Vous êtes sur la page 1sur 107

INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL

UNIDAD PROFESIONAL DE BIOTECNOLOGA


DEPARTAMENTO DE BIOLOGA
ACADEMIA DE MICROBIOLOGA

MANUAL DE PRCTICAS PARA LA ASIGNATURA:


LABORATORIO DE TCNICAS MICROBIOLGICAS
PRIMERA EDICIN

AUTORAS:
Q.B.P. MIRIAM JUREZ JUREZ
Q.B.P. REFUGIA PREZ SNCHEZ
BIOL. L. PATRICIA RODRGUEZ PASCUAL
EDITORAS:
Q.B.P. MIRIAM JUREZ JUREZ
M. EN C. GLORIA LPEZ JIMNEZ

Manual para el Laboratorio de tcnicas microbiolgicas. UPIBI-IPN

INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL


UNIDAD PROFESIONAL DE BIOTECNOLOGA
DEPARTAMENTO DE BIOLOGA
ACADEMIA DE MICROBIOLOGA

MANUAL DE PRCTICAS PARA LA ASIGNATURA:


LABORATORIO DE TCNICAS MICROBIOLGICAS
PRIMERA EDICIN

AUTORAS:
Q.B.P. MIRIAM JUREZ JUREZ
Q.B.P. REFUGIA PREZ SNCHEZ
BIOL. L. PATRICIA RODRGUEZ PASCUAL
EDITORAS:
Q.B.P. MIRIAM JUREZ JUREZ
M. EN C. GLORIA LPEZ JIMNEZ

Autoras: Jurez Jurez M., Prez Snchez R., Rodrguez Pascual P.

PRCTICA No. 1: MICROSCOPA


UNIDAD I: Normatividad en el laboratorio y microscopa
1. OBJETIVOS:
1.1 Objetivo general

El alumno aprender a enfocar correctamente una preparacin para ser observada en el microscopio
compuesto, as como la forma correcta de utilizarlo
1.2 Objetivos especficos

Utilizar correctamente el microscopio compuesto


Realizar la tcnica de iluminacin de Khler
Observar preparaciones temporales en el microscopio compuesto
2.- INTRODUCCIN
El microscopio es un instrumento ptico que amplifica la imagen de un objeto pequeo. Mediante un sistema de
lentes y fuentes de iluminacin se puede hacer visible un objeto microscpico. Los microscopios pueden
aumentar de 100 a cientos de miles de veces el tamao original. Los diversos elementos que existen en la
naturaleza, presentan tamaos, formas y composiciones distintas, la mayora de ellas pueden verse, algunas a
simple vista, y otras mediante instrumentos.
Para poder observar a la clula es necesario recurrir a equipos como el microscopio, de este existen diversas
variedades, los cuales estn diseados a lo que pretendemos observar y como ejemplo tenemos a:
Microscopio ptico
Es un instrumento (de un lente o varios lentes), que amplifica una imagen y permite la observacin de mayores
detalles de los posibles a simple vista. El microscopio ms simple es una lente de aumento o un par de anteojos.
El poder de resolucin del ojo humano es de 0,2 mm es decir que para ver dos objetos separados estos deben
estar como mnimo a esa distancia. El microscopio aumenta la imagen hasta el nivel de la retina, para captar la
informacin. La resolucin depende de la longitud de onda de la fuente luminosa, el espesor de la muestra, la
calidad de la fijacin y la intensidad de la coloracin. Tericamente la mxima resolucin que se puede alcanzar
es de 0,2 m dada por una luz con longitud de onda de 540 nm, la cual pasa por un filtro verde (muy sensible
por el ojo humano) y con objetos condensadores adecuados. El ocular aumenta la imagen producida por el
objetivo, pero no puede aumentar la resolucin. Existen distintos microscopios pticos generales y de
investigacin que se diferencian en factores tales como la longitud de onda de la iluminacin, la alteracin fsica
de la luz que incide en la muestra y procesos analticos que se aplican a la imagen final.
El microscopio compuesto esta formado por tres sistemas: 1. Sistema de iluminacin; 2. Sistema ptico y 3.
Sistema mecnico.
El sistema de iluminacin corresponde a la fuente de luz y sus aditamentos para iluminar eficazmente la
preparacin y esta formado principalmente por la lmpara (6V), el diafragma de campo y el condensador (lente
frontal, diafragma de iris y lente auxiliar)
El sistema ptico esta formado por una serie de lentes de vidrio en los objetivos y oculares que permiten
agrandar la imagen y esta formado por los objetivos, tubo y el ocular.

El sistema mecnico esta formado por una serie de engranes y botones que permiten realizar el movimiento y
cambio de las lentes as como el enfoque de la preparacin y esta formado por la base, estativo, tornillos
macromtrico y micromtrico, platina, revlver y portarevlver.
Funcin bsica de cada parte del microscopio:
a.- Sistema mecnico
Base. Pieza metlica que sostiene a todo el aparato
Estativo. Lugar de donde se debe tomar para trasladar al microscopio
Platina. Es una plancha cuadrada y gruesa de metal con un orificio central en donde descansa la preparacin, la
cual es fijada por dos pequeas pinzas, se puede mover hacia arriba y hacia abajo con los tornillos macromtrico
y micromtrico por medio de un sistema de engranes. Posee escalas numricas que permiten ubicar fcilmente
la posicin de lo que se observa y, al mismo tiempo, deslizar la preparacin en forma de cruz (ejes X y Y) para
su localizacin.
Pinzas. Sirve para sujetar al portaobjetos.
Tornillo macromtrico. Permite el enfoque mayor.
Tornillo micromtrico. Permite el enfoque con precisin.
Tubo del ocular. Sostiene el lente del ocular.
Revolver: Es un dispositivo giratorio en donde se atornillan las lentes de los objetivos de distinto aumento.
Tubo binocular. Cada uno de los tubos contiene en el interior un sistema de prismas y espejos que dividen el
haz de luz en dos haces, cada uno de los cuales se enva por separado a cada tubo, estos tubos se deslizan
hacia los lados para ajustar la distancia interpupilar ya que cada persona posee una diferente separacin entre
sus ojos. Los microscopios binoculares tienen entre los tubos una escala grabada para poder ajustar la distancia
y cada persona debe memorizar su valor de apertura interpupilar; uno de los tubos tiene el ocular fijo y el otro
tiene un sistema mecnico que sube o baja. Para realizar el enfoque de cada ojo primero se enfoca con el
tornillo micromtrico el tubo que tiene el ocular fijo y despus se enfoca el que tiene el ocular mvil, pero en este
caso sin mover el tornillo micromtrico, girando el ocular mvil hasta encontrar el foco.
b.- Sistema de iluminacin
Lmpara. Es la encargada de proporcionar los haces de luz y tiene las siguientes caractersticas: 6V, 5-15 W
12 V, 50-100 W
Diafragma de campo. Esta situada en la base del microscopio y su funcin es la de regular el dimetro de la
emisin de la luz a fin de que se ilumine solo el rea de campo visual, es decir controla la cantidad de luz que
atraviesa la preparacin.
Condensador. Es un sistema de tres lentes convergentes que concentran los rayos luminosos sobre el objeto a
observar, el condensador utilizado es capaz de agrupar todos los rayos que provienen del foco y permite
aprovechar toda la luz posible que inciden sobre l y los dirige hacia el plano focal del objeto.
c. Sistema ptico
Oculares

El ocular es la parte ptica final externa, situados en el tubo a travs de los cuales se obtiene la imagen final, el
ocular tiene aumento propio (los aumentos son denominados con la letra X), en nuestro caso es de 10X. El
ocular consta de una lente cercana al ojo, collar, tubo del ocular y una lente cercana al objetivo.
Tubo
El tubo es la parte ptica mecnica, situada en la parte superior del microscopio, este puede ser monocular o
binocular, adems esta adaptada para poderle colocar una cmara fotogrfica una cmara de televisin. El
tubo generalmente esta diseado para trabajar a una distancia mecnica fija entre ellos y este valor puede ser
de 160 mm, el factor del tubo del microscopio a utilizar en el laboratorio es de 1,25X, dato que nos sirve para
calcular el aumento total.
Objetivos
Son lentes que captan la imagen a observar, estn construidos de cristal o fluorita, poseen aumento propio,
apertura numrica y esta diseada para trabajar con diferentes campos. Todos los objetivos tienen anillos de
colores y nmeros grabados sobre el tubo metlico, que nos permite saber a detalle cuales son sus ventajas, la
disposicin de estos caracteres es la siguiente:
1.- El anillo de color superior indica los aumentos (Tabla 1)
2.- El lado superior izquierdo indica el nmero de aumentos
3.- El lado superior derecho la apertura numrica.
4.- El lado inferior la distancia mecnica
5.- El lado inferior derecho el espesor del cubreobjetos
6.- El anillo de color inferior indica en qu medio se hace la inmersin del objetivo (Tabla 2)
En ocasiones el objetivo puede traer en lugar de 0.17, el nmero 1, el cual indica que:
Acepta cubreobjetos desde 0,17 a 0,22 mm de espesor,
10= No requiere cubreobjetos
0,11 0,27 = Es ajustable a diferentes espesores de los cubreobjetos, desde 0,11 mm hasta 0,27 mm.
Anillo superior
Los anillos de color cerca del anillo moleteado facilitan el reconocimiento del coeficiente de aumento:
Tabla 1. Correspondencia entre los aumentos y los anillos de colores
grabados
Aumentos
1.0X

Color anillo
superior
Negro

2.5 X
4.0 X
6.3 X
10 X
16 X
25 X
40 X
63 X
100X

Pardo
Rojo
Anaranjado
Amarillo
Verde claro
Verde oscuro
Azul claro
Azul oscuro
Blanco

Tabla 2. Colores para el anillo inferior que indican en qu medio se debe hacer la
inmersin del objetivo
Carcter
Oil

Sustancia
Aceite

ndice de refraccin Color del anillo


1,515
Negro

Agua

1,333

Blanco

Glyz

Glicerina

1,455

Anaranjado

Metileno

Yoduro de metileno

1,740

Amarillo

Aumentos totales:
El nmero total de aumentos que se puede lograr en un microscopio se obtiene multiplicando el nmero de
aumentos que tiene el ocular por el nmero de aumentos que tiene el tubo y por el nmero de aumentos que
tiene el objetivo con el que se esta observando.
Distancia mecnica:
Se llama distancia mecnica a la distancia que recorre a luz por el interior del microscopio desde que penetra por
el objetivo, pasando por los tubos y espejos, hasta llegar al ocular, la distancia mecnica se mide desde la
superficie de la rosca del objetivo hasta la base del ocular, esta distancia en el caso de nuestro microscopio es
de 160 mm.
Poder de resolucin:
El poder de resolucin de una lente se define como la capacidad que tiene para discernir entre dos puntos muy
cercanos entre s y que puedan verse separada.
El poder de resolucin del ojo humano es de 0,2 mm, el microscopio ptico de 0,2 y el microscopio electrnico
de 6 ngstrom.
Apertura numrica:
Es una medida de la amplitud del cono luminoso que se forma por las lentes del microscopio, ya sea del
condensador o del objetivo.
Microscopio de contraste de fase
Permite observar clulas sin colorear y resulta especialmente til para clulas vivas.
Este aprovecha las pequeas diferencias de los ndices de refraccin en las distintas partes de una clula y en
distintas partes de una muestra de tejido. La luz que pasa por regiones de mayor ndice de refraccin
experimenta una deflexin y queda fuera de fase con respecto al haz principal de ondas de luz que pasaron la
muestra. Aparea otras longitudes de onda fuera de fase por medio de una serie de anillos pticos del objetivo y
del condensador, anula la amplitud de la porcin fuera de fase inicial del haz de luz y produce un contraste til
sobre la imagen. Las partes oscuras de la imagen corresponden a las porciones densas del espcimen; las
partes claras de la imagen corresponden a porciones menos densas. Por lo tanto estos microscopios se utilizan
para observar clulas vivas, tejidos vivos y cortes semifinos no coloreados.
La resolucin de este microscopio no puede ser mejor que la del microscopio de campo oscuro porque emplea la
misma fuente de longitud de onda, sin embargo puede detectar partculas individuales ms pequeas en las
imgenes de campo oscuro, debido al contraste creado. Es til para observar autorradiografas, cristales en la
orina y para detectar espiroquetas en particular el Treponema pallidum microorganismo causante de la sfilis.
Cada uno de los microscopios tiene una funcin determinada, en este y en este caso este tipo de microscopio
utiliza un microscopio auxiliar y un filtro verde, adems en este tipo de microscopio tambin se realiza la tcnica
de iluminacin de Khler.

Fig. Diafragma de iris de un microscopio de contraste de fases, microscopio auxiliar y filtro verde
3. MATERIAL, EQUIPO, REACTIVOS Y CEPAS MICROBIANAS POR EQUIPO
3.1 MATERIAL POR EQUIPO

Microscopio compuesto

Preparaciones fijas de bacterias

Preparaciones en fresco de mohos

Preparaciones en fresco de agua estancada

Frasco con benzal


Esponja
Papel seda
Lmpara de alcohol

3.2 REACTIVOS

Aceite de inmersin

Atomizador con benzal


3.3 MATERIAL QUE DEBE TRAER EL ALUMNO

Una muestra de agua estancada

Comida con mohos

Colores

4. DESARROLLO EXPERIMENTAL
4.1 Cuidado y limpieza del microscopio
Un proceso de limpieza debe considerar los siguientes aspectos:
a.- Para limpiar la parte ptica, se elimina primero las partculas de polvo, ya sea con un bulbo inyector de aire,
un pincel o soplando fuertemente sobre la lente.
b.- Algunos solventes como la acetona disuelven los revestimientos de barniz, la pintura y an el cemento de las
molduras y los objetivos compuestos, por lo que no se deben usar.
c.- Las guas mecnicas deben mantenerse lubricadas.
Se enlistan algunos compuestos recomendados slo para ciertas partes del microscopio.
a.- Espuma de jabn suave.- Solo para remover lo sucio de la superficie de instrumentos
b.- Agua destilada con algn detergente sin aditivos alcalinos.- para un prelimpiado de la ptica.
c.- Solucin para limpiar la ptica.- etanol al 40 %, ter al 20 %, para limpiar superficies de la ptica o remover
residuos de aceite de inmersin.
4.2 TCNICA DE ILUMINACIN MTODO KHLER
A fin de evitar toda serie de inconvenientes y poder utilizar lmparas de filamento espirilado, Khler propone un
mtodo que actualmente es utilizado. Su iluminacin comporta dos diafragmas: un diafragma denominado de
campo, situado generalmente a nivel de la lmpara colectora y un diafragma llamado de abertura, situado
generalmente debajo del condensador.
Pasos a seguir para la iluminacin de Khler en un microscopio
1.- Luz amarilla (bajo voltaje)

2.- Ajustar la distancia interpupilar


3.- Ajustar las dioptras
4.- Abrir el diafragma de campo e iris

4.3 Observacin de una preparacin temporal


a.- Tomar un portaobjetos limpio y desengrasado con una torunda que contenga alcohol
b.- Colocar una gota pequea del agua estancada con una pipeta Pasteur
d.- Cubrir la preparacin con el cubreobjetos
e.- Observar al microscopio de contraste de fases a 10 y 40 X
f.- Observar la preparacin temporal realizada en el microscopio compuesto y comparar los resultados obtenidos
g.- Realizar esquemas de las preparaciones observadas.
4.4 Observaciones de preparaciones fijas
a.- Tomar una preparacin fija y enfocarla a 10 y 40 X.
b.- Adicionarle aceite de inmersin y observarlo a 100 X
c.- Observar la preparacin que contiene una gran cantidad de muestra y realizar el esquema biolgico
d.- Ahora mover la preparacin para enfocar la preparacin con poca cantidad de muestra.
e.- Comparar ambas muestra y concluir

5.- RESULTADOS Y CUESTIONARIO


5.1.- Imagen a color de la preparacin en fresco de agua estancada con el microscopio ptico a 10X y 40X.
5.2.- Imagen a color de la preparacin fija a 40X y 100X, Nombre del microorganismo, Forma y agrupacin
5.3 Consulta la bibliografa y llena la siguiente tabla:
Tipo de microscopio Poder de resolucin
Compuesto
Contraste de fase
Electrnico
Estereoscpico
Fluorescencia
Interferencia
Polarizacin

Aplicaciones

5.4 En la siguiente tabla resume la funcin de cada una de las siguientes partes:
Parte del microscopio
Funcin
Sistema al que pertenece:
(mecnico, ptico, iluminacin)
Condensador
Diafragma de campo
Diafragma de iris
Filtro azul
Lmpara
Objetivo
Ocular
Platina
Revlver
Tornillo macromtrico
Tornillo micromtrico
6.- ANLISIS Y DISCUSIN DE RESULTADOS
6.1 Ventajas y desventajas de utilizar la iluminacin de Khler.
6.2 Ventajas y desventajas de un microscopio compuesto, con respecto a su uso, Tipo de preparacin y cantidad
de muestra utilizada
6.3 Tamao de las imgenes observadas en cada aumento
7.- CONCLUSIONES
Elabora tus conclusiones tomando en consideracin los objetivos de la prctica, los resultados obtenidos y la
bibliografa consultada.

8.- REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS


8.1 Barrera Escorcia Hctor El Microscopio ptico 1 edicin. 1997. Editores Plaza y Valdez, S.A. de C.V.
8.2. Freifelder, D. Tcnicas de Bioqumica y Biologa Molecular. Revert Mexicana, S.A. de C.V. 1991. 139.
8.3 Locquin Marcel, Manual de Microscopa I 1 edicin, 1985. Ed. Labor S.A.
8.4 Rincn-Snchez A.R.y ReyesOrtiz N. Manual de Microscopa ptica 1 edicin. 1991. Editado por la
Asociacin de Qumicos del Instituto Nacional de Nutricin, Secretara de Salud., Mxico..

LABORATORIO DE TCNICAS MICROBIOLGICAS. UPIBI-IPN

PRACTICA No. 2
PREPARACIONES FIJAS Y EN FRESCO
UNIDAD I: Normatividad en el laboratorio y microscopa.
TEMA: 1.3 Preparacin de un frotis microbiano.
1.3.1 Preparaciones fijas
1.3.2 Preparaciones en fresco
1. OBJETIVOS
1.1 Objetivo general
El alumno realizar preparaciones en fresco y fijas para ser observadas en el microscopio ptico por medio de
tinciones.
I.2 Objetivo especficos
1.2.1 Realizar preparaciones en fresco y fijas de bacterias y mohos
1.2.2 Realizar tinciones simples, diferenciales y especficas.
1.2.3. Realizar esquemas coloridos de las observaciones a 40X y 100X
2. INTRODUCCIN
La gran mayora de los microorganismos son invisibles para el ojo humano, por lo que el uso del microscopio
resulta indispensable para observar a estos seres vivos. Para lograr una buena observacin microscpica es
necesario tomar en cuenta la preparacin de la muestra, debido a que los objetos deben tener un cierto grado de
contraste con el medio circundante para poder ser percibidos a travs del microscopio, adems de que los
microorganismos carecen de una coloracin natural, hay que teirlos previamente para hacerlos resaltar de
manera artificial del fondo de la imagen. Una forma de conseguir este contraste consiste en realizar tinciones
simples con un colorante o tincin diferencial.
Tincin simple: En las tinciones simples se utiliza un solo colorante, que siempre es de tipo bsico, se utiliza
solamente para incrementar el contraste de la clula que absorber el colorante y quedar teido del mismo
color.
Tincin diferencial: Se utilizan una combinacin de colorantes para dar diversos complejos coloridos y como
ejemplo tenemos la tincin de Gram y la tincin de Ziehl-Neelsen.
Tinciones especficas: Incrementan el contraste en las clulas microbianas y revelan estructuras particulares,
entre las que se incluyen las endosporas, los flagelos y la cpsula. Estas tcnicas se basan en la estructura que
se desea poner de manifiesto tiene un grado de afinidad por los colores utilizados mayor que el resto de la
clula.
Las bacterias no teidas muestran pocos detalles morfolgicos, el diagnstico bacteriolgico generalmente se
basa en las diferentes afinidades tintoriales de las bacterias para identificarlos ms adecuadamente, Sin
embargo, tambin resultan tiles las preparaciones no teidas en la determinacin de la movilidad.
Las preparaciones fijas y teidas son de uso casi universal, tanto a partir de especimenes recibidos como de
colonias cultivadas. En general una muestra del espcimen original puede ser colocada directamente sobre el
portaobjetos o bien ser recogida con una asa, recordando siempre tener una preparacin delgada y homognea.
Una colonia puede ser examinada haciendo con ella una suspensin tenue en una gota de solucin salina, y
luego extendindola con una asa sobre un portaobjetos. Las pelculas secadas al aire son fijadas con calor
suave sobre la flama de un mechero y luego pasadas a travs de ella. Debe tenerse cuidado para evitar el calor
excesivo, que puede alterar la forma bacteriana. El calor deseable es aquel en el que el portaobjetos sea apenas
caliente para ser colocado sobre el dorso de la mano.
Aunque cuando tenemos la necesidad de observar preparaciones en fresco podemos utilizar el microscopio de
contraste de fases, en donde la caracterstica ms importante de este tipo de microscopio es que nos permite ver
a los microorganismos sin la necesidad de teirlos.

Autoras: Jurez Jurez M., Prez Snchez R., Rodrguez Pascual P.

3.- MATERIAL, EQUIPO, REACTIVOS Y CEPAS MICROBIANAS POR EQUIPO


3.1 EQUIPO
Microscopio ptico
3.2 MATERIAL
Portaobjetos
Cubreobjetos
Pipeta pasteur
Gradilla
1 tubo de ensaye de 13 X 100 mm
Asa bacteriolgica
Frasco gotero con solucin de cristal violeta
Frasco gotero con solucin de lugol
Frasco gotero con solucin de alcohol acetona
Frasco gotero con solucin de safranina
Frasco gotero con solucin de fucsina fenicada
Frasco gotero con solucin de alcohol cido
Frasco gotero con solucin de azul de metileno
Frasco gotero con solucin de verde de malaquita
Solucin salina o agua de la llave
Mechero
Asa y porta asa
Puente de coloracin
Gradilla metlica
Lmpara de alcohol

3.3 CEPAS MICROBIANAS


Staphylococus aureus
Escherichia coli
Sacharomyces cerevisiae
Mohos que se encuentren disponibles

3.4 REACTIVOS
Atomizador con benzal
4. DESARROLLO EXPERIMENTAL
4.1 Preparacin de Frotis:
Mtodo A
4.1.1 Limpiar el portaobjetos con una torunda de algodn y que contenga alcohol.
a.- Etiquetar la preparacin, solo sobre la superficie superior del portaobjetos, la etiqueta ser preferentemente
pegada a la izquierda de la preparacin, si con una etiqueta no basta colocar otra del lado derecho, la etiqueta
llevar el nombre del microorganismos, el nombre de la tincin, el equipo, el grupo y la fecha.

b) En la gradilla se tiene un tubo de ensaye de 13 X 100 mm con 2 ml de agua, de ah tomar con el asa una
pequea gota de agua y colocarla en el centro de la superficie de un portaobjetos.
c) En el mechero, flamear el asa al rojo vivo y en un radio de 20 cm de la flama del mechero, abrir el tubo de
ensaye y flamearlo, tomar la muestra con el asa, volver a flamear la boca del tubo y taparlo. Dejar el tubo sobre
la gradilla y con la mano izquierda tomar el portaobjetos y con la mano derecha en la que tenemos el asa
extender el inoculo aproximadamente un cm2 para obtener una pelcula delgada de microorganismos. Flamear el
asa para esterilizarla.

d) Dejar secar el frotis a temperatura ambiente.


d) Fijar el frotis con calor, es decir pasarlo rpidamente por la flama del mechero, luego colocarlo en el dorso de
la mano, si soportamos el calor pasarlo nuevamente.. El calor deseable es aquel que soportamos en el dorso de
la mano. Realizar esta operacin una vez ms Dejar enfriar el portaobjetos antes de teir.

Nota: Procurar no tomar una gran cantidad del inculo de lo contrario quedar un frotis grueso, la luz no pasar
y no observaremos; en caso de haber ocurrido esto entonces, observa en la periferia del frotis
Mtodo B
a) Si se proporciona un tubo con una suspensin bacteriana, entonces encender el mechero.
b) En un radio de 20 cm abrir el tubo, flamearlo y con el asa tomar un inculo de la suspensin.
c) Flamear la boca del tubo de ensaye, cerrar el tubo y colocarlo en la gradilla
d) Colocar el inculo en el centro de un portaobjetos limpio. Extender el inculo por lo menos 1 cm2, y flamear el
asa. Dejar secar el frotis y fijarlo al calor.

4.2 Examen en fresco de una muestra agua estancada


4.2.1 De la muestra de agua estancada que se ha trado al laboratorio, colocar una gota en un portaobjetos
limpio
4.2.2 Con la ayuda de una pipeta Pasteur colocar en el centro una gota de la muestra y cubrirla con un
cubreobjetos.
4.2.3 Al colocarle el cubreobjetos dejarlo caer con un movimiento rpido para evitar que se formen burbujas.
4.2.4 Observar al microscopio ptico o de contraste de fases con el objetivo de 10 X y 40 X.

4.3 Preparacin en fresco de un moho


4.3.1 Colocar una gota del colorante azul de algodn lactofenol
4.3.2 Colocar el inoculo y hacer una pequea extensin
4.3.3 Colocarle el cubreobjetos sin realizar burbujas
4.3.4. Observar la preparacin al microscopio con el objetivo 10X y 40X. Si se requiere que la preparacin dure
un poco ms se sellar los bordes del cubreobjetos con barniz de uas transparentes.

4.4 Tincin simple


a) Tomar la preparacin fija de Staphylococcus aureus y colocarla el colorante que previamente les ha tocado
b) Tomar el tiempo por 1 minuto
c) Enjuagar el portaobjetos en el recipiente que contiene el agua
d) Dejar secar la preparacin y observarla al microscopio con el objetivo de 40 y 100 X.
4.5 Tinciones diferenciales
4.5.1 Tincin de Gram completa:
a) Colocar los frotis correspondiente de cada uno de los microorganismos Bacillus subtilis, Escherichia coli,
Staphylococcus aureus, Micrococcus luteus en el puente de coloracin.
b) Cubrir los frotis con cristal violeta (colorante primario) durante 1 minuto.
c) Lavar los frotis con agua de la llave para eliminar el exceso de colorante.
d) Cubrir los frotis con lugol (mordente) durante 1 minuto.
e) Lavar los frotis con agua de la llave.
f) Aplicar gota a gota el alcohol-acetona (decolorante) durante 15 segundos.
g) Lavar inmediatamente con agua de la llave.
h) Cubrir los frotis con safranina (colorante secundario) durante 30 segundos
i) Lavar los frotis con agua de la llave.
j) Dejar secar los frotis, colocar una gota de aceite de inmersin y observarlos al microscopio con el objetivo de
100X. (Previamente realizar la tcnica de iluminacin de Khler y enfocar a 10 y 40X)
4.6 Tincin de Gram decolorada:
a) Colocar un frotis fijado de Bacillus subtilis y de Escherichia coli en el puente de coloracin.
b) Cubrir los frotis con cristal violeta (colorante primario) durante 1 minuto.
c) Lavar los frotis con agua de la llave para eliminar el exceso de colorante.
d) Cubrir los frotis con lugol (mordente) durante 1 minuto.
e) Lavar los frotis con agua de la llave.
f) Aplicar gota a gota el alcohol-acetona (decolorante) durante 90 segundos.
g) Lavar inmediatamente con agua de la llave.

h) Cubrir los frotis con safranina (colorante secundario) durante 30 segundos


i) Lavar los frotis con agua de la llave.
j) Dejar secar los frotis, colocar una gota de aceite de inmersin y observarlos al microscopio con el objetivo de
100 X.
4.7 Tincin de Gram completa aplicada a una suspensin de microorganismos:
a) Colocar un frotis fijado de una mezcla de Escherichia coli y Staphylococcus aureus.
b) Cubrir el frotis con cristal violeta (colorante primario) durante 1 minuto.
c) Lavar el frotis con agua de la llave para eliminar el exceso de colorante.
d) Cubrir el frotis con lugol (mordente) durante 1 minuto.
e) Lavar el frotis con agua de la llave.
f) Aplicar gota a gota el alcohol-acetona (decolorante) durante 30 segundos.
g) Lavar inmediatamente con agua de la llave.
h) Cubrir el frotis con safranina (colorante secundario) durante 30 segundos
i) Lavar el frotis con agua de la llave.
j) Dejar secar el frotis, colocar una gota de aceite de inmersin y observarlos al microscopio con el objetivo de
100 X.
4.8 Tincin de Ziehl-Neelsen.
a) Colocar el frotis correspondiente en el puente de coloracin
b) Cubrir los frotis con fucsina-fenicada y calentar con una lmpara de alcohol, hasta que emita vapores, aplicar
calor peridicamente durante cinco minutos sin que se seque la preparacin y esperar a que se enfre.
c) Enjuagar con agua de la llave.
d) Cubrir los frotis con alcohol cido por un minuto.
e) Enjuagar con agua de la llave.
f) Cubrir los frotis con azul de metileno por un minuto
g) Enjuagar y dejar secar los frotis y observarlos con el microscopio utilizando lente de inmersin
4.9 Tincin especfica
4.9.1 Tincin de ShaefferFulton
a) Cubrir el frotis correspondiente con verde de malaquita y calentar con una lmpara de alcohol, hasta que
emita vapores, aplicar calor peridicamente durante cinco minutos, sin que se seque la preparacin.
b) Dejar que el frotis se enfre.
c) Lavar con agua de la llave.
d) Cubrir el frotis con safranina por un minuto.
e) Enjuagar, dejar secar y observar con el microscopio utilizando lente de inmersin.

5. RESULTADOS Y CUESTIONARIO
5.1 Realiza el esquema de la preparacin en fresco del moho observado.
5.2 Realiza un esquema de lo observado en el microscopio en la siguiente tabla
Aumento

Agua
estancada

Tincin
Simple

Tincin
diferencial:
Gram
completa

Tincin de
Gram:
decoloracin

Tincin de
Ziehl-Neelsen

Tincin
especfica
Shaeffer y
Fulton

40X

100X

5.3 Cuales son los inconvenientes al realizar un frotis con una gran carga microbiana?
5.4 Cual es la finalidad de observar una muestra en fresco?
5.5 Por qu se coloca un cubreobjetos sobre la muestra?
5.6 Cul es el propsito de fijar los frotis?
5.7 Cmo afecta la edad del cultivo en la tcnica de Gram?
5.8 Por qu la tincin de Gram no se emplea para teir mohos?
5.9 Cuando es recomendable utilizar una tincin simple y que colorante utilizaras?
5.10 Cul es la finalidad de utilizar el barniz de uas en las preparaciones en fresco?
6. ANLISIS Y DISCUSIN DE RESULTADOS
6.1 Discutir las ventajas y desventajas de las preparaciones en fresco, preparaciones fijas y tipos de tinciones
adecuadas para cada una de ellas.
7. CONCLUSIONES
7.1 Elaborar las conclusiones con base al anlisis y discusin de las ventajas y desventajas en la realizacin de
preparaciones en fresco y fijas, el fundamento de las tinciones diferenciales, comparando con la bibliografa
consultada y los objetivos de la prctica.
8 BIBLIOGRAFA
8.1 Lymch, M.J.; S.S. Raphael: L. D. Mellor; D.D. Spare, M. J., Inwood. Mtodos de Laboratorio. 2 Edicin.
Interamericana. Mxico. 1140 pags.

LABORATORIO DE TCNICAS MICROBIOLGICAS.UPIBI-IPN

PRACTICA No. 3
ESTERILIZACIN
UNIDAD II: Esterilizacin
TEMA: Agentes fsicos. Calor hmedo, calor seco
Filtracin a travs de membrana
Prueba de esterilidad (Mtodo de la tira de papel impregnada con esporas)
1. OBJETIVOS
1.1 Objetivo general
El alumno preparar material de uso en microbiologa para su esterilizacin
Utilizar el mtodo adecuado de esterilizacin de acuerdo al tipo de material
I.2 Objetivo especficos
Lavar el material a esterilizar para uso en el rea microbiolgica
Preparar el material de vidrio e instrumental para ser esterilizado por calor seco
Preparar el material de vidrio e instrumental para ser esterilizado por calor hmedo
Esterilizar el material previamente preparado, por calor seco y calor hmedo.
Realizar el proceso de filtracin a travs de membrana
2. INTRODUCCIN
La esterilizacin es un proceso que destruye o elimina los microorganismos. La esterilizacin se puede realizar a
travs de mtodos fsicos y qumicos. Para seleccionar el ms adecuado es necesario conocer la naturaleza del
material, aunque algunos pueden tener varias formas de esterilizacin.
Mtodos fsicos
Calor hmedo:
La aplicacin de calor es el mtodo ms simple para esterilizar un material, a condicin de que no sufra dao en
s mismo. Una temperatura de 100 C matar a todas las formas vegetativas de Eubacterias, pero no las
esporas ni a las Arqueobacterias extremfilas, para matar a estas es necesario una temperatura de 121 C, 15
minutos y 15 libras de presin. La muerte microbiana se produce por la desnaturalizacin de las protenas,
generalmente se utiliza vapor, tanto porque las bacterias se mueren ms rpidamente cuando se encuentran
hmedas como porque el vapor proporciona un medio de distribuir el calor uniformemente en todas las partes del
recipiente.
Calor seco:
Para esterilizar materiales que deben permanecer secos se dispone de hornos elctricos por los que circula aire
caliente, en vista de que el calor es menos eficaz en materiales secos, se aplica una temperatura de 160 170
C durante una h.
Para ambos tipos de calor aplicadas en los tiempos ya mencionados el calor acta desnaturalizando las
protenas y los cidos nucleicos de la clula y fragmentando las membranas celulares.
Incineracin:
La llama es un agente esterilizador eficaz, y el ms simple de todos. Es frecuentemente utilizado para esterilizar
el asa bacteriolgica para sembrar o resembrar un cultivo. Al flamear el asa, debe evitarse de ser posible, que
dicha asa lleve grandes cantidades de material biolgico, pues ste podra saltar diseminndose partculas
infectantes.
A veces para instrumentos como tijeras, hojas de bistur o pinzas, se puede esterilizar el material mojndolo con
alcohol y encendindolo ste. Se debe repetir varias veces para lograr una esterilizacin completa. El mtodo es
rpido pero produce carbonizacin y prdida del filo.

Autoras: Jurez Jurez M., Prez Snchez R., Rodrguez Pascual P.

15

Radiaciones ionizante y no ionizante:


La radiacin ultravioleta provoca dao en el DNA, la luz ultravioleta induce el entrecruzamiento entre pirimidinas
adyacentes en una u otra de las dos tiras de polinucletidos, formando dmeros pirimidnicos, las radiaciones
ionizantes producen roturas en las tiras sencillas y en las dobles.
Pueden emplearse tambin ondas supersnicas o ultrasnicas para romper o desintegrar a la clula.
Filtracin a travs de Membranas
Algunas sustancias no pueden ser esterilizadas por calor hmedo o seco pues son termolbiles, es decir que se
desnaturalizan o que pierden alguna propiedad deseable, en tal caso se utilizan sistemas de filtracin de
membranas para retener a los microorganismos. Aqu debemos de conocer las dimensiones del microorganismo
a eliminar para poder utilizar el filtro adecuado (dimetro).
Los filtros utilizados son fabricados con porcelana, cuarzo, tierra de diatomeas, vidrio pulverizado, asbesto o
steres de celulosa, para la filtracin a travs de membrana, se utiliza como bioindicador a Pseudomonas
diminuta para filtros con porosidad de 0.22 m, como mnimo.

Jeringas y portamembranas

Mtodos qumicos
Gases (oxido de etileno) y lquidos (formaldehdo y propiolactona)
Es un agente alquilante que se une a compuestos con hidrgeno lbiles como los que tiene grupos carboxilos,
amino, sulfhidrilos e hidroxilos. Es utilizado en la esterilizacin gaseosa, generalmente en la industria
farmacutica, sirve para esterilizar material termosensible como el plstico, equipos electrnicos, bombas
cardiorrespiratorias. Es muy peligroso por ser altamente inflamable y explosivo y adems cancerigeno, por lo que
se suministra normalmente con una concentracin entre el 10 y el 20 % de CO2. La concentracin de xido de
etileno, la humedad y la temperatura influyen sobre la velocidad de esterilizacin. Un objeto limpio puede
esterilizarse si se trata de 5 a 8 h a 38 C o de 3 a 4 h a 54C, cuando la humedad relativa se mantiene entre el
40 y el 50 % y la concentracin de xido de etileno es de 700 mg/L. Una vez esterilizado el material es necesario
airear para eliminar el xido de etileno residual porque es muy txico.
La -propiolactona se emplea para esterilizar vacunas y suero, se degrada hasta una forma inactiva despus de
varias h y, por ello, no es tan difcil de eliminar. Destruye a los microorganismos ms rpidamente que el xido
de etileno, pero no penetra tan bien en los materiales y puede ser cancergena.
Indicadores biolgicos para el proceso de esterilizacin
En todo lugar en donde se realice esterilizacin se debe de contar con indicadores de calidad que manifiesten
que la esterilizacin se ha llevado correctamente y que dicho material se encuentra estril, para ello existen en el
mercado varios indicadores que se introducen con el material a esterilizar y posteriormente se verifica un cambio
de color o turbidez de la ampolleta.

Mtodo de la tira de papel


Las esporas de Geobacillus stearothermophilus.- En un proceso de esterilizacin por calor hmedo, se utilizan
tres tiras impregnadas con las esporas del microorganismo, colocando una que se esteriliza previamente y
servir como control negativo; una tira sin esterilizar que fungir como control positivo y una tira ms se coloca
en la muestra que se va a esterilizar. Una vez concluido el proceso de esterilizacin, cada tira se transfiere, bajo
condiciones aspticas, a tubos con caldo de un medio enriquecido estril y se incuban a 55 C durante 7 das. Al
trmino de la incubacin, se observa si hay crecimiento en cada uno de los tubos. Si la tira control positivo no
presenta crecimiento o si la tira control negativo presenta crecimiento, se invalida el proceso. Si hay crecimiento
solamente en la tira que corresponde al seguimiento del proceso, este se realiz en condiciones incorrectas y no
hubo esterilizacin. Si no hay crecimiento solamente en la tira control negativo y en la tira de la muestra, el
proceso se realiz correctamente.
Mtodo de la ampolleta:
Son ampolletas que contienen una suspensin de Geobacillus stearothermophilus en medio de cultivo con
prpura de bromocresol como indicador. Las ampolletas indicadoras se colocan entre el material que se va a
esterilizar por calor hmedo. Al trmino del proceso de esterilizacin, las ampolletas (sin abrir) se incuban entre
55 y 65 C durante 24 h, la turbidez y la aparicin de un color amarillo indica un proceso de esterilizacin
incorrecto. Al mismo tiempo se incuba una ampolleta sin esterilizar como control positivo, la cual debe mostrar
desarrollo bacteriano y el medio se vuelve amarillo.

OTROS AGENTES ESTERILIZANTES:


Para instrumentos como hojas de bistur, tijeras o pinzas, se esteriliza el material, impregnando con alcohol y
ponindolo a la flama hasta que se apague solo repitiendo el procedimiento tres veces. El mtodo tiene la
ventaja de ser rpido pero se produce carbonizacin y prdida de filo.
Pueden emplearse ondas supersnicas o ultrasnicas de 9000 ciclos / s, para romper y desintegrar las clulas.
Se cree que las bacterias se daan y destruyen por la formacin de pequeas burbujas de gas en la suspensin
a consecuencia de las ondas sonoras.
NOTAS:
-Los tubos o frascos con tapa de baquelita, nunca deben cerrarse completamente.
-Si existe material que ha estado en contacto con cultivo de microorganismos, ste debe ser esterilizado en
autoclave a 121 oC, 1,05 atm de presin durante 15 minutos
- Recolectar los desechos del material esterilizado en recipientes adecuados para darle una disposicin final
ambientalmente responsable.

3.- MATERIAL, EQUIPO, REACTIVOS Y CEPAS MICROBIANAS POR EQUIPO


3.1 EQUIPO
Autoclave a 121 C

Bao Mara a 55C


Autoclave a 110 C
Membranas con porosidad de 0,45 m de dimetro.
Horno a 170 C

Termmetros de 150
Incubadora a 35 C

Termmetro de 200 C

3.2 MATERIAL
Papel aluminio
Papel Kraft
Algodn
2 cajas de Petri
2 matraces de 125 ml
3 pipetas de 2, 5 y 10 mL
Una pinza de diseccin
Una tijera
Una gradilla
Un cilindro pipetero
Un cilindro para cajas de Petri

Un mechero Fisher
Un vaso de precipitados de 100 ml
8 tiras de papel filtro
Ligas
Un sistema MillexHA
Un portamembranas de filtracin
Membranas de 0.45 micrones de porosidad
Escobillones de diferentes tamaos
Una esponja
Un tubo de ensaye 13 X 100 estril con caldo
nutritivo

3.3 MEDIOS DE CULTIVO


4 tubos de 16 x 150 mm con 3 ml de caldo nutritivo
2 matraces con 20 ml de caldo nutritivo estril
2 tubos de 113 X 100 con 3 ml de caldo nutritivo sin esterilizar

3.4 CEPAS MICROBIANAS


Tiras controles de esporas
Suspensin microbiana de Escherichia coli

3.5 REACTIVOS
Agua destilada
Caldo nutritivo
4. DESARROLLO EXPERIMENTAL
PREPARACIN DE MATERIAL PARA ESTERILIZACIN
4.1 Lavado de material de vidrio e instrumental
a).Utilizando escobillones para pipetas, tubos y matraces y una fibra suave para las cajas de Petri, el material
plano y el instrumental metlico lavar el material que se va a esterilizar, utilizando detergentes aninicos que no
dejan residuos
b) Enjuagar suficientemente con agua de la llave
c) Enjuagar con agua destilada, escurrir y secar en el horno o dejarlos secar a temperatura ambiente.
4.2 PREPARACIN DE MATERIAL PARA ESTERILIZACIN POR CALOR HMEDO
4.2.1 TUBOS DE ENSAYO
a) Tapar 2 tubos de 16 x 150 mm con tapones de algodn siguiendo las indicaciones del profesor
b) Colocar los tubos en un bote de lmina, taparlos con papel Kraft y asegurarlos con una liga, anotar fecha,
equipo, grupo, medida de los tubos y cantidad preparada.

Autoras: Jurez Jurez M., Prez Snchez R., Rodrguez Pascual P.

21

4.2.2 CAJAS DE PETRI


a) Envolver 8 cajas de Petri con papel Kraft siguiendo las indicaciones del profesor. Anotar en el papel, la
cantidad de cajas envueltas, fecha, equipo, nmero de equipo de laboratorio y grupo.

4.2.3 PIPETAS
a) Colocar en la boquilla de cada una de las pipetas un tapn de algodn cuidando que no quede muy
compactado, utilizar para ello una aguja de diseccin o un clip
b) Flamear en la flama del mechero las boquillas de las pipetas a fin de eliminar el exceso de algodn
c) Envolver de manera individual cada una de las pipetas con una tira de papel Kraft, fijar el extremo con
masking-tape y anotar sobre el papel la capacidad de la pipeta, la fecha, el grupo y el nmero de equipo de
laboratorio. Con una fecha indicar el sentido de la punta de la pipeta.
4.2.4 MATRACES
a) Colocar en la boca de cada matraz un tapn compacto de algodn, envuelto con gasa, siguiendo las
instrucciones del profesor.
b) Con papel Kraft, elaborar un gorro ligeramente ms grande que el tapn de algodn.
c) En una tira de Masking-tape anotar la fecha, grupo y equipo, adherir el Masking-tape al matraz. No anotar los
datos sobre el gorro de papel.
4.2.5 PINZAS Y TIJERAS
a) Envolver con papel Kraft una pinza o tijera y con lpiz sealar con una flecha la punta.
b) Anotar en el papel la pieza de que se trate, la fecha, grupo y equipo.

4.2.6 PORTAMEMBRANAS Y MEMBRANAS DE 0.45 MICRONES DE POROSIDAD


a) Abrir el portamembranas, revisar que contenga el empaque y con la ayuda de pinzas, colocar una membrana
de 0.45 micrones de porosidad, del dimetro adecuado al tamao del portamembrana, cerrar adecuadamente,
envolver en papel Kraft, siguiendo las instrucciones del profesor.
4.3 PREPARACIN DE MATERIAL PARA ESTERILIZACIN POR CALOR SECO
4.3.1 TUBOS DE ENSAYE
a) Colocar en 2 tubos de ensaye, una cubierta de papel aluminio y colocarlos en una canastilla metlica.
b) Anotar en una tira de papel Kraft la fecha, grupo y equipo, sujetar el papel con masking-tape.
4.3.2 CAJAS DE PETRI
a) Colocar en el interior de un cilindro de acero inoxidable para cajas de Petri dos cajas en posicin invertida
perfectamente secas. (NUNCA ESTERILIZAR POR ESTE MTODO MATERIAL CONTAMINADO)
b) Anotar en una tira de papel Kraft la fecha, el nmero de cajas que contiene el cilindro, el grupo y la fecha.
Colocar la tira de papel entre la tapa del cilindro.

4.3.3 PIPETAS
a) Poner en la boquilla de cada una de las pipetas un tapn de algodn cuidando que no quede muy
compactado.
b) Flamear las boquillas en la flama del mechero a fin de eliminar el exceso de algodn, antes colocar en el
interior un poco de papel aluminio para evitar que las pipetas se despunten en el momento de introducirlas.
c) Colocar en el interior de un cilindro pipetero, las pipetas preparadas.
d) Anotar en una tira de papel Kraft la cantidad de pipetas, su capacidad, fecha, grupo y equipo. Fijar la tira entre
la tapa del cilindro pipetero.
4.3.4 MATRACES
a) Colocar en la boca de un matraz de 125 ml una tapa de papel aluminio.
b) En una tira de papel Kraft anotar fecha, grupo y equipo. Fijar la tira al cuello del matraz sujetndolo con
masking-tape o etiquetar con un marcador indeleble.
4.3.5 PINZAS Y TIJERAS
a) Envolver en papel aluminio una pinza o una tijera.
b) En una tira de masking-tape, anotar fecha, grupo y equipo. Fijar el masking-tape a la envoltura.

PRUEBAS DE ESTERILIDAD POR CALOR SECO Y CALOR HMEDO


4.4. REDUCCIN DE LA CARGA MICROBIANA
a) Preparar 2 tubos de ensaye de 13 X 100 mm con 3 ml de caldo nutritivo sin esterilizar y etiquetar cada uno de
ellos como tubo 1 y 2. (Etiqueta con la siguiente informacin, grupo, equipo, temperatura efectuada y fecha)
b) Colocar en el tubo 1, una tira de esporas de Geobacillus stearothermophilus, mantener el tubo nmero 1 sin
esterilizar. (Testigo positivo)
c) En el segundo tubo de ensaye sin esterilizar y que contiene el caldo nutritivo, colocarle una tira de esporas de
Geobacillus stearothermophilus, tapar el tubo con un tapn de algodn, y someterlo a una temperatura de 110
C durante 10 minutos y una presin de 10 lb/pulg
d) Un tercer tubo con 3 ml de caldo nutritivo estril ser nuestro testigo negativo en toda la prctica
e) Incubar los tres tubos a 55 oC 2C durante 5 das en bao mara y observar diariamente durante el tiempo
sealado. Anotar en la bitcora de laboratorio cualquier cambio en cuanto a la aparicin de turbidez.
4.5 ESTERILIZACIN POR CALOR HMEDO
a) Preparar un tubo de ensaye de 13 X 100 mm con 3 ml de
caldo nutritivo estril y etiquetarlo.
b) Colocar en el tubo una tira de esporas de Geobacillus sthearothermophilus, tapar el tubo con un tapn
de algodn y esterilizarlo a 121 C, 15 min y 15 lb.
c) Los tubos del punto 4.4 inciso b y d son los testigos positivo y negativo respectivamente.
e) Incubar el tubo a 55 oC 2C durante 5 das en bao mara y observar diariamente. Anotar en la bitcora de
laboratorio cualquier cambio en cuanto a la aparicin de turbidez.
NOTAS: Consideraciones importantes para llevar a cabo el proceso de esterilizacin adecuado:
-Tener cuidado de eliminar todo el aire del autoclave.
-Colocar agua suficiente hasta el nivel de la rejilla o en la marca de la autoclave vertical
-Cuando se caliente la olla observar que no salga vapor por la tapa, en caso de suceder cambiar el empaque.
-Si se esta utilizando la autoclave vertical utilizar agua destilada.
-Observar que el manmetro registre la presin
Autoras: Jurez Jurez M., Prez Snchez R., Rodrguez Pascual P.

22

4.6 ESTERILIZACIN POR CALOR SECO


a) Precalentar el horno a 170C, colocar el material preparado para esterilizar y esperar que la temperatura se
vuelva a ajustar a 170 oC, en este momento empezar a contar el tiempo de 1 h.
b) En un tubo de ensaye sin esterilizar y vaco, colocar una tira de papel filtro que contenga esporas de Bacillus
subtilis var. niger, cubrir la boca del tubo con papel aluminio y colocarlo junto con el material indicado en el inciso
a. Esterilizar a 170 oC durante 1 h. En caso de que no se te proporcione la tira impregnada con esporas introduce
una ampolleta que ya contenga el papel filtro impregnada con esporas, etiqueta el tubo con los datos
correspondientes de preferencia con un marcador indeleble.
c) Los tubos del punto 4.4 inciso b y d son los testigos
d) Despus de transcurrido el tiempo de esterilizacin, apagar el horno y esperar a que el termmetro indique la
temperatura ambiente. Abrir, retirar el material y el tubo de ensaye con la tira de esporas.
e) Con ayuda de la pinza estril (flamear con alcohol) y bajo condiciones aspticas, colocar la tira de papel filtro
conteniendo las esporas de Bacillus subtilis a un tubo de ensaye que contenga 3 mL de caldo nutritivo estril y
etiquetado. Incubar a 55 2 oC durante 24 48 h. Observar diario y anotar cualquier cambio en cuanto a la
aparicin de turbidez. (esto se har extraclase)
NOTA:-Registrar en su cuaderno de notas la temperatura y el tiempo de esterilizacin
Caractersticas de las tiras impregnadas con esporas (uso a nivel industrial).
1.- Colocar estratgicamente las ampolletas No. 1 (12 por m3) y operar el sistema de esterilizacin.
2.- Una vez concluido el proceso de esterilizacin, transferir bajo condiciones aspticas,la tira con esporas a la
ampolleta No. 2, cortndole en la parte cintada.
3.- Incubar las ampolletas No. 2 de 35 a 37 oC durante 24 48 h.
Testigo positivo.- Sin haber sido esterilizada incubar una tira de esporas con las condiciones anteriores
Interpretacin
Ampolletas con desarrollo.-Proceso de esterilizacin inadecuado
Ampolletas sin desarrollo.- Proceso de esterilizacin adecuado
Testigo positivo.- Deber mostrar desarrollo
La ampolleta tiene un disco con esporas de Bacillus subtilis (niger) con no menos de 5 X 105 esporas.
4.7 PROCESO DE FILTRACIN A TRAVS DE MEMBRANA
a) Colocar 1 ml de la sustancia a filtrar en una jeringa desechable
b) Bajo condiciones aspticas, ensamblar la jeringa al portamembrana con la membrana previamente
esterilizada
c) Filtrar gota a gota y recibir el filtrado en un tubo de ensaye estril.
d) Transferir la membrana con la ayuda de una pinza estril, a un tubo que contiene 3 mL de caldo nutritivo
estril
d) Incubar el filtrado y el tubo que contiene la membrana, a 35 2 oC de 48 a 72 h.
e) Colocar la jeringa en un bote de lmina para su esterilizacin.
d) Observar diariamente y anotar en el cuaderno de notas del laboratorio cualquier cambio en cuanto a la
aparicin de turbidez durante 3 das.

NOTAS:-El bioindicador utilizado en los procesos por filtracin a travs de membrana es Pseudomonas diminuta,
para membranas con un dimetro de poro de 0,22 m
5. RESULTADOS Y CUESTIONARIO
5.1 Completa el siguiente cuadro indicando presencia o ausencia de turbidez.
Mtodo
Reduccin de
la
carga Calor seco
Calor hmedo
Filtracin a travs
microbiana (110C/10/10lb)
170C/2 h
121C/15/15lb
de membrana
Testigo Testigo +
Resultado
5.2 Cul es la finalidad de utilizar agua destilada en el enjuagado del material?
5.3 Explicar porqu utilizamos un tapn de algodn en las pipetas, en matraces y tubos de ensaye
5.4. Porque utilizamos el papel Kraft para envolver el material?
5.5 Anota 3 ejemplos de materiales que se esterilicen por calor seco, hmedo y por filtracin
5.6 Qu concluyes si al trmino de la incubacin: se observa que la tira control positivo no presenta crecimiento,
la tira control negativo presenta crecimiento y en la tira de la muestra, no hay crecimiento.
6. ANLISIS Y DISCUSIN DE RESULTADOS
6.1 Discutir cuales son los inconvenientes o riesgos de preparar el material con papel aluminio y papel Kraf para
su esterilizacin por calor seco y hmedo.
7. CONCLUSIONES
7.1 Elaborar las conclusiones con base a los resultados obtenidos, al anlisis y discusin de estos, as como a la
bibliografa consultada y los objetivos de la prctica.
8. BIBLIOGRAFA

LABORATORIO DE TCNICAS MICROBIOLGICAS. UPIBI-IPN

PRACTICA No.4
NUTRICIN Y CULTIVO MICROBIANO
UNIDAD: III. Nutricin y Cultivo Microbiano
TEMA: 3.1 Formulacin de medios de cultivo
3.2 Agar, fuentes de carbono y nitrgeno
3.3 Preparacin de medios de cultivo
3.4 Cultivo de microorganismos
1.- OBJETIVOS
1.1 Objetivo General.

El alumno cultivar microorganismos en los diferentes medios de cultivo, previa preparacin y clasificacin
con base a sus componentes, uso y consistencia.
Objetivos especficos

Determinar las especificaciones mnimas que deben tener los medios de cultivo para microorganismos en
general de acuerdo a la NOM-065-SSA1-1993

Preparar y clasificar diversos medios de cultivo en base a sus componentes, complejidad, uso y
consistencia.

Cultivar bacterias y hongos en placa y tubo e identificar los requerimientos nutricionales de estos
microorganismos.
2.- INTRODUCCIN
Las clulas estn formadas por grandes cantidades de pequeas molculas como agua, iones inorgnicos,
carbohidratos y aminocidos y contienen un nmero todava ms pequeo de molculas grandes, los polmeros de
las clulas, siendo los ms importantes las protenas y los cidos nucleicos. La clula puede obtener la mayora de
las molculas pequeas de su medio ambiente de manera preformada, mientras que las grandes molculas son
sintetizadas dentro de ellas. Existen complejas interrelaciones entre los compuestos incorporados por la clula y los
que son sintetizados.
Nutricin.
A las sustancias en el medio ambiente utilizadas por los organismos para el catabolismo y el anabolismo se les llama
nutrientes, y pueden dividirse en dos clases:
(1) nutrientes necesarios, sin los cuales la clula no podra crecer, y
(2) nutrientes tiles pero no indispensables, que se emplean si estn presentes pero no son esenciales.
Algunos nutrientes son los ladrillos a partir de los cuales las clulas forman las macromolculas y otras estructuras,
mientras que otros nutrientes sirven solo para la obtencin de energa sin ser incorporados directamente en las
sustancias celulares, aunque en ocasiones un nutriente puede desempear ambas funciones. Las sustancias
pueden dividirse en dos grupos: macronutrientes y micronutrientes, dependiendo de si son necesarios en cantidades
grandes o pequeas respectivamente y factores de crecimiento como compuestos orgnicos, vitaminas, cidos
orgnicos etc. Es fcil detectar cuando se requiere un macronutriente, simplemente porque se necesita en gran
proporcin. Frecuentemente los micronutrientes son necesarios en cantidades tan pequeas que es imposible
determinar cunto se requiere; muchas veces ni siquiera se sospecha que un micronutriente est presente en el
medio en que un microorganismo est creciendo, debido a que los componentes del medio pueden contener tales
micronutrientes en pequea cantidad como contaminantes.
Autoras: Jurez Jurez M., Prez Snchez R., Rodrguez Pascual P.

25

Los microorganismos se desarrollan a partir de sustancias nutritivas que se obtienen del medio que las rodea. En el
laboratorio los microorganismos se desarrollan en medios de cultivo que contienen los nutrimentos adecuados para
cada uno y requeridos para la sntesis de sus constituyentes celulares, adems estos medios proporcionan las
condiciones de pH, osmolaridad y humedad que le permiten un buen crecimiento.
Existe una gran diversidad de sustancias que pueden utilizarse en la preparacin de medios de cultivo, formulado
con un fin especfico, y el cual deber contener:

Fuente de carbono

Fuente de nitrgeno

Fuente de azufre

Factores de crecimiento (que actan como cofactores, oligoelementos como aminocidos o vitaminas que
no pueden sintetizar)

Fuente de enriquecimiento para microorganismos exigentes (huevo, sangre, suero etc).

Inhibidores de crecimiento microbiano como los colorantes, sales biliares, detergentes, antibiticos o
metales pesados.

Indicadores de potencial oxido-reduccin.

Agar como el agente gelificante o soporte.


Medios de cultivo: Segn la NOM-065-SSA-1993. Que establece las especificaciones sanitarias de los medios
de cultivo.Generalidades.
Medios selectivos.
Son medios que contienen sustancias que impiden el desarrollo de algunos microorganismos, pero en una flora
mixta permiten el aislamiento y recuperacin del germen o grupo de grmenes de inters.
Medios selectivos de enriquecimiento.
Son medios lquidos que estimulan la multiplicacin de algn germen determinado e impiden o inhiben la
reproduccin de otros.
Medios diferenciales.
Son aquellos que contienen indicadores de cido base, redox o sustancias que detectan cambios en el medio o en
las caractersticas tpicas de las colonias.
Medios para cultivar grmenes anaerbicos.
Son medios de cultivo para aquellos grmenes que requieran condiciones de anaerobiosis o de microaerofilia.
Medios de transporte.
Sirven para transportar los especmenes que contienen a los microorganismos, del sitio de la toma del producto
hasta el laboratorio donde va a efectuarse el estudio.
Estos medios impiden que se altere la proporcin original de la flora microbiana en los especmenes.
Medios para filtracin a travs de membrana.
Pueden ser lquidos o slidos. En el primer caso, se preparan a la concentracin usual y permiten el crecimiento de
microorganismos presentes en la membrana.
Los medios slidos tienen un contenido mnimo de agar para favorecer la difusin de nutrientes del medio de la
membrana.
Medios especiales para cultivo de hongos y levaduras.
En el caso de los hongos, el medio de cultivo descrito por Sabouraud es el que ms se utiliza, ya que tiene un pH de
5.6 lo que inhibe el crecimiento de la mayora de las bacterias. Este medio puede ser ms selectivo al adicionarle
ciertos antibiticos tales como: cloranfenicol, eritromicina o gentamicina; para eliminar los hongos filamentosos de
rpido crecimiento se adiciona cicloheximida (este medio se llama mycosel o micobitico). Se emplea tambin el
medio de agar papa y dextrosa para promover la esporulacin de hongos filamentos y para recuento, se acidifica con

cido tartrico al 0.1 M hasta un pH de 4.5 El agar rosa de bengala se emplea para inhibir el crecimiento radial de
hongos con micelio cenoctico.
Otros medios de cultivo que pueden ser utilizados son los siguientes:
Medios especiales para cultivo de protozoarios.
Medios de cultivo para medir la potencia de los antibiticos.
En la formulacin de un medio de cultivo deben considerarse, no slo el tipo de microorganismo, sino tambin el tipo
de muestra que se va a analizar, y el objetivo final que se persiga: aislamiento, recuento o identificacin.
Por otro lado, es de suma importancia los cuidados que deben observarse en la preparacin de los medios de cultivo
como son:
a. La calidad del agua utilizada (que se prefiere libre de sales)
b. Los materiales y utensilios que deben encontrase en condiciones de limpieza (libres de otras sustancias o
reactivos que interfieran en la formulacin original)
c. Si se debe aadir calor y cunto para no incurrir en problemas de homogeneidad, desnaturalizacin,
caramelizacin o prdida de actividad nutricional.
d) pH final del medio que deber ajustarse segn indicaciones del fabricante o frmula estandarizada.
e) Esterilidad del medio de cultivo de acuerdo a indicaciones del fabricante si es una formulacin comercial,
o en otras condiciones si los componentes lo requieren.
Cultivo microbiano.
Los microorganismos obtenidos a partir de suelo, aire, alimentos, etctera se encuentran asociados, y en raras
ocasiones se encontrar un solo tipo de microorganismo. A partir del cultivo inicial de una muestra, se encontrar
una variedad de tipos de colonias y posteriormente se pretender lograr un cultivo puro. Un cultivo puro es aquel que
est constituido por microorganismos de la misma especie. El cultivo de microorganismos se puede realizar en
medio slido, en medio semislido y en medio lquido.
Se conoce como cultivo en medio slido al que se hace en una caja Petri con el medio de cultivo gelificado (agar).
Las variantes del cultivo en caja son diversas pero todas se centran en la formacin de estras sobre la superficie
del medio de cultivo con el asa en el caso de bacterias y por punto si se trata de hongos filamentosos.
Las siembras en tubos con medio slido, por lo general se emplean para la conservacin de un cultivo proveniente
de una placa.
Existen dos variedades de cultivo en tubo:
a)
Por estras: se utilizan los medios de cultivo inclinados, se toma una muestra de alguna colonia
inclinada y en forma recta, se toma la colonia y se arrastra el asa en forma zigzagueante en el medio por la superficie
inclinada del agar.
b)
Por picadura: se utilizan los medios de cultivo en un tubo solidificado semislido en forma inclinada y
en forma recta, se toma la colonia y se introduce en el medio picndolo longitudinalmente.
La siembra en tubos de cultivo en medio lquido se realiza tomado el inculo con el asa y se introduce en el medio
lquido agitando suavemente el asa.
a)
Desarrollo en medio slido inclinado. Se siembran los microorganismos por estra en tubos con agar
inclinado
b)
Desarrollo en medio lquido. Las caractersticas que se observan en el cultivo son:
turbidez, un sedimento, una pelcula superficial, o combinados.
c)
Desarrollo en medio semislido por picadura hasta partes del tubo
Cabe sealar que la identificacin de microorganismos por el estudio de sus caractersticas de cultivo es solo parcial
ya que se requiere otras pruebas bioqumicas, fiosiolgicas e inmunolgicas.
Mediante la evaluacin de las caractersticas de las colonias descritas y la accin en el medio, se puede hacer una
identificacin preliminar de los diferentes microorganismos aislados en un cultivo primario. Estas caractersticas son

tiles para seleccionar otros medios y pruebas diferenciales apropiadas para completar la identificacin de los
microorganismos.
3.- MATERIAL, EQUIPO, REACTIVOS Y CEPAS MICROBIANAS
3.1 MATERIAL POR GRUPO
Sesin I
Algodn
Balanza granataria
Gasa
Autoclave
Papel Kraft
Horno 170 C
Refrigerador
Potencimetro
Sesin II
Incubadora a 28 C
Incubadora a 37 C
3.2 MATERIAL POR EQUIPO
Sesin I
1 mechero Fisher
1 esptula
6 matraz Erlenmeyer de 250 mL
7 tubos de ensaye de 16 x 150 mm
2 matraces de 125 mL
6 cajas Petri
Sesin II

3 tubos con 3 ml de medio SIM

3 cajas con agar EMB

3 tubos con agar PDA

3 tubos con agar nutritivo

5 tubos de ensaye de 13 x 100 mm


1 gradilla metlica
1 probeta de 100 mL
1 termmetro
1 pipeta de 10 mL

3 cajas con agar nutritivo


1 matraz con 150 ml de caldo glucosa sales
1 matraz con 150 ml de caldo nutritivo

3.3 REACTIVOS
150 mL de caldo glucosa sales
100 mL de agar nutritivo
75 mL de agar EMB
25 mL de PDA
25 mL de medio SIM
Glucosa

(NH4) 2SO4
K2HPO4
MgSO4 7H2O
MnSO4 4H2O
6 g de agar bacteriolgico
Agua destilada

3.4 CEPAS
Escherichia coli
Bacillus sp.

Penicillum sp.
Aspergillus sp.

4.- DESARROLLO EXPERIMENTAL


SESIN I
Recomendaciones generales para la preparacin de los medios de cultivo.
Preparar los volmenes de cada medio que se han de utilizar en el perodo recomendado para su empleo.
Utilizar agua destilada y material de vidrio libre de detergentes.
Pesar la cantidad del medio que marca el fabricante (en la etiqueta)
En el caso de medios deshidratados, el medio debe de guardarse en su frasco y en lugares frescos.
Emplear recipientes con el doble de capacidad al volumen que se va a preparar para evitar la proyeccin en
el momento de la ebullicin.
Aadir un pequeo volumen de agua para permitir la disolucin completa y despus completar el volumen
total.
En general los medios se mezclan hasta disolucin completa para aclararse, pero debe evitarse que se
derramen. Nunca deben calentarse a la flama directa del mechero para evitar que se proyecten.
El pH de los medios debe ajustarse antes de la esterilizacin y con el medio a una temperatura de 25 C.
Es conveniente evitar el sobrecalentamiento durante la esterilizacin por calor para evitar la prdida de
materiales nutritivos y agua que puedan cambiar la consistencia del medio.
Antes de inocular un medio debe comprobarse la esterilidad de cada lote, incubando un 3-4% del total
durante 3 das a 37 C.
Los medios de cultivo ya preparados y esterilizados deben mantenerse en refrigeracin (4 C) y protegidos
de la luz. Antes de emplearlos verificar que no exista contaminacin, precipitacin, cambio de color o de
consistencia etc.
Un medio contenido en un matraz no puede ser esterilizado una segunda ocasin.
PREPARACIN DE MEDIOS DE CULTIVO
4.2 MEDIO SINTTICO (glucosa-sales)
Preparar la cantidad de caldo o agar en tubo o en matraz segn lo que el profesor indique.
Pesar cuidadosamente los componentes del medio de acuerdo a la siguiente formulacin:
Formulacin g/L
Glucosa
5.0 g
(NH4) 2SO4
2.0 g
KH2PO4
0.05 g
K2HPO4
0.05 g
MgSO4 7H2O
0.25 g
MnSO4 4H2O
0.001 g
Agua destilada
1000 mL
Nota: Para el medio slido adicionar 1.5 g de agar bacteriolgico/ 100mL de medio.
Disolver los componentes en un matraz de 250 mL, calentar si es necesario y ajustar el pH a 7.0 - 0.2.
Una vez disueltos los componentes transferir 30 mL a cada uno de los dos matraces Erlenmeyer de 125 mL
limpios y taparlos con un tapn de algodn-gasa y gorro de papel Kraft. Etiquetar los matraces
perfectamente. Si es necesario agregarle agar bacteriolgico tal que la concentracin sea de 1.5 %
Calentar a ebullicin hasta disolucin en el caso de haber preparado agar.

Si se requiere preparar tubos con agar una vez que se haya disuelto el agar agregar 3 mL a cada uno de los
tubos, agregar el agar rpidamente antes de que solidifique, una vez agregado el agar tapar los tubos con
tapo de algodn y colocarlos en un bote de lmina para su esterilizacin.
Para el caso de matraz tapar el matraz con un tapn de algodn- gasa y gorro de papel Kraft. Etiquetar el
matraz.
Esterilizar los tubos, el matraz con caldo glucosa y el matraz de agar glucosa en autoclave a 121 C
durante 15 minutos a 15 libras de presin.
Una vez que se ha llevado a cabo la esterilizacin dejar a temperatura ambiente los matraces y tubos
durante 24 horas como prueba de esterilidad.
En condiciones de esterilidad transferir de 15 a 20 mL de cada medio a las cajas de Petri estriles y dejar
que se solidifiquen a temperatura ambiente.
Tomar una muestra representativa de las cajas y dejarlas a temperatura ambiente colocndolas en posicin
invertida durante 24 horas para prueba de esterilidad.

4.3 MEDIO COMPLEJO ( agar nutritivo )


Pesar cuidadosamente la cantidad que indica la etiqueta del envase para preparar la cantidad de medio
indicada por el profesor (a) ya sea para tubos de ensaye o cajas petri.
Colocar el medio en un matraz del doble de volumen y adicionar el agua necesaria.
Calentar suavemente hasta disolverlo completamente.
Vaciar 3 mL de medio en cada uno de los tubos de ensaye de 13 x 100 mm limpios, taparlos con un tapn
de algodn-gasa y gorro de papel Kraft.
Tapar el matraz que contiene el medio restante con un tapn de algodn-gasa y gorro de papel Kraft.
Etiquetar los tubos y el matraz.
Esterilizar en autoclave a la temperatura y tiempo que indica la etiqueta del envase (en este caso es de
121 C durante 15 minutos y 15 libras de presin).
Enfriar el matraz hasta 45 C, por debajo de esta temperatura el agar solidificar.
En condiciones aspticas, transferir del matraz de 15 a 20 mL de cada medio en cajas de Petri estriles y
permitir que solidifiquen a temperatura ambiente.
Etiquetar con los datos correspondientes cada caja (en la base de la caja) colocar el masking tape o con
marcador indeleble.
Colocar los tubos con agar nutritivo en una superficie inclinada y permitir que solidifiquen Incubar una placa
y un tubo a 37 C durante 24 horas como prueba de esterilidad.
4.4 MEDIO DIFERENCIAL Agar Eosina Azul de Metileno (EMB)
Pesar cuidadosamente la cantidad que indica del envase para preparar la cantidad que indique el profesor.
Colocar el medio en un matraz con el doble del volumen y adicionarle el agua necesaria.
Calentar suavemente hasta disolucin completa.
Tapar el matraz con un tapn de algodn-gasa y gorro de papel Kraft.
Esterilizar en autoclave a la temperatura y tiempo que indica la etiqueta del envase (en este caso a 121 C
durante 15 min).
Enfriar hasta 45 C.
En condiciones aspticas transferir de 15 a 20 mL de cada medio en cajas de Petri estriles y dejar que
solidifiquen a la temperatura ambiente. Etiquetar en la base de la caja.
Dejar una placa a 35 C durante 24 horas para prueba de esterilidad, incubar en posicin invertida.

4.5 MEDIO SELECTIVO ( Agar Papa y Dextrosa )


Pesar cuidadosamente la cantidad que se indica en la etiqueta del envase para preparar la cantidad que
indique el profesor.
Colocar el medio en un matraz de y adicionarle agua necesaria.
Calentar suavemente hasta disolverlo completamente.
Tapar el matraz con tapn de algodn y papel Kraft.
Esterilizar en autoclave a la temperatura y tiempo que indica la etiqueta del envase (121 C durante 15
minutos).
Al medio de cultivo preparado enfriarlo hasta una temperatura de aproximadamente 45C y agregarle 1.8
mL de cido tartrico al 10% estril por cada 100 mL de medio preparado y homogeneizar.
Vaciar el medio de cultivo antes que solidifique en placas de Petri estriles, dejar solidificar y etiquetar en la
base de las cajas.
Dejar una placa a 35C durante 3 a 5 das para prueba de esterilidad, incubar en posicin invertida
4.6 MEDIO INDICADOR medio SIM (Sulfur Indol Motility).
Pesar con cuidado la cantidad que indica la etiqueta del envase para preparar la cantidad que indique el
profesor.
Colocar el medio en un matraz del doble de capacidad y adicionarle agua necesaria.
Calentar suavemente hasta disolucin completa vaciar en tubos de ensaye de 13 x 100 mm 3 mL del medio.
Esterilizar en autoclave a la temperatura y tiempo que indica la etiqueta del envase (121 C durante 15
minutos).
Colocar los tubos en una gradilla y dejar que estos solidifiquen a temperatura ambiente en posicin vertical.
NOTA: ESTOS MEDIOS SE UTILIZARAN PARA LA SIGUIENTE SESIN (II) QUE ES CULTIVO DE
MICROORGANISMOS, POR CONSIGUIENTE DEBERN MANTENERSE EN REFRIGERACIN Y BIEN
ETIQUETADOS.
SESIN II
4.7 CULTIVO EN MEDIO SLIDO EN PLACA
Se utilizarn cajas con agar nutritivo EMB.
Tomar el asa de platino acero y quemarla al rojo vivo en la flama del mechero para esterilizarla.
Destapar el tubo que contenga el microorganismo, pasar la boca del tubo por la flama del mechero.
Enfriar el asa en el interior del tubo y tomar con ella el inculo.
Pasar la boca del tubo nuevamente por la flama del mechero y colocarle el tapn.
Destapar la caja Petri con agar nutritivo o EMB y sembrar al microorganismo por estra cruzada como se
indica en el esquema 1
Quemar el asa cada vez que se realiza una estra.
Una vez sembrado el microorganismo incubar la caja sembrada a 37 C, durante 24 horas.
Observar el crecimiento a las 24 horas y anotar las caractersticas del crecimiento en el medio cultivo ya sea
agar nutritivo o EMB
NOTA: Se recomienda practicar en papel con lpiz o pluma en su cuaderno.

Esquema 1. Aislamiento por estra cruzada


4.8 CULTIVO EN MEDIO SEMISLIDO
Se utilizarn tubos con agar nutritivo y agar papa dextrosa inclinados. (Un tubo por alumno de c/u de los
medios)
Tomar una asada de la bacteria previamente aislada y sembrar por estra en S la superficie del medio
inclinado de agar nutritivo.
Para hongos tomar el inculo (micelio y esporas) con el asa micolgica y sembrar por punto en la parte
central.
Quemar el asa una vez realizada la siembra.
Incubar los tubos sembrados a 37 C para bacterias y a 28 C para hongos, durante 24 y 48
horas respectivamente.
Observar los cultivos a las 24 y 48 horas y anotar las caractersticas del cultivo.

4.8
CULTIVO EN MEDIO LQUIDO
Se emplearn tubos y matraz con caldo nutritivo y glucosa sales.
Tomar el inculo de bacterias con el asa y disgregar ste agitndolo en las paredes del tubo con caldo
nutritivo y glucosa sales a fin de evitar la formacin de grumos
Tomar el inculo de hongos con el asa en forma de L y sembrarlo en el matraz o en tubo segn sea el caso
con caldo nutritivo y glucosa sales, procurando tomar esporas y micelio para disgregarlo en el medio de
cultivo.
Quemar el asa una vez realizada la siembra.
Incubar los tubos con bacterias a 35 C, durante 24 horas y el matraz con hongos a 28 C durante 48 horas
en agitacin (se sugiere 120 rpm).
Observar los cultivos a las 24 y 48 horas y anotar las caractersticas observadas.
Los equipos designados por el profesor dejarn su matraz inoculado con un moho sin agitacin.
4.9
CULTIVO EN MEDIO SEMISLIDO
Se emplearn tubos con medio SIM
Tomar un inculo de bacterias con el asa recta.
Autoras: Jurez Jurez M., Prez Snchez R., Rodrguez Pascual P.

32

Sembrar por picadura, sumergiendo el asa hasta partes del medio SIM sin tocar el fondo y sacar el asa
verticalmente. (El crecimiento debe de darse en la lnea de trazo en el caso de que la bacteria sea no mvil,
cuando es mvil el crecimiento se difunde a travs del medio).
Quemar el asa una vez realizada la siembra.
Incubar los tubos a 37 C durante 24 horas.
Observar los cultivos a las 24 horas y anotar las caractersticas del cultivo.

5.- RESULTADOS Y CUESTIONARIO


5.1 En un cuadro anota los medios de cultivo que se prepararon, sus condiciones de esterilizacin, el aspecto final
del medio y cual es su clasificacin en base a su consistencia y composicin.
Medio de cultivo

Condiciones
esterilizacin

de

Aspecto final del Clasificacin por su


medio
consistencia

Clasificacin por su
composicin

Caldo
Glucosa
sales
Agar Glucosa sales
Agar Nutritivo
EMB
PDA
5.2 Qu precauciones deben tomarse en cuenta para la preparacin de medios de cultivo?
5.3 Qu cuidados deben tenerse al preparar un medio de cultivo slido en caja de petri?
5.4- Clasificar los siguientes medios de acuerdo a su composicin, selectividad y complejidad. Mencionar que
componentes les confieren la capacidad diferencial o selectiva y qu tipos de microorganismos crecen en ellos.
a) Agar Nutritivo
b) Agar Rosa de Bengala
c) Agar Papa Dextrosa
d) Agar Soya y Tripticasena
5.5 Cul es la funcin de los colorantes e indicadores en los medios de cultivo?
5.6 Cul es la fuente de carbono de cada uno de los medios utilizados?
5.7 Por qu es recomendable llenar los tubos con medio lquido y luego esterilizarlos. Por qu en las cajas de
Petri, primero se esteriliza el medio y posteriormente se transfiere a cajas de Petri estriles?

5.8 De los medios utilizados indica cules son especficos para hongos y cules para bacterias y por qu?
5.9 Los medios de cultivo tienen fecha de caducidad? Qu pasa si la fecha esta vencida?
5.10 Cuando se siembran hongos filamentosos (mohos) en medio lquido, describa cmo es el crecimiento con y sin
agitacin.
5.11 En qu casos se siembra en medio semislido y cules son las precauciones que se deben tomar?
5.12 Realiza un esquema indicando la forma correcta de sembrar a bacterias y mohos en medio slido inclinado.

6.- ANLISIS Y DISCUSIN DE RESULTADOS


El anlisis y la discusin se basarn en relacin a:
La clasificacin de los medios segn la Norma Oficial Mexicana.
Las caractersticas de la morfologa colonial ( macroscpica ) para cada especie microbiana segn los medios
utilizados.
El crecimiento en placa con el crecimiento en agar inclinado
La componentes de los medios de cultivo, fuente de Carbono, fuente de Nitrgeno, fuente de Azufre, etc. .
7.- CONCLUSIONES
Elabora tus conclusiones utilizando los resultados obtenidos, al anlisis y discusin de stos, la bibliografa
consultada y al objetivo de la prctica.
8.- BIBLIOGRAFA
Enlistar la bibliografa que utilizaste para el informe de esta prctica.
9.-BIBLIOGRAFA RECOMENDADA
8.1 Manual de medios de cultivo Bioxn
8.2 Norma Oficial Mexicana Nom-065-SSA1-1993, Bienes y Servicios.

LABORATORIO DE TCNICAS MICROBIOLGICAS- UPIBI.IPN

PRACTICA No 5
AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS

UNIDAD IV : Ubicuidad y aislamiento de microorganismos


TEMA: 4.2. Aislamiento
4.2.1 Por estra cruzada
4.2.2 Diluciones
4.2.3 Vaciado en placa
4.2.4 Extensin con varilla

1. OBJETIVO GENERAL:
El alumno aplicar las tcnicas de aislamiento y cuantificacin de microorganismos.
1.2 OBJETIVOS ESPECFICOS:

Aplicar las tcnicas de aislamiento de microorganismos por estra cruzada, extensin con varilla, vaciado en
placa, dilucin en tubo.

Correlacionar las normas oficiales mexicanas con las tcnicas de aislamiento.


2. INTRODUCCIN
Se entiende por aislamiento, al proceso que permite separar uno o ms microorganismos presentes en una muestra.
No todos los microorganismos pueden cultivarse en medios de cultivo, es el caso de los organismos biotrficos
(parsitos obligados), slo se desarrollan sobre tejido vivo de su hospedante (viroides, virus, rickettsias, hongos).
Las tcnicas de aislamiento ms frecuente usadas son:
Estra cruzada en placa:
Esta tcnica consiste en establecer un gradiente de diluciones por medio de las estras cruzadas sobre la superficie
de un medio slido, para separar a los microorganismos, dando origen a colonias separadas que generalmente
corresponden a un *cultivo puro. En el estudio microbiolgico, el primer paso es la separacin de la poblacin mixta
a un cultivo puro y luego su posterior identificacin (familia, gnero, especie).
*Cultivo puro: es aquel que contiene una sola especie o tipo de microorganismo y que presumiblemente se ha
obtenido a partir de una sola clula (clona). En un cultivo puro, no necesariamente todas las clulas que lo
componen tienen que ser exactamente iguales, ya que es factible que algunas de ellas sufran mutaciones y se
diferencien de las restantes. Cada uno de los cultivos puros que componen una especie se denominan cepas.
Diluciones
La dilucin primaria tiene por objeto obtener una distribucin lo ms uniforme posible de los microorganismos
contenidos en la muestra destinada para el anlisis.

Autoras: Jurez Jurez M., Prez Snchez R., Rodrguez Pascual P.

35

La preparacin de diluciones decimales adicionales, si son necesarias, tiene como objetivo reducir el nmero de
microorganismos por unidad de volumen, para permitir, despus de la incubacin, la observacin de la prueba en el
caso de tubos o matraces y la cuenta de colonias en el caso de placas.
Dilucin primaria, es la solucin, suspensin o emulsin obtenida despus de pesar o medir una cantidad del
producto bajo examen y mezclarla con una cantidad de nueve veces en proporcin de diluyente.
Diluciones decimales adicionales, las suspensiones o soluciones obtenidas al mezclar un determinado volumen de la
dilucin primaria con un volumen de nueve veces un diluyente y que por repeticin de esta operacin con cada
dilucin as preparada, se obtiene la serie de diluciones decimales adecuadas para la inoculacin de medios de
cultivo.
Vaciado en placa:
El fundamento de la tcnica consiste en contar las colonias, que se desarrollan en el medio de eleccin despus de
un cierto tiempo y temperatura de incubacin, presuponiendo que cada colonia proviene de un microorganismo de la
muestra bajo estudio. El mtodo admite numerosas fuentes de variacin, algunas de ellas controlables, pero sujetas
a la influencia de varios factores.
Despus de inocular las diluciones de las muestras en las cajas Petri estriles y vacas, agregar de 12 a 15 ml del
medio preparado que esta a una temperatura aproximada de 45C, mezclarlo mediante 6 movimientos de derecha a
izquierda, 6 en el sentido de las manecillas del reloj, 6 en sentido contrario y 6 de atrs a adelante, sobre una
superficie lisa y horizontal hasta lograr una completa incorporacin del inculo en el medio; cuidar que el medio no
moje la cubierta de las cajas. Dejar solidificar.
Incubar las cajas en posicin invertida (la tapa hacia abajo) durante el tiempo y la temperatura que se requieran,
segn el tipo de alimento y microorganismo de que se trate.
En la lectura seleccionar aquellas placas donde aparezcan entre 25 a 250 UFC, para disminuir el error en la cuenta y
en la interpretacin. Si hay mas colonias que las indicadas, en la ltima dilucin realizada, hacer ms diluciones
hasta que se tenga este rango del nmero de colonias.
Unidades Formadoras de Colonias (UFC), trmino que debe utilizarse para reportar la cuenta de colonias en placa,
las cuales pueden surgir de una clula o de un cmulo de clulas.
Extensin con varilla
Utilizando diferentes pipetas de 1 ml para cada dilucin, depositar 0,1 mL sobre la superficie de las placas de agar
cuenta estndar o el agar que se vaya a utilizar.
Distribuir el inculo sobre la superficie del agar con varillas estriles de vidrio en ngulo recto, utilizando una para
cada dilucin.
Mantener las placas en su posicin hasta que el inculo sea absorbido por el agar.
Invertir las placas e incubar de 45 a 48 h a 35C.
Si el inculo esta bien distribuido con la varilla de vidrio se podrn contar las colonias que hay crecido sobre la
superficie del medio.
3. MATERIAL, EQUIPO Y REACTIVOS
3.1 MATERIAL POR EQUIPO
4 Cajas de Petri esteriles
3 Cajas de Petri con ACS
3 Cajas de Petri con EMB
3 Cajas de Petri con Agar Nutritivo

Matraz con 100 mL de Agar Cuenta Estandar


4 Tubos de 16 X 150 con 9 mL de solucin salina al 0.85%
Asa bacteriolgica
1 Frasco con Benzal
1 Esponja
Cilindro con pipetas de 1 mL estriles
Balanza granataria
3.2 MATERIAL QUE DEBE TRAER EL ALUMNO
Muestra de queso, jugo natural, etc.
4. DESARROLLO EXPERIMENTAL
Realizar diluciones de la muestra como lo indique el profesor ( figura 1)
4.1Diluciones
A partir de muestras lquidas:
a) Para muestras lquidas no viscosas (agua, leche, refrescos, etc.) en las cuales la distribucin de microorganismos
es homognea o fcilmente homogeneizable por medios mecnicos (agitacin, etc.).
b) Para muestras congeladas de un alimento originalmente lquido o licuable, fundir por completo en bao de agua
de 40 a 45C un tiempo mximo de 15 minutos y homogeneizar agitando vigorosamente.
c) Para la parte lquida de una muestra heterognea la cual sea considerada suficientemente representativa de la
muestra total (por ejemplo la fase acuosa de grasas animales y vegetales).
d) Agitar la muestra manualmente con 25 movimientos de arriba a abajo en un arco de 30 cm efectuados en un
tiempo de 7 segundos. Tomar 1 mL de la muestra si es muestra lquida y /o 1 g si es muestra slida y diluir con 9 mL
del diluyente el cual debe encontrarse a una temperatura similar a sta, evitando el contacto entre la pipeta y el
diluyente (todo en condiciones aspticas). (Ver figura 1).
e) Utilizar pipetas diferentes para cada dilucin inoculando simultneamente las cajas que se hayan seleccionado. El
volumen que se transfiera nunca debe ser menor al 10% de la capacidad total de la pipeta.

1g o 1 mL

1 mL

1 mL

1 mL

9 mL de
diluyente sol.
Salina al
0.85% o
agua
peptonada al
0.1%

10 1

10-2
Figura 1

10-3

10-4

f) La seleccin de las diluciones que se vayan a preparar y de aquellas que se van a inocular, dependen del nmero
esperado de microorganismos en la muestra, con base a los resultados de anlisis previos y de la informacin que
se obtenga del personal de inspeccin que la haya colectado. En ausencia total de informacin, trabajar con las
diluciones de la primera a la sexta.
4.2 tcnica de vaciado en placa.
a) Una vez realizadas las diluciones se procede a inocular las placas para la tcnica de vaciado en placa.
b) Distribuir las cajas estriles en la mesa de trabajo de manera que la inoculacin; la adicin de medio de cultivo y
homogenizacin, se puedan realizar cmoda y libremente. Marcar las cajas en la base de la misma con los datos
pertinentes previamente a su inoculacin y correr por duplicado.
c) Se inocula 1 mL de las dos ltimas diluciones segn las diluciones que se hayan realizado en las cajas Petri,
estriles, agregar de 12 a 15 mL del medio preparado que es agar cuenta estndar, mezclarlo mediante 6
movimientos de derecha a izquierda, 6 en el sentido de las manecillas del reloj, 6 en sentido contrario y 6 de atrs a
adelante, sobre una superficie lisa y horizontal hasta lograr una completa incorporacin del inculo en el medio; ([Fig.
2), cuidar que el medio no moje la cubierta de las cajas. Dejar solidificar.

Figura 2
d) Incluir una caja sin inculo por cada lote del medio preparado como testigo de esterilidad.
e) El tiempo transcurrido desde el momento en que la muestra se incorpora al diluyente hasta que finalmente se
adiciona el medio de cultivo a las cajas, no debe exceder de 20 minutos.
f) Incubar las cajas en posicin invertida (la tapa hacia abajo) por el tiempo y la temperatura que se requieran, segn
el tipo de alimento y microorganismo de que se trate.
g) Para mohos 27C por 48 a 72 horas para bacterias y levaduras 37C 24 a 48 horas.
h) Contar todas las colonias en aquellas cajas que tengan entre 25 y 250 colonias
i) Si se cuenta la ltima dilucin y no tiene entre 25 y 250 sino ms, se sigue lo siguiente:
j) Entre 250 y 450 colonias contar la mitad de la caja
k) Entre 451 y 750 colonias contar un cuarto de la caja
l) Si es mayor de 750 colonias, contar 9 cuadros al azar, hacer un promedio y multiplicar por 65, cuando se utilizan
cajas que en su base mide 91 mm de dimetro, si se usan cajas con dimetro diferente, obtener el rea para saber el
factor por multiplicar.
4.3 Tcnica de extensin en placa
a) Distribuir las cajas estriles en la mesa de trabajo de manera que la inoculacin; la adicin de medio de cultivo y
homogenizacin, se puedan realizar cmoda y libremente.

b) Marcar las cajas en sus tapas con los datos pertinentes previamente a su inoculacin y correr por duplicado.
c) Se inocula 0.1 mL de las dos ultimas diluciones de las muestras preparadas sobre la superficie del medio de
cultivo a utilizar.
d) Humedecer una varilla de vidrio en forma de L con alcohol y pasarla por la flama del mechero.
e) Enfriar la varilla, una vez fra extender el inoculo por toda la superficie del medio de cultivo Agar nutritivo. (Fig. 3).
f) Incluir una caja sin inculo por cada lote de medio y diluyente preparado como testigo de esterilidad.
g) El tiempo transcurrido desde el momento en que la muestra se incorpora al diluyente hasta que finalmente se
adiciona el medio de cultivo a las cajas, no debe exceder de 20 minutos.
h) Incubar las cajas en posicin invertida (la tapa hacia abajo) por el tiempo y la temperatura que se requieran, segn
el tipo de alimento y microorganismo de que se trate.
i) Para bacterias 37C 24 a 48 horas.
j) Se procede a contar el nmero de bacterias haciendo los clculos como en la tcnica de vaciado en placa.

0.1 mL

Varilla en
forma de L

Figura 3
4.4 Aislamiento por estra cruzada
a) Este sistema de siembra en estra en placas de Petri con medios slidos es el procedimiento habitual para aislar
bacterias en cultivos puros.
b) Se extiende el inculo sobre una pequea zona de la placa de Petri.
c) Se esteriliza el asa para trazar dos estras a partir del inculo depositado. Una de ellas se hace slo hasta el
centro de la placa de Petri.
d) Se vuelve a esterilizar el asa y se realizan una serie de estras paralelas a las dos primeras.
e) Luego de esterilizar el asa nuevamente, se hacen una serie de estras perpendiculares a las dos primeras, pero
comenzando desde el lado opuesto al depsito y sin llegar a tocarlo (ver figura 4).
f) Cuando el medio no es selectivo y la carga microbiana es alta el asa se quema entre estra y estra.
g) Incubar las cajas en posicin invertida (la tapa hacia abajo) por el tiempo y la temperatura que se requieran, segn
el tipo de alimento y/o microorganismo de que se trate.
h) Para mohos 27C por 48 a 72 horas.
i) Para bacterias y levaduras 37C 24 a 48 horas.

Figura 4
5. RESULTADOS
5.1 Informe de resultados de la tcnica de Vaciado en placa:
5.1.1 Reportar como: Unidades formadoras de colonias,
agar cuenta estndar, incubadas:
horas a
5.2 Informe de resultados de la tcnica de Extensin en placa:
5.2.1 Reportar como: Unidades formadoras de colonias,
agar cuenta estandar, incubadas:
horas a

UFC/g o mL de bacterias aerobias en placa en


_C
UFC/g o mL de bacterias aerobias en placa en
_C.

6 CUESTIONARIO:
6.1 En que casos aplicaras la tcnica de estra cruzada?
6.2 La tcnica de estra cruzada permite contar el nmero de colonias?
6.3 Cul es el fundamento de la tcnica de vaciado en placa?
6.4 Cul es el fundamento de la tcnica de extensin en placa?
6.5 Escribe 3 ventajas y 3 desventajas de la tcnica de vaciado en placa y de la tcnica de extensin en placa
6.6 En que casos aplicaras utilizar diluciones?
6.7 De los medios utilizados clasifcalos de acuerdo a su uso y composicin
7 . ANLISIS Y DISCUSIN DE RESULTADOS.
7.1 Discutir las ventajas y desventajas de cada una de las tcnicas de aislamiento.
7.2 Analizar los resultados obtenidos en cada una de las tcnicas.
8. CONCLUSIONES
8.1 Elabora tus conclusiones tomando en consideracin si se cumplieron los objetivos de la prctica y los resultados
obtenidos.
9. BIBLIOGRAFA
-NOM-092-SSA-1994 Bienes y Servicios. Mtodo para la cuenta de bacterias aerobias en placa.
-Mac Faddin, Pruebas Bioqumicas para la identificacin de bacterias de importancia clnica, Edit. Medica
Panamericana, 2002.
-Koneman, Diagnstico Microbiolgico 3ra. Edicin, Edit. Panamericana 2003

LABORATORIO DE TCNICAS MICROBIOLGICAS- UPIBI-IPN

PRCTICA No 6
CONSERVACIN DE MICROORGANISMOS
UNIDAD: III Nutricin y cultivo microbiano
TEMA: 3.5 Mtodos de conservacin de microorganismos
3.6 Resiembra en arena, glicerol, congelacin y liofilizacin
1.- Objetivo General
El alumno aplicar algunos mtodos para la conservacin de microorganismos.
1.1 Objetivos especficos:
Aplicar mtodos de conservacin para bacterias y hongos a corto plazo
Comprobar la viabilidad de los microorganismos a los que se les aplic algn mtodo de conservacin .
2.- INTRODUCCIN
Los microorganismos que son seleccionados por producir algn metabolito importante industrialmente no deben de
sufrir cambios metablicos, por lo que es importante conservarlos, el mtodo elegido debe ser el adecuado para que
no varen sus caractersticas genticas.
Existen varios mtodos para la conservacin de microorganismos donde la eleccin del mtodo estar encaminada
a retener las caractersticas de la cepa, estas tcnicas se mencionan a continuacin as como algunas diferencias
entre ellas. (Cada uno de estos mtodos presenta dos o ms variaciones):
Durante un programa de aislamiento y seleccin han demostrado tener y mantener las caractersticas requeridas por
la industria, se deben someter a un estudio estricto acerca de los cambios que pueden sufrir cuando se someten a
algn procedimiento de conservacin; as pues, el mtodo de conservacin elegido juega un papel importante en la
industria de fermentacin.

Parmetros para observar el funcionamiento del microorganismo.


Criterios generales para seleccionar el medio:
Tiempo.
Tipo de microorganismo
Forma de reproduccin del microorganismo

Conservacin a Corto plazo


Resiembra en serie en tubos inclinados y en medio lquido en refrigeracin con una duracin de 15 a 20 das de
almacenamiento. Tapa de aceite mineral, tapa de cera, con una duracin de 12 a 36 meses de almacenamiento.
a) Cultivos profundos en agar extracto de suelo, este es un mtodo adecuado para el mantenimiento de
microorganismos anaerobios los cuales han sido aislados de suelo.
b) Mantenimiento de cultivos en tubos inclinados de agar y en medios lquidos. Este es un mtodo de
conservacin muy empleado en cultivos que se emplean continuamente (cultivos de trabajo).

Autoras: Jurez Jurez M., Prez Snchez R., Rodrguez Pascual P

41

Por otro lado las resiembras sucesivas y continuas aunadas a los cambios que sufre el medio propiciarn
cambios genticos indeseables en los cultivos, lo cual se reflejar en los rendimientos de la cepa. Aunque este
mtodo es el mas usado y normalmente se aplica a hongos, bacterias, levaduras actinomyces y algas.
c) Cultivos en tubos inclinados con agar adicionado de aceite mineral. A los cultivos preservados por el
mtodo anterior, se les puede adicionar un aceite mineral como Amerol o Nugol, con esto se disminuyen las
posibilidades de contaminacin, de tal forma que los cultivos pueden mantenerse por ms tiempo, aunque
no se elimina el problema de los cambios genticos que pueden sufrir la cepa. Los cultivos mantenidos en
agar inclinado ya sea con o sin aceite mineral deben ser protegidos con capuchn mtalico o de papel
parafina.
Mantenimiento de cultivos por congelamiento.
En muchas ocasiones es mas conveniente mantener un cultivo usando tcnicas menos convencionales, de tal forma
que una de las empleadas es por congelamiento del cultivo este mtodo tiene el inconveniente de que la velocidad
de muerte del microorganismo ser mayor cuando menos baja sea la temperatura de mantenimiento, adems
tambin durante el proceso de congelamiento algunas clulas mueren. En la conservacin de cultivos por este
procedimiento, se requiere equipo capaz de mantener temperatura de enfriamiento bastantes bajas, esto puede
lograrse con el uso de nitrgeno lquido.
Congelacin (a -20 C en glicerol) se mezcla con el microorganismo.
Este tipo de conservacin es utilizada en la prctica comn, para trabajo continuo, mantiene un ritmo elevado de
metabolismo, no es recomendable para trabajos largos ya que provoca mucho estrs al microorganismo, porque la
reactivacin es muy rpida.
Conservacin de microorganismos a mediano plazo
Para este tipo de conservacin se utiliza un soporte slido para atenuar el metabolismo.
Mantenimiento de cultivos en suelo estril. Este es un mtodo simple y muy empleado Principalmente para
microorganismos que esporulen. Aunque el mtodo originalmente uso suelo estril, tambin se pueden usar otros
soportes como: Arena estril, papel filtro, esferas de plstico o perlas en vidrio.
Conservacin de microorganismos a largo plazo
Mantenimiento de microorganismos por secado en fro (Liofilizacin).

Liofilizacin coloca al microorganismo en un soporte leche descremada, carbonatos, lactosa, para darle
proteccin por los cambios del proceso. Este proceso puede durar de 15 a 20 aos ms de
almacenamiento.
Tierra frtil estril: el microorganismo esta con sustrato, el microorganismo se coloca en un recipiente al
vaco, esto es perfecto para el microorganismo que esporula.
Criogenia: sumergir en gases lquidos como N2 liquido a 80 C, se requiere un equipo muy grande,
instalaciones especiales, es muy utilizado para microorganismos que no esporulan.
Otros gases O2, He - 220 C, Argn, se usa un soporte Ej. Polvo de cal.
Virus se conserva en tejido o se inserta a un hospedero) o en estado atenuado en cultivo de clulas
anmales, embriones de pollo.

En algunas ocasiones la industria fermentativa tiene frecuentes prdidas por degeneracin de las cepas de trabajo;
las causas primordiales que cusan estas prdidas de los cultivos que se mantienen bajo determinadas condiciones
se mencionan a continuacin:
a) Contaminacin por otros microorganismos
b) Contaminacin por fagos
c) Problemas de mutacin y seleccin natural.
d) Personal mal entrenado.
El objetivo fundamental de mantener la viabilidad en los microorganismos es: conservar todas las funciones
metablicas, reproducible y que transmitan todas sus caractersticas a sus descendientes, con replicaciones bajas,
capaces de reproducirse.
Para la reactivacin del microorganismo se pueden utilizar solucin salina, agua peptonada en general medio de
cultivo lquido; esto para cuidar la osmolaridad.
La reactivacin tambin depende del medio que se utiliza par realizar la conservacin, el H2O no se utiliza porque
deben de ser soluciones con concentraciones osmticas y el H2O no cumple pero para esporas si se puede utilizar.
Cuidar que no haya mucho estrs y que se reactive en condiciones iguales a donde se conserva:
1. Medio de cultivo.
2. Temperatura
3. Componentes de nutricin.
Los pasos a seguir para la recuperacin del microorganismo son:
Reactivar
Rehidratar
Inocular en medio del cultivo.
Vaciado en placa el ms comn.
Extensin con varilla.
Resuspender en lquido se retendr una alcuota y sirve como fuente de propagacin del microorganismo.
La comprobacin de la viabilidad nos dar a reconocer tres aspectos fundamentales:
a) El nmero de clulas sobrevivientes despus del proceso de conservacin.
b) El posible grado de contaminacin
c) El grado de uniformidad en el crecimiento y esporulacin del cultivo generado.
Evaluacin
Siempre se utiliza un cultivo sumergido (medio lquido).
Realizar cintica.
Se realiza de una forma que se pueda comparar antes y despus.
En la industria se le deben de hacer todas las pruebas necesarias porque influirn en una nueva produccin.
La compaa que certifica es la World International Directories Culture Cultive

Centros con Cepas certificadas:


Puebla
Biomdicas
ATCC tiene el monopolio de certificacin de cepas (American Type Culture Collection)
NIA Instituto de Agricultura Norteamericana

GSCC Alemana Standar Culture Cultive


Los datos que debe de tener el microorganismo aislado son:
I.-Nombre del microorganismo
II.-Fuente de obtencin (aislado en el laboratorio o proporcionado por alguna institucin)
III.-Nombre del Instituto y de la persona que proporcion la cepa.
IV.-Nmero de catlogo o de coleccin
V.-Localizacin de la fuente de aislamiento
VI.-Requerimientos especiales (Medio de mantenimiento, temperatura ptima de crecimiento, y de produccin, pH
ptimo, nutrientes especficos etc.)
VII.-Productos principales y rendimientos aproximados.
VIII.-Nmero de cultivos en existencia en el lote preservado
IX.-En caso de cepas patentadas dar la referencia.
Los datos que debe de tener el microorganismo que va a ser reactivado son:

Distribucin de tiempo, cada cuando se va ha realizar la reactivacin.


Informacin sobre el microorganismo (caractersticas, ficha de identificacin).
Forma de evaluacin.
Hojas de registro (fecha, responsable, resultados, medios, lotes).
Seleccionar el mtodo de conservacin (considerando tiempo de conservacin, tipo de microorganismo,
forma de reproduccin).

En el laboratorio se trabaja con dos cultivos del mismo microorganismo a los cuales se les, llama Cultivos Stock, a
stos se les divide en Cultivos Stock Primario y Cultivos Stock de Trabajo, los primeros se usan como cultivos de
referencia y de reserva, los cultivos de trabajo son usados para la preparacin del inculo que se usar en el
proceso de fermentacin.
3.- MATERIAL, EQUIPO, REACTIVOS Y CEPAS MICROBIANAS
3.1. MATERIAL
Mechero Fisher
6 tubos de ensaye de 16 X 150 mm
2 tubos de 16x 150 mm con 9 mL de solucin salina fisiolgica (0.85%)
1 gradilla metlica
1 Pipetero con pipetas estriles de 1 mL
1 puente de coloracin
4 pipetas de 1 mL
1 caja de Petri con varilla en forma de V , con un porta y un cubreobjetos
1 asa micolgica y bacteriolgica
1 bistur
Algodn
Gasa

Papel Kraft
Colorantes para la tincin de Gram
Azul de metileno
3.2. EQUIPO
1 autoclave
1 incubadora 28 C
1 incubadora 35 2 C
1 microscopio
1 horno a 170C
1 balanza digital
3.3 MEDIOS DE CULTIVO
Agar Soya tripticasena.
Agar Papa y Dextrosa.
Caldo Nutritivo.
3.4 REACTIVOS
Aceite mineral
Arena estril
Solucin salina fisiolgica
3.5 Cepas de bacterias, mohos y levaduras a conservar
Sern los obtenidos de la prctica de aislamiento de microorganismos y en la prctica de aislamiento de mohos y
levaduras.
4.- DESARROLLO EXPERIMENTAL
4.1 MANTENIMIENTO DE MICROORGANISMOS
4.1.1 Realizar un examen microscpico de los microorganismos que se quieren conservar.
4.1.2 Previamente se deber realizar una tincin de Gram para bacterias y una preparacin en fresco para mohos y
tincin simple para levaduras.
4.1.3 Si el cultivo es puro, se deben preparar tubos con medio para conservarlo.
4.1.4 Preparar tubos inclinados con 5 mL de medio agar soya tripticasena, para bacterias y actinomicetos, agar papa
dextrosa para mohos y levaduras, tambin se pueden usar los medios de cultivo en los que se haya aislado o bien el
que recomiende la bibliografa que se haya consultado.
4.1.5 Rotular los cultivos con los siguientes datos:
Nombre del microorganismo

Lugar y fuente de donde se aisl (aislado en el laboratorio o proporcionado por alguna institucin)
Requerimientos especiales (Medio de mantenimiento, temperatura ptima de crecimiento, y de produccin,
pH ptimo, nutrientes especficos etc.)
Nombre del metabolito (si lo produce).
4.2 MANTENIMIENTO DE CULTIVOS EN TUBOS CON AGAR INCLINADO.
4.2.1 Por este mtodo se recomienda sembrar bacterias, levaduras y mohos
4.2.2 Se siembra por triplicado cada uno de los microorganismos que se van a conservar.
4.2.3 Incubar los tubos a 35 2C durante 24 horas si se trata de bacterias y levaduras y a 28C durante 48 horas
si se trata de mohos durante cinco das.
4.2.4 Se verifica el crecimiento adecuado y se conservan los tubos en refrigeracin a una temperatura aproximada
de 4C
4.3 MANTENIMIENTO DE CULTIVOS EN TUBOS CON AGAR INCLINADO Y ACEITE MINERAL.
4.3.1 Por este mtodo se recomienda que se conserven bacterias y levaduras.
4.3.2 Se colocan 100 mL de aceite mineral en un matraz Erlenmeyer y se esteriliza por calor seco a 170C durante
una hora.
4.3.3. Al tubo inclinado que se sembr en el punto 4.2 se le adiciona el aceite mineral hasta que cubra el agar, sellar
con papel parafilm y guardar el tubo en el cuarto fri a una temperatura aproximada a 4C (figura 1).

TAPON DE ALGODON

TAPON METALICO

ACEITE MINERAL

MEDIO DE CULTIVO SOLIDO

FIGURA 1.
4.4 MANTENIMIENTO DE CULTIVOS EN ARENA ESTRIL.
4.4.1 Este mtodo se recomienda para conservar mohos y microorganismos esporulados.
4.4.2 Se esterilizan 3 tubos de ensaye con tapn de rosca que contienen arena y se esterilizan por calor seco 170C
durante 1 hora.
4.4.3 El tubo que tiene el moho que se va a conservar se le adicionan 5 mL de solucin salina estril, se homogeniza
hasta que se vea una suspensin y se adiciona lentamente al tubo que contiene el suelo de tal manera que la arena
solo se humedezca.
4.4.4 Se sella el tubo con papel parafilm y se conserva en refrigeracin.
* Nota: Para evaluar la viabilidad del cultivo conservado se realiza lo siguiente
y levaduras a
Se siembran los microorganismos en caldo nutritivo incubando 24 horas para bacterias
37C y para mohos 48 horas a 28C
Realizar cintica.
Sembrar pruebas bioqumicas para verificar que no hay variacin en el metabolismo de los
microorganismos.
Se
realiza de una forma que se pueda comparar los resultados antes y despus de la conservacin.

En la industria se le deben de hacer todas las pruebas necesarias porque influirn en una nueva produccin.
5. RESULTADOS Y CUESTIONARIO
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.

Qu les pasa a los tubos con agar inclinado si se mantienen en refrigeracin por ms de 6 meses?
Menciona otros mtodos de conservacin de microorganismos?
Cunto tiempo pueden durar vivos los microorganismos por el mtodo de suelo estril?
Cunto tiempo pueden durar vivos los microorganismos por el mtodo de tubos inclinados?
Cunto tiempo pueden durar vivos los microorganismos por el mtodo con aceite mineral?
Cunto tiempo pueden durar vivos los microorganismos por el mtodo de congelacin?
Cunto tiempo pueden durar vivos los microorganismos por el mtodo de liofilizacin?
Tendrn variacin gentica transferencias masivas?
A que se le llama cultivo patrn?
A que se le llama cultivo probado?
Se considera la edad fisiolgica del microorganismo para conservarlo?
En que fase del crecimiento se siembra un microorganismo?

6.- ANLISIS Y DISCUSIN DE RESULTADOS


6.1 Discutir con los resultados obtenidos y con los objetivos propuesto.
7.- CONCLUSIONES
7.1 Elaborar las conclusiones con base a los resultados obtenidos, al anlisis y discusin de stos, a la bibliografa
consultada y a los objetivos de la prctica.
8.- BIBLIOGRAFA
Enumerar la bibliografa consultada para la elaboracin del reporte de la prctica
9.- REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS.

-Koneman, E.W. & Morrison; Micologa, diagnstico de laboratorio; Ed. Mdico Panamericana: 1991.
-Tortora J. Gerard; Introduccin a la microbiologa; Ed. Acribia; 1993.

PRACTICA No.7
CRECIMIENTO MICROBIANO
UNIDAD V: Crecimiento Microbiano
TEMA: 5.1 Crecimiento microbiano
5.2 Tcnicas para cuantificar el crecimiento microbiano
1.3 Curva de crecimiento
1. OBJETIVO GENERAL
El alumno aplicar las tcnicas ms utilizadas para el recuento de microorganismos y explicar qu ocurre en cada
una de las fases de crecimiento celular.
1.2 Objetivos Especficos
Realizar un cultivo sumergido con agitacin (fermentacin) a nivel matraz de Escherichia coli por 24 horas.
Cuantificar el nmero de microorganismos viables como unidades formadoras de colonias (UFC), a travs
de la tcnica por vaciado en placa
Estimar el crecimiento microbiano por la tcnica de turbidimetra y comparacin con el nefelmetro de
McFarland.
Cuantificar el nmero de microorganismos por cuenta directa con la tcnica de conteo en cmara de
Neubauer.
2. INTRODUCCIN
Al hablar de crecimiento microbiano nos referimos al nmero de clulas, las clulas que crecen, estn aumentando
de nmero y forman cmulos de cientos de microorganismos, colonias de cientos de microorganismos o poblaciones
de miles de millones.
Al conocer las condiciones para el crecimiento microbiano, podemos predecir la rapidez con que crecern estos en
distintas situaciones y determinan la forma de controlar su crecimiento, estos requerimientos pueden ser fsicos y
qumicos. Los aspectos fsicos incluyen la temperatura, el pH y la presin osmtica y entre los requerimientos
qumicos estn el agua, las fuentes de carbono y nitrgeno, las sustancias minerales, el oxigeno y los factores
orgnicos de crecimiento.
Las bacterias se reproducen generalmente por fisin binaria, una divisin celular da lugar a dos clulas, la divisin de
estas clulas produce cuatro y as sucesivamente.
El tiempo necesario para que una clula se divida y por consiguiente para que su poblacin se duplique, es lo que se
llama tiempo de generacin o tiempo de duplicacin, puesto que, para los organismos unicelulares; cada
duplicacin constituye una nueva generacin, vara considerablemente entre los diferentes microorganismos. La
mayora de las bacterias tienen un tiempo de generacin de una a tres horas.
Hay una serie de mtodos para medir el crecimiento bacteriano. Algunos mtodos miden el nmero de clulas, otros
la masa total de la poblacin. Las medidas de poblacin se refieren normalmente al nmero de clulas que hay en un
mililitro de lquido o en gramo de material slido.
Los mtodos de cuantificacin estn basados en mediciones directas o indirectas de muestras muy pequeas,
despus se determina mediante clculos el tamao de la poblacin total.
Los mtodos recomendados para medir la poblacin son:
Recuento en placa
Diluciones seriadas.
Autoras: Jurez Jurez M., Prez Snchez R., Rodrguez Pascual P

49

Siembra por vaciado en placa.


Siembra por extensin con varilla.
Filtracin.
Mtodo del nmero ms probable.
Recuento directo al microscopio (cmara de Neubauer).
Hay otros 3 mtodos llamados indirectos.
Turbidimetra.
Actividad metablica.
Peso seco.
Es posible determinar la densidad celular empleando mtodos ms sencillos. Nos basta con una cmara de conteo
celular, por ejemplo la cmara de Neubauer, y un microscopio. Una cmara de conteo celular es un dispositivo en el
que se coloca una muestra de la suspensin a medir. El dispositivo presenta unas seales que determinan un
volumen conocido (x microlitros). Al contar bajo el microscopio el nmero de partculas presentes en ese volumen se
puede determinar la densidad de partculas en la suspensin de origen.

Existen numerosos modelos de cmaras de para contar clulas, adaptadas a su uso en microscopa. En la imagen
puedes observar una cmara de Neubauer doble, como las que usas en el laboratorio de prcticas.
Para determinar la viabilidad celular se emplean diferentes mtodos. El ms comn es el de tincin con azul tripn.
El azul tripn es un coloide que se introduce en el interior de las clulas que presentan roturas en la membrana. As
pues las clulas que aparecen en la imagen, claramente de color azul, son consideradas no viables. Asimilar clulas
blancas, por exclusin, a clulas viables es un error pues por este mtodo se sobrevalora la viabilidad de las clulas
en la suspensin, determinando como inviables slo aquellas con la membrana rota. Existen otros mtodos de
determinacin de la viabilidad celular como el ms preciso de la tincin con ioduro de propidio.
Es importante diferenciar entre el crecimiento de las clulas individuales y el crecimiento de poblaciones de clulas
(proliferacin). El crecimiento de una clula es el aumento en su tamao y peso y generalmente es la antesala de la
divisin celular. Por otra parte, la proliferacin es el aumento del nmero de clulas a consecuencia del crecimiento y
la divisin celulares.
Una vez que se proveen de nutrientes necesarios al microorganismo, la clula empiezan a crecer y/o a producir
algunos metabolitos.
Fase del crecimiento
En un cultivo microbiano todas las partes estn sujetas a las mismas condiciones de temperatura, pH, concentracin
de nutrientes, en la figura siguiente se indican diferentes fases que ocurren en un cultivo, en donde se refleja los
cambios en la biomasa y en el medio ambiente.
Parmetros de la curva de crecimiento
Si se sigue el crecimiento de un cultivo discontinuo a travs de la multiplicacin de la masa, nos interesaran tres
parmetros que son la produccin, la tasa de crecimiento y el periodo de latencia.

La produccin es la diferencia entre la masa bacteriana inicial y la mxima: X = X max- X 0


La tasa de crecimiento exponencial es una medida de la velocidad del crecimiento celular (velocidad especfica de
crecimiento celular) se designa con la letra griega en la fase exponencial del crecimiento. Se calcula a partir de las
densidades bacterianas X y X en los tiempos t y t, en la fase de crecimiento exponencial segn
0
t
0
= ln Xt ln X0
t t0

El tiempo de duplicacin es td = ln 2 /
Hay una serie de mtodos para medir el crecimiento bacteriano. Algunos mtodos miden el nmero de clulas, otros
la masa total de la poblacin. Las medidas de poblacin se refieren normalmente al nmero de clulas que hay en un
mililitro de lquido o en un gramo de material slido.
Los mtodos que vamos a utilizar en el laboratorio de tcnicas microbiolgicas es el de cuenta viable por la tcnica
de vaciado en placa, cuenta directa al microscopio utilizando una cmara de Neubauer y por turbidimetra que es un
mtodo indirecto que mide la densidad de una suspensin por su extincin, en algunas ocasiones se utiliza el
nefelmetro.
3.- MATERIAL, EQUIPO, REACTIVOS Y CEPAS MICROBIANAS
3.1.- MATERIAL
Por corrimiento (una seccin del laboratorio):
1matraz nefelomtrico con 50 mL de caldo nutritivo estril (matraz semilla)
11 Matraces de 125mL con 25 mL de caldo nutritivo estril (matraces de crecimiento)
1 matraz de 1 L con 600 mL de agar cuenta estndar (para el vaciado en placa)
1 juego de nefelmetro de Mac Farland
2 celdas y un portaceldas
120 tubos de 16 x 150 mm con 9 mL de solucin salina (para las diluciones)

Pipetas de 2,5 y 10 ml estriles


40 Cajas de Petri estriles (para el vaciado en placa)
3.2.-REACTIVOS Y MEDIOS DE CULTIVO
NaCI peptona
Caldo nutritivo
Agar cuenta estndar

3.3.- EQUIPO
Espectrofotmetro
Autoclave
Horno
Incubadora a 37 C
Contador de colonias
Cmaras de Neubauer
3.4.- CEPAS:
Cepa de Escherichia coli
Cepa de Saccharomyces cerevisiae
4.- DESARROLLO EXPERIMENTAL
4.1 PREPARACIN DE MATRAZ SEMILLA
4.1.1 Inocular en condiciones de esterilidad un matraz nefelomtrico conteniendo 50 mL de caldo nutritivo estril con
2.5 mL de una suspensin de Escherichia coli Saccharomyces cerevisiae ajustado al tubo 3 del nefelmetro de
6

Mac Farland (aproximadamente 3x10 de clulas de E. coli).


4.1.2 Incubar a 35 C por 24 horas en agitacin aproximadamente a 120 rpm. ste ser el matraz semilla.
NOTAS
A.- El da de la cintica tomar en condiciones de esterilidad 4 ml y medir la turbidez en el espectrofotmetro.
B.- De lo que quede en la pipeta realizar una tincin de Gram para verificar la pureza de nuestro matraz semilla.
C.- Enjuagar una celda espectrofotomtrica con benzal y luego en condiciones de esterilidad enjuagarla con alcohol,
ahora con una pipeta estril tomar 4 ml de caldo nutritivo del matraz de cintica y colocarlo en la celda
espectrofotomrica y colocarle papel parafilm (este es el blanco para ajustar el espectro y poder leer cada lectura).
4.2 INOCULACIN DE MATRAZ DE CINTICA
4.2.1 Homogeneizar la suspensin microbiana del matraz semilla y tomar una muestra de 2.5 mL de esta suspensin
en condiciones de esterilidad e inocular el matraz con caldo nutritivo para la cintica (de 250 mL) y homogeneizarlos.
4.2.2 Con una pipeta de 5 ml tomar inmediatamente la primera muestra de 4 mL en condiciones estriles, esta ser
la muestra de tiempo cero (t 0), 3 mL se ocupan para la tcnica de turbidimetra, 1 mL para hacer las diluciones, y un
par de gotas para llenar la cmara de Neubauer. Despus coloca el matraz en agitacin aproximadamente a 120
rpm.
4.2.3. Cada hora, o segn los tiempos establecidos, en condiciones de esterilidad se toma una muestra de 4 mL para
determinar el crecimiento por los tres mtodos sealados. Recuerda que inmediatamente despus de tomar la
muestra debes regresar el matraz a la agitadora.
4.3 DETERMINACIN DEL CRECIMIENTO POR TURBIDIMETRIA
4.3.1 Prender el espectrofotmetro con el paso de luz bloqueado y ajustar a 100% de transmitancia y cero de
absorbancia con la celda que contiene el caldo nutritivo (blanco) a una longitud de onda de 540 nanmetros (seguir
indicaciones y recomendaciones de uso de los profesores).
4.3.2 Tomar 3 mL de muestra de cada una de los matraces desde el tiempo cero hasta el tiempo final en condiciones
de esterilidad y colocarla en la celda espectrofotomtrica. Tapar la celda con papel parafilm, y leer en el
espectrofotmetro para registrar la absorbancia; esta lectura corresponde a la turbidimetra adquirida por aparicin
de clulas a lo largo de la cintica.
4.3.3 Despus de obtener la lectura desecha el contenido en benzal, y enjuaga la celda con benzal, para
posteriormente enjuagarlo con agua, junto al espectro tenemos los frascos de desecho.

4.4 CONTEO DIRECTO CON CMARA DE NEUBAUER


4.4.1 Coloca sobre la cmara de Neubauer el cubreobjetos, cubriendo las dos cmaras de conteo.
4.4.2 Con una pipeta coloca la muestra del cultivo, tomada en condiciones de esterilidad, entre la cmara y el
portaobjetos, para que por cohesin se llene la cmara, realzalo en ambas cmaras.
La cmara de Neubauer es una cmara de conteo adaptada al microscopio de campo claro o al de contraste de
fases. Se trata de un portaobjetos con una depresin en el centro, en el fondo de la cual se ha marcado con la ayuda
de un diamante una cuadrcula como la que se ve en la imagen. Es un cuadrado de 3 x 3 mm., con una separacin
entre dos lneas consecutivas de 0.25 mm. As pues el rea sombreada y marcada L corresponde a 1 milmetro
cuadrado. La depresin central del cubreobjetos est hundida 0.1 mm respecto a la superficie, de forma que cuando
se cubre con un cubreobjetos ste dista de la superficie marcada 0.1 milmetro, y el volumen comprendido entre la
superficie L y el cubreobjetos es de 0.1 milmetro cbico, es decir 0.1 microlitro.

4.4.3 Enfocar con objetivo seco fuerte (nunca uses el objetivo de inmersin) y contabilizar las clulas que se
observan en toda la cuadrcula central (marcada con la letra M), la cual a su vez se encuentra subdividida en 25
cuadros, cada uno dividido en 16 cuadros. Si el nmero de clulas es muy grande, selecciona al menos cinco de los
25 cuadros y cuenta las clulas, y obtn un promedio. Este promedio multiplcalo por 25 que es el nmero total de
cuadros.
4.4.4 Calcular el nmero de clulas totales por mililitro de cultivo, siguiendo la siguiente frmula.
Concentracin en la suspensin (clulas/ mL) = # de clulas contadas X 10,000
4.4.5 Retira el cubreobjetos con una torunda de algodn impregnada con alcohol y con una pinza que contenga

tambin una torunda impregnada con alcohol, limpia la cmara con mucho cuidado procurando no frotar demasiado
para evitar rayar la cmara y la torunda utilizada colcala en un frasco que contenga benzal.
4.5 DILUCIONES PARA REDUCCIN DE CARGA MICROBIANA
4.5.1 La muestra se toma en condiciones de esterilidad, toma un mililitro del matraz cintica y colocalo en un tubo
-1

que contenga 9 mL de solucin salina, para realizar la dilucin 10 . Mezcla el tubo y toma un mililitro y colcalo en
-2

otro tubo con 9 mL de solucin salina para obtener la dilucin 10 .


4.5.2 El nmero de diluciones que realices depender del crecimiento que encuentres por turbidimetra o en el
6

-6

conteo directo anterior, si el conteo es del orden de 1x10 , entonces realiza hasta las diluciones 10 y 10-7. Conforme
aumente el nmero de microorganismos aumenta el nmero de diluciones, recordemos que debemos tener un
intervalo de conteo.

4.6 DETERMINACIN DE CUENTA VIABLE POR VACIADO EN PLACA


4.6.1 De las ultimas 2 diluciones realizadas tomar 1 mL y colocarlo en una caja Petri estril previamente etiquetada,
(tcnica, dilucin, equipo y tiempo)
4.6.2 Adicionar aproximadamente 15 mL de agar cuenta estndar a una temperatura de 45 C, recordar las
recomendaciones de la tcnica de vaciado en placa.
4.6.3 Homogeneizar por rotacin en la superficie de la mesa y dejar enfriar hasta que solidifique el agar e incubar a
37 C durante 24 horas.
4.6.4 Contar las colonias de cada placa, considerando nicamente las placas que contengan entre 25 y 250 colonias.
4.6.5 Calcula el nmero de bacterias viables por mL de cultivo, multiplicando por el inverso de la dilucin.

5. RESULTADOS Y CUESTIONARIO
5.1 Turbidimetra: anota los resultados obtenidos de lecturas de absorbancia en los tiempos correspondientes.
MUESTRA
T0

TIEMPO (min)

ABSORBANCIA (nm)

T1
T2
T3
T4
T5
T6
T7
T8
T9
T10
T11
5.2 Cuenta viable por vaciado en placa: Anota el nmero de colonias que se desarrollaron en las cajas petri con
agar cuenta estndar.
Microorganismo:
MUESTRA
T0
T1
T2
T3
T4
T5
T6
T7
T8
T9
T10

TIEMPO (min)

DILUCIN

No. de UFC/mL

5.3 Cuenta directa por cmara de Neubauer:


MUESTRA TIEMPO (min) No de clulas/mL
T0
T1
T2
T3
T4
T5
T6
T7
T8
T9
T10
5.3.1 Anota el nmero de clulas totales que se contabilizaron en cada uno de los tiempos de la cintica.
5.3.2 Cul es el fundamento del nmero total de clulas?
5.3.3 Es posible diferenciar clulas muertas de las vivas?
5.4. Con los resultados obtenidos del mtodo de cuenta viable determina el nmero de unidades formadoras de
colonias en los 25 mL del medio de cultivo.
5.5. Menciona el fundamento de la tcnica de cuenta viable.
5.6. Construye una grfica del nmero de UFC/mL vs Tiempo, sealando en la curva las diferentes zonas de
crecimiento.
5.7. Construye una grfica del nmero de UFC/mL vs Tiempo (horas).
5.8. Construye una grfica del log del nmero de UFC/mL vs Abosrbancia.
5.9. Determina la velocidad especfica de crecimiento mxima.
5.10. Calcula el tiempo de generacin de la cepa estudiada.
5.11. Define el trmino crecimiento microbiano
5.12. Define el trmino Velocidad Especfica de Crecimiento
5.13. Menciona los factores de que depende la fase de muerte
5.14. Explica fisiolgicamente qu sucede en la fase lag.
5.15. Por qu es importante la cintica microbiana?
6. ANLISIS Y DISCUSIN DE RESULTADOS
6.1 Discute las ventajas y desventajas de los mtodos empleados.
6.2 Analiza y discute sobre la base de lo anterior y a la investigacin bibliogrfica realizada, los resultados obtenidos
en esta prctica.
6.3 Discute la conveniencia o no de construir una curva de calibracin con los resultados de trubidimetra y de cuenta
viable para un microorganismo dado, de ser conveniente explica para qu podr servir.
7. CONCLUSIONES

Elabora las conclusiones sobre la base de los resultados obtenidos, al anlisis y discusin de estos, a la bibliografa
consultada y a los objetivos de la prctica.
8. BIBLIOGRAFA
Enlistar la bibliografa consultada para el reporte de esta practica.
9. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS RECOMENDADAS.
9.1.- Atlas, R. W. 1988. Microbiology. Second edition. Mc. Millan Public, U. K. 807 pg.
9.2.- Moat, A. G., J. W. Foster, M. P. Spector. 2002. Microbial Phisiology. Fourth edition. Wiley-Liss, USA. 715 pg.
9.3.- Brock, T.D.; Smith y M.T. Madigan. 1997. Biologa de los Microorganismos. Octava edicin. Prentice Hall,
Espaa. 956 pg.
9.4.- Stanbury, F. Peter, A. Whitaker, S. Hall. 1998. Principles of Fermentation Technology. Second edition.
Pergamon Press, Oxford. 376 pgs.
9.5.- Reina, Manuel. 2003. Contaje de clulas :cmara de Neubauer. Departamento de Biologa Celular. Universidad
de Barcelona. ltima actualizacin 20 de octubre de 2003.
http://www.ub.es/biocel/wbc/tecnicas/imagenes_de_neubauer.htm

LABORATORIO DE TCNICAS MICROBIOLGICAS- UPIBI.IPN

PRCTICA No. 8
PRODUCCIN DE UN METABOLITO (cidos orgnicos)
UNIDAD V: Crecimiento microbiano
TEMA: Produccin de cido lctico
1. OBJETIVOS GENERAL
El alumno realizar la produccin de un metabolito de importancia industrial de origen microbiano
I.2 Objetivos especficos
Determinar cuantitativamente el metabolito producido.
Establecer la correlacin entre el crecimiento microbiano y la produccin de un metabolito primario.
2. INTRODUCCIN
Por biotecnologa se entiende Toda aplicacin tecnolgica que utilice sistemas biolgicos y organismos vivos o sus
derivados para la creacin o modificacin de productos o procesos para usos especficos, segn la definicin de la
ONU. Desde los inicios de la civilizacin, la humanidad ha hecho uso de los microorganismos para obtener productos
especficos como pan, cerveza, vino, yogurt, etc., en lo que se conoce como biotecnologa tradicional o de primera
generacin. En la dcada de los 40s, se emplearon las herramientas de la bioqumica y la microbiologa en el uso y
manipulacin de organismos para la obtencin de metabolitos (aminocidos, antibiticos, enzimas), como
biotecnologa de segunda generacin. Actualmente, la biotecnologa de tercera generacin hace uso de las
herramientas de la biologa molecular y la ingeniera gentica para la produccin de compuestos, enzimas, vacunas,
anticuerpos, etc.
Uno de estos metabolitos de origen microbiano es el cido lctico, obtenido generalmente a partir de bacterias
lcticas homofermentativas. Fue el primer cido orgnico producido mediante fermentacin microbiana industrial en
1880. Se emplea en medicina para estabilizacin hemodinmica, en cosmtica como queratinoltico, para curtir
pieles en peletera, y como acaricida en el ganado. El cido lctico tiene mltiples aplicaciones en la industria
alimentaria como aditivo y conservante en productos crnicos y lcteos, en industria derivada de cereales y en
numerosas industrias de bebidas. De hecho el yogurt se produce por la fermentacin de la lactosa de la leche hasta
cido lctico, cuya acidez genera la precipitacin de la casena, dando el aspecto grumoso del yogurt. Se producen
otros alimentos a partir de fuentes de carbono diversas, en donde se genera acido lctico, tales como la leche
blgara, el yakult, el jocoque, etc. En la produccin de saeukrut (col fermentada), la primera fase del proceso incluye
la fermentacin lctica. La produccin slo del cido es de 20,000 toneladas anuales.
El cido lctico se produce a travs de la degradacin de lactosa glucosa por la ruta de Embden Meyerhoff
Parnas o gliclisis, hasta producir piruvato, el cul es reducido por la Lacato deshidrogenada (LDH) a L (+) Lactato.
El lactato es un cido carboxlico, y la acidez que genera, la cul llega a ser de pH 4.5, detiene el crecimiento de los
microorganismos, lo que da fin al proceso fermentativo, y permite conservar los productos, pues la acidez evita la
contaminacin por otros microorganismos
Las cepas utilizadas desde hace tiempo en la produccin de lactato (sal sdica del cido lctico, y que es la forma
como se comercializa) son principalmente las del grupo I de lactobacilos (homofermentativos), como son
Lactobacillus delbruckii sub. delbrueckii, sub. bulgaricus y sub. lactis, y L. helveticus. Estos microorganismos son
anaerobios aerotolerantes, por lo que la fermentacin se puede llevar a cabo en condiciones parcialmente
anaerobias, y no es necesaria la anaerobiosis absoluta. Otros lactobacilos son heterofermentativos (grupo III), y
adems de producir lactato, producen actico, etanol u otros productos, por lo que no son tiles para la produccin.
L. delbruckii sub. delbrueckii fermenta la glucosa y la fructosa, pero no la lactosa; L. delbruckii sub. bulgaricus y
lactis si pueden fermentar la lactosa. Actualmente la mitad del lactato que se genera se produce por fermentacin, y
el resto por sntesis qumica.

Autoras: Jurez Jurez M., Prez Snchez R., Rodrguez Pascual P.

58

Los fabricantes ponen especial inters en la seleccin de las condiciones adecuadas de cultivo para lograr altas
tazas de produccin del cido. En la produccin se puede emplear glucosa o lactosa como fuentes de carbono, pero
se prefiere la glucosa por el precio. Adems de la glucosa y de la fuente de nitrgeno, generalmente fosfato de
amonio, estas bacterias requieren vitaminas del grupo B para su crecimiento, las cuales se pueden adicionar puras,
o adicionar una fuente rica en ellas, como el extracto de levadura. En los procesos continuos, se adiciona CaCO3
para mantener el pH alto y evitar que la fermentacin se detenga. La fermentacin tpica dura 72 horas y debe
mantenerse una temperatura entre 30 -35 C. En los ltimos tiempos, se han desarrollado procesos para la
obtencin a partir del suero lcteo desproteineizado que es un subproducto de queseras, con lo cul se disminuyen
costos, adems de evitar contaminacin por su desecho. Este suero contiene un 5% aprox. de lactosa que funciona
como fuente de carbono. Tambin se emplea la melaza del azcar, dando un uso alternativo de la caa de azcar.
Un proceso tpico de fermentacin batch, consiste en la preparacin del inculo, la inoculacin del fermentador
semilla, la fermentacin en el tanque de produccin y la etapa de purificacin del metabolito. El estudio cintico de un
proceso fermentativo para la obtencin de un metabolito consiste en la determinacin y anlisis de los componentes
del sistema que nos permitan establecer las mejores condiciones de produccin y tener control sobre ellas, como
son: determinacin del crecimiento del microorganismo como biomasa producida (x), el consumo de carbohidratos o
de la fuente de carbono empleada, es decir el sustrato (s) y la cantidad de metabolito producido (P).
La determinacin de biomasa microbiana se puede hacer por peso seco o peso hmedo, por cuenta directa. La
determinacin del consumo de la fuente de carbono o sustrato depende de la naturaleza de ste, y y existen varias
tcnicas espectrofotomtricas para ello. La tcnica elegida para la determinacin del metabolito producido, tambin
depende de la naturaleza de este. Dado que el cido es un metabolito asociado al crecimiento, la medicin de la
biomasa producida, puede ser indicativa de la produccin de lctico en un cultivo batch. En este caso la
determinacin de la acidez del medio nos permitir determinar su produccin.
3. MATERIAL Y REACTIVOS
3.1 EQUIPO Y MATERIAL

Estufa de incubacin a 40 C
Microscopio ptico
Balanza analtica
Refrigerador con congelador
Mechero Bunsen.
Matraces Erlenmeyer de 125 mL.
Matraces Erlenmeyer de 250 mL.
Pipetas serolgicas graduadas de 1, 5 y 10 mL estriles.
Tiras de papel pH
Cmara de Newbauer
Equipo Swinex de filtracin.
Membranas Millipore de 0.45 m de poro y 25mm de dimetro
Jeringa de 5 mL.
Pinzas de diseccin
Tubos de ensaye de 13 X 100 mm
Vaso de precipitados de 30 mL
Bureta graduada

3.2 REACTIVOS Y MATERIAL BIOLGICO


Cepa: Lactobacillus delbrueckii sub. lactis en tubos inclinados de medio MRS
Medios de cultivo:
Medio Suero

Extracto de levadura
2.0 g
Peptona tripticasena
1.0 g.
Suero de leche desproteinizado cbp
100.0 mL
Ajustar pH a 6.0 con NH4OH. Esterilizar a 121C / 15 minutos
Medio Glucosa
Glucosa
9.0 g
Extracto de levadura
2.0 g
Fosfato de amonio
1.5 g
Agua cbp
100.0 mL
Ajustar pH a 6.0 con NH4OH. Esterilizar a 121C / 15 minutos

Solucin salina isotnica estril


Colorantes para tincin de Gram
NaOH 0.1 N
Solucin de fenolftalena

4. DESARROLLO EXPERIMENTAL
PRIMERA SESIN
A PREPARACIN DEL INCULO Y MATRAZ SEMILLA.
4.1
Tomar un tubo con medio inclinado con un cultivo de Lactobacillus lactis y adicionarle 2 mL de solucin
salina isotnica.
4.2
Homogeneizar perfectamente para formar la suspensin celular.
4.3
Inocular un matraz conteniendo 25 mL de medio de cultivo con 2.0 mL de la suspensin celular (el
profesor indicar cul le toca a cada equipo). A fin de verificar la pureza de ste matraz semilla, se
realizar una tincin de Gram (ver apartado C) y se revisar en el microscopio, antes de inocular el matraz
de produccin.
4.4
Incubar a 40 oC durante 48 horas sin agitacin.
SEGUNDA, TERCERA y CUARTA SESIN: (algunas de estas sesiones son extraclase).
B CINTICA DE PRODUCCIN DE ACIDO LCTICO.
4.5
Inocular el matraz de produccin conteniendo 150 mL del mismo medio de cultivo que se haya asignado,
con 15 mL provenientes del matraz semilla incubado durante 48 horas (verificar que tenga crecimiento
abundante).
4.6
Tomar en condiciones aspticas e inmediatamente despus de inocularlo, una alcuota de 3 mL de cada
matraz (tiempo 0) y filtrarlo mediante swinex colocar el filtrado en un tubo de ensaye de 13 x 100 mm.
4.7
Determinar el pH de este filtrado con tira reactiva.
4.8
Tambin realizar el conteo de clulas en cmara de Neubauer, como se indica en el apartado D.
4.9
Llevar el matraz a incubar a una temperatura de 40 C, sin agitacin.
4.10
Posteriormente a las 24, 48 y 72 horas de incubacin se tomar del matraz y en condiciones aspticas,
otras alcuotas de 3 mL y se tratarn como marcan los puntos 4.7, 4.8 y 4.9. Todos los tubos se rotularn
debidamente con el tiempo a que correspondan y se guardarn a 4C para su procesamiento posterior
para la determinacin de: Nmero de clulas, como se indica mas adelante en el apartado D.
4.11
Para Monitorear la Pureza del Cultivo se realizarn observaciones al microscopio de preparaciones
teidas con Gram al inicio y al final de la fermentacin, como marca el apartado C.

C MONITOREO DE LA PUREZA DE LA CEPA


4.12
Tomar una gota de la alcuota inmediatamente despus de tomarla (dejar caer la gota con la misma pipeta
con la que se tom) y colocarla en un portaobjetos.
4.13
Dejar secar la muestra y fijala con calor, pasando varias veces el portaobjetos por el mechero, hasta calor
que resista el dorso de la mano.
4.14
Gotear colorante de cristal violeta y dejar actuar 1 minuto, se enjuaga con agua, se gotea lugol, se deja 30
segundos y se enjuaga, se gotea alcohol-acetona 15 segundos y se enjuaga y al final se gotea colorante de
safranina 1 minuto y se enjuaga.
4.15Observar al microscopio (Inmersin). Lactobacillus es un bacilo largo Gram + .
D DETERMINACIN DEL CRECIMIENTO CELULAR.
4.16
Tomar una gota de la alcuota inmediatamente despus de tomarla (dejar caer la gota con la misma pipeta
con la que se tom) y colocarla en la Cmara de Neubauer.
4.17
Colocar la cmara en el microscopio y enfocar a 10X, eligiendo el campo de la cuadricula.
4.18
Cambiar a 40X y realizar el conteo de bacterias en cinco cuadrantes. Registrarlas para el clculo posterior
del nmero de clulas.
E. DETERMINACIN DEL CIDO LCTICO PRODUCIDO POR DETERMINACIN DE ACIDEZ.
4.19
Tal como se mencion en el paso 4.7, se determin el pH del medio a cada tiempo. Esto ser indicativo de
la produccin de cido lctico. Para verificar la produccin total se realizar una titulacin con NaOH 0.1 N
al final de la fermentacin, es decir a las 72 horas.
4.20
Para ello, despus de las 72 horas se filtrarn a travs de Millipore15 mL del medio y se colocarn en un
vaso de precipitados de 30 mL.
4.21
Se adicionarn 5 gotas de fenolftalena y se mezclar bien.
4.22
Titular con NaOH 0.1 N gota a gota hasta el vire estable del indicador.
4.23
Registrar el volumen de lcali gastado, para calcular los moles de cido orgnico lctico.
5. MANEJO Y ANLISIS DE RESULTADOS.
5.1 Anotar en la tabla 5.1 los resultados de sus observaciones al microscopio para verificar la pureza de la cepa
empleada:
Tabla 5.1
Tiempo (horas)
Forma
Gram
Matraz semilla
48
72
5.2 Anotar en la tabla 5.2 sus resultados de nmero de clulas producidas (que es un indicativo de la biomasa
producida). Los resultados obtenidos sern utilizados para elaborar la grfica de la cintica de produccin de
lactato.
Tabla 5.2. Determinacin de biomasa producida
Tiempo
0
24
48

No. de clulas por cuadrante

Promedio de 5 cuadrantes

Total de 25
cuadrantes.

72

5.3 Anotar en la tabla 5.3 los resultados del valor de pH determinado con tira reactiva, a los diferentes tiempos.
Tabla 5.3
Tiempo
Valor de pH
(horas)
0
24
48
72
5.4 Ahora anotar el gasto en mL de NaOH con la muestra de tiempo 72 horas, y con ello calcular los moles de cido
lctico producido. Para ello primero se calculan los moles de sosa consumidos en la titulacin, con la siguiente
frmula:
Moles de NaOH = mL de NaOH gastados x 0.1 moles / 1000 mL*
* la solucin de sosa es 0.1N, lo que equivale a 0.1 moles / L
Despus se calculan los moles de lactatos presentes en la muestra:
Moles de lactato = moles de NaOH_ x 1000 mL
15 mL
5.5 Cuntos moles de lactato se produjo en el matraz que se corri? Comparar la cantidad de lactato producido en
los matraces con suero de leche y con glucosa, e indicar cul es ms conveniente para la produccin de lactato.
5.6 Con los resultados anteriores de pH, y nmero de clulas, elaborar una grfica, de tiempo contra crecimiento y
pH a los diferentes tiempos. Con esto tendremos una grfica donde se muestre como se comporta el cultivo con
respecto al pH. Recuerda que es una so0la grfica para pH y nmero de clulas.
5.7 Escribir la va metablica utilizada en la fermentacin para la produccin de cido lctico.
5.8 Explicar porque se eligi esta cepa para la produccin de lactato.
5.9 Mencionar dos usos del cido lctico.
5.10Elaborar el diagrama de flujo (en bloques) de la produccin de lactato.
5.11DISCUTIR LOS RESULTADOS OBTENIDOS en funcin del medio empleado y la cantidad de lactato producido
en cada medio. Explicar las ventajas de producir lactato en cada uno de los medios.
6. BIBLIOGRAFIA
6.1
Crueger,D y Crueger, A. Biotecnologa: Un texto de microbiologa industrial. 2da. Edicin. Ed. Omega.
Barcelona. 1994.
6.2
Jakymec, M.; Moran, H.; Pez, G.; Ferrer, J.; Mrmol, Z.; Ramones, E. 2001. Cintica de la produccin de
cido lctico por fermentacin sumergida con lactosuero como sustrato. Rev. Cient., FCV-LUZ. XI(1): 5359.
6.3
Rodrguez Pascual, L. y Martnez Ziga R.1999. Manual de Prcticas de Laboratorio de Bioqumica
Microbiana. UPIBI-IPN. Mxico.

6.4

Ro de Janeiro. Convenio de Diversidad Biolgica. Secretariat of the Convention on Biological Diversity.


UNEP.
1992.
Disponible
en
WEB
como
[ref.
marzo
de
2007]
http://www.biodiv.org/convention/convention.shtml

Laboratorio De Tcnicas Microbiolgicas-UPIBI.IPN

PRCTICA No. 9
CUANTIFICACIN DE BACTERIAS POR LA TCNICA DEL NMERO MS PROBABLE (NMP)
UNIDAD V: Crecimiento microbiano
TEMA: 5.2.3 Mtodo del Nmero Ms Probable (NMP)
1.-OBJETIVOS GENERAL
El alumno utilizar la tcnica del Nmero Ms Probable.para cuantificar bacterias coliformes

1.1 Objetivos especficos:


Aplicar la Tcnica del Nmero Ms Probable para cuantificar organismos coliformes totales en muestras
de agua y alimentos.
Aplicar la Tcnica de Nmero Ms Probable para cuantificar de organismos coliformes fecales en
muestras de agua y alimentos.
2.- INTRODUCCIN
Esta tcnica est basada en la estadstica, matemtica inobjetable, para expresar cuantitativamente la densidad
de microorganismos en una muestra. Se basa en la presuncin de que las bacterias se hallan normalmente
distribuidas en un medio lquido, esto es, en las muestras repetidas del mismo tamao de un mismo producto,
debe esperarse contengan el mismo nmero de microorganismos como promedio; naturalmente, algunas de las
muestras pueden contener algunos grmenes mas o menos. La cifra media es el nmero ms probable (Numero
Ms Probable o MPN).
La Norma Oficial Mexicana NOM-112-SSA1-1994 Bienes y Servicios Determinacin de bacterias coliformes
Tcnica del Nmero Ms Probable. Secretaria de Salud. Mxico, establece el mtodo microbiolgico para
estimar el nmero de coliformes presentes en productos alimenticios, por medio del clculo del nmero ms
probable (NMP).
Este procedimiento puede aplicarse a agua potable, agua purificada, hielo y alimentos procesados trmicamente,
as como a muestras destinadas a evaluar la eficiencia de prcticas sanitarias en la industria alimentara. Este
procedimiento debe seleccionarse cuando la densidad esperada es como mnimo de una bacteria en 10 mL de
producto lquido o una bacteria por gramo de alimento slido.
Cuando la densidad bacteriana sea menor que la aqu citada y si la naturaleza del alimento lo permite, utilizar el
mtodo de filtrado en membrana. Si la densidad microbiana se espera sea mayor a 100 por mililitro o gramo de
muestra, ampliar el intervalo de diluciones o utilizar el mtodo en placa.
El mtodo se basa en que las bacterias coliformes, fermentan la lactosa incubadas a 35 1C durante 24 a 48
horas, resultando una produccin de cidos y gas el cual se manifiesta en las campanas de fermentacin.
La tcnica NMP requiere de mucho ms material que la utilizada en los recuentos en placa y se considera en
general, que posee una menor exactitud y precisin; es sin embargo, incomparablemente ms sensible ya que
estima la presencia de unos cuantos microorganismos o uno solo, en un gran volumen de muestra (tericamente
litros). Por esta razn encuentra aplicacin en el anlisis de agua, por ejemplo, en donde la presencia de 2
organismos coliformes en 100 mL, ya reclama atencin especial en un sistema de abastecimiento. Para este
propsito deber usarse tambin un recuento por vaciado en placa.
Con frecuencia en la aplicacin de la tcnica de NMP de un grupo particular de microorganismos, el ensayo se
extiende a dos o ms estadios, en el primero, que constituye la prueba presuntiva, los tubos positivos pueden ser
el resultado de la actividad del microorganismos en cuestin, o tambin de otros con comportamiento similar e
incluso, de asociaciones de diferentes microorganismos. La que viene a ser la prueba presuntiva en la
investigacin de organismos coliformes, consiste en inocular alcuotas de la muestra en tubos de fermentacin
64

Autoras: Jurez Jurez M., Prez Snchez R., Rodrguez Pascual P.

con caldo lactosado. En ellos, estos microorganismos proliferan fcilmente fermentando la lactosa y liberando
anhdrido carbnico que en gran cantidad se acumula en la campana o tubo de Durham. Un efecto semejante
puede ocurrir en ausencia de organismos coliformes como resultado de la accin sinrgica de dos tipos de
bacterias; una capaz de fermentar la lactosa hasta cido lctico y pirvico; y otra que metaboliza estos cidos
generando el gas aldehdo y cidos menores. Algunas bacterias Gram positivas tambin pueden, aunque en
menor grado producir gas a partir de la lactosa. se hace por ello indispensable efectuar un segundo ensayo,
llamado prueba confirmatoria en la cual los organismos coliformes, en caso de existir, proliferan activamente en
tanto que los falsos positivos sern inhibidos por la presencia de sustancias selectivas antibacterianas
adicionadas al medio de confirmacin.
Otras pruebas para determinar la presencia de bacterias coliformes:
Las bacterias coliformes son bacilos cortos, Gram negativos, que fermentan la lactosa y forman cido y gas. Son
anaerobios facultativos y se multiplican a mayor rapidez a temperaturas entre 30 y 37 C.
Las bacterias coliformes incluyen la Escherichia coli y otras bacterias que se asemejan morfolgica y
fisiolgicamente. Estos microorganismos con frecuencia difieren entre s en caractersticas pequeas; se
diferenciaron docenas de especies, pero en la actualidad solamente se reconocen cuatro gneros que son: E.
coli, Klebsiella, Citrobacter y Enterobacter.
3.- MATERIAL, EQUIPO, REACTIVOS, MEDIOS DE CULTIVO Y MUESTRAS
3.1 MEDIOS DE CULTIVO
3 Tubos con 9 mL de Agua peptonada al 0.1 %.
9 tubos con 10 mL de caldo lactosado con campana de Durham.
9 tubos con 10 mL de caldo lactosa bilis verde brillante con campana de Durham.
5 tubos con 20 mL de caldo lactosado de doble concentracin con campana Durham
2 tubos con 10 mL de caldo lactosado con campana de Durham
7 tubos con 10 mL de caldo lactosa bilis verde brillante con campana de Durham.
9 tubos con 10 mL de Caldo EC con campana de Durham.
9 tubos con 10 mL de caldo bilis verde brillante al 2% con campana de Durham.
3.2 MATERIAL
1 pipetero metlico
4 pipetas de 2 mL
4 pipetas de 10 mL
3.3 REACTIVOS
Benzal
3.4 EQUIPO
1 autoclave.
1 balanza granataria.
1 incubadora a 35C.
1 horno a 180C.

4.- PROCEDIMIENTO
4.1 Organismos coliformes totales en alimentos

(queso, embutido, crema)


Pesar cuidadosamente 10 g de la muestra y licuarla en condiciones aspticas durante 5 minutos, con
ayuda de 90 mL de agua peptonada al 0.1% estril (dilucin 10 -1). Transferir 1 ml de la dilucin 10-1 a
otro tubo que contenga 9 mL de agua peptonada al 0.1% estril (dilucin 10-2)
Prueba presuntiva

Inocular 1 mL de la dilucin 10 -1, de la muestra a cada uno de los 3 tubos con 10 mL de caldo
lactosado concentracin sencilla (0.1 g)
Inocular otra serie de tres tubos con caldo lactosado de concentracin sencilla con 0.1 ml de la dilucin
10-1. (0.01g)
Inocular otra serie de tres tubos con caldo lactosado de concentracin sencilla con 0.1 ml de la dilucin
10-2 (0.001g)
Incubar los tubos a 35C durante 48 horas.
Observar si hay produccin de gas en los tubos a las 24 horas, si no la hay, seguir incubando hasta las
48 horas, si en este tiempo no hay formacin de gas la prueba se considera negativa.

No olvidar que cada vez que se quita el tapn, la boca del tubo se debe flamear, en cada transferencia se debe
de emplear una pipeta estril.
Prueba confirmativa
Ordenar los tubos de acuerdo a la dilucin.
Agitar suavemente los tubos de caldo lactosado que resultaron positivos en la prueba presuntiva.
Transferir de 2 a 3 asadas de cada tubo positivo a caldo lactosa bilis verde brillante.
Incubar a 35C durante 48 horas.
Considerar la prueba positiva si hay formacin de gas en cualquier cantidad.
Determinar el nmero de organismos coliformes totales de acuerdo con la tabla correspondiente
tomando como base el nmero de tubos en que se observe produccin de gas.
Informar: Nmero ms probable de coliformes por gramo de muestra NMP.
Comparar con el lmite microbiano de cada muestra de acuerdo a la Norma Oficial mexicana que le
corresponda.

DE TE RMINACIN D E ORGANISMOS COLIFOR MES TOTALES POR LA TCNICA D EL NMP


EN AL IMENTOS Muestra: Agregar 1 mL 1 g de mues tr a
Prueba pres untiv a

9mL*10 1

1 mL c/u

1 mL

10mL
Caldo lactosado

9mL*10 2
1 mL

1 mL c/u

9mL*10 3

1 mL c/u

Prue ba confirmatoria

Caldo bilis ver de brillante

10mL
Caldo lactosado

Caldo bilis ver de brillante

10mL
Caldo lact osado

Caldo bilis ve rde brillante

Incubar a 35 C, 24-48 hora s Incubar a 35C, 24 -48 horas


So luc in diluyente: *Agu a peptonada al 0.1%

4.2 Organismos coliformes totales en agua y helado


(Agua de la red municipal, agua embotellada, hielo, helados procesados, pulque)
En el caso del hielo y del helado dejar fundir completamente la muestra, homogenizarla
Si se realizan simultneamente las determinaciones de organismos coliformes totales y fecales, traer una
muestra de 200 mL.
Prueba presuntiva

Inocular 10 mL de la muestra directa a cada uno de los 5 tubos con 10 mL de caldo lactosado doble
concentracin
Inocular otra serie de cinco tubos con caldo lactosado de concentracin sencilla con 1 ml de la muestra
directa
Inocular otra serie de cinco tubos con 0.1 mL de la muestra directa.
Incubar los tubos a 35C durante 48 horas.
Observar si hay produccin de gas en los tubos a las 24 horas, si no la hay, seguir incubando hasta las
48 horas, si en este tiempo no hay formacin de gas la prueba se considera negativa.

No olvidar que cada vez que se quita el tapn, la boca del tubo se debe flamear, en cada transferencia se debe
de emplear una pipeta estril.
Prueba confirmativa
Agitar suavemente los tubos de caldo lactosado que resultaron positivos en la prueba presuntiva.
Transferir de 2 a 3 asadas de cada tubo a caldo lactosa bilis verde brillante.
Incubar a 35C durante 48 horas.
Considerar la prueba positiva si hay formacin de gas en cualquier cantidad.
Determinar el nmero de organismos coliformes totales de acuerdo con la tabla correspondiente
tomando como base el nmero de tubos en que se observe produccin de gas.
Informar: Nmero ms probable de organismos coliformes totales por 100 mL de muestra NMP
Comparar con el lmite microbiano de cada muestra de acuerdo a la Norma Oficial mexicana que le
corresponda.

ORGAN ISMOS COLIFORMES TOTALES PARA AGUA POTABLE, AGUA EMBOTELLADA Y HIE
LO Muestra: Se debe n de tr aer 100 mL de muestra
Prueba pres untiv a

Pr ueba c onfirmatoria

10 mL c/tubo
100 mL de muestra

20 mL de C aldo Lac tosado


de doble c oncentraci n

10 mL de C ald o
bilis e brillante
verd

1 mL

0.1 mL

1 0 mL de Caldo Lactosa do
bilis de concentr acin s encilla

10 mL de C aldo
verd e brillante

1 0 mL de Caldo Lactosa do
bilis de concentr acin s encilla
nte

10 mL de C aldo
v erde brilla

Incubar a 35C, 24- 48 h oras

Incubar a 35C, 24-48 horas

4.3 Organismos coliformes fecales en alimentos

(queso, embutido, crema)


Pesar cuidadosamente 10 g de la muestra y licuarla en condiciones aspticas durante 5 minutos, con
ayuda de 90 mL de agua peptonada al 0.1% estril (dilucin 10 -1). Transferir 1 ml de la dilucin 10-1 a
otro tubo que contenga 9 mL de agua peptonada al 0.1% estril (dilucin 10-2)
Prueba presuntiva

Inocular 1 mL de la dilucin 10 -1, de la muestra a cada uno de los 3 tubos con 10 mL de caldo Lauril
triptosa sulfat (CLTS) (0.1 g)
Inocular otra serie de tres tubos con caldo lauril triptosa sulfato con 0.1 ml de la dilucin 10-1. (0.01g)
Inocular otra serie de tres tubos con caldo llauril triptosa sulfato con 0.1 ml de la dilucin 10-2 (0.001g)
Incubar los tubos a 35C durante 48 horas.
Observar si hay produccin de gas en los tubos a las 24 horas, si no la hay, seguir incubando hasta las
48 horas, si en este tiempo no hay formacin de gas la prueba se considera negativa.

No olvidar que cada vez que se quita el tapn, la boca del tubo se debe flamear, en cada transferencia se debe
de emplear una pipeta estril.
Prueba confirmativa
Ordenar los tubos de acuerdo a la dilucin.
Agitar suavemente los tubos de caldo lauril triptosa sulfato que resultaron positivos en la prueba
presuntiva.
Transferir de 2 a 3 asadas de cada tubo positivo a caldo EC.
Incubar a 44.5C durante 48 horas.
Considerar la prueba positiva si hay formacin de gas en cualquier cantidad.
Determinar el nmero de organismos coliformes fecales de acuerdo con la tabla correspondiente
tomando como base el nmero de tubos en que se observe produccin de gas.
Informar: Nmero ms probable de organismos coliformes fecales por gramo de muestra NMP.
Comparar con el lmite microbiano de cada muestra de acuerdo a la Norma Oficial mexicana que le
corresponda.

4.2 Organismos coliformes fecales en agua y helado


(Agua de la red municipal, agua embotellada, hielo, helados procesados, pulque)
En el caso del hielo y del helado dejar fundir completamente la muestra, homogenizarla
Si se realizan simultneamente las determinaciones de organismos coliformes totales y fecales, traer una
muestra de 200 mL.
Prueba presuntiva

Inocular 10 mL de la muestra directa a cada uno de los 5 tubos con 10 mL de caldo lauril sulfato doble
concentracin
Inocular otra serie de cinco tubos con caldo lauril triptosa sulfato de concentracin sencilla con 1 ml de
la muestra directa
Inocular otra serie de cinco tubos con 0.1 mL de la muestra directa.
Incubar los tubos a 35C durante 48 horas.
Observar si hay produccin de gas en los tubos a las 24 horas, si no la hay, seguir incubando hasta las
48 horas, si en este tiempo no hay formacin de gas la prueba se considera negativa.

No olvidar que cada vez que se quita el tapn, la boca del tubo se debe flamear, en cada transferencia se debe
de emplear una pipeta estril.
Prueba confirmativa
Agitar suavemente los tubos de caldo lauril triptosa sulfato que resultaron positivos en la prueba
presuntiva.
Transferir de 2 a 3 asadas de cada tubo a caldo lactosa bilis verde brillante.
Incubar a 44.5C durante 48 horas.
Considerar la prueba positiva si hay formacin de gas en cualquier cantidad.
Determinar el nmero de organismos coliformes fecales de acuerdo con la tabla correspondiente
tomando como base el nmero de tubos en que se observe produccin de gas.
Informar: Nmero ms probable de organismos coliformes fecales por 100 mL de muestra
Comparar con el lmite microbiano de cada muestra de acuerdo a la Norma Oficial mexicana que le
corresponda.

5.- RESULTADOS Y CUESTIONARIO


Anota los resultados de todos los equipos en el siguiente cuadro.
Equipo

Muestra

Organismos coliformes totales


por NMP

Organismos coliformes fecales


por NMP

1
2
3
4
5
6
7
8
9
10

1.-Qu son los organismos coliformes Totales?


2.-Cual es el fundamento de la tcnica del nmero ms probable (NMP).
3.-Anota todos los componentes del caldo lactosado y menciona la funcin de cada uno de ellos.
4.- Por que se usa caldo lactosado de doble concentracin para anlisis de agua?
5.-Anota todos los componentes del caldo lactosa bilis verde brillante y menciona la funcin de cada uno de
ellos.
6.-Anota todos los componentes del caldo lauiril sulfato triptosa y del caldo EC, menciona la funcin de cada uno
de ellos.
7.-Anota todos los componentes del caldo lactosado y menciona la funcin de cada uno de ellos.
8.-Qu son los organismos Coliformes Fecales?
9.- Cul es la diferencia de usar la tcnica para coliformes fecales y coniformes totales?
10.- Por qu se les llama indicadores sanitarios a los microorganismos coliformes?
11.- A que se debe la presencia de organismos coliformes fecales en muestras de agua y alimentos.
12.- En qu Norma Oficial Mexicana se basa este anlisis?
13.- Cules son las principales gneros que conforman el grupo coliforme?

6.- ANLISIS Y DISCUSIN DE RESULTADOS


Analice la Tcnica del Nmero Ms Probable, presencia o ausencia de organismos coliformes totales y
coliformes fecales en muestras de agua, as como el uso de las tablas.
7.- CONCLUSIONES
Elabora las conclusiones con base a los resultados obtenidos y a los objetivos de la prctica.
8.- BIBLIOGRAFA
Anota la bibliografa consultada para el reporte de esta prctica.
9.- REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
-American Public Health association 1998. Compendium of Methods for the Microbiological Examination of
Foods. Ed. Marvin L. Speck. E.U.A.
-Fernndez Escartn E. 1981. Microbiologa Sanitaria Agua y Alimentos. Vol 1. Universidad de Guadalajara.
ANUIES-SEP. Mxico.
-NOM-109-SSA-1994 Bienes y Servicios Procedimiento para la toma, manejo y transporte de muestras de
alimentos para su anlisis microbiolgico. Secretaria de Salud Mxico.
-NOM-110-SSA-1994 Bienes y Servicios. Preparacin y dilucin de muestras de alimentos para su anlisis
microbiolgico. Secretaria de Salud Mxico.
-NOM-112-SSA1-1994 Bienes y Servicios Determinacin de bacterias coliformes Tcnica del Nmero Ms
Probable. Secretaria de Salud. Mxico.
-IPN. Escuela Nacional de Ciencias Biolgicas. Departamento de Microbiologa. 2004 Manual de Laboratorio de
Microbiologa Sanitaria. 3 Edicin.

LABORATORIO DE TCNICAS MICROBIOLGICAS- UPIBI.IPN

PRCTICA No 10
IDENTIFICACIN DE BACTERIAS
UNIDAD: VI Identificacin de microorganismos
TEMA: 6.2 Identificacin de bacterias por pruebas bioqumicas
1.-OBJETIVOS
1.1 Objetivo general
El alumno utilizar las pruebas bioqumicas para la identificacin de bacterias.
1.2 Objetivos especficos
Determinar la actividad enzimtica sobre los carbohidratos y sales orgnicas como principales fuentes de carbono.
Determinar la actividad enzimtica en la hidrlisis de aminocidos y protenas
Determinar la actividad de los microorganismos en los procesos de xido-reduccin.
2.- INTRODUCCIN
El trmino metabolismo se utiliza cuando nos referimos a todos los procesos qumicos que tienen lugar dentro de
una clula. Los elementos qumicos bsicos que utiliza una clula provienen del medio ambiente y estos elementos
qumicos son transformados por la clula en los constituyentes caractersticos que componen dicha clula. Estos
compuestos qumicos se llaman nutrientes y el proceso por el cual una clula transforma estos nutrientes en sus
componentes celulares se denomina anabolismo o biosntesis. La biosntesis es un proceso que requiere energa.
Las clulas pueden utilizar 3 tipos distintos de fuente de energa: luz, compuestos orgnicos y compuestos
inorgnicos. Aunque algunos organismos obtienen su energa de la luz, la mayor parte lo hacen a travs de
compuestos qumicos. Cuando estos compuestos qumicos se rompen originando compuestos ms simples se libera
energa. Este proceso se denomina catabolismo. Las clulas tambin necesitan energa para otras funciones
celulares como es la movilidad celular y transporte de nutrientes.
Los microorganismos son capaces de efectuar reacciones bioqumicas para degradar nutrientes cuyos productos
finales permiten su identificacin, a este grupo de reacciones se les denomina pruebas bioqumicas, las cuales se
han clasificado segn el sustrato que emplean:
a) Reacciones de carbohidratos (almidn, lactosa, sacarosa, glucosa, manitol, etctera).
Los carbohidratos almacenan gran cantidad de energa, la capacidad de fermentar depende de las enzimas del
microorganismo.
Los carbohidratos ms simples se definen como polihidroxialdehdos (aldosas, p.e. glucosa, galactosa, ribosa y
manosa) y polihidroxicetosas (cetosas, p.e. ribulosa y xilulosa) los cuales se denominan como monosacridos, estos
se pueden unir entre s para dar lugar a los disacridos (p.e. sacarosa, lactosa y maltosa) si se une ms de un
monosacridos se le puede denominar oligosacrido (p.e. rafinosa) y si se unen un gran nmero de estos
monosacridos se le llama polisacrido (p.e. almidn, celulosa y glucgeno). Derivados de carbohidratos tambin
son usados como fuente de energa por los microorganismos, como son el caso de cidos (p.e. cido glucnico y
glucornico) y alcoholes (p.e. sorbitol, manitol e inositol).
Al producto final de la degradacin de los azcares se le conoce como fermentacin y la realizan los
microorganismos principalmente en condiciones anaerobias.

Autoras: Jurez Jurez M., Prez Snchez R., Rodrguez Pascual P

73

Existen distintas clases de fermentacin producidas por las bacterias y cada una depende de los productos finales
caractersticos formados. Segn la mayora de los autores los grupos ms importantes de bacterias muestran uno de
los cinco tipos principales de formas de fermentacin.
1.Fermentacin alcohlica.
2.Fermentacin del cido lctico.
3.Fermentacin del cido propinico.
4.Fermentacin del cido mixta.
5.Fermentacin del alcohol butlico.
b)
Reacciones para sales orgnicas (citrato, malonato, urea).
c)
Reacciones para protenas y aminocidos (gelatina, casena, triptfano, lisina, arginina y ornitina)
Las protenas son demasiado grandes para entrar en la clula por lo tanto para ser metabolizadas deben ser
hidrolizadas a componentes ms pequeos.El catabolismo de las proteinas es realizada por las enzimas
exocelulares de tipo proteoltico, llamadas gelatinazas son secretadas por ciertas bacterias para desdoblar a las
protenas en aminocidos individuales
La capacidad enzimatica de un microorganismo de descarboxilar es un proceso por el cual las bacterias que poseen
enzimas descarboxilasas especificas atacan los aminocidos en su carboxilo terminal (COOH) para formar una
amina o una diamina y dixido de carbono: R-CH-NH2-COOH
R-CH2-NH2+CO2 Estas descarboxilasas son
enzimas adaptativas o inducidas
d)

Por el tipo de respiracin que efectan (aerobios estrictos, microaeroflicos,, anaerobios facultativos y
anaerobios estrictos).
La identificacin bacteriana preliminar pueden efectuarse observando las caractersticas de las colonias y la
morfologa microscpica, pero la caracterizacin final de un aislamiento bacteriano desconocido en gnero y especie
se logra mediante la deteccin de ciertos sistemas enzimticos exclusivos de cada especie.
En el laboratorio estos sistemas se detectan inoculando una pequea porcin de la colonia bien aislada a una serie
de medios de cultivo que contienen substratos especficos, e indicadores qumicos que detectan los cambios de pH
o la presencia de un subproducto.
Para poder realizar una identificacin bacteriana es necesario primero sembrar por estra a los microorganismos, ya
que generalmente tendremos un cultivo mixto, de esta manera lograremos tenerlos aislados y podemos conocer su
morfologa colonial (una vez teniendo el cultivo puro lo pasamos a un medio de cultivo en la cual se desarrolle, para
poder lograr estos pasos es necesario saber la temperatura de crecimiento, cuando tenemos el cultivo puro
procederemos a realizar la tincin de Gram para saber a que grupo pertenece G+ GAdems en la morfologa microscpica podemos conocer la forma del microorganismo ( bacilo, coco, coma, etc).
La mayora de las pruebas utilizadas para evaluar la actividad bioqumica o metablica de las bacterias, por medio
de las cuales podemos identificarlas hasta especie, es realizando un subcultivo de la colonia pura, aunque es posible
efectuar observaciones preliminares utilizando ciertos medios de aislamiento primario, selectivo o diferencial. Se
recomienda que de una sola colonia hacer una suspensin bacteriana en 1 mL de solucin salina fisiolgica 0.85 p/v
para que de ah se tome la muestra e inocular todo el juego de pruebas bioqumicas.

LAS SIGUIENTES PRUEBAS DE IDENTIFICACIN PARA BACTERIAS ESTN AGRUPADAS PARA


BACTERIAS GRAM POSITIVAS Y NEGATIVAS
Pruebas bioqumicas recomendadas para bacterias Gram negativas

Fermentacin de carbohidratos ( glucosa, lactosa, sacarosa, manitol, dulcitol, salicina, adonitol, sorbitol,
rafinosa, ramnosa, xilosa, etc.)
TSI (fermentacin de la glucosa, produccin de cido sulfhdrico, produccin de gas)
LIA ( descarboxilacin de la lisisna)
MIO (movilidad, descarboxilacin de la ornitina y la produccin de indol)
SIM (movilidad, produccin de cido sulfhdrico)
Rojo de metilo
Producin de urea
Reaccin de Voges Proskauer
Utilizacin deMalonato
Utilizacin del citrato
Licuefaccin de la gelatina
Crecimiento en caldo CN
Utilizacin de la esculina
Utilizacin del gluconato
Requerimientos de oxgeno
Catalasa
Oxidasa
Reduccin de nitratos
Fermentacin O/F

Pruebas bioqumicas recomendadas para bacterias Gram positivas

Fermentacin de carbohidratos ( glucosa, lactosa, sacarosa, manitol, dulcitol, salicina,


adonitol, sorbitol, rafinosa, ramnosa, xilosa, etc.)
TSI (fermentacin de la glucosa, produccin de cido sulfhdrico, produccin de gas)
LIA ( descarboxilacin de la lisisna)
MIO (movilidad, descarboxilacin de la ornitina y la produccin de indol)
SIM (movilidad, produccin de cido sulfhdrico)
Catalasa
Oxidasa
Reducicn de nitratos
Hemlisis
Crecimiento en NaCl al 5, 10 y 15 %
Crecimiento en bilis al 40 %
Coagulasa
Licuefaccin del a gelatina
Hidrlisis de la esculina
Voges - Proskauer

Prueba de la fosfatas
Prueba de la DNAsa
Incubacin a 10 y 45 C
Reduccin con azul de metileno
Hidrlisis del hipurato
Formacin de cpsula
Hidrlisis del almidn

A continuacin se describen los fundamentos de las pruebas de identificacin que se realizarn en el


laboratorio.
A.- UTILIZACIN DE CARBOHIDRATOS
HIDRLISIS DE ALMIDN
Fundamento: Determinar la capacidad de un microorganismos para secretar la enzima amilasa para la degradacin
de almidn en molculas mas pequeas para ser utilizadas en su metabolismo.
FERMENTACIN DE CARBOHIDRATOS EN TUBOS CON CALDO ROJO DE FENOL MANITOL Y LACTOSA
Fundamento: Determinar la capacidad de unos organismos de fermentar unos carbohidratos incorporado a un medio,
produciendo cido y/o gas en una campana de Durham; el medio es lquido y como indicador contiene rojo de fenol
FERMENTACION DE AZUCARES EN MEDIO TSI.
Deteccin de fermentadores de glucosa y lactosa en agar de hierro de Kligler (KIA) o agar triple azcar hierro (TSI).
Fundamento: Este medio sirve para determinar la fermentacin de glucosa, sacarosa y lactosa adems de la
produccin de gas a partir de glucosa y la produccin de cido sulfhdrico que precipita como sulfuro frrico al
reaccionar con el hierro, la liberacin del cido sulfhdrico se libera por accin enzimtica, de los aminocidos que
contienen azufre produciendo una reaccin visible de color negro.
PRUEBA DE ROJO DE METILO
Fundamento: El rojo de metilo es un indicador de pH con un intervalo entre 6.0 8 amarillo) y 4.4 (rojo), esta prueba
es cuantitativa para la produccin de cido y requiere de organismos positivos que produzcan cidos lctico, actico,
o frmico a partir de la glucosa, por la va de la fermentacin mixta. Dado que existen muchos microorganismos que
producen cidos, slo se consideran rojo de metilo positivos aquellos organismos que puedan mantener este pH bajo
un largo tiempo de incubacin (48 -72 horas), contrarrestando el sistema estabilizador de pH del medio.
PRUEBA DE VOGES-PROSKAUER
Fundamento: La reaccin de Voges Proskauer se basa en la conversin del acetilmetilcarbinol (acetona) en
diacetilo por accin del KOH al 40 % y el oxgeno atmosfrico, la acetona se convierte en diacetilo - naftol acta
como catalizador para revelar un complejo de color rojo.
B.- UTILIZACIN DE SALES ORGNICAS

UTILIZACIN DE CITRATO DE SIMMMONS


Fundamento: Algunos microorganismos pueden suministrar energa en ausencia de l fermentacin o produccin de
cido lctico empleando como nica fuente de carbono al citrato. El metabolismo del citrato comprende una
condensacin de acetilo con la coenzima A y oxaloacetato para entrar en el ciclo de Krebs. Los productos obtenidos
del metabolismo del citrato dependen del pH del medio si es alcalino se produce ms acetato y formato con una
disminucin del lactato y CO2. Por encima del pH de 7 no hay produccin de lactato y los productos son CO2 cido
formica y cido actico.
UTILIZACIN DE MALONATO DE SODIO
Fundamento: Determinar la capacidad de un organismo de utilizar malonato de sodio como nica fuente de carbono,
con la consiguiente alcalinidad.
El malonato es un inhibidor enzimtico ya que interfiere en la oxidacin del cido succnico en cido fumrico,
inhibiendo la accin cataltica de ka enzima succnico deshidrogenasa, mediante un proceso de inhibicin
competitiva. El cido malonico ( malonato) se une a la enzima encerrando los sitios activos de manera que la enzima
no puede combinarse con su sustrato normal, el cido succnico. Esto ocasiona un cloqueo en la oxidacin del cido
succnico. El medio se inocula por asada y se incuba a 35 C durante 24.
HIDRLISIS DE UREA
Fundamento: La urea es una diamida del cido carbnico y esta es fcilmente hidrolizada con la liberacin de
amonaco y dixido de carbono. La enzima ureasa que posee un microorganismo pueden hidrolizar a la urea que
esta presente en el medio de cultivo de acuerdo con la siguiente reaccin: el amonaco reaccionan en solucin para
formar carbonato de amonio, producindose una alcalinizacin y un aumento del pH del medio.
C.- HIDRLISIS DE PROTENAS Y AMINOCIDOS:
LICUEFACCIN DE LA GELATINA (mtodo del tubo)
Fundamento: Determinar la capacidad de un organismo de producir enzimas proteo lticas que, a su vez son
detectadas por la digestin o licuefaccin de la gelatina presente . Estas enzima que son capaces de gelatinlisis, se
denominan gelatinazas. Las protenas que se producen son demasiado grandes para entrar en la clula por lo tanto
para ser metabolizadas deben ser hidrolizadas a componentes ms pequeos, las enzimas exocelulares de tipo
proteoltico, gelatinazas son secretadas por ciertas bacterias para desdoblar a las protenas y esta capacidad ayuda
a la identificacin bacteriana.
PRUEBA EN MEDIO MIO
Es un medio semislido, se siembra por picadura y se incuba 24 horas a 35 C. Sirve para leer la movilidad,
produccin de Indol y descarboxilacin de la ornitina.
La prueba de movilidad nos sirve para determinar si un microorganismo es mvil por la presencia de flagelos o
inmvil .

La prueba de Indol nos sirve para determinar si un organismo es capaz de desdoblar el indol de la molcula de
triptfano.
Este aminocido puede ser oxidado por ciertas bacterias para formar tres metabolitos indlicos principales: indol,
escatol e indolactico. El proceso es efectuada por varias enzimas que en conjunto se denomina triptofanasa .
La prueba de la descarboxilacin de la ornitina sirve para determinar la capacidad enzimtica de un microorganismo
de descarboxilarla para formar una amina, con la siguiente alcalinidad del medio. La descarboxilacin es un proceso
por el cual las bacterias que poseen enzimas descarboxilasas especficas son capaces de atacar a los grupos
carboxilo del aminocido dando una amina o una diamina y anhdrido carbnico, la enzima que efecta esta reaccin
se llama ornitina descarboxilasa , la cual es una enzima inducida que es formada por el organismo cuando son
cultivadas en un medio cido en presencia del sustrato y los productos de la descarboxilacin provocan un cambio
de pH hacia la alcalinidad.. Adems la descomposicin del aminocido se produce anaerobicamente y el proceso es
irreversible, no oxidativo y requiere de una coenzima comn, el fosfato de piridoxal.
El aminocido L-ornitina es descarboxilado por la enzima ornitina descarboxilasa para dar la diamina putrescina y
anhdrido carbnico. En ocasiones podemos producir condiciones de anaerobiosis si recubrimos la superficie del
medio con parafina o vaselina .
PRUEBA EN MEDIO SIM
El medio se inocula por picadura, se incuba a 35 C durante 24 horas, para leer la prueba de Indol agregar de 3 a 4
gotas del reactivo de Kovacs.
DESAMINACIN Y DESCARBOXILACIN DE AMINOCIDOS EN MEDIO LIA.
En este medio se determina la descarboxilacin de la lisina que se lleva a cabo en anaerobiosis y la desaminacin
de la lisina que se lleva acabo en aerobiosis.
D.- DETERMINACIN DEL METABOLISMO OXIDATIVO Y/O FERMENTATIVO
REDUCCIN DE NITRATOS A NITRITOS
Fundamento: La capacidad de un organismo para reducir nitratos a nitritos es una caracterstica importante utilizada
para la identificacin y diferenciacin de muchas especies. Los organismos que reducen nitratos tienen la capacidad
de obtener oxgeno de los nitratos para formar nitritos y otros productos de reduccin. La presencia de nitritos en el
medio se detecta aadiendo - naftilamina y cido sulfanlico, con la formacin de un color rojo de diazonio, p
sulfobenceno azo - - naftilamina. El color en caso de ser positiva aparecer a los 30 segundos de aadir los
reactivos.
DETERMINACIN DEL METABOLISMO OXIDATIVO Y/O FERMENTATIVO DE LA GLUCOSA EN MEDIO DE
HUGH Y LEIFSON
Fundamento: Los microorganismos sacarolticos degradan glucosa fermentativamente u oxidativamente, los
subproductos de la fermentacin son cidos mixtos relativamente fuertes, que pueden detectar en un medio de
fermentacin convencional. En cambio, los cidos formados por degradacin oxidativa la glucosa son sumamente
dbiles y para su deteccin se requiere de un medio de oxido fermentacin mas sensible, como el medio OF.

Este medio difiere de otros medios de fermentacin de carbohidratos en lo siguiente:


a.- la concentracin de protena 8 peptonas ) ha disminuido del 1 5 al 0.2 %.
b.- la concentracin de hidratos de carbono est aumentada del 0.5 % al 1 %.
c.- La concentracin de agar est disminuida de 1.5 a 0.25, con lo cual su consistencia es semislida.
La prueba OF presenta limitaciones, ya que los bacilos fermentadores de desarrollo ms lento pueden no
producir cambios de color durante varios das, y las especies que son esencialmente proteolticas pueden con el
tiempo producir reversiones de las reacciones dbiles, confundiendo as la interpretacin final.
PRUEBA DEL CIANURO DE POTASIO
Fundamento: Determinar la capacidad e un organismo de vivir y reproducirse en un medio que contenga
cianuro de potasio.
La respiracin aerbica es un proceso biolgico de oxidacin reduccin que produce energa y por medio del cual
un sustrato orgnico es oxidado, el mismo trasfiere electrones e iones hidrgeno por medio del sistema de transporte
de electrones, al aceptor de hidrgeno final, el oxgeno molecular. El proceso produce agua o perxido de hidrgeno,
segn la especie bacteriana y su sistema enzimtico.
PRUEBA DE CITOCROMO OXIDASA
Fundamento: Los citocromos son hemoprotenas que contienen fierro y actan como el ltimo eslabn de la
cadena respiratoria, transfiriendo electrones ( hidrgeno) al oxgeno, con formacin de agua. El sistema citocromo
oxidasa se encuentra en los organismos aerobios o anaerobios facultativos, de modo que la prueba de oxidasa es
importante para identificar a aquellos organismos que carecen de la enzima o son anaerobios obligados. La prueba
es muy til para el conocimiento de las colonias sospechosas de ser enterobacterias (todas negativas ) y para la
identificacin de colonias que se presume sean especies de Pseudomonas o Neisseria (positivas)
Esta prueba ocupa el diclororhidrato de p-fenilendiamina, que actua como aceptor final de electrones, sustituyendo al
oxgeno, la p-fenilendiamina es incolora en estado reducido, pero en presencia de citicromo oxidasa y oxgeno
atmosfrico se oxida formando azul de indofenol.
La prueba se lleva a cabo por 3 mtodos que son:
1.- La tcnica directa en placas, en la cual se aaden directamente 2 a 3 gotas de reactivo a las colonias aisladas
que se han desarrollado en la placa.
2.- La tcnica indirecta en tiras de papel filtro, en la que se aaden unas gotas del reactivo y,
3.- Tiras comerciales impregnados del reactivo y secos.
En la zona de papel donde se halla el reactivo se extiende un asa de la colonia sospechosa.
PRODUCCIN DE LA CATALASA
Fundamento: Determinar la presencia de la enzima catalasa, que se encuentra en la mayora de las bacterias
aerobias y anaerobias facultativas que contiene citocromo.

La catalasa es una enzima que se descompone en perxido de hidrgeno en oxgeno y agua, qumicamente la
catalasa es una hemoprotena de estructura similar a la de la hemoglobina.
El perxido de hidrgeno se forma como uno de los productos finales del metabolismo oxidativo aerbico de los
hidratos de carbono. Si se deja acumular el perxido de hidrgeno es letal para la clula bacteriana. La catalasa
transforma al perxido de hidrgeno en agua y oxgeno en agua.
3.-MATERIAL, EQUIPO, REACTIVOS Y CEPAS MICROBIANAS
3.1.- EQUIPO
1 incubadora a 35C
1 microscopio
1 refrigerador
1 autoclave
1 horno
3.2.- MATERIAL
1 Mechero Fisher
2 cajas de Petri
portaobjetos
65 tubos de ensaye de 13 x 100 mm
1 gradilla metlica
1 pipetero con pipetas estriles de 1 mL
1 frasco con alcohol
8 campanas de Durham
Algodn
Gasa
Papel Kraft
Asas bacteriolgicas
cilindro de acero inoxidable para cajas Petri
3.3.- MEDIOS DE CULTIVO:
1 tubo con 9 mL de solucin salina
1 caja con 20 mL de agar almidn
4 tubos con 3 mL de caldo rojo de fenol manitol con campana de Durham
4 tubos con 3 mL de caldo rojo de fenol lactosa con campana de Durham
4 tubos con 3 mL de medio TSI
4 tubos con 3 mL de caldo rojo de metilo
4 tubos con 3 mL de caldo Voges Proskauer
4 tubos con 3 mL de agar citrato de Simmons
4 tubos con 3 mL de caldo malonato
4 tubos con 3 mL de caldo urea
4 tubos con 3 mL de gelatina nutritiva
4 tubos con 3 mL de medio SIM
4 tubos con 3 mL de medio MIO

4 tubos con 3 mL de medio LIA


4 tubos con 3 mL de caldo nitrato
4 tubos con 3 mL de medio Hugh Leifson
4 tubos con 3 mL de medio cianuro de potasio

3.4 .-REACTIVOS:
Solucin de rojo de metilo
Solucin de naftol
Solucin de KOH
Reactivo de Kovacs o Erlich
Solucin de cido sulfanilico
Solucin de naftilamina
Aceite mineral
Solucin de peroxido de hidrogeno al 1 %
Reactivo N,N,N,N-tetrametil-p-fenilndiamina
Reactivos para tincin de Gram
Reactivos para tincin de esporas
Benzal
3.5.-BACTERIAS:
Bacterias Gram + y Gram cultivadas en la prctica de Aislamiento o bacterias control
disponibles en el laboratorio
4.- DESARROLLO EXPERIMENTAL:
4.1 Anotar el nombre del medio de cultivo en el que describiste la morfologa colonial de la cepa aislada de la
prctica de aislamiento, as como la morfologa microscpica y el resultados de la tincin de Gram.
4.2 Realizar una suspensin de la cepa pura en un tubo que contenga 5 mL de solucin salina estril.
4.3 Inocular en este orden las pruebas bioqumicas.
Prueba bioqumica
Utilizacin de carbohidratos
Hidrlisis de almidn
Utilizacin de citrato de sodio
Fermentacin de carbohidratos
Fermentacin de carbohidratos
Prueba de rojo de metilo
Prueba de Voges-Proskauer
Utilizacin de sales orgnicas
Utilizacin de malonato de sodio
Hidrlisis de urea

Medio de cultivo

Forma de inocular

Agar almidn
Citrato de Simmmons
Caldo rojo fenol con lactosa
Caldo rojo fenol con manitol
Rojo de metilo
Voges Proskauer

Por estra simple


Por estra
Por asada
Por asada
Por asada
Por asada

Caldo malonato
Caldo urea

por asada
por asada

Reduccin de nitratos a nitritos


Caldo nitrato
Prueba del cianuro de potasio
Cianuro de potasio
Hidrlisis de Protenas y
aminocidos
Licuefaccin de la gelatina
Gelatina nutritiva
SIM (produccin de H2S, indol y Medio SIM
movilidad)
MIO (movilidad, indol y ornitina)
Medio MIO
Metabolismo Oxidativo y/o
fermentativo
Determinacin del metabolismo
oxidativo y/o fermentativo de la glucosa
Desaminacin y descarboxilacin de
aminocidos
Fermentacin de carbohidratos
(glucosa, lasctosa)
Prueba de citocromo oxidasa
Prueba de la catalasa

Por asada
Por asada
Por picadura
Por picadura
Por picadura

LIA

Por picadura y a un
tubo agregar 0.2 mL
de aceite mineral
por picadura y estra

TSI

Por picadura y estra

Medio OF (Inocular dos tubos)

Realizar despus de incubar las


En portaobjetos
pruebas anteriores
Realizar despus de incubar las
En portaobjetos
pruebas anteriores

4.4 Incubar las pruebas a 35 C durante 24 horas e incubar una serie de pruebas bioqumicas sin inocular para
observar las reacciones por cambios de coloracin.

5.- RESULTADOS: Y CUESTIONARIO


5.1 Leer todas las pruebas bioqumicas en este orden y anotar los resultados tericos.

LABORATORIO DE TCNICAS MICROBIOLGICAS- UPIBI.IPN

FERMENTACIN DE RESULTADOS DE LAS PRUEBAS BIOQUMICAS


RESULTADO
AZCARES
Hidrlisis de almidn Agregar lugol sobre la estra
+ Positiva- Si se forma un halo claro alrededor de la estra.
- Negativa- No se forma un halo claro alrededor de la estra.
Fermentacin
de +Positiva: el medio se torna amarillo con la produccin de gas, la
manitol
campana esta llena de gas
- Negativa: El color del medio es rosa-rojizo.
Fermentacin
de + Positiva: el medio se torna amarillo con la produccin de gas, la
lactosa
campana esta llena de gas
- Negativa: El color del medio es rosa-rojizo.
Fermentacin de TSI Glucosa positiva: Fondo del tubo amarillo.
Fermentacin
de Sacarosa y lactosa positiva: Superficie amarilla
glucosa, lactosa y Lactosa positivo: Color amarillo en el pico de flauta, Produccin de
sacarosa
con H2S positivo: Coloracin negra en el medio.
produccin de H2S
Produccin de CO2 y H2: Burbujas, ligera muesca sobre el costado del
tubo desplazamiento del medio.
Glucosa, sacarosa y lactosa ( - ) el medio se torna rojizo.
Produccin de H2S ( - ): sin coloracin.
Produccin de CO2 y H2 ( - ): no hay burbujas.
Prueba de rojo de Agregar 2 gotas de rojo de metilo
metilo
+ Positiva: Color rojo en la superficie del medio de cultivo (Produccin
de acetil-metil-carbinol).
-Negativa: No hay cambio en el color
Prueba de Voges- agregar 6 gotas de naftol y 2 gotas de KOH
Proskauer
+Positiva: El cultivo cambia a color rojo, en todo el tubo.
- Negativa: El cultivo no cambia de color
UTILIZACIN DE
SALES INORGNICAS
Utilizacin de citrato de + Positivo: Desarrollo abundante, cambio de color verde a azul intenso
sodio
- Negativa: No hay desarrollo ni cambio de color.
Utilizacin de malonato Positivo: Desarrollo abundante con o sin alcalinizacin (color azul).
de sodio
Negativa: No hay desarrollo (medio de
Hidrlisis de urea
Produccin de ureasa
+ Positiva: Color rosa fucsia en el medio.
- Negativa: Sin cambio de color en el medio
HIDRLISIS DE
PROTENAS Y AMINOCIDOS
Licuefaccin de la Para leer la prueba los tubos se colocan en el cuarto fro durante
gelatina
cinco minutos.
+ Positivo: licuefaccin de la gelatina.
- Negativo: Si no hay licuefaccin de la gelatina volver a incubar,
descartar la prueba
negativa hasta los 14
das.
MIO (movilidad, indol y Movilidad: Crecimiento alrededor de la picadura.
ornitina)
Descarboxilacin de la ornitina:
Autoras: Jurez Jurez M., Prez Snchez R., Rodrguez Pascual P

83

LABORATORIO DE TCNICAS MICROBIOLGICAS- UPIBI.IPN

SIM (produccin de
H2S, indol y movilidad)

LIA (Desaminacin y
descarboxilacin
de
aminocidos)

METABOLISMO
Reduccin de nitratos a
nitritos
Determinacin
metab. oxidativo
fermentativo
de
glucosa (OF)

de
y/o
la

Prueba del cianuro de


potasio
Prueba de citocromo
oxidasa

Prueba de la catalasa

+ Positiva: Color prpura del medio.


- Negativa: Color amarillo del medio.
Despus de leer las dos pruebas se agregan 3 4 gotas de reactivo de
kovacs y se observa:
- Indol + Positivo: Se forma un anillo de color rosa o rojo
- Negativo: No se forma el anillo.
Produccin de H2S: Presencia de un precipitado color negro alrededor
de la picadura o en todo el tubo
Produccin de Indol: Presencia de un anillo de color rojo en la
superficie al adicionarle el reactivo de Kovacs.
Movilidad: Turbidez alrededor de la picadura.
Nota: Cuando el microorganismo es mvil y productor de cido
sulfhdrico el medio se torna completamente negro.
Desaminacin de aminocidos:
+ Positiva: La superficie del tubo es de color rojo vino.
- Negativa: La superficie no tiene cambios.
Descarboxilacin de aminocidos
+ Positiva: El fondo del tubo es de color purpura.
- Negativa: El fondo del tubo es de color amarillo.
OXIDATIVO FERMENTATIVO
Agregar 3 gotas de naftilamina y 3 gotas de cido sulfanlico.
+ Positiva: Aparicin de un color rojo en 30 segundos
- Negativa: Sin cambio de color.
TUBO SIN SELLO DE ACEITE
Oxidativo: + positivo cidoamarillo, - negativo verde, sin cambios
Fermentativo: + positivo cidoamarillo, - negativo verde, sin
cambios
Sacarolitico: + positivo cidoamarillo, - negativo verde, sin cambios.
TUBO CON SELLO DE ACEITE
Oxidativo: + positivo cidoamarillo, - negativo verde, sin cambios
Fermentativo: + positivo acidoamarillo, - negativo verde, sin
cambios
Sacarolitico: + positivo acidoamarillo, - negativo verde, sin cambios.
+ Positivo: Presencia de crecimiento (turbidez)
- Negativo: Ausencia de crecimiento (medio claro)
Tomar una asada del cultivo TSI y colocarla en un pedazo de papel
filtro impregnada con el reactivo (N.N.N.N-tetrametil-p-fenilendiamina).
+ Positiva: aparicin de un color azul violeta.
- Negativa: No hay cambio de color.
Tomar una asada del cultivo TSI y colocarla en un portaobjetos que
contiene 2 gotas de perxido de hidrogeno y observar.
+ Positiva: Presencia de burbujas de oxigeno.
- Negativa: Ausencia de burbujas de oxigeno.

Autoras: Jurez Jurez M., Prez Snchez R., Rodrguez Pascual P

84

5.2 Con los resultados obtenidos consulta las tablas que sern proporcionadas por el profesor, para la identificacin
de su microorganismo.
5.3 NOMBRE DE LA BACTERIA:_
5.4 Qu pasara si las pruebas bioqumicas se dejaran ms de 24 horas?
5.5 Por qu siempre que se identifica una bacteria se pone una serie de pruebas bioqumicas sin inocular?
5.6.Explicar el significado de la presencia o ausencia de un halo claro, al agregar el lugol, en las pruebas de hidrlisis
del almidn
5. 7.Qu microorganismos hidrolizan el almidn?
5.8 Explicar porqu en las pruebas de fermentacin de azcares en tubos con campana de Durham se emplea un
indicador de pH, cual es el indicador y cual es su rango de sensibilidad.
5. 9 Qu otros azcares se pueden utilizar para la fermentacin de azcares?
5. 10 Qu significa TSI y que es lo que podemos observar con esta prueba?
5. 11 Cul es el fundamento de las pruebas de utilizacin de citrato y malonato y cual es el indicador de pH que se
emplea en estas pruebas bioqumicas?
5.12 Cul es el fundamento de la prueba de hidrlisis de la urea?
5.13 Explicar cual es la utilidad de detectar la capacidad de hidrlisis de protenas que tienen ciertos
microorganismos. De qu manera se detectan estas enzimas proteolticas de los microorganismos?
5.14 Qu microorganismos licuan la gelatina?
5.15 Qu significa SIM y cual es el fundamento de esta prueba ?
5.16 Qu significa MIO y cual es el fundamento de esta prueba?
5. 17 Qu significa LIA y cual es el fundamento de esta prueba?
5.18 Cul es el fundamento de la prueba reduccin de nitratos a nitritos?
5.19 Cmo se determina el metabolismo oxidativo y/o fermentativo de la glucosa?
5.20 Cul es el fundamento de la prueba del cianuro de potasio?
5.21 Cul es el fundamento de la prueba de citocromo oxidasa?
Autoras: Jurez Jurez M., Prez Snchez R., Rodrguez Pascual P

85

5.22 Cul es el fundamento de la prueba de la catalasa?


6.- ANLISIS Y DISCUSIN DE RESULTADOS
6.1 Discutir la importancia de un buen aislamiento para la identificacin de microorganismos.
6.2 Discutir la importancia de la morfologa microscpica y de la morfologa colonial.
6.3 Analizar la importancia de las pruebas bioqumicas en cuanto a fermentacin de azcares, utilizacin de sales
inorgnicas, hidrlisis de protenas y aminocidos, metabolismo oxidativo fermentativo
realizadas para la
identificacin de microorganismos.
6.4 Discutir la importancia de utilizar otras pruebas bioqumicas.
6.5 Discutir la importancia del buen uso de las tablas para identificar a los microorganismos.
7.- CONCLUSIONES
7.1 Elaborar las conclusiones con base a los resultados obtenidos, al anlisis y discusin de stos, a la bibliografa
consultada y a los objetivos de la prctica.
7.2 Concluir el gnero del microorganismo analizado de acuerdo a las pruebas bioqumicas.

8.- BIBLIOGRAFA
Enumerar la bibliografa consultada para la elaboracin del reporte de la prctica
9.- REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
-Koneman. E: W Allen, S.D., Dowell, VR., Sommers, H.M. Diagnstico Microbiolgico. Traduccin: Wasserman. A. V.
Editorial Mdica Panamericana. Mxico. 1984.
- Mac Faddin. J.F., Pruebas Bioqumicas para la Identificacin de Bacterias de Importancia Clnica. Traduccin
Lorenzo, I., Editorial Mdica Panamericana, Mxico. 1984.

LABORATORIO DE TCNICAS MICROBIOLGICAS- UPIBI.IPN

Autoras: Jurez Jurez M., Prez Snchez R., Rodrguez Pascual P

87

LABORATORIO DE TCNICAS MICROBIOLGICAS UPIBI. IPN

PRACTICA No. 11
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN DE MOHOS Y LEVADURAS
Unidad VII: Mohos y Levaduras
TEMA: 7.1 Aislamiento e identificacin de mohos y levaduras
7.2 Identificacin de mohos y levaduras
1. OBJETIVOS:
1.1 Objetivo general:
1.1.1 El alumno identificar y cuantificar mohos filamentosos y levaduras en productos de inters biotecnolgico.
1.2 Objetivos especficos:
1.2.1 El alumno aislar de una muestra de inters un moho filamentoso y una levadura por la tcnica de vaciado en

placa.
1.2.2 El alumno cuantificar mohos filamentosos y levaduras aislados.
1.2.3 El alumno describir la morfologa microscpica de los mohos filamentosos y levaduras aislados.
1.2.4 El alumno describir la morfologa macroscpica de los mohos filamentosos y levaduras aislados.
1.2.5 El alumno identificar un moho filamentoso por medio de la tcnica Ridell (Microcultivo).
2. INTRODUCCIN

Existen aproximadamente 100,000 especies de mohos microscpicos, y la mayora viven en el suelo como
saprofitos sobre materia orgnica en descomposicin, manteniendo as la fertilidad de los suelos.
Alrededor de 50 especies producen enfermedades en los animales, y aproximadamente 8,000 especies causan
enfermedades en las plantas, por las que se producen prdidas econmicas en la agricultura. En el rea de la
industria farmacutica algunos mohos son utilizados para obtener antibiticos, como la penicilina a partir del gnero
Penicillium .
En el campo de la elaboracin de alimentos y la biotecnologa, los mohos microscpicos se utilizan para elaboracin
de cerveza, vino, pan, maduracin de quesos, produccin de diversos cidos orgnicos, etc.
Los mohos tambin se pueden usar, por ejemplo, en la degradacin de hidrocarburos en el caso de
derrames de petrleo en el mar. Los mohos pueden crecer tanto en agua dulce como el agua marina. Tambin es
relevante el hecho de que algunos mohos forman sustancias txicas al crecer en alimentos.
MORFOLOGA DE LOS MOHOS
Se les llama tambin Eumicetos, no producen flagelos, es decir, son inmviles la mayor parte de ellos. Los
mohos microscpicos pueden ser:
1) Mohos Unicelulares: se llaman mohos levaduriformes o levaduras.
2) Mohos filamentosos: se llaman mohos y constan de muchas clulas.
Tanto las levaduras como los mohos presentan clulas eucariotes, es decir, con cromosomas mltiples, membrana
nuclear bien definida, mitocondrias, retculo endoplsmico y pared celular.
Son microorganismos que contienen paredes celulares rgidas hechas de glucgeno, de celulosa o de quitina o
mananas. Adems la membrana celular fngica, a diferencia de la bacteriana, presenta esteroles. Estos
microorganismos carecen de clorofila y son hetertrofos.
El conjunto celular de los mohos son llamados micelios. Es decir, a cada filamento individual se le llama hifa, al
conjunto de hifas se le llama micelio, y a la colonia entera del moho se le llama talo. El aspecto que presentan las
Autoras: Jurez Jurez M., Prez Snchez R., Rodrguez Pascual P.
86

colonias de mohos es de tipo aterciopelado, algodonoso o polvoso, con muy diversas coloraciones que abarcan toda
la gama de color. Los mohos poseen hifas multinucleadas y estas pueden tener septos o carecer de ellos con base
en esta caracterstica, se clasifican en:
1) Mohos con micelio cenoctico : son los que carecen de septos o tabicaciones
2) Mohos con micelio septado: son los que presentan septos o tabicaciones entre las clulas.
Cada hifa puede tener un grosor uniforme o puede terminar en porciones mas delgadas o anchas. El dimetro va
desde 0.5 hasta 100 micras, y su longitud puede ser desde unas cuantas micras hasta varios metros. En algunas
formas superiores de mohos, las hifas estn pegadas juntas para formar cuerpos fructiferos grandes, de estructura
compleja, formado los llamados mohos carnosos o macroscpicos. Pero aun cuando alcancen tales dimensiones,
todos los mohos siguen siendo microorganismos primitivos, debido a su especializacin en tejido es reversible.
En cuanto a su funcin, las hifas y micelios se clasifican en 2 tipos:
1) Hifa o micelio vegetativo: son las que penetran al sustrato para absorber las sustancias nutritivas.
2) Hifa o micelio areo o reproductivo: son las que se proyectan sobre el sustrato y producen estructuras de
reproduccin.
Muchos mohos patgenos presentan dimorfismo, desarrollndose como formas de aspecto de levadura o como
micelios. Por ejemplo, cuando cierto moho crece a temperatura de 37C en el cuerpo humano, se pueden presentar
como levaduras, pero cuando crece en un medio de cultivo para mohos a 25C presenta forma de moho con micelio
y esporas asexuales.
REPRODUCCIN
Los mohos se reproducen principalmente por medio de esporas, que son estructuras especializadas para la
propagacin del moho y estn capacitados para soportar condiciones adversas del medio ambiente, sin embargo
son ms sensibles, en general que las endosporas bacterianas. Las esporas fngicas pueden formarse
asexualmente o pueden ser el resultado de un proceso sexual. A continuacin se muestran la clasificacin de estas
esporas:

Talosporas
Reproduccin
Asexual

Conidiosporas

Esporangiosporas

Reproduccin
Sexual

Esporas asexuales:

Zigosporas
Ascosporas
Basidiosporas
Oosporas

Artrosporas
Blastosporas
Clamidosporas
Microconidias
Macroconidias

I.- Talosporas:
a) Artrosporas. Son esporas que se forman por fragmentacin de hifas generalmente son rectangulares con doble
pared gruesa.
b) Blastosporas. Se forman en las levaduras por gemacin a partir de una clula preexistente; una vez que la yema
ha alcanzado su mximo desarrollo se separa de la clula madre y en este estado o todava unida, produce un nuevo
brote, pudindose formar un pseudomicelio.
c) Clamidosporas. Se forman cuando las condiciones del medio se tornan adversas, las clulas aumentan de tamao
y se hinchan. Estas esporas son redondeadas y poseen doble pared gruesa que les confiere gran resistencia.
II.- Conidiosporas.
Son esporas producidas libremente, por segmentacin de las puntas de unas hifas especializadas, llamadas
conidioforos.
a) Microconidias. Son esporas unicelulares que se presentan en una variedad de tamaos, formas y colores.
Son producidas por los conidiforos, mediante el estrangulamiento sucesivo en el punto de unin.
b) Macroconidias. Son esporas multicelulares, las hay de diversas formas. Las macroconidias pueden dividirse
en dos o ms clulas por tabiques transversales y pueden adoptar forma de huso o de clava. La forma de
estas estructuras vara, segn el gnero.
III.- Esporangiosporas.
Son esporas producidas en estructuras especializadas llamadas esporangios, que son sacos redondos unidos al
micelio vegetativo por una estructura especial llamada esporangiforo.
Esporas sexuales
I.- Cigosporas o Zigosporas:
Esta espora surge cuando las puntas de dos hifas cercanas se unen y fusionan sus contenidos genticos,
desarrollndose as grandes cuerpos de paredes gruesas. Las dos hifas que se unen pueden ser homotlicas (ambas
provenientes de la misma colonia o talo), o heterotlicas (provenientes de dos talos distintos).
II.- Ascosporas.
De la fusin de los gametos masculino y femenino surge una estructura llamada asco o asca. Las ascosporas se
desarrollan en el interior del asca, que es un saco que contiene generalmente ocho ascosporas.
III.- Basidiosporas
De la fusin de los gamento masculino y femenino surge una basidia, en cuyo interior estn las basidiosporas; se
desarrollan en grupo de cuatro como carcter atpico a partir de los extremos de estructuras en forma de maza, que
debido a su forma reciben el nombre de basidios.
IV.- Oosporas
Esporas que surgen de la unin de dos estructuras llamadas anteridio (gameto masculino) y oogonio (gameto
femenino), y que van a producir una sola oospora.
FISIOLOGA DE LOS MOHOS MICROSCPICOS.
Respecto a sus requerimientos nutricionales, los mohos son hetertrofos. Al faltarles la clorofila lgicamente
no llevan a cabo fotosntesis, y comparndolos con las bacterias, los mohos en general tienen requerimientos

nutritivos extraordinariamente simples y sus procesos metablicos y de biosntesis los llevan acabo por las vas mas
comunes. Por lo tanto pueden vivir en condiciones ms severas que otros microorganismos, casi en cualquier
sustrato. Por ejemplo: cuero, madera, alimentos, mermelada, frutas, plantas, el cuerpo humano, animales, etc.
El pH ptimo en el cual se desarrollan es de 3 a 5. Pueden crecer en humedad pero tambin resisten la falta de agua.
Son aerobios estrictos y carecen en un rango de temperatura ptimo de 22 a 30C. Algunos mohos son capaces de
desarrollarse en condiciones extremas, como deteriorqando carne a 0C (mohos psicrfilos), o crecimiento a 62 C
(mohos termfilos).
Las fuentes de carbono que pueden utilizar los mohos son: glucosa, sacarosa, maltosa, almidn o celulosa. Las
fuentes de nitrgeno que pueden utilizar los mohos son: nitrgeno orgnico, nitrgeno inorgnico y nitratos. Algunos
iones que requieren son: Zn, Cu, Mn, Fe y Mo.
De acuerdo al color de las hifas estas pueden ser hialinas cuando no estn pigmentadas o dematiceas
cuando poseen con color caf oscuro
3. MATERIAL, EQUIPO, REACTIVOS Y CEPAS MICROBIANAS
3.1 MATERIAL

Pipetas de 1 mL
Bisturi
Caja de Petri con varilla en forma de V
con un porta y cubreobjetos
Asa micolgica

3.2 EQUIPO

Autoclave
Incubadora a 28C
Incubadora a 35C
Mechero
Horno a 170C

3.3 MEDIOS DE CULTIVO

Tubos con 9 mL de agua peptonada al 0.1% estril


Matraz con 200 mL de Agar Papa Dextrosa
Tubos con 6 mL de Agar Papa Dextrosa
Tubos con 6 mL de Agar Dextrosa Saboraud
Cajas de Petri con agar Rosa de Bengala
Cajas de Petri con Agar Papa Dextrosa (para microcultivo)
Matraz con 50 mL de Glicerol al 10% estril
Matraz con 50 ml de formaldehido al 10%
Matraz con 50 mL de cido tartrico estril al 10%
Tubos de ensayo de 16x 150 con campana de Durham con los azcares siguientes:
(Un juego de tubos por equipo)
Glucosa al 10%
Lactosa al 10%

Maltosa al 10%
Sacarosa al 10%
Rafinosa al 10%
Matraces con Agar Dextrosa sabouraud para 4 placas por equipo
cido tartrico al 10%

3.4 CEPAS DE MOHOS

Penicillium sp
Aspergillus nger
Muestra de inters biotecnolgico
4. DESARROLLO EXPERIMENTAL
4.1 CUANTIFICACIN DE MOHOS FILAMENTOSOS Y LEVADURAS
4.1.1 Colocar 1 gramo de la muestra (pan, tortilla, verdura, tierra, etc) que contenga mohos, en un tubo que contiene

9 mL de agua peptonada al 1% con una pinza estril y en condiciones de esterilidad.


4.1.2 Homogenizar y esperar a que se sedimente.
4.1.3 Realizar diluciones decimales de 10-1 hasta 10-4 en tubos que contienen 9 mL de agua peptonada al 1%.
4.1.4 Realizar la tcnica de vaciado en placa, colocando 1 mL de la dilucin 10-2 hasta la dilucin 10-4 a una caja de

Petri estril.
4.1.5 Vaciar a la caja aproximadamente 20 mL de agar papa dextrosa previamente acidificado y a una temperatura
adecuada.
4.1.6 Homogenizar perfectamente con movimientos circulares dejar solidificar.
4.1.7 Realizar la tcnica por duplicado.
4.1.8 Incubar una serie de placas a 25C durante 5 das para mohos y otra serie a 35C durante 48 horas para
levaduras.
4.1.9 Revisar las placas a las 48 y 72 horas y hacer los recuentos correspondientes donde las colonias estn bien
aisladas.
4.1.10 Realizar los clculos y reportar el nmero de UFC/mL o g
4.2. MORFOLOGIA COLONIAL DE MOHOS
4.2.1 Observar la morfologa colonial de los mohos aislados y reportar tamao, forma, aspecto, color del micelio

vegetativo y reproductor, adems de observar si hay pigmento difusible.


4.3 RESIEMBRA DEL MOHO AISLADO
4.3.1 Elegir una colonia de moho bien aislada y sembrarlo por punto en tubos con PDA y ADS y en cajas con agar

Rosa de bengala y ADS.


4.3.2 Incubar los tubos y las cajas a28C durante 48 horas
4.3.3 Una vez terminado el tiempo de incubacin anotar las diferencias de morfologa colonial en los diferentes

medios de cultivo.
4.4 IDENTIFICACIN DE MOHOS POR LA TCNICA DE RIDELL (Microcultivo)

4.4.1 De una caja de Petri con agar PDA cortar cuadros de 1 cm de lado y 3 mm de espesor con un bistur estril.

4.4.2 Colocar el cuadro de PDA en un portaobjetos que esta sobre una varilla de vidrio doblada en forma de V en
una caja de Petri (todo esto previamente esterilizado).
Tomar con el asa el inoculo del moho al cual se quiere identificar.
4.4.3 Inocular por picadura cada uno de los 4 lados del cuadro de agar.
4.4.4 Colocar sobre el cuadro de agar un cubreobjetos y presionar ligeramente para que se adhiera este al medio.
4.4.5 Adicionar a la caja 5 mL de glicerol al 10%.
4.4.6 Cerrar la caja Petri e incubarla a 28C durante 48 horas.
4.4.7 Realizar observaciones mnimo cada 12 horas para identificar los cuerpos fructferos
4.4.8 Si se observa que el moho ya se ha desarrollado y se puede identificar, quitar el glicerol con una pipeta pasteur.
4.4.9 Adicionar 5 mL de formaldehido para inactivar el moho, esto es durante 15 minutos.
4.4.10 Desprender con cuidado el cubreobjetos que se encuentra sobre el cuadro de agar y colocarlo sobre un
portaobjetos que contenga una gota de azul de algodn, sellar la preparacin con barniz de uas transparente.
4.4.11 Desprender con cuidado el cuadro de agar y colocar una gota de azul de algodn ahora colocar un
cubreobjetos y sellar nuevamente la preparacin con barniz de uas trasparente.
4.4.12 Realizar las observaciones de las preparaciones en el microscopio con el objetivo de 10X y 40X.
4.4.13 Dibujar las estructuras observadas y con ayuda de la bibliografa comparar las estructuras reproductivas e
identificar el moho.
4.5 OBSERVACIN MICROSCPICA DE LEVADURAS
4.5.1 De la placa de PDA que se incubo a 28C seleccionar una colonia de levadura.
4.5.2 Fijar la levadura de la misma manera como se fija una bacteria.
4.5.3 Teir la preparacin con azul de metileno o cualquier otro colorante durante un minuto.
4.5.4 Lavar la preparacin dejar secar.
4.5.5 Observar la preparacin al microscopio con el objetivo de 10X y 40X.
4.5.6 Dibujar la levadura que se observ.

4.6 Zimograma
Se utiliza para identificar diversos gneros y especies fngicas, principalmente levaduras y algunas bacterias
pertenecientes a los Actinomycetes, con base en su capacidad de fermentar azcares.
4.6.1 Tomar una colonia de levadura aislada e inocular cada tubo que contiene diferentes azcares con las levaduras
a estudiar, una concentracin aproximada a la del tubo nmero 1 de la escala de Mc Farland, incubar 72 horas y
observar la fermentacin de carbohidratos y comparar con la tabla.
IDENTIFICACIN DE LEVADURAS DEL GENERO CANDIDA
Dextrosa
Maltosa
Sacarosa
Galactosa
+
+
+
C. albicans
C. tropicales
+
+
+
+
C. glabrata
+
+
+
C. guilliermondii
+
+
C. parapsilosis
+
C. krusei
+
+
+
C. kefyr
+
C. lipolytica

Lactosa
+
-

Trehalosa
+
+
+
+
+
+
-

+*

C. zeylanoides

5. RESULTADOS Y CUESTIONARIO.
5.1 Anotar el nmero de UFC/mL o g de mohos y levaduras de las diluciones correspondientes en la siguiente tabla.
DILUCION

MOHOS UFC/mL o g

LEVADURAS UFC/mL o g

10-2
10-3
10-4
5.2 Dibujar la levadura observada al microscopio
5.3 Dibujar las estructuras de reproduccin del moho.
5.4 Anotar en la siguiente tabla las caractersticas de la morfologa colonial del moho.

Caractersticas
Tamao
Forma
Aspecto
Color del micelio vegetativo
Pigmento difusible
Anota el nombre del moho identificado

PDA

ADS

ARB

5.5 Anotar en la siguiente tabla las caractersticas de la morfologa colonial de la levadura en el medio PDA.
Tamao
Aspecto
Color
Consistencia
Anota el nombre de la levadura identificada

5.6 Anota la composicin y utilidad de los medios de cultivo: Sabouraud, agar Papa Dextrosa y Agar Rosa de
Bengala.
5.7 Describe la tcnica de microcultivo.
5.8 Por que se inocula con esporas y micelio un medio de cultivo?
5.9 Por que se utiliza la tcnica de punto para sembrar mohos?
5.10 Porque es necesario realizar la tcnica de microcultivo para identificar mohos?
5.11 Cul es la funcin del glicerol y el formaldehido en un microcultivo?
5.12 Como identificaras un moho contaminante de un producto biolgico?
5.13 Que otras tcnicas se utilizan para la identificacin de levaduras?

6. ANALISIS Y DISCUSIN DE RESULTADOS


6.1 Discutir las caractersticas de cada grupo de mohos, as como su importancia microscpica en la naturaleza.
6.2 Discutir la relacin que guarda el crecimiento de los mohos en los diferentes medios de cultivo.

7. CONCLUSIONES
7.1 Elabora tus conclusiones tomando en consideracin los objetivos de la practica, los resultados obtenidos y la
bibliografa consultada.
8. BIBLIOGRAFIA
8.1 Enumera la bibliografa consultada para la elaboracin del reporte.
9. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

-Koneman, E:W:& Morrison; Micologa, Diagnstico de Laboratorio, Edito.. Mdico Panamericana 1991.
-Tortora, J. Gerard; Introduccin a la microbiologa, Editorial Acribia, 1993

Aspergillus nger

Rhizopus oligosporus

Aspergillus flavus

Trichoderma viride

Saccharomyces cerevisiae
Penicillium

LABORATORIO DE TCNICAS MICROBIOLGICAS-UPIBI.IPN

PRCTICA No. 12
FACTORES AMBIENTALES
UNIDAD VIII : Factores ambientales
TEMA: 8.1 Factores que afectan el crecimiento en el medio de cultivo
8.2 Efecto de los factores fsicos y qumicos
1. OBJETIVOS
1.1 Objetivo general
1.1.1 El alumno determinar la influencia de algunos factores ambientales que modifican el crecimiento de los
microorganismos que identific en prcticas anteriores.
1.2
1.2.1
1.2.2
1.2.3
1.2.4
1.2.5
1.2.6

Objetivo especficos
El alumno determinar la temperatura ptima, el punto trmico mortal (PTM) y el tiempo trmico mortal
(TTM) de algunos microorganismos.
El alumno determinar el efecto de la presin osmtica y del pH sobre el crecimiento de los
microorganismos.
El alumno determinar el efecto de algunos metales pesados y halgenos sobre el crecimiento de los
microorganismos.
El alumno determinar la sensibilidad de algunas bacterias ante el efecto de los antibiticos.
El alumno realizar una pasteurizacin como una aplicacin de un proceso trmico.
El alumno evaluar la resistencia bacteriana ante un antibitico.

2.-INTRODUCCIN
La temperatura es el factor ambiental que ejerce una variada influencia sobre el crecimiento microbiano, el
crecimiento microbiano se ve afectado de manera importante por la temperatura por lo que se clasifican en
psicroflicos: (0C a 20C), los mesoflicos crecen entre 20 y 40C y los termoflicos: crecen entre 40 y 80C.
La forma mas comn de determinar la sensibilidad a calor de un organismo es por medio de su Punto Trmico
Mortal (PTM), que es la temperatura mnima necesaria para que todos los organismos de una poblacin
mueran en 10 minutos y el Tiempo Trmico Mortal (TTM), es el tiempo mnimo en el cual muere una poblacin a
una temperatura dada.
La elevada concentracin de solutos en la clula genera una presin interna que recibe el nombre de presin
osmtica; las bacterias poseen paredes celulares rgidas y por lo general no presentan cambios muy
pronunciados de forma y tamao cuando experimentan plasmolisis o plasmoptisis.
Existen microorganismos que crecen en medios con alta concentracin de solutos y reciben el nombre de
osmofilicos, como son los haloflicos, que crecen en altas concentraciones de sal y los sacaroflicos, que crecen
en altas concentraciones de azcar.
El pH optimo de crecimiento de los microorganismos pueden afectar el crecimiento y se clasifican en acidfilos,
neutrfilos, basfilos, la degradacin de las protenas y otras substancias nitrogenadas, la fermentacin de
azucares produce cidos, por lo tanto, la naturaleza del microorganismo y el sustrato determinara si el medio
se alcaliniza o acidifica.
Autoras: Jurez Jurez M., Prez Snchez R., Rodrguez Pascual P.
95

Los metales pesados presentan actividad antimicrobiana, actan generalmente por medio de la precipitacin de
enzimas o de otras protenas esenciales para la clula o interfieren con algunas
funciones celulares, el
mercurio, la plata, el arsnico, el zinc y el cobre son los ms utilizados, se utilizan en bajas concentraciones ya
que tienen buena actividad antimicrobiana.
Compuestos halogenados como el yodo, cloro, el hipoclorito, actan como oxidantes de los constituyentes
celulares, como las protenas.
Los antibiticos se definen como substancias producidas por un microorganismo, la cual a bajas
concentraciones inhibe el crecimiento de los microorganismos, por su modo de accin, los antibiticos se pueden
clasificar como bactericidas, bacteriostticos, macrlidos, polipptidos y grupo miscelneo.
La pasteurizacin es un proceso trmico en el que se aplica un calentamiento moderado seguido de un
enfriamiento brusco, con la finalidad de reducir la carga microbiana presente en productos que son termo
sensibles, este proceso no es un mtodo de esterilizacin, puesto que existen microorganismos que resisten la
pasteurizacin, a los cuales se le conoce con el nombre de termodricos; ejemplo de ellos son algunas
especies de los gneros: Streptococcus, Micrococcus, Corynebacterium, Lactobacillus, Arthrocabter, Bacillus y
Clostridium.
3. EQUIPO, MATERIAL, MEDIOS DE CULTIVO Y CEPAS MICROBIANAS
3.1.- MATERIAL
Pipetas de 1,2,5 y 10mL estriles.
Tubos de 13x 100mm con 5 mL de caldo nutritivo
Tubos de 13x 100mm con 5 mL de caldo nutritivo Placas con agar nutritivo
20 mL de leche de establo
Tubos con 9 rnL de agua peptonada al 0. 1%
Matraz de 1 50 mL con Agar bilis rojo violeta
Cajas Petri con Agar cuenta estndar
Caja con agar Luria
Caja con agar Luria + ampicilina (50 g/mL)
Tubo con 5 mL de caldo Luria inoculado con una cepa de Esccherichia coli, con crecimiento de 24
horas.
Tubos de 13x 100 mm con 3 mL de caldo nutritivos pH 3. 5
Tubos de 13x 100 mm con 3 mL de caldo nutritivos pH 5
Tubos de 13x l00 mm con 3 mL de caldo nutritivo a pH 7.0
Tubos de 13x 100 mm con 3 mL de caldo nutritivo a pH 9.0
Tubos de 13x 100 mm con 3 mL de caldo nutritivo con 1% de cloruro de sodio
Tubos de 13x100 mm con 3 mL de caldo nutritivo con 3% de cloruro de sodio
Tubos de 13x 100 mm con 3 mL de caldo nutritivo con 5% de cloruro de sodio
Discos de papel filtro de 1 cm de dimetro
Cajas de Petri estriles
Pinzas de diseccin
Discos de papel filtro impregnados con hipoclorito de sodio

Discos de papel filtro impregnados con yodo


Sensidiscos con diferentes antibioticos
3.1 EQUIP0
1 termmetro
1 refrigerador a 4C
1 incubadora a 25C
1 incubadora a 35C
1 bao Mara a 50C
1 bao Mara a 60C
1 bao Mara a 70C
1 bao Mara a 80C
1 bao Mara a 92C
1 autoclave
Probetas
Horno
3.2 CEPAS MICROBIANAS

Bacillus sp.
Saccharomyces cerevisiae
Pseudomonas sp.
Escherichia coli

Aspergillus niger

Micrococcus luteus
4. DESARROLLO EXPERIMENTAL
4.1 EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE EL CRECIMIENTO MICROBIANO
4.1.1 Hacer una suspensin del microorganismo, cada equipo utilizar el mismo microorganismo en todos sus
experimentos.
4.1.2 Etiquetar 4 tubos con 3 mL de caldo nutritivo con: nombre del microorganismo, fecha, equipo, grupo y con
las siguientes temperaturas, 5C, 28C, 35C y 55C.
4.1.3 Inocular cada uno de los tubos con 0.1 mL de la suspensin microbiana, dejar un tubo sin inocular que
servir como testigo.
4.1.4 Incubar los tubos a la temperatura correspondiente durante 24 horas.
4.1.5 Despus de este tiempo observar si hay crecimiento haciendo anotaciones con un signo (+) dependiendo
de cuanta turbidez se observe y si no hay crecimiento con un signo (-).
4.2 DETERMINACIN DEL PUNTO TRMICO MORTAL (PTM)

4.2.1 Etiquetar una serie de 7 tubos conteniendo cada uno 3 mL de caldo nutritivo, con las siguientes
temperaturas: 35, 50, 60, 70, 80 y 92 C y un tubo que se mantendr a temperatura ambiente,
4.2.2 Inocular cada tubo con 0. 1 mL de la suspensin microbiana.
4.2.3 Calentar los tubos a las temperaturas correspondientes durante 10 minutos a bao Mara.
4.2.4 Dividir una caja Petri con agar nutritivo en 6 partes y marcar con 35, 50, 60, 70, 80, 92C y el testigo.
4.2.5 Sembrar por estra simple sobre el agar en su correspondiente temperatura.
4.2.6 Incubar la placa durante 48 horas a 25C si se sembr a mohos y a 35C, 24 horas si se trata de bacterias
y levaduras.
4.2.7 Observar si hay crecimiento en cada una de las temperaturas.
4.3 DETERMINACION DEL TIEMPO TERMICO MORTAL (TTM)
4.3.1 Etiquetar una serie de 7 tubos conteniendo cada uno 3 mL de caldo nutritivo, con los siguientes tiempos 5,
l0, 15, 20, 25 y 30 minutos y un testigo a temperatura ambiente.
4.3.2 Inocular cada tubo con 0, 1 mL de la suspensin microbiana
4.3.3 Calentar los tubos a 70C en un bao Mara durante los tiempos indicados
4.3.4 Dividir una caja Petri con agar nutritivo en 7 partes y marcar con 5, l0, 15, 20, 25 y 30 minutos y un
testigo a temperatura ambiente.
4.2. 5 Sembrar por estra simple sobre el agar en su correspondiente tiempo.
4.2.6 Incubar la placa durante 48 horas a 25 C si se sembr a mohos y a 35C, 24 horas si se trata de bacterias
y levaduras.
4.2.7 Observar si hay crecimiento en cada una de los tiempos.
TIEMPO TRMICO MORTAL Y PUNTO TRMICO MORTAL
5

35

10
15

50

Tamb

60

20

4.4.-PASTTe
EURIZACIN
30

70
Te
92

25

80

Leche sin pasteurizar: determinar organismos mesoflicos aerobios (OMA) y organismos coliformes
(OC).
Para organismos coliformes.
4.4.1 Realizar diluciones hasta 10-2 en agua peptonada al 0.1 %.
4.4.2 Sembrar por duplicado la dilucin 10-1 para organismos coliformes.
4.4.3 Sembrar por duplicado utilizando agar bilis rojo violeta, homogenizar, dejar solidificar y agregar una capa
de agar, solidificar e incubar a 35C durante 24 horas.
4.4.4 Contar las colonias tpicas de coliformes que son de color rosa o roja con un halo de precipitacin.
Para organismos mesoflicos aerobios.
4.4.5 Sembrar por duplicado la dilucin 10-2 utilizando agar cuenta estndar o agar nutritivo.
4.4.6 Dejar solidificar e incubar a 35C 24 horas.
4.4.7 Contar y reportar el nmero de colonias como unidades formadoras de colonias.
4.4.8 Pasteurizar la leche pasteurizada: adicionar 10 mL de leche bronca en un tubo estril, en un bao Mara a
70 C durante 30 minutos, enfriar rpidamente en bao de hielo y determinar organismos mesoflicos y
organismos coliformes.
4.5 Leche pasteurizada: determinar organismos mesoflicos aerobios (OMA) y organismos coliformes
(OC).
Para organismos coliformes.
4.5.1 Etiquetar 2 cajas vacas y estriles con los siguientes datos: leche pasteurizada, equipo, grupo.
4.5.2 Sembrar por duplicado la leche, adicionar agar bilis rojo violeta, homogenizar, dejar solidificar, agregar una
capa de agar, dejar solidificar e incubar a 35C durante 24 horas.
4.4.3 Contar las colonias tpicas de coliformes que son de color rosa o roja con un halo de precipitacin.
Para organismos mesoflicos aerobios.
4.4.4 Etiquetar 2 cajas vacas y estriles con los siguientes datos: leche pasteurizada, equipo, grupo y OMA.
4.4.5 Adicionar 1 mL de leche a cada caja, adicionar agar cuenta estndar, homogenizar, dejar solidificar e
incubar a 35C durante 24 horas.

4.4.6 Contar las colonias tpicas de coliformes que son de color rosa o roja con un halo de precipitacin.
4.4.7 Contar y reportar el nmero de colonias como unidades formadoras de colonias.
DIAGRAMA DE LECHE PASTEURIZADA Y SIN PASTEURIZAR

10 mL

Leche de establo sin Pasteurizar

Pasteurizar esta leche a 70C durante 30 min

Coliformes Organismos mesofilicos


(OC)
Aerobios (OMA)
ABRV

ACS

10 1

10-2

Coliformes Organismos
(OC)
mesoflicos
aerobios (OMA)
ABRV

ACS

Utilizar agar bilis rojo violeta


Utilizar agar nutritivo o agar cuenta estndar
Utilizar agua peptonada al 0.1% para la dilucin
EFECTO DE LOS FACTORES FISICOQUIMICOS EN EL CRECIMIENTO CELULAR
4.5- EFECTO DEL pH
4.5.1 Marcar los 4 tubos de caldo nutritivo con los diferentes pH con: el nombre de la cepa, grupo, equipo.
4.5.2 Inocular con 0.1 mL de la suspensin cada uno de los tubos.

4.5.3 Incubar los tubos a 35C para bacterias y levaduras durante 24 horas y a 25C durante 48 horas para
mohos.
4.5.4 Despus de este tiempo observar presencia o ausencia de crecimiento observando la turbidez para los
diferentes pH.
4.6-EFECTO DE LA PRESION OSMOTICA SOBRE EL CRECIMIENTO
4.6.1 Etiquetar los tubos que contienen 3 mL de caldo nutritivo con diferentes concentraciones de cloruro de
sodio (1%, 3% y 5%.) con nombre de la cepa, grupo y equipo.
4.6.2 Inocular con 0.1 mL de la suspensin cada uno de los tubos.
4.6.3 Incubar los tubos a 35C para bacterias y levaduras durante 24 horas y a 25C durante 48 horas para
mohos.
4.6.4 Despus de este tiempo observar presencia o ausencia de crecimiento observando la turbidez para los
diferentes pH.
4.7- METALES PESADOS
4.7.1 Impregnar discos de papel filtro con los siguientes compuestos. AgNO3, CuSO4
4.7.2 Marcar una caja Petri con agar nutritivo con: nombre de la cepa, grupo, equipo, nombre del metal.
4.7.3 Sembrar por estra masiva la caja y colocar los discos sobre la placa.
4.7.4 Incubar la placa a 35 C para bacterias y levaduras durante 24 horas y a 25C durante 48 horas para
mohos.
4.7.5 Observar el crecimiento del microorganismo y medir el halo de inhibicin de c/u de los agentes utilizados.
AgNO3

CuSO4

AgNO3

CuSO4

4.8 COMPUESTOS HALOGENADOS


4.8.1 Impregnar discos de papel filtro con los siguientes compuestos: hipoclorito de sodio y de yodo.
4.8.2 Marcar una caja Petri con agar nutritivo con: nombre de la cepa, grupo, equipo, nombre del metal.
4.8.3 Sembrar por estra masiva la caja y colocar los discos sobre la placa.
4.8.4 Incubar la placa a 35C para bacterias y levaduras durante 24 horas y a 25C durante 48 horas para
mohos.

4.8.5 Observar el crecimiento del microorganismo y medir el halo de inhibicin de c/u de los agentes utilizados.
Iodo

Iodo

Hipoclorito de sodio

Hipoclorito de sodio

4.9 EFECTO DE LA ACTIVIDAD DE ANTIBITICOS SOBRE EL CRECIMIENTO MICROBIANO


4.9.1 Marcar una placa con agar nutritivo con el nombre de la cepa, grupo, equipo.
4.9.2 Sembrar la placa por estra masiva con el microorganismo proporcionado.
4.9.3 Colocar un multidisco o discos individuales sobre las placas sembradas con las cepas.
4.9.4 Presionar ligeramente cada disco sobre el cultivo con ayuda de pinzas de diseccin para poner en contacto
el antibitico con la cepa
4.9.5 Incubar las placas a 35C durante 24 horas.
4.9.6 Despus del tiempo de incubacin medir el dimetro del los halos de inhibicin del crecimiento producido y
anotar los resultados.

Penicilina

Eritromicina

Penicilina

Eritromicina

4.9.1 RESISTENCIA BACTERIANA A UN ANTIBITICO


4.9.1.1 Tomar 1 mL del cultivo de Escherichia coli e inocularlo en cada una de las cajas con agar luria y agar
luria + ampicilina (50 g/mL). Incubar a 35C durante 24 horas, marcar correctamente las cajas.
4.9.1.2 Contar el nmero de colonias desarrolladas en cada caja.

4.9.1.3 Guardar la placa con colonias desarrolladas en presencia del antibitico en el refrigerador para la prctica
siguiente.
4.9.1.4 Calcular la frecuencia de bacterias resistentes al antibitico, como UFC en presencia de antibitico/UFC
sin antibitico (nmero de bacterias resistentes / cuenta total).

5. RESULTADOS
5.1 EFECTO DE LA TEMPERATURA
TEMPERATURA
CRECIMIENTO
UFC/mL

5C

28C

37C

55C

5.2 PUNTO TRMICO MORTAL


TEMPERATURA

37C

50C

60C

70C

80C

92C

10

15

20

25

30

CRECIMIENTO
UFC/mL
5.3 TIEMPO TRMICO MORTAL
TIEMPO
CRECIMIENTO UFC/mL
5.4 PASTEURIZACIN
LECHE SIN
PASTEURIZADA

LECHE PASTEURIZADA

UFC/mL

UFC/mL

ORGANISMOS
MESOFILOS
AEROBIOS
ORGANISMOS
COLIFORMES

5.5 EFECTOS DEL pH


EFECTO DEL pH
CRECIMIENTO
5.6 EFECTO DE LA PRESIN OSMTICA

3.5

5.0

7.0

9.0

CONCENTRACIN DE NaCl
CRECIMIENTO

1%

3%

5%

AgNO3

CuSO4

BaCl

5.7 EFECTO DE METALES PESADOS


METAL
DIMETRO DEL HALO DE
INHIBICIN (mm)
5.8 EFECTO DE COMPUESTOS HALOGENADOS
HALGENO

CLORO

YODO

DIMETRO HALO DE INHIBICIN (mm)


5.9 EFECTO DE LOS ANTIBITICOS
ANTIBIOTICO
DIMETRO HALO DE INHIBICIN (mm)
5.9 RESISTENCIA A UN ANTIBITICO
UFC en presencia de antibitico
UFC sin antibitico
Nmero de bacterias resistentes / cuenta total =
CUESTIONARIO
5.1 D tres ejemplos de microorganismso psicroflicos, 3 de mesoflicos y 3 de termoflicos
5.2 Define el trmino termodrico
5.3.-Da 3 ejemplos de microorganismos cuyo pH ptimo de crecimiento sea cido, 3 de pH alcalino y 3 de pH
neutro.
5.4 -Da la diferencia en la composicin y estructura de la pared celular de un organismo mesoflico y un
termodrico.
5.5 Qu significa actividad de un antibitico?
5.6.Cmo actan los antibiticos utilizados sobre el microorganismo con el que trabajaste?
5.7 A qu se debe la resistencia a un antibitico?
5.8 Cul es la importancia en salud y en biotecnologa de este tipo de cepas?
5.9 Explica brevemente que es el efecto bactericida, bacteriosttico, fungicida y fungisttico.

5.10 Explica la diferencia como actan los diferentes metales pesados utilizados en el laboratorio.

5.11 Explica la relacin que existe entre la concentracin del agente qumico y el tiempo de exposicin
6. ANLISIS Y DISCUSIN DE RESULTADOS
6.1 Basndose en los resultados anteriores y a la bibliografa consultada, analizar y discutir los resultados
obtenidos en esta prctica, haciendo nfasis en el efecto causado a nivel molecular de los factores estudiados y
la importancia prctica que tiene el conocer el efecto de estos mismos sobre los microorganismos.
7.-CONCLUSIONES.
7.1 Elaborar las conclusiones basndose en los resultados, al anlisis y discusin que se hicieron de estos, a la
bibliografa consultada y a los objetivos de la practica.
8.-BIBLIOGRAFA
Escriba la bibliografa consultada para el reporte de esta prctica,
9.- REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS RECOMENDADAS.
-Atlas, R. Mycrobiology, 2d Edition, Maxweil-MacNfillan Co. 1990
-Brock, T.D, microbiologa, 4'. Edicin, Pranticc-Hali Hispanoamerica, Mxico, D:F: 1995