc
ractif
=
Les
autres
prlvements
seffectueront
de
la
mme
faon
toutes
les
10
minutes
pendant
la
premire
heure
puis
toutes
les
15
minutes
ensuite.
Relever
dans
un
tableau
les
diffrentes
valeurs
dabsorbance
en
fonction
du
temps
ainsi
que
le
nombre
de
cellules
comptes/mL.
Attention
des
dilutions
seront
ncessaires
partir
du
moment
o
labsorbance
lue
dpasse
les
limites
du
spectrophotomtre
(voir
selon
lappareil)
ou
lorsque
le
nombre
de
bactries
est
indnombrable
en
cellule
de
Thoma.
Le
tracer
de
A
=
f(t)
se
fera
en
mme
temps
que
les
manipulations
jusqu
lobtention
dun
plateau
=
phase
stationnaire.
Arrter
alors
les
manipulations.
A
la
fin
du
TP,
vrifier
sil
ny
a
pas
eu
de
contamination
en
faisant
un
Gram
et
un
isolement
sur
GN.
Prcautions
lors
de
la
sance
:
Eviter
de
contaminer
lerlen
en
travaillant
le
plus
proche
possible
du
bec
et
en
rebouchant
lerlen
soigneusement
aprs
les
prlvements.
Lerlen
doit
tre
remis
au
bain-marie
rapidement
aprs
les
prlvements
B
:
Partie
biochimique
:
A
partir
des
chantillons
prlevs
effectuer
le
dosage
du
glucose
en
fonction
du
temps
selon
la
fiche
dutilisation
du
document
4.
Fin
de
sance
:
Rflchir
sur
vacuation
des
dchets,
des
milieux
utiliss
et
des
matriels.
5. Compte
rendu
:
Q1
:
Tracer
les
courbes
de
croissance
e
A=f(t)
;
N=
f(t).
Q2
:
Tracer
la
courbe
ln
A
=
f(t)
en
tenant
compte
quune
unit
dabsorbance
=
5.108
cellules/mL
Q3
:
Tracer
ln
N
=
f(t).
Q4
:
Pour
chaque
courbe,
indiquer
titre,
chelle,
conditions
.Comparer
les
courbes
et
choisir
celle
vous
permettant
de
dterminer
les
paramtres
de
la
croissance
Qexpo(
Hafnia
alvei)
et
G.
Q5
:
Tracer
(glucose
;
milieu)
=
f(t)
Indiquer
(titre,
chelle,
conditions.)
sous
Excel
Lexploitation
des
courbes
sera
effectue
en
cours.
Puis
indiquer
les
paramtres
de
la
croissance
dtermins
sur
la
courbe
qui
a
pu
tre
exxploite.
Q6
:
Donner
lintrt
de
placer
lerlen
contenant
le
milieu
strile
dans
les
mmes
conditions
que
la
pr-culture.
Q7
:
Trouver
lintrt
de
conserver
lagitation
pendant
la
culture
ainsi
que
la
temprature.
Q8
:
Analyser
la
composition
du
BCC
ci-dessous
et
expliquer
son
classement
dans
la
catgorie
des
milieux
riches.
Q9
:
Retrouver
le
rle
des
peptones
et
du
glucose
dans
la
nutrition
des
bactries.
Composition
en
g/L
du
bouillon
cur-cervelle
BCC
:
Peptones
Infusion
de
cervelle
de
veau
Infusion
de
cur
de
buf
NaCl
Glucose
Na2HPO4
10
12,5
5
5
2
2,5
DOCUMENT
1
Lors
de
la
croissance
bactrienne,
il
y
a
reproduction
asexue
par
scission
binaire
ou
de
scissiparit
en
l'absence
de
toute
recombinaison
gntique
(pas
de
zygote).
La
bactrie
est
haplode
(
possde
un
chromosome)
.
Chaque
bactrie
donne
deux
bactries
filles
chaque
gnration,
on
dfinit
deux
paramtres
de
la
croissance
:
Le
temps
de
gnration
(G)
:
le
temps
que
met
une
bactrie
mre
pour
se
ddoubler
en
deux
bactries
filles
ou
temps
ncessaire
au
doublement
de
la
population.
G
sexprime
en
heure
ou
en
minute
Le
taux
de
croissance
horaire
(r)
:
le
nombre
de
divisions
par
heure,
r
sexprime
en
h
-1
DOCUMENT
2
DOCUMENT
2a
DOCUMENT
2b
Qx expo=(lnA2 lnA1) / (t2 t1) =
coefficient directeur de lnA = f(t)
DOCUMENT 3 : CELLULE DE THOMA
Compter
les
lments
cellulaires
Avant
de
faire
le
comptage
:
faire
une
observation
lobjectif
x10
non
seulement
pour
reprer
le
quadrillage
mais
aussi
pour
vrifier
que
les
cellules
compter
sont
rparties
de
faon
homogne
Passer
lobjectif
x40
pour
effectuer
le
comptage
Pour
les
lments
chevauchant
les
lignes,
comptez
tous
ceux
qui
chevauchent
les
lignes
gauches
et
en
haut.
Ne
comptez
aucun
lment
qui
chevauche
les
lignes
droite
et
en
bas.
Calcul
du
nombre
de
cellules
par
microlitre
Description
Le
quadrillage
total
volume
:
0,1
l
ct
:
1
mm
hauteur
:
0,1
mm
Manipulation
:
homogniser
le
liquide
analyser
(ou
sa
dilution),
lintroduire
dans
la
cellule
Attendre
au
moins
4
min,
la
cellule
bien
lhorizontal,
(les
lments
cellulaires
doivent
sdimenter).
Si
on
prvoit
un
nombre
lev
de
cellules
:
Diluer
le
liquide
analyser
:
1/2
ou
1/5
ou
1/10
ou
plus,
dans
du
srum
physiologique.
Soit
n
le
nombre
dlments
compts,
N
le
nombre
dlments
par
microlitre
(l),
V
le
volume
de
comptage.
Thoma
:
V
=
0,1
l
(totalit
du
quadrillage)
N
=
n
/
V
donc
N
=
n
/
0,1
Si
le
comptage
est
effectu
sur
du
liquide
dilu
:
ne
pas
oublier
de
multiplier
le
nombre
dlments
compts
par
le
taux
de
dilution.
Nettoyage
aprs
usage
:
cellule
et
lamelle
plane
:
immersion
pendant
5
minutes
dans
un
bain
deau
de
javel
dilu,
rinage
leau
du
robinet
puis
leau
distille,
essuyage
:
linge
fin
ou
papier
absorbant
non
pelucheux
(genre
Sopalin
)
sans
frotter,
laisser
scher
lair
libre
durant
quelques
minutes,
ranger
labri
des
poussires.
DOCUMENT
4
KIT
Glucose
RTU
Dosage enzymatique du glucose PRINCIPE
:
Mthode
utilisant
une
enzyme
pour
permettre
le
dosage
de
son
substrat,
lenzyme
est
ici
un
ractif,
son
activit
catalytique
nest
pas
recherche.
Il
est
ncessaire
que
tout
le
substrat
doser
soit
transform.
Il
faut
pour
cela
que
les
ractions
soient
totales
et
termines,
certains
ractifs
sont
ajouts
en
large
excs
pour
dplacer
les
quilibres
vers
la
droite
La
quantit
de
substrat
transform
est
mesure
par
spectrophotomtrie.
Une
des
molcules
doit
prsenter
une
absorption
caractristique.
Raction 1 : Glucose oxydase Glucose + O2
acide gluconique + H2O2
Leau oxygne forme est dose selon la raction de TRINDER (2).
Lintensit de la coloration rouge (quinonimine), mesure 505 nm, est proportionnelle la quantit de glucose prsente dans lchantillon. MODE
OPERATOIRE
:
Prparation
du
ractif
Ractif prt lemploi. Stabilit aprs ouverture, dans le flacon dorigine 2 mois 2-8C. 21 jours 20-25C. Ralisation
du
test
Longueur donde : ____________ 505 nm (492 550 nm) Zro de l'appareil : _____________________ blanc ractif Blanc ractif
Mlanger. Photomtrer aprs une incubation de : 10 minutes 37C. 20 minutes 20-25C. Stabilit
de
ltalonnage
: Effectuer un talonnage chaque srie de dosages. Stabilit
de
la
coloration
:
1 heure 20-25C.
CALCUL :
xn
Concentration de l'chantillon = n = concentration de ltalon Multiplier, si ncessaire, le rsultat obtenu par le facteur de dilution. FACTEUR DE CONVERSION :
